KR101495744B1 - 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환되어, 라이신 아날로그 내성, 온도 내성, 및 호모세린, 로이신 및/또는 발린 영양요구성인 특성을 지니며, 목적 유전자의 발현이 상기 유전자의 내재적 발현보다 증가된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 이용한 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.

Description

코리네형 세균 유래의 sod 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 형질전환된 숙주세포 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법{Recombinant vector comprising sod promoter derived from coryneform bacteria, transformed host cell and method for producing amino acid using the same}

본 발명은 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 아미노산의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어, 유전자의 발현이 상기 유전자의 내재적 발현보다 증가된 코리네박테리아 글루타미쿰, 및 상기 미생물을 이용한 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.

코리네형 세균은 대표적으로 널리 이용되는 산업용 균으로서, 적절한 배양조건에서 대사산물을 많은 양으로 분비할 수 있는 능력을 지니고 있기 때문에, L-라이신, L-아르기닌, L-트레오닌 등의 다양한 아미노산 및 핵산 등의 생산에 유용하게 이용되고 있다.

그 중, L-라이신은 사람이나 동물의 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산으로서, 식품, 의약 그리고 사료첨가용으로 사용되고 있다. 이처럼 L-라이신을 산업적으로 생산하는 것이 경제적으로 중요한 산업공정이므로, L-라이신 생산 효율을 증대하기 위한 다양한 방법이 연구되어 왔다.

이러한 코리네형 세균 균주를 이용하여 L-라이신의 생산을 증대시키기 위하여 고전적인 돌연변이(classical mutagenesis)를 통해 돌연변이 균주를 얻거나 발효조건들을 개선하고 있으며, 유전공학을 통한 L-라이신 생합성 경로 관련 유전자의 증폭, 다른 경로의 유전자 결실 등의 방법이 이용되었다 (유럽공개특허 제0733710호).

또한, 한국공개특허 제2010-20140호, 제2008-8620호 및 제2008-10073호에 따르면, L-라이신 생산에 관련된 유전자인 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제와 피루베이트 카르복실라아제를 함께 발현시킴으로써 라이신 생산이 증가되었고 (한국특허출원 제2007-0094433호), 내재적 프로모터보다 개량한 프로모터의 교체로 라이신 생산에 효과를 확인한 바 있다 (미국특허출원 제13/037,790호).

아스파테이트 카이네이즈 유전자와 함께 디하이드로피콜리네이트 씬타아제, 디하이드로피콜리네이트 리덕타아제, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제, 디아미노피멀레이트 디카르복실라아제 등의 유전자 조합으로 라이신 합성 관련 유전자들의 발현을 증가시켜 생산 효과를 확인한 바 있다 (미국특허출원 제12/772,538호, 한국특허출원 제2002-7008533호, 한국특허출원 제1997-0709002호). 또한, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 프로모터를 변형시켜 그 유전자의 발현을 증대시키는 방법이 보고된 바 있다 (출원번호 10-2008-0010073).

또한, SOD(Superoxide dismutase, Gene ID:1020869) 유전자는 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)을 O2와 H2O2로 디스뮤테이션을 촉매하는 항산화 효소로 알려져 있으며, 세포의 항산화 방어체계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Jow et al., 1993.; J.Androl.,14:(6)439; Bauche et al., 1994; FEBS Lett., 1994, 349:392-396).

상기 효소는 보조인자(cofactor)에 따라 Cu/Zn SOD, Fe SOD, Mn SOD 와 Ni SOD 등이 알려져 있으며, 세균에서 발견되는 SOD는 Mn SOD와 Fe SOD가 대부분으로 cytoplasm에 존재하는 것으로 보고되었다 (Tainer and Getzoff, 1983, Nature 306:284-287).

이에 반해, 병원성 세균의 경우는 숙주의 ROS (Reactive oxygen species) 공격에 대한 방어 및 공격과 관련하여 Cu/Zn SOD 효소로 주로 주변 세포질(periplasm)에 존재하는 것으로 알려져 있다 (Tainer & Getzoff, 1983, Nature 306:284-287).

즉, Cu/Zn SOD는 진핵세포와 병원성 및 인체 내부 공생 세균에서 발견되는 것에 반해, Fe/Mn SOD는 원핵세포, 원생생물, 미토콘드리아에서 확인되고 (Borgstahl et al., 1992, Cell 71:107-118), Fe-과 Mn-SODs는 진행생물과 원핵생물 오리진에서 높은 상동성이 나타난 바 있다 (Borgstahl et al., 1992, Cell 71:107-118).

이 외에도, Ni-hooked SOD (Barondeau et al., Biochem. 43(25):8038-8047)와 Sulphate reducing bacteria Desulfo vibrio에서 non-classical SODs 등이 보고되었다 (Silva et al., 1999, Eur.J.Biochem.259:235).

Escherichia coli의 SOD는 2개의 isoenzyme으로 호기성/혐기성 상태에서는 Fe SOD가 호기적 상태 하에서는 MnSOD만이 나타난다고 보고되었고(Hassen and Fridovich. 1977 Fed.Proc. 36:715), SOD gene regulation에 fur 등이 관여 한다고 알려져 있다 (Tardat and Touati, 1993, Mol.Microbiol. 9: 53-63.).

세균에 있어서, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 관련된 SOD 연구는 Escherichia coli 이후 Lactococcus lactis (Sanders et al., 1995, J. Bacteriol. 177:5254-5260), Vibrio species (Kimoto et al., 2001. Microbiol.Immunol.45:135-142), Porphyromonas gingivalis (Ohara et al., 2006, Microbiology. 152:955-966), Corynebacterium melassecola (Merkamm and Guyonvarch, 2001, J. Bacteriol. 183(4):1284), Corynebacterium glutamicum (Shafey et al., 2008, Microbiol. Res. 163:80-86), Staphylococcus aureus (J. Bacteriol. 191(10):3301, 2009), Helicobacter pylori (J. Agric. Food Chem. 57(17): 7743, 2009) 등이 보고되었다.

뿐만 아니라, Corynebacterium melassecola 균주와 sod 유전자의 결핍 균주와의 인위적인 산화적 스트레스 반응에서의 균주 생장을 비교했을 때, sod 유전자가 있는 경우에는 세포 생장에 무리가 없었으나, 상기 유전자의 결핍시 세포 생장이 억제되는 것을 보고한 바 있다 (Muriel et al.,2001. J. Bacteriol.).

슈퍼 옥사이드 디스뮤타아제 (sodA) 돌연변이 균주에서는 야생형과 비교했을 때, 슈퍼옥사이드 라디칼에 민감도가 매우 높게 증가되는 것을 확인하였다 (Carlioz et al.,1986, EMBO.J. 5, 623-630).

또한, 대장균에서는 슈퍼 옥퍼옥사이드 디스뮤타아제인 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유전자의 발현이 생장단계에서 정지기(stationary phase)에서 많이 증가되는 것을 알 수 있었고 (Gort et al., 1999, Mol Microbiol 32:179), Rhizobium leguminosarum 에서도 sodA의 유전자의 활성이 배양 24 시간에 가장 높은 활성을 보였으며, 대체로 세포 생장기 중 정지기 말기 이후로 크게 증가된 것을 확인하였다 (Krehenbrink et al., 2011), J. Bacteriol.; Korshunov et al., 2006).

그러나, 상기 종래기술은 sod 프로모터를 이용하여 아미노산의 생합성 경로에 관여하는 유전자들의 동시발현을 통하여, 유전자의 발현을 증가시킴으로써 아미노산의 생산을 증대시키고자 하는 연구결과는 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래기술을 활용하여 아미노산의 일종인 라이신생산성을 증가시키는 균주를 개발하기 위하여 연구를 수행하던 중, sod 프로모터가 특징적으로 가지고 있는 외부 스트레스가 없을 경우 과발현되지 않고, 외부 스트레스가 증가될 경우 과발현되는 특성을 이용하여 목적 유전자들을 작동 가능하게 숙주세포를 형질전환시켜, 발효 초기에는 균체 생육이 저해되지 않게 유도함으로써, 단기간에 균체를 확보하게 하고, 균체 생육이 지수 성장기에 도달한 이후, 증가되는 환경적 스트레스에 노출되면 sod 프로모터로 조절되는 아미노산 생합성 유전자가 상류에 결합된 sod 프로모터가 과량으로 발현되어 목적 생산물인 아미노산을 과량으로 생합성하는 패턴으로 전환시킬 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 소망하는 아미노산의 생합성에 관여하는 목적 유전자들의 상류에 각각 코리네형 세균 유래의 sod 유전자 프로모터가 작동 가능하게 연결된 신규한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 백터로 형질 전환됨으로써 상기 목적 유전자들이 균의 대수증식기 이후에 증가되는 환경적 스트레스에 의해서 동시 발현되고, 발현된 유전자의 활성이 그 내재적 활성보다 증가된 새로운 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질 전환된 숙주세포를 배양하여 아미노산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, pPK-cassette1이라 명명한다.

본 발명은 또한, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 6의 fbp 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 7의 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 8의 tkt 유전자, 서열번호 9의 tal 유전자, 서열번호 10의 zwf 유전자 및 서열번호 11의 opcA 유전자 오페론을 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, pPK-cassette2라 명명한다.

본 발명은 또한, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 12의 pycA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 13의 lysA 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고, pPK-cassette3이라 명명한다.

본 발명은 또한, 상기 세 종류의 재조합 벡터로 1종 또는 2종 이상의 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환 된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 상기 재조합 벡터는 목적 유전자들의 상류에 코리네형 세균 유래의 sod 유전자 프로모터가 작동 가능하게 연결됨으로써, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포는 상기 sod 프로모터의 특징으로 인하여 숙주세포의 대수 증식기 이후에 증가되는 환경적 스트레스에 의해서 상기 목적 유전자들의 동시 발현이 이루어지게 된다.

이와 같이 sod 프로모터 특성을 가진 상기 숙주세포는 발효초반 생육은 정상적으로 성장하게 되고, 대수 증식기 이후 아미노산 생합성에 관여하는 유전자들의 활성이 그 내재적 활성보다 증가되어 대사의 흐름을 균체 생육에서 목적 산물, 즉 아미노산의 증산과 전이율 향상의 효과를 지닌다.

또한, 본 발명의 상기 형질전환 된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법에 의하면, L-라이신 등과 같은 아미노산의 생산증대 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에 사용된 벡터의 기본구조인 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pPK를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 사용된 pPK-cassette1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 사용된 pPK-cassette2 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 사용된 pPK-cassette3 벡터를 나타내는 도면이다.

본 발명에서 "프로모터"라는 용어는, 폴리머라아제에 대한 결합부위를 포함하고, 프로모터 하류(downstream) 유전자의 mRNA로의 전사개시 활성을 갖는, 코딩 영역의 상류(upstream)의 비해독된 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 ddh, dapA, dapB 등과 같이 효소를 코딩하는 목적 유전자의 전사 개시 및 프로모터 서열과 유전자 서열의 기능적 연결, 즉 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서 "벡터"라는 용어는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 뜻한다. 상기에서 "조절요소"는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

또한, 본 발명에서 "숙주세포"라는 용어는, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로서 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다.

또한, 본 발명에서 "형질전환"이라는 용어는, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외의 인자로서 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에서, “sod 프로모터”라는 용어는, 코리네형 세균, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutases; SOD, EC 1.15.1.1)의 프로모터를 의미하는 것으로서, 그 서열은 NCgl2826와 같다.

또한, 본 발명에서, 서열번호 1의 "ask 유전자"는 아스파르토키나아제를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3345161), 서열번호 2의 "asd 유전자"는 아스파테이트 세미알데하이드를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3345564), 서열번호 3의 "dapB 유전자"는 디하이드로피콜레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3345049), 서열번호 4의 "dapA 유전자"는 디하이드로피콜레이트 씬타아제를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3345490), 서열번호 5의 "ddh 유전자"는 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3344238), 서열번호 6의 "fbp 유전자"는 프럭토오즈 비스포스파타아제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3345276), 서열번호 7의 "gnd 유전자"는 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3344993), 서열번호 8의 "tkt 유전자"는 트랜스케톨라제를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3343601), 서열번호 9의 "tal 유전자"는 트랜스알도라아제를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3343602), 서열번호 10의 "zwf 유전자"는 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3345621), 서열번호 11의 "opcA 유전자"는 글루코즈 6 포스페이트 디하이드로게아나제 추정 서브유닛 (glucose-6-P dehydrogenase putative subunit)을 코딩하는 유전자 (Gene ID: 3345622), 서열번호 12의 "pycA 유전자"는 피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3344537), 서열번호 13의 "lysA 유전자"는 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(Gene ID: 3344931)를 의미한다.

본 발명의 일 태양은, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 목적 유전자가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 재조합 벡터는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제2도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette1일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 6의 fbp 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 7의 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 8의 tkt 유전자, 서열번호 9의 tal 유전자, 서열번호 10의 zwf 유전자 및 서열번호 11의 opcA 유전자 오페론을 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제3도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette2일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 12의 fbp 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 13의 lysA 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제4도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette3일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에 삽입되는 상기 sod 프로모터는 내재적 활성이 증가된 프로모터 활성을 지니고 있으므로, 목적에 적합하게 프로모터의 기능을 개선시킬 수 있는데, 상기 변이는 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 그 예는 부위-지정 돌연변이(site - directed mutagenesis ), 에러유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링 방법((DNA shuffling) 등이 있다.

본 발명의 재조합 벡터로 사용되는 플라스미드는 숙주 내로 삽입 후에 선별될 수 있는 마커를 가지고 있으며, 바람직하게는 제1도에 개시된 개열지도를 갖는 플라스미드 pPK는 제한효소를 이용하여 절단한 뒤, 카세트를 제작 삽입시켜 벡터를 제조할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 코리네형 세균 뿐만 아니라, 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이 때, 상기 적합한 숙주세포는 벡터가 복제가능한 것으로서, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체(숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서, 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환 된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커의 대표적인 예로서 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으며, 본 발명에서는 카나마이신을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 형질전환용 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자들은 상동성 재조합 교차로 인하여 코리네박테리움 속 미생물과 같은 숙주세포 내로 치환될 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 형질전환된 숙주세포는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터와; 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 6의 fbp 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 7의 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 8의 tkt 유전자, 서열번호 9의 tal 유전자, 서열번호 10의 zwf 유전자 및 서열번호 11의 opcA 유전자 오페론을 포함하는 재조합 벡터; 및 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 12의 fbp 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 13의 lysA 유전자를 포함하는 재조합 벡터일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 제2도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette1과, 제3도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette2, 및 제4도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette3로 형질전환된 숙주세포일 수 있는데, 상기 재조합 벡터들이 순차적으로 숙주세포, 바람직하게는 코리네박테리움 속 세균에 삽입될 수 있고, 상기 재조합 벡터가 삽입되는 예시적인 순서는 pPK-cassette1, pPK-cassette2, 및 pPK-cassette3의 순이나, 특별히 이에 제한될 되지는 않는다.

이 때, 재조합 벡터를 숙주세포에 삽입하는 방법은 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다.

또한, 본원발명의 상기 형질전환된 숙주세포는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제2도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette1일 수 있다.

또한, 본원발명의 상기 형질전환된 숙주세포는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 6의 fbp 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 7의 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 8의 tkt 유전자, 서열번호 9의 tal 유전자, 서열번호 10의 zwf 유전자 및 서열번호 11의 opcA 유전자 오페론을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환 된 숙주세포일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제3도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette2일 수 있다.

또한, 본원발명의 상기 형질전환된 숙주세포는, 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 12의 fbp 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 13의 lysA 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포일 수 있다.

상기 재조합 벡터는 제4도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette3일 수 있다.

본 발명에서 상기 숙주세포로는 코리네형 세균, 즉 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 또는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 L-아미노산 생산 돌연변이체, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 C123 (KCTC12307BP)일 수 있다.

또한, 상기 형질전환 된 숙주세포는 예를 들면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰과 다른 코리네박테리움속 균주인 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 상기 형질전환 된 숙주세포는 라이신 아날로그 내성(예컨대, Aminoethyl-L-Cysteine(AEC) 내성), 온도 내성 및/또는 호모세린, 로이신 및 발린으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 아미노산 요구성일 수 있다.

본 발명의 형질전환 된 숙주세포, 바람직하게는 코리네박테리아 속 미생물, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 C123 (KCTC12307BP)에 상기 목적 유전자가 동시 발현되어 그 유전자의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 특성을 갖는다.

상기 ask 유전자가 코딩하는 아스파르토키나아제, asd 유전자가 코딩하는 아스파테이트 세미알데하이드, dapB가 코딩하는 디하이드로피콜레이트 리덕타아제, dapA가 코딩하는 디하이드로피콜레이트 씬타아제, ddh가 코딩하는 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제, fbp가 코딩하는 프럭토오즈 비스포스파타아제, gnd가 코딩하는 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제, tkt가 코딩하는 트랜스케톨라제, tal이 코딩하는 트랜스알도라아제, zwf가 코딩하는 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제, opcA가 코딩하는 글루코즈 6 포스페이트 디하이드로게아나제 추정 서브유닛, pycA가 코딩하는 피루베이트 카르복실라아제, 및 lysA가 코딩하는 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제로 이루어지는 13종의 유전자일 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환된 숙주세포는 상기 13종의 유전자가 동시에 발현되는 것이 바람직하다.

바람직하게는 상기 13종의 유전자 모두일 수 있고, 또는 ask가 코딩하는 아스파르토키나아제, asd가 코딩하는 아스파테이트 세미알데하이드, dapB가 코딩하는 디하이드로피콜레이트 리덕타아제, dapA가 코딩하는 디하이드로피콜레이트 씬타아제, ddh가 코딩하는 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제로 이루어지는 5종의 유전자일 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환 된 숙주세포는 상기 5종의 유전자가 동시에 발현되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 fbp가 코딩하는 프럭토오즈 비스포스파타아제, gnd가 코딩하는 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제, tkt가 코딩하는 트랜스케톨라제, tal이 코딩하는 트랜스알도라아제, zwf가 코딩하는 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제, opcA가 코딩하는 글루코즈 6 포스페이트 디하이드로게아나제 추정 서브유닛으로 이루어지는 6종의 유전자일 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환 된 숙주세포는 상기 6종의 유전자가 동시에 발현되는 것이 바람직하다.

한편, 상기 유전자는 pycA가 코딩하는 피루베이트 카르복실라아제, 및 lysA가 코딩하는 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제로 이루어진 2종의 유전자일 수 있다.

본 발명에서 상기 형질전환된 숙주세포는 상기 2종의 유전자가 동시에 발현되는 것이 바람직하다.

상기 유전자들의 동시 발현은 고유 프로모터보다 강력한 프로모터로의 교체 및 돌연변이에 의한 발현량 증가에 의한 것이 포함되며, 상기 유전자 복제수의 증가는, 외래 유전자의 도입에 의한 복제수의 증가뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다.

상기 유전자 프로모터의 교체는 목적 유전자와 작동 가능하게 연결됨으로써, 상기 유전자들의 발효 안정기에서 발현 증가시키는 특성은 물론 내재 프로모터의 교체에 의한 것도 포함된다.

본 발명자에 의한 상기 형질전환된 sod 프로모터가 특징적으로 가지고 있는 외부 스트레스가 없을 경우 과발현되지 않고, 외부 스트레스가 증가될 경우 과발현되어 목적 유전자들을 작동 가능하게 숙주세포를 형질전환시켜, 발효 초기에는 균체 생육이 저해되지 않게 유도함으로써, 단기간에 균체를 확보하게 하고, 균체 생육이 지수 성장기에 도달한 이후, 산화적 스트레스에 노출되면 sod 프로모터로 조절되는 아미노산 생합성 유전자가 상류에 결합된 sod 프로모터가 과량으로 발현되어 목적 생산물인 아미노산을 생합성하는 패턴으로 전환시킬 수 있는 특성을 지닌다.

상기한 바와 같이, 균주를 생육시킨 후, 고가의 발현 유도체(예컨대, Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG) 등의 처리없이 배양중에 발생하는 자연적인 현상(예컨대, 산화적 스트레스 등)을 이용하여 발효 초기에 아미노산(예컨대, 라이신) 생합성 관련 유전자들의 과발현으로 야기되는 균의 생장 저해를 방지할 수 있었고, 발효 후반기에는 외부 스트레스에 의해 감소될 수 있는 균주의 라이신 생합성을 오히려 증가시킬 수 있어 상업적 생산규모의 문제를 해소할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은, 상기 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.

상기 아미노산으로는 L-라이신, L-트레오닌, L-메티오닌 등을 들 수 있는데, L-라이신이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991);및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기술되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981).

사용될 수 있는 당원으로는 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두박 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원도 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 또한, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다.

배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 표적 물질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

본 실시예에서는 코리네형 세균 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutases; SOD, EC 1.15.1.1)의 프로모터(sod 프로모터)와 작동 가능하도록 연결된 ask 유전자 및 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 ddh 유전자가 포함된 재조합 벡터와, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 fbp 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 tkt 유전자, tal 유전자, zwf 유전자 및 opcA 유전자 오페론이 포함된 재조합 벡터, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 pycA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 lysA 유전자가 포함된 재조합 벡터를 제작하고, 상기 13종의 모든 유전자들에 작동 가능하게 연결될 수 있는 형질전환체를 제작하였으며, 상기 제작된 형질전환체를 동시 발현 가능하게 순차적으로 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC10065에 상동 재조합을 통한 치환방법으로 라이신 생산에 효과적인 개량 균주를 얻었다.

< 실시예 1> 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC10065 유래 ask - asd , dapB , dapA, ddh 유전자의 클로닝 및 재조합 벡터 (PK-cassette1)의 제작

본 실시예에서는 고전적 변이처리에 의해서 분리된 라이신 생산이 가능한 C. glutamicum KFCC 10065의 염색체 DNA를 주형으로 ask-asd, dapB, dapA 그리고 ddh 유전자를 확보하였다. NCBI를 근거로 상기 유전자의 염기서열 정보(NC_006958.1)를 확보하고 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 수행시 중합효소는 DNA 폴리머라제 (clontech)를 사용하였으며, 하기 수득된 단편을 순차적으로 pPK (Kim et al.,2011.,J. Microbiol. Methods)벡터에 결합시켰다.

서열번호 1의 ask 유전자와 서열번호 2의 asd 유전자는 오페론을 구성하고 있으므로, 상기 오페론 전체를 상기 프라이머 서열번호 14 및 15를 이용한 PCR 증폭을 통해 2.6kb 크기의 프로모터 sod 부위를 포함한 단편을 획득하였으며 PCR 조건은 변성 96℃에서 40초 풀림 57℃에서 40초 및 중합반응 72℃에서 3분을 30회 반복하였다.

증폭 산물은 TA cloning vector (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RC001)에 클로닝하고 AscI과 NotI을 처리하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후 T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 상기 벡터 구조물에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함된 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 생성된 콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다.

상기 정제된 플라스미드는 하기 유전자와의 클로닝에 이용하였다. 서열번호 3의 dapB 유전자와 서열번호 4의 dapA 유전자도 sod 프로모터 부위를 포함한 단편을 각각 프라이머 서열번호 16과 17, 및 서열번호 18과 19를 이용하여 PCR 증폭을 통해 각각 1kb, 1.2kb를 수득하였고, PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, TA cloning vector에 클로닝하여 E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 앰피실린 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 여기서 추출된 dapB (NotI, NdeI)와 dapA (NdeI, SpeI) 는 각각 제한효소 처리 후에 상기 벡터 구조물에 T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 클로닝하였다.

상기에서 수득된 라이케이트는 E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 20시간 정치하였다. 생성된 콜로니에서 상기 제작 된 벡터를 정제하였다.

상기 벡터는 하기 유전자와 클로닝에 이용되었다. 서열번호 5의 ddh 유전자는 상기 프라이머 서열번호 20 및 21을 이용하여 PCR 증폭 후 프로모터 부위를 포함한 1.2kb 단편을 획득하여 SpeI, kpnI 제한효소 처리 후 상기 최종 벡터 구조물에 T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 클로닝하였다.

상기에서 수득된 라이케이트는 E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다. 플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 20시간 정치하였다.

콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였고, 이 구조물을 "PK-cassette1"이라고 명명하였으며 최종 그 유전자들의 염기서열은 시퀀싱 분석방법을 통해 확인하였다.

< 실시예 2> 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC10065 유래 fbp , gnd , 오페론 tkt-tal-zwf-opcA 유전자의 클로닝 및 재조합 벡터(PK- cassette2)의 제작

본 실시예에서는 C. glutamicum KFCC 10065의 염색체 DNA를 주형으로

서열번호 6의 fbp, 서열번호 7의 gnd, 서열번호 8-11의 오페론 tkt-tal-zwf-opcA 유전자를 확보하였다.

NCBI를 근거로 상기 유전자의 염기서열 정보(NC_006958.1)를 확보하고 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
PKP-6F	GCTGTAGACCGATTTCAG AGGGGCGGAG C	24
PKP-6R	GGGTACCATAAGAATGCGGCCGCCTACGATTGGCATCAAGTTTC	25
PKP-7F	ATAAGAATGCGGCCGCGAG GTTGAGGCGG TTGCGC	26
PKP-7R	CGGGATCCCGGGAATTCAAGCAAAAAACCGCCGACCACAATGG	27
PKP-8F	GGAATTCAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGTGAC	28
PKP-8R	GGGTACCGACTAGTGAATTCCATATGCTCACAATCTAAGGTGAC	29
PKP-9F	GGAATTCCATATGAGCTGCCAATTATTCCGGGCTTGT	30
PKP-9R	GCTCTAGAGCGAAGATCTAGTGTTGTATTTCTCCTTAGACGG	31
PKP-10F	GCTTCAACTGGCCACATCAC	32
PKP-10R	GTTCCGATGTTTCAGCTGC	33

PCR 수행시 중합효소는 DNA 폴리머라제 (clontech)를 사용하였으며, 상기 기재된 실시예 1과 같은 방법으로 pPK에 클로닝하고, 하기 제작되는 구조물은 E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

서열번호 6의 fbp 유전자는 서열번호 26과 27를 이용하여 PCR 증폭을 통해 1.2kb 크기의 프로모터 부위를 포함한 단편을 획득하였으며, 이 때 PCR 조건은 변성 96℃에서 40초 풀림 56℃에서 40초 및 중합반응 72℃에서 1분을 30회 반복하였다.

증폭 산물은 TA cloning vector (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RC001)에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 앰피실린(50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 상기에서 정제된 플라스미드는 NotI과 EcoRI을 처리하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 상기 벡터 구조물에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 18시간 정치하였다. 상기에서 얻어진 벡터 구조물을 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다.

상기 플라스미드는 하기 유전자와의 클로닝에 이용되었다. sod 프로모터 부위를 포함한 서열번호 7의 gnd 유전자는 서열번호 28과 29를 이용하여 PCR 증폭을 통해 1.7kb 크기의 단편으로 획득되었고, 증폭 산물은 EcoRI과 NdeI을 처리하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 상기 벡터 구조물에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 20시간 정치하였다. 생성된 콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하고 하기 유전자와의 클로닝에 이용하였다.

sod를 작동가능하게 연결한 서열번호 8의 tkt 유전자로서 서열번호 9의 tal, 서열번호 10의 zwf 그리고 서열번호 11의 opcA와 오페론을 구성하고 있으므로, 그 전체를 포함한 유전자군을 서열번호 30와 31을 이용하여 PCR 증폭을 통해 6.2kb 크기 단편을 획득하였고, 이 증폭산물은 NdeI과 BglII을 처리하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후 T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 상기 벡터 구조물에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 생성된 콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다.

상기 수득된 벡터는 BglII와 SpeI 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 상기 추출되어진 벡터 구조물에 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 24시간 정치하였다. 생성된 콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. 상기 구조물을 "PK-cassette2"라고 명명하였으며, 최종 그 유전자들의 염기서열은 시퀀싱 분석방법을 통해 확인하였다.

< 실시예 3> 코리네박테리아 글루타미쿰 KFCC10065 유래 pycA , lysA 유전자의 클로닝 및 재조합 벡터 (PK- cassette3)의 제작

실시예 2와 동일한 방법으로 실시하여 C. glutamicum KFCC 10065의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 12의 pycA, 서열번호 13의 lysA 유전자를 확보하였다.

NCBI를 근거로 상기 유전자의 염기서열 정보(NC_006958.1)를 확보하고 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 수행시 중합효소는 DNA 폴리머라제 (clontech)를 사용하였으며, SOD를 포함하는 유전자 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 12의 pycA 유전자를 서열번호 34와 35을 이용하여 PCR로 전체를 증폭하여 3.6kb 단편을 수득하였고, 상기 증폭산물은 ApaI 과 SpeI 을 처리하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, T4 DNA 리가제 (Roche)를 이용하여 이용하여 상동성 재조합에 적합한 벡터에 클로닝 하였으며, 상기에서 수득된 라이케이트는 E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 상기에서 생성된 콜로니들의 플라스미드 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다.

상기에서 추출된 벡터는 하기 유전자와의 클로닝에 사용하였다. sod 프로모터와 작동가능하게 연결된 서열번호 13의 lysA 유전자를 서열번호 36과 37를 사용하여 PCR 증폭하여 1.4kb 크기의 단편을 획득하였으며, 상기 증폭산물은 SpeI과 NdeI 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후, T4 DNA 리가제 (Roche )를 이용하여 상기 추출된 벡터 플라스미드와 접합시킨 후, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat.No. RH618, Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580)에 형질전환시켰다.

플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 20시간 정치하였다. 상기에서 생성된 콜로니들의 플라스미드는 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다.

상기 구조물을 "PK-cassette3"라고 명명하였으며, 최종 그 유전자들의 염기서열은 시퀀싱 분석방법을 통해 확인하였다.

< 실시예 4> 재조합 벡터( PK - cassette1 )로 형질전환된 라이신 생산균주의 제작

본 실시예에서는 코리네박테리움에 상기 실시예 1에서 제작한 PK-cassette1 벡터를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065을 형질 전환시키고, 상동 재조합을 통해 유전자들을 삽입시켰다.

상기 실시예 1에서 제작된 PK-cassette1 벡터가 확인된 클론을 C. glutamicum을 형질전환하기 위하여, C. glutamicum KFCC10065를 수용성 세포(competent cell)로 제작하였다.

10ml CM-broth 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]에서 30℃의 온도로 밤새 배양하였다. 상기 전배양된 세포는 100ml의 BHIS 배지[BHI 37 g, 2M 소르비톨 250ml (증류수 1L 기준)]에 OD(600nm)가 0.2-0.3이 되도록 접종하여, 30℃에서 200 rpm으로 OD(600nm)가 0.8-0.9이 될 때까지 6시간 동안 배양하였다.

배양액은 전처리된 튜브(prechilled tube)에 넣고 4℃에서 5000 rpm에 3~4번, 10% 글리세롤로 반복적으로 세정하여 세포를 회수하고, 상기 회수된 세포를 10% 글리세롤로 현탁시킨 후, 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.

상기 수용성 세포를 이용하여 제작된 구축물을 전기천공(electorporation; 0.2cm cuvette)을 이용하여 BIO-RAD사의 펄서(2.5kv, 25 ㎌, 200Ω)로 형질전환시켰다. 그 후, CM-broth 배지 1ml을 첨가한 후에 바로 46℃에서 6분 동안 예열(pre-warmming)하고, 200 rpm , 30℃에서 2 시간 동안 진탕배양을 한 후, 카나마이신 (25㎍/ml)이 포함되어진 BHIS (Brain Heart Infusion) 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 40시간 동안 정치하였다.

상기 생성된 콜로니들은 2차 재조합에 이용하기 위해 200 ㎕ BHIS 배지에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 밤새 배양하였으며, 그 배양액을 1:1000으로 희석하여 10% 스트렙토마이신(40 ug/ml)이 포함된 CM 아가 [포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g, 아가 20 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0] 플레이트에 도말하고, 30℃에서 72시간 동안 정치한 후, 생성된 콜로니를 다시 카나마이신의 내성이 없는지 확인한 다음, 상기 서열번호 22과 23의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하고, DNA 시퀀싱으로 PK-cassette1의 삽입을 최종 확인하였고, 이를 C. glutamicum C1으로 명명하였다.

< 실시예 5> 재조합 벡터( PK - cassette1 및 PK - cassette2 )로 형질전환된 라이신 생산균주의 제작

본 실시예에서는 상기 실시예 4에 의해 PK-cassette1이 삽입된 C. glutamicum C1에 실시예 2에 의해 제작된 PK-cassette2 벡터를 이용하여 상기 균주를 형질 전환시키고, 상동 재조합을 통해 유전자들을 삽입시켰다.

상기 PK-cassette2가 확인된 클론을 C. glutamicum에 형질전환하기 위하여, PK-cassette1이 삽입된 C. glutamicum C1을 수용성 세포(competent cell)로 제작하였다.

10ml CM-broth 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]에서 30℃의 온도로 밤새 배양하였다. 상기 전배양된 세포는 100ml의 BHIS 배지[BHI 37 g, 2M 소르비톨 250ml (증류수 1L 기준)]에 OD(600nm)가 0.2-0.3이 되도록 접종하여 30℃에서 200 rpm 으로 OD(600nm)가 0.8-0.9이 될 때까지 6시간 동안 배양하였다.

배양액은 전 처리된 튜브(prechilled tube)에 넣고 4℃에서 5000 rpm에 3-4번 10% 글리세롤로 반복적으로 세정하여 세포를 회수하고, 상기 회수된 세포를 10% 글리세롤로 현탁시킨 후, 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.

상기 수용성 세포를 이용하여 제작된 구축물을 전기천공(0.2cm cuvette)을 이용하여 BIO-RAD사의 펄서(2.5kv, 25 ㎌, 200Ω)로 형질 전환시켰다. 그 후, CM-broth 배지 1ml을 첨가한 후에 바로 46℃에서 6분 동안 예열(pre-warmming)하고, 200 rpm , 30℃에서 2 시간 동안 진탕배양을 한 후, 카나마이신 (25㎍/ml)이 포함된 BHIS (Brain Heart Infusion) 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 40시간 동안 정치하였다.

상기 생성된 콜로니들은 2차 재조합에 이용하기 위해 200 ㎕ BHIS 배지에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 밤새 배양하였으며, 그 배양액을 1:1000으로 희석하여 10% 스트렙토마이신( 40 ug/ml)이 포함된 CM 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 72시간 동안 정치한 후, 생성된 콜로니를 다시 카나마이신의 내성이 없는지 확인한 다음, 상기 서열번호 32, 33의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하고, DNA 시퀀싱으로 PK-cassette2의 삽입을 최종 확인하였고, 이를 C. glutamicum C12 으로 명명하였다.

< 실시예 6> 재조합 벡터( PK - cassette1 , PK - cassette2 및 PK - cassette3 )로 형질전환된 라이신 생산균주의 제작

본 실시예에서는 상기 실시예 5에 의해 PK-cassette1 및 PK-cassette2가 삽입된 C. glutamicum C12에 상기 실시예 3에서 제작된 PK-cassette3 벡터를 이용하여 상기 균주를 형질전환시키고, 상동 재조합을 통해 유전자들을 삽입시켰다.

상기 PK-cassette3 벡터가 확인된 클론을 C. glutamicum에 형질전환하기 위하여, PK-cassette1 및 PK-cassette2가 삽입된 C. glutamicum C12을 수용성 세포(competent cell)로 제작하였다.

10ml CM-broth 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]에서 30℃의 온도로 밤새 배양하였다. 상기 전 배양된 세포는 100ml의 BHIS 배지[BHI 37 g, 2M 소르비톨 250ml (증류수 1L 기준)]에 OD(600nm)가 0.2-0.3이 되도록 접종하여, 30℃에서 200 rpm 으로 OD(600nm)가 0.8-0.9이 될 때까지 6시간 동안 배양하였다.

배양액은 전 처리된 튜브(prechilled tube)에 넣고 4℃에서 5000 rpm에 3-4번 10% 글리세롤로 반복적으로 세정하여 세포를 회수하고, 상기 회수된 세포를 10% 글리세롤로 현탁시킨 후, 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.

상기 수용성 세포를 이용하여 제작된 구축물을 전기천공(0.2cm cuvette)을 이용하여 BIO-RAD사의 펄서(2.5kv, 25 ㎌, 200Ω)로 형질전환시켰다. 그 후, CM-broth 배지 1ml을 첨가한 후에 바로 46℃에서 6분 동안 예열(pre-warmming)하고, 200 rpm , 30℃에서 2 시간 동안 진탕배양을 한 후, 카나마이신 (25㎍/ml)이 포함되어진 BHIS (Brain Heart Infusion) 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 40시간 동안 정치하였다.

상기 생성된 콜로니들은 2차 재조합에 이용하기 위해 200 ㎕ BHIS 배지에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 밤새 배양하였으며, 그 배양액을 1:1000으로 희석하여 10% 스트렙토마이신(40ug/ml)이 포함된 CM 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 72시간 동안 정치한 후, 생성된 콜로니를 다시 카나마이신의 내성이 없는지 확인한 다음, 상기 서열번호 38 및 39의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하고, DNA 시퀀싱으로 최종 확인하였다.

상기와 같이 제작된 균주를 "코리네박테리움 글루타미쿰 Corynebacterium glutamicum C123"이라고 명명하고, 2012년 11월 13일자로, 한국생명자원센터 (KCTC)에 기탁번호 KCTC12307BP로 기탁되었다.

< 실시예 7> 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 C1 , 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 C12 및 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 C123을 이용한 L-라이신의 생산

L-라이신 생산을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10065 균주 및 상기 실시예 4에서 제작된, 재조합 벡터(PK-cassette1)로 형질 전환된 라이신 생산균주 C. glutamicum C1으로 하는 것, 실시예 5에서 제작된, 재조합 벡터(PK-cassette2)로 형질전환된 라이신 생산균주 C. glutamicum C2로 하는 것 및 실시예 6에서 라이신 생합성 관련 13종류의 유전자가 sod promoter에 의해서 동시에 발현이 가능하도록 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 C123 을 아래와 같이 배양하였다.

CM 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]를 10 ml 함유한 100ml 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065와 코리네박테리움 글루타미쿰 C123 (KCTC12307BP)를 접종하고, 30℃에서 16시간, 180 rpm의 조건으로 진탕 배양하였다.

100 ml 플라스크에 하기의 L-라이신 배지를 10ml 첨가하여 CM 배지에서 진탕 배양된 세포 1ml을 접종하고, 30℃, 180 rpm, 96시간의 조건으로 진탕 배양하였다.

배양 종료 후 라이신 분석은 오르쏘-프탈아데하이드(o-phthalaldehyde)를 유도체화 시킨 후(Hill DW et al., 1979. Anal Chem 51:1338), HPLC (Shimazu, Japan)로 L-라이신의 생산량을 측정한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KFCC10065보다 PK-cassette1을 삽입한 균주의 L-라이신이 5.8%, PK-cassette1과 PK-cassette2를 삽입한 균주의 L-라이신이 8.1% 가량 그리고 PK-cassette1, PK-cassette2 및 PK-cassette3를 삽입한 균주의 L-라이신이 15% 증가된 것을 확인할 수 있었다.

이는 C. glutamicum C12가 C. glutamicum C1보다 L-라이신이 2% 증가되었고, 최종 C. glutamicum C123 (KCTC12307BP)이 C. glutamicum C12보다 L-라이신이 6.3% 증가된 것을 확인할 수 있었다.

[L-라이신 배지 조성 (pH 7. 0)]

당밀 16g, 원당 51g, (NH₄)₂SO₄ 30g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄-7H₂O 1g, FeSO₄-7H₂O 10mg, MnSO₄-5H₂O 10mg, Thiamine 1mg, Biotin 1mg, CaCO₃ 5% (증류수 1L 기준)

본 발명에 의한 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 목적 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포는 목적 유전자들 이 동시 발현되고, 목적 유전자의 발현이 그 내재적 발현보다 증가된 특성을 지니므로, -라이신, L-아르기닌, L-트레오닌 등의 다양한 아미노산 및 핵산 등의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC12307BP 20121113

<110> Paik Kwang Ind. Co. Ltd <120> Recombinant vector comprising sod promoter derived from coryneform bacteria, transformed host cell and method for producing amino acid using the same <130> 9013_div <160> 39 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 746 <212> DNA <213> Cotynebacterim glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(746) <223> ask <400> 1 agggaatcaa ggttggcgtt ctcggagcca aaggccgtgt tggtcaaact attgtggcag 60 cagtcaatga gtccgacgat ctggagcttg ttgcagagat cggcgtcgac gatgatttga 120 gccttctggt agacaacggc gctgaagttg tcgttgactt caccactcct aacgctgtga 180 tgggcaacct ggagttctgc atcaacaacg gcatttctgc ggttgttgga accacgggct 240 tcgatgatgc tcgtttggag caggttcgcg actggcttga aggaaaagac aatgtcggtg 300 ttctgatcgc acctaacttt gctatctctg cggtgttgac catggtcttt tccaagcagg 360 ctgcccgctt cttcgaatca gctgaagtta ttgagctgca ccaccccaac aagctggatg 420 caccttcagg caccgcgatc cacactgctc agggcattgc tgcggcacgc aaagaagcag 480 gcatggacgc acagccagat gcgaccgagc aggcacttga gggttcccgt ggcgcaagcg 540 tagatggaat cccggttcat gcagtccgca tgtccggcat ggttgctcac 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720 atccacagcg aactgggcgt tgcccttcct gaactggatc tcggtggcgg atacggcatt 780 gcctataccg cagctgaaga accactcaac gtcgcagaag ttgcctccga cctgctcacc 840 gcagtcggaa aaatggcagc ggaactaggc atcgacgcac caaccgtgct tgttgagccc 900 ggccgcgcta tcgcaggccc ctccaccgtg accatctacg aagtcggcac caccaaagac 960 gtccacgtag acgacgacaa aacccgccgt tacatcgccg tggacggagg catgtccgac 1020 aacatccgcc cagcactcta cggctccgaa tacgacgccc gcgtagtatc ccgcttcgcc 1080 gaaggagacc cagtaagcac ccgcatcgtg ggctcccact gcgaatccgg cgatatcctg 1140 atcaacgatg aaatctaccc atctgacatc accagcggcg acttccttgc actcgcagcc 1200 accggcgcat actgctacgc catgagctcc cgctacaacg ccttcacacg gcccgccgtc 1260 gtgtccgtcc gcgctggcag ctcccgcctc atgctgcgcc gcgaaacgct cgacgacatc 1320 ctctcactag aggcataa 1338 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-1F <400> 14 ggggtaccgc gtttcctggc gaagacgctg 30 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-1R <400> 15 cccgagctcg atagcattgc agaaggatat g 31 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-2F <400> 16 ataagaatgc ggccgcagct gccaattatt ccgggcttg 39 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-2R <400> 17 cccgagctcg gaattccata tgcggccaca gcctttaaac gctc 44 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-3F <400> 18 ggaattccat atgagctgcc aattattccg ggcttg 36 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-3R <400> 19 cccgagctcg actagtgctt ctggtgggcc cgccttg 37 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-4F <400> 20 gactagtagc tgccaattat tccgggct 28 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-4R <400> 21 cccgagctcg gggtacccac cctctgaaaa ggctaaaag 39 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-5F <400> 22 tctccaatgt atcttttgcg g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-5R <400> 23 acgattatct gtggagcgtc c 21 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-6F <400> 24 gctgtagacc gatttcagag gggcggagc 29 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-6R <400> 25 gggtaccata agaatgcggc cgcctacgat tggcatcaag tttc 44 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-7F <400> 26 ataagaatgc ggccgcgagg ttgaggcggt tgcgc 35 <210> 27 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-7R <400> 27 cgggatcccg ggaattcaag caaaaaaccg ccgaccacaa tgg 43 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-8F <400> 28 ggaattcagc tgccaattat tccgggcttg tgac 34 <210> 29 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-8R <400> 29 gggtaccgac tagtgaattc catatgctca caatctaagg tgac 44 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-9F <400> 30 ggaattccat atgagctgcc aattattccg ggcttgt 37 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-9R <400> 31 gctctagagc gaagatctag tgttgtattt ctccttagac gg 42 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-10F <400> 32 gcttcaactg gccacatcac 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-10R <400> 33 gttccgatgt ttcagctgc 19 <210> 34 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-11F <400> 34 cggggcccaa agcggcttaa agtttggctg cc 32 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-11R <400> 35 gctctagaga ctagtaagcc ccgcctcctc catgag 36 <210> 36 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-12F <400> 36 gctctagaga ctagtagctg ccaattattc cgggct 36 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-12R <400> 37 ctgcagcgaa actgaactca tgggtaaaaa atcctttcgt ag 42 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer_PKP-13F <400> 38 ccatgacgat cgtaaaagcg c 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer_PKP-13R <400> 39 gaaagaccta ctcggttaag c 21

Claims (14)

1. 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 6의 fbp 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 7의 gnd 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 8의 tkt 유전자, 서열번호 9의 tal 유전자, 서열번호 10의 zwf 유전자 및 서열번호 11의 opcA 유전자 오페론을 포함하는 재조합 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 제3도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette2인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
3. 제1항의 재조합 벡터; 및
   코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
4. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포가 아미노에틸-L-시스테인 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
5. 삭제
6. 제3항에 있어서, 상기 숙주세포는 ask, asd, dapB, dapA, ddh, fbp, gnd, tkt, tal, zwf 및 opcA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
7. 제6항에 있어서, 상기 ask, asd, dapB, dapA, ddh, fbp, gnd, tkt, tal, zwf 및 opcA 유전자가 동시에 발현되는 것을 특징으로 하는 숙주세포.
8. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
9. 제3항에 있어서, 상기 제1항의 재조합 벡터가 제3도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette2인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
10. 제3항에 있어서, 상기 코리네형 세균 유래의 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 1의 ask 유전자 및 서열번호 2의 asd 유전자 오페론, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 3의 dapB 유전자, 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 4의 dapA 유전자, 및 상기 sod 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 서열번호 5의 ddh 유전자를 포함하는 재조합 벡터가, 제2도에 개시된 개열지도를 갖는 pPK-cassette1인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
11. 제3항의 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 아미노산이 L-라이신인 것을 특징으로 하는 생산방법.
13. 제8항의 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 아미노산이 L-라이신인 것을 특징으로 하는 생산방법.

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