JP2018531033A6 - L−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてl−イソロイシンを生産する方法 - Google Patents
L−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いてl−イソロイシンを生産する方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物、及びそれを用いてL−イソロイシンを生産する方法に関する。
Description
本出願は、L−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物及びこれを用いてL−イソロイシンを生産する方法に関する。
分岐鎖アミノ酸(branched−chain amino acid)は、L−バリン、L−ロイシン、及びL−イソロイシン3種を指すもので、食品添加物、薬学剤などの用途に産業的に用いられる。特に、L−イソロイシンは筋肉で代謝されてエネルギーを生成し、ヘモグロビンの生成に関与して疲労軽減と成長促進機能をする。これにより、輸液製剤及び栄養剤などに多様に用いられており、スポーツ栄養食品にも使用が増加している。
微生物を用いたL−イソロイシンの生合成は、ピルビン酸(pyruvate)と、2−ケト酪酸(2−ketobutyrate)を前駆体として使用して、3つの中間代謝物質を経て合成される(非特許文献1)。
しかし、L−イソロイシン生合成段階中のL−トレオニンから2−ケト酪酸を生成するトレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase、遺伝子ilvA)と、次の段階のアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase、遺伝子ilvBN)はすべてL−イソロイシンによってフィードバック阻害を受ける。
したがって、L−イソロイシンによるフィードバック解除を介して生合成に関与する酵素を調節することが高収率のL−イソロイシン生産菌株を製作するのに重要な要素であることが分かる(非特許文献2)。これに加え、分岐鎖アミノ酸は、ピルビン酸(pyruvate)まで同様の生合成経路を介して生成されるため、高収率のL−イソロイシンを大量生産するためには、2−ケト酪酸の前段階であるL−トレオニンの円滑な供給がなされるべきである(特許文献1)。
Jinhwan Park et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 85: 491-506, 2010
Jinhwan Park et al., Biotechnology Journal, 560-577, 2010
Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999
Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004
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Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991
Schreiner et al., J Bacteriol. 187: 6005-18, 2005
本発明者らはL−トレオニンを前駆体として利用しない新規生合成経路を検討していた中、シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有する遺伝子をL−イソロイシン生合成経路に導入した結果、L−イソロイシン生産が向上されたことを確認し、本出願を完成した。
本出願の目的は、新規生合成経路が導入されたL−イソロイシン生産能を有する組み換え微生物を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記新規生合成経路が導入された組み換え微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地からL−イソロイシンを回収する段階を含む、L−イソロイシンを生産する方法を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記新規生合成経路が導入された組み換え微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地からL−イソロイシンを回収する段階を含む、L−イソロイシンを生産する方法を提供することにある。
本出願のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼ活性が導入されてL−トレオニンを前駆体として利用しない新しい生合成経路を介してL−イソロイシンを高収率で生産しうる。
前記目的を達成するために、本出願の一態様は、シトラマレートシンターゼ活性を有するタンパク質を含むL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属微生物を提供する。
本出願で用語、「L−イソロイシン」は、必須アミノ酸の一つであり、構造的にL−バリン、L−ロイシンと共に分岐鎖アミノ酸に該当する化学式HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3であるL−アミノ酸を意味する。
本出願で用語、「L−イソロイシン生産能を有する」とは、該当微生物が培地で培養されるときの培地または微生物内にL−イソロイシンを蓄積できる能力を示すことを意味する。このようなL−イソロイシン生成能は野生型菌株によって保有された特性であるか、または菌株の改良によって付与または増強された特性であってもよい。
例えば、L−イソロイシン生産能を有するために、該当微生物は栄養要求性変異株、アナログ耐性変異株、または代謝制御変異株の取得、またはL−イソロイシン生合成関連酵素の活性を強化させるなどの組み換え変異株の製作などの微生物の変形に用いられる方法を単独または組み合わせて適用してもよい。
また、L−イソロイシン生合成に関連する酵素活性を強化する場合、強化されるL−イソロイシン生合成に関与する遺伝子、具体的にはilvG、ilvM、ilvE、ilvD及びilvA遺伝子は、単独または2種以上で組み合わせて強化されてもよい。前記ilvG、ilvM、ilvE、ilvD及びilvA遺伝子は、それぞれアセトヒドロキシ酸シンターゼのアイソザイムIIの大型サブユニット、小型サブユニット、トランスアミナーゼ、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ及びトレオニンデアミナーゼを暗号化する。
本出願で用語、「シトラマレートシンターゼ(EC2.3.1.182)」は、アセチルCoAとピルビン酸をシトラマレート及びコエンザイムA(coenzyme A)に変換する過程を触媒する酵素である。この酵素は、メタノカルドコッカス・ヤナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)(非特許文献3)、レプトスピラ・インタロガンス(Leptospira interogans)(非特許文献4)、ゲオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens)などの古細菌類で発見され、イソロイシン生合成のトレオニン非依存型経路に関与する(非特許文献5)。前記酵素は基質としてのピルビン酸に対する特異性が高く、典型的にイソロイシンによって阻害されることが公知されている。
本出願で用語、「シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質」及び「それをコードする遺伝子」には、前記のようなシトラマレートシンターゼの活性を有する任意のタンパク質及びこれをコードする任意の遺伝子が制限なく含まれてもよい。
具体的には、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質はメタノカルドコッカス由来であってもよく、より具体的には、メタノカルドコッカス・ヤナシイ由来であってもよい。前記シトラマレートシンターゼは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするcimA遺伝子は、配列番号2に記載される塩基配列を有する。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列の違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性(degeneracy)により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記開示された配列番号に限定されない。
また、実質的に配列番号1のアミノ酸配列と70%以上、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もっと具体的には98%以上の相同性を示すアミノ酸配列として実質的にシトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
さらに、前記配列と相同性を有する配列として実質的に配列番号1のタンパク質と同一または相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願の範囲に含まれるのは自明である。
また、前記シトラマレートシンターゼをコードする遺伝子は、配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。前記ポリヌクレオチドはコドンの縮退性(degeneracy)により、または前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。前記ポリヌクレオチド配列は、例えば、配列番号2のポリヌクレオチド配列を有してもよく、それと相同性が80%、具体的には90%以上、より具体的には99%以上の塩基配列を有してもよい。しかし、これに限定されない。
また、前記シトラマレートシンターゼの活性が向上された変異型を収得するために、配列番号1のタンパク質の変異型として本出願は、エラープローンPCRを用いて収得されたCimA(M)突然変異ライブラリーを提供する。
具体的には、本出願によるCimA(M)突然変異ライブラリーは
配列番号3のアミノ酸配列を有するCimA(M)m1(具体的に配列番号4の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号5のアミノ酸配列を有するCimA(M)m2(具体的に配列番号6の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号7のアミノ酸配列を有するCimA(M)m3(具体的に配列番号8の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号9のアミノ酸配列を有するCimA(M)m4(具体的に配列番号10の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号11のアミノ酸配列を有するCimA(M)m5(具体的に配列番号12の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号13のアミノ酸配列を有するCimA(M)m6(具体的に配列番号14の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);及び
配列番号15のアミノ酸配列を有するCimA(M)m7(具体的に配列番号16の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる)を含んでもよい。
配列番号3のアミノ酸配列を有するCimA(M)m1(具体的に配列番号4の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号5のアミノ酸配列を有するCimA(M)m2(具体的に配列番号6の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号7のアミノ酸配列を有するCimA(M)m3(具体的に配列番号8の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
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配列番号11のアミノ酸配列を有するCimA(M)m5(具体的に配列番号12の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);
配列番号13のアミノ酸配列を有するCimA(M)m6(具体的に配列番号14の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる);及び
配列番号15のアミノ酸配列を有するCimA(M)m7(具体的に配列番号16の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされうる)を含んでもよい。
また、実質的に前記配列番号のアミノ酸配列と、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もっと具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列として実質的に前記シトラマレートシンターゼ変異体の活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
本出願で用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、または類似の活性を有するその相同性配列が「%相同性」と示される。例えば、スコア(score)、同一性(identity)及び類似度(similarity)などのパラメータ(parameter)を計算する標準ソフトウェア、具体的にBLAST 2.0を用いたり、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認でき、定義される適切な混成化条件は当該技術の範囲内であり(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 1989参照)、当業者によく知られている方法で決定されうる。
具体的な一実施態様で、本出願の微生物は、メタノカルドコッカス・ヤナシイに由来の下記配列番号1のシトラマレートシンターゼ及びその変異体として配列番号3、5、7、9、11、13及び15で構成された群から選択されるアミノ酸配列のタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。より具体的には、前記遺伝子をそれぞれ含む組み換えベクターを微生物内に形質転換させて目的の遺伝子を発現させることができる。
本出願で使用される用語、「組み換えベクター」は、適切な宿主内で目的タンパク質を発現させるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。組み換えベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそれ自体に統合されてもよい。
本出願で用いられる組み換えベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いて作製されてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及びCharon21Aなどが用いられてもよく、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などが用いられてもよい。本出願に使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく公知の発現ベクターを用いてもよい。具体的には、pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いられてもよい。
一例として、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への導入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組み換えによって行ってもよいが、これに限定されない。
本出願で用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現されることさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これら両方を含みうる。
また、前記で用語、「作動可能に連結」されたということは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(3−isopropylmalate dehydrogenase)及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ(3−isopropylmalate dehydratase)をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「タンパク質の活性の強化」とは、当該タンパク質の活性が野生型または変異前の状態に比べて活性が増加されることを意味する。具体的に、当該タンパク質をコードする内在的遺伝子の活性の増加、内部または外部要因から内在的遺伝子の増幅、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子の導入、発現調節配列の変形、特にプロモーターの交替または変形及び遺伝子内の突然変異によるタンパク質活性の増加等によりその活性が増加されることを含んでもよい。
具体的に、本出願でイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼまたはイソプロピルマレートデヒドラターゼタンパク質の活性を強化させることは、
1)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
2)前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
3)前記酵素の活性が増強されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、または
4)これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
1)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
2)前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
3)前記酵素の活性が増強されるように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失、または
4)これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
前記でポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行われうる。具体的に、本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主とは無関係に複製されて機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることによって行なわれてもよいが、前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行なわれてもよい。
次に、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することは、特に限定されないが、前記発現調節配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含む。
前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、cj7プロモーター(特許文献2及び3)、EF−Tuプロモーター、groELプロモーター、aceAあるいはaceBプロモーターなどがあり、さらに好ましくはコリネバクテリウム由来のプロモーターであるcj7プロモーターと作動可能に連結されて、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させうる。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性を強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、より強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。
本出願で用語、「イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ」及び「イソプロピルマレートデヒドラターゼ」は、L−ロイシン、L−イソロイシン及びL−バリンの生合成経路に関与する酵素であって、これらの活性を有するタンパク質及びこれをコードする遺伝子には、前記のような酵素活性を有する任意のタンパク質及びこれをコードする任意の遺伝子が制限なく含まれてもよい。
具体的に、本出願でイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.85)は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来であってもよい。
一方、本出願のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号17のアミノ酸配列と70%以上、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もって具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号17で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性(degeneracy)により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は開示された配列番号に限定されないが、例えば、配列番号18の塩基配列を有してもよく、これと相同性が80%、具体的には90%以上、より具体的には99%以上の塩基配列を有してもよい。
また、本出願でイソプロピルマレートデヒドラターゼ(EC4.2.1.33)は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来であってもよい。一方、本出願のイソプロピルマレートデヒドラターゼは、2つの小単位(small/large subunits)で構成され、これらそれぞれは、配列番号19及び配列番号21に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号19及び21のアミノ酸配列と70%以上、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もっと具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にイソプロピルマレートデヒドラターゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記イソプロピルマレートデヒドラターゼをコードする遺伝子は、配列番号19及び配列番号21で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性(degeneracy)により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は、開示された配列番号に限定されない。例えば配列番号20及び配列番号22の塩基配列を有してもよく、この相同性が80%、具体的には90%以上、より具体的には99%以上の塩基配列を有してもよい。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は、活性が強化されたL−イソロイシン生合成経路に関与する酵素をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「L−イソロイシン生合成経路に関与する酵素」には、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase、lysC遺伝子)、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate−β−semialdehyde dehydrogenase、asd遺伝子)、ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase、hom遺伝子)、ホモセリンキナーゼ(homoserine kinase、thrB遺伝子)、トレオニンシンターゼ(threonine synthase、thrC遺伝子)、トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase、ilvA遺伝子)、アミノトランスフェラーゼ(aminotransferase、ilvE遺伝子)などが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
本出願で用語、「L−イソロイシン生合成経路に関与する酵素」には、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase、lysC遺伝子)、アスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate−β−semialdehyde dehydrogenase、asd遺伝子)、ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase、hom遺伝子)、ホモセリンキナーゼ(homoserine kinase、thrB遺伝子)、トレオニンシンターゼ(threonine synthase、thrC遺伝子)、トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase、ilvA遺伝子)、アミノトランスフェラーゼ(aminotransferase、ilvE遺伝子)などが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
一方、本出願の具体的な実施態様で、コリネバクテリウム属微生物は、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)をさらに含んでもよい。
本出願で用語、「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.2.4.1)」は、ピルビン酸をアセチルCoA及びCO2に転換させる酵素である。本出願では、cimA遺伝子の前駆体として用いられるアセチルCoAの供給を増加させるために、前記酵素をコードするaceE遺伝子が欠損された菌株を製造することができる。
具体的に、本出願でピルビン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.2.4.1)は、コリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)由来であってもよい。一方、本出願のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号25に記載されるアミノ酸配列を有するものであってもよい。また、実質的に配列番号25のアミノ酸配列と70%以上、具体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もっと具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列として、実質的にピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。
また、前記ピルビン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号25で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有してもよい。微生物の種または菌株に応じて前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在するか、または遺伝子コードの縮退性(degeneracy)により機能的に同様の多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードしうるため、前記遺伝子は開示された配列番号に限定されない。例えば、配列番号26の塩基配列を有してもよく、これと相同性が80%、具体的には90%以上、より具体的には99%以上の塩基配列を有してもよい。
本出願で用語、「不活性化」とは、該当ポリペプチドをコードする遺伝子が発現されないか、遺伝子発現において不完全な発現による活性の減少を示したり、発現されても機能性のある該当ポリペプチドを生産しないことを意味する。
また、当該ポリペプチドをコードする遺伝子が完全に不活性化されているだけでなく、その発現レベルが著しく低くて実質的に発現しないものも含まれる意味である。したがって、遺伝子不活性化は、完全(ノックアウト)されたり、部分的(例えば、遺伝子が正常の発現レベル未満を示す低次形遺伝子(hypomorph)またはこれが影響を与える活性において部分的な減少を示す突然変異体遺伝子の生成物)であってもよい。
さらに、本出願で該当ポリペプチドの「不活性化」には、変形されない菌株に比べて、該当ポリペプチドの活性が減少されたことだけでなく、その活性が削除された場合も含む。具体的に、本出願でトレオニンデヒドラターゼの不活性化は、
1)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
2)前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
3)前記タンパク質の活性が弱化するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、または
4)これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
1)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体の欠失、
2)前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の変形、
3)前記タンパク質の活性が弱化するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形、または
4)これらの組み合わせから選択された方法で行なわれてもよいが、特にこれに限定されない。
前記でタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全体を欠失する方法は、細菌内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に置換することによって行われてもよい。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には1〜300個、より具体的には1〜100個、さらに具体的には1〜50個であってもよい。
次に、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を変形する方法は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をより弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することによって行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含んでもよく、これに限定されない。
また、染色体上のポリヌクレオチド配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をより弱化するようにポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することにより行ってもよく、これに限定されない。
本出願の別の具体的実施態様で、イソロイシン生産能を有する微生物は、前記シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質が導入されて発現されうる微生物であれば、制限なく本出願の範囲に含まれてもよい。例としては、エシェリキア属(Escherichia sp.)、赤痢菌属(Shigella sp.)、シトロバクター属(Citrobacter sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、エンテロバクター属(Enterobacter sp.)、エルシニア属(Yersinia sp.)、クレブシエラ属(Klebsiella sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium sp.)、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、セレノモナス属(Selenomonas sp.)、ビブリオ属(Vibrio sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、ストレプトマイセス属(Streptomyces sp.)、アルカノバクテリウム属(Arcanobacterium sp.)、アルカリゲネス属(Alcaligenes sp.)など属する微生物であってもよい。具体的に、本出願の微生物はコリネバクテリウム属に属する微生物であり、より具体的にコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これに限定されない。
本出願の別の態様は、
シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び
前記微生物または培地からL−イソロイシンを回収する段階を含む、L−イソロイシン生産方法を提供する。
シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び
前記微生物または培地からL−イソロイシンを回収する段階を含む、L−イソロイシン生産方法を提供する。
前記方法において、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属微生物は、先に説明した通りである。
簡単に説明すると、前記コリネバクテリウム属微生物は、メタノカルドコッカス(Methanocaldococcus)由来のシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよく、具体的には配列番号1、3、5、7、9、11、13及び15で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有するシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよい。
簡単に説明すると、前記コリネバクテリウム属微生物は、メタノカルドコッカス(Methanocaldococcus)由来のシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよく、具体的には配列番号1、3、5、7、9、11、13及び15で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有するシトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよい。
また、本出願によるコリネバクテリウム属微生物は、イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(3−isopropylmalate dehydrogenase)及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ(3−isopropylmalate dehydratase)の活性がさらに強化されたものであってもよい。さらに、前記コリネバクテリウム属微生物は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)の活性がさらに不活性化されたものであってもよい。
具体的に、本出願の一例によるコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼをコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。
前記方法において、本出願によるコリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行なわれてもよい。
このとき、培養条件は、特に限定されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて、適正pH(例えば、pH5〜9、具体的にはpH6〜8)を調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。
酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよく、培養温度は20〜45℃、具体的には25〜40℃を維持してもよい。培養は、目的のL−イソロイシンの生成量が最大に得られるまで続き、この目的を達成するために、通常10〜160時間培養してもよい。前記培養によって生産されたL−イソロイシンは培地中に分泌されるか、または細胞内に残留してもよい。
また、使用される培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース)、油脂及び脂肪(例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸)、アルコール(例えば、グリセロール及びエタノール)及び有機酸(例えば、酢酸)などを個別に使用したり、または混合して使用してもよい。しかし、これに限定されるものではない。
窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア)、または無機化合物(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム)などを個別に使用したり、または混合して使用してもよい。しかし、これに限定されるものではない。
リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用してもよいが、これに限定されるものではない。また、その他の金属塩(例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄)、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよいが、これに限定されるものではない。
本出願の具体的な実施態様でイソロイシンを生産する方法は、前記コリネバクテリウム属微生物の培養段階で酢酸がさらに供給されてもよい。
前記方法において、培養段階で生産されたL−イソロイシンを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが使用されてもよいが、これらに限定されるものではない。
前記方法において、培養段階で生産されたL−イソロイシンを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などによって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが使用されてもよいが、これらに限定されるものではない。
本出願の別の態様は、
シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物のイソロイシン生産用途を提供する。
シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物のイソロイシン生産用途を提供する。
前記用途において、シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属微生物は、先に説明した通りである。
前記で説明したように、本出願のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼの活性が導入されてL−トレオニンを前駆体として用いない新しい生合成経路を介してL−イソロイシンを高収率で生産することができる。
前記で説明したように、本出願のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、シトラマレートシンターゼの活性が導入されてL−トレオニンを前駆体として用いない新しい生合成経路を介してL−イソロイシンを高収率で生産することができる。
(実施例)
実施例1:メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子を含む組み換えベクターの作製
<1−1>メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子断片の準備
シトラマレートシンターゼをコードするcimA遺伝子(NC_000909.1)のオープンリーディングフレーム(ORF)を含む1476bp断片を得るために、ジェノミックチップシステム(Genomic−tip system、Qiagen)を用いて、メタノカルドコッカス・ヤナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)DSM 2661からゲノムDNAを抽出した。
実施例1:メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子を含む組み換えベクターの作製
<1−1>メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子断片の準備
シトラマレートシンターゼをコードするcimA遺伝子(NC_000909.1)のオープンリーディングフレーム(ORF)を含む1476bp断片を得るために、ジェノミックチップシステム(Genomic−tip system、Qiagen)を用いて、メタノカルドコッカス・ヤナシイ(Methanocaldococcus jannaschii)DSM 2661からゲノムDNAを抽出した。
メタノカルドコッカス・ヤナシイDSM 2661由来のシトラマレートシンターゼは配列番号1に記載される491個のアミノ酸配列を有し、これをコードするcimA遺伝子は、配列番号2に記載される塩基配列を有する。
前記で抽出されたgDNAを鋳型にして、下記配列番号35及び36のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「CimA(M)断片」と命名した。
プライマーcimA−5−NdeI(配列番号35):
5’−GCATCATATGATGGTAAGGATATTC−3’
プライマーcimA−3−XbaI(配列番号36):
5’−CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT−3’
<1−2>組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)の製作
公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターcj7を含むp117−cj7−gfpを鋳型としてPCRを行った(特許文献2)。ここで、「p117」は、大腸菌コリネバクテリウムシャトルベクター(E.coli−Corynebacterium shuttle vector)であるpECCG117(非特許文献6)を示すものである。前記PCR反応は、下記配列番号27及び28のプライマー対を用いて95℃で30秒の変性、56℃で20秒のアニーリング、及び72℃で30秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
プライマーcimA−5−NdeI(配列番号35):
5’−GCATCATATGATGGTAAGGATATTC−3’
プライマーcimA−3−XbaI(配列番号36):
5’−CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT−3’
<1−2>組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)の製作
公知のコリネバクテリウム属微生物由来のプロモーターcj7を含むp117−cj7−gfpを鋳型としてPCRを行った(特許文献2)。ここで、「p117」は、大腸菌コリネバクテリウムシャトルベクター(E.coli−Corynebacterium shuttle vector)であるpECCG117(非特許文献6)を示すものである。前記PCR反応は、下記配列番号27及び28のプライマー対を用いて95℃で30秒の変性、56℃で20秒のアニーリング、及び72℃で30秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、323bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「cj7断片」と命名した。
プライマーPcj7−5−KpnI(配列番号27):
5’−GATGGTACCACCCCAGAAACATCCCAGC−3’
プライマーPcj7−3 NdeI(配列番号28):
5’−CGATCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG−3’
前記で準備したcj7断片と前記実施例<1−1>で作製したCimA(M)断片を鋳型にして、配列番号27及び36のプライマー対を用いて融合(sewing)PCRを行った。PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
プライマーPcj7−5−KpnI(配列番号27):
5’−GATGGTACCACCCCAGAAACATCCCAGC−3’
プライマーPcj7−3 NdeI(配列番号28):
5’−CGATCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG−3’
前記で準備したcj7断片と前記実施例<1−1>で作製したCimA(M)断片を鋳型にして、配列番号27及び36のプライマー対を用いて融合(sewing)PCRを行った。PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1799bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「cj7−CimA(M)断片」と命名した。
前記で収得したcj7−CimA(M)断片を制限酵素KpnI及びXbaIで処理した後、同じ制限酵素で処理された線形p117断片とライゲーション(ligation)した。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌DH5α細胞に熱ショックで形質転換(heat shock transformation、以下同一)させ、これをカナマイシン25μg/mlを含有するLB固体培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン25μg/mlを含有するLB液体培地3mlに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキット(Qiagen、カタログ#27104、以下同一)を用いてプラスミドDNAを回収した。
組み換えベクターの作製有無は制限酵素KpnI及びXbaIで処理して確認し、下記配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「p117−cj7−CimA(M)」と命名した。
プライマー117−F(配列番号29):
5’−CCACAGCCGACAGGATGGTGA−3’
プライマー117−R(配列番号30):
5’−CTCAGGGTGTAGCGGTTCGGT−3’
<1−3>2−ケト酪酸の生合成経路に関与するleuBCD遺伝子断片の準備
2−ケト酪酸の生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(3−isopropylmalate dehydrogenase)及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ(3−isopropylmalate dehydratase)をコードするleuBCD遺伝子断片を下記のように準備した。
5’−CCACAGCCGACAGGATGGTGA−3’
プライマー117−R(配列番号30):
5’−CTCAGGGTGTAGCGGTTCGGT−3’
<1−3>2−ケト酪酸の生合成経路に関与するleuBCD遺伝子断片の準備
2−ケト酪酸の生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(3−isopropylmalate dehydrogenase)及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ(3−isopropylmalate dehydratase)をコードするleuBCD遺伝子断片を下記のように準備した。
まず、イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.85)をコードするleuB遺伝子のORFを含む1359bp断片を得るために、ジェノミックチップシステム(Qiagen)を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032からのゲノムDNAを抽出した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来のイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼは、配列番号17に記載される340個のアミノ酸配列を有し、これをコードするleuB遺伝子は、配列番号18に記載される塩基配列を有する。
前記で抽出されたgDNAを鋳型にして、下記配列番号31及び32のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「leuB断片」と命名した。
プライマーleuB−5−cimA(配列番号31):
5’−TTGTTGAATTAATCTAGAGGTGACACCCCAGTGG−3’
プライマーleuB−3−leuC(配列番号32):
5’−TCGCAGCTGCCACCGATATTTAGCTTTGCAGCGC−3’
イソプロピルマレートデヒドラターゼ(EC4.2.1.33)をコードするleuCD遺伝子のORFを含む2078bp断片を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のgDNAを鋳型にしてPCRを行った。
プライマーleuB−5−cimA(配列番号31):
5’−TTGTTGAATTAATCTAGAGGTGACACCCCAGTGG−3’
プライマーleuB−3−leuC(配列番号32):
5’−TCGCAGCTGCCACCGATATTTAGCTTTGCAGCGC−3’
イソプロピルマレートデヒドラターゼ(EC4.2.1.33)をコードするleuCD遺伝子のORFを含む2078bp断片を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のgDNAを鋳型にしてPCRを行った。
leuC遺伝子はイソプロピルマレートデヒドラターゼの大きな小単位(large subunit)を暗号化し、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来のleuC遺伝子は、配列番号20に記載される塩基配列を有し、これから配列番号19に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。また、leuD遺伝子は、イソプロピルマレートデヒドラターゼの小さな小単位(small subunit)を暗号化し、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来のleuD遺伝子は、配列番号22に記載される塩基配列を有し、これから配列番号21に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
前記PCR反応は、下記配列番号33及び34のプライマー対を用いて95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で80秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、目的のサイズのバンドを溶離して収得し、これを「leuCD断片」と命名した。
プライマーleuC−5−leuB(配列番号33):
5’−GCGCTGCAAAGCTAAATATCGGTGGCAGCTGCGA−3’
プライマーleuD−3−XbaI(配列番号34):
5’−TGGCGGCCGCTCTAGAGCTTTCGCTATCAGACTG−3’
前記で収得したleuB断片とleuCD断片を鋳型にして、配列番号31及び34のプライマー対を用いる融合PCRを行った。PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で120秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
プライマーleuC−5−leuB(配列番号33):
5’−GCGCTGCAAAGCTAAATATCGGTGGCAGCTGCGA−3’
プライマーleuD−3−XbaI(配列番号34):
5’−TGGCGGCCGCTCTAGAGCTTTCGCTATCAGACTG−3’
前記で収得したleuB断片とleuCD断片を鋳型にして、配列番号31及び34のプライマー対を用いる融合PCRを行った。PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で120秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、3437bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「leuBCD断片」と命名した。
<1−4>組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)−leuBCDの製作
2−ケト酪酸生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例<1−2>で作製した組み換えベクターであるp117−cj7−CimA(M)をXbaIで処理し、前記実施例<1−3>で収得したleuBCD断片を制限酵素XbaIで処理した後、これらの2つの断片をライゲーションした。
<1−4>組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)−leuBCDの製作
2−ケト酪酸生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例<1−2>で作製した組み換えベクターであるp117−cj7−CimA(M)をXbaIで処理し、前記実施例<1−3>で収得したleuBCD断片を制限酵素XbaIで処理した後、これらの2つの断片をライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌DH5α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン25μg/mlを含有するLB固体培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン25μg/mlを含有するLB液体培地3mlに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドDNAを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素XbaIで処理して確認し、前記配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で180秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。このことから収得した組み換えベクターを「p117−cj7−CimA(M)−leuBCD」と命名した。
<1−5>エラープローンPCRを用いたCimA(M)変異体断片の準備
cimA遺伝子にランダム変異が導入されたDNAプール(pool)を確保するために、前記実施例<1−1>で収得したCimA(M)断片を鋳型にして、多様化PCRランダム突然変異化キット(diversify PCR random mutagenesis kit、Clonetech、カタログ#630703)を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、製品のユーザーマニュアルの表III内の突然変異化反応4を条件にして行われた。そのために、下記配列番号35及び36のプライマー対を用い、95℃で30秒の変性と68℃で30秒の伸長過程を25回繰り返し行った。
cimA遺伝子にランダム変異が導入されたDNAプール(pool)を確保するために、前記実施例<1−1>で収得したCimA(M)断片を鋳型にして、多様化PCRランダム突然変異化キット(diversify PCR random mutagenesis kit、Clonetech、カタログ#630703)を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、製品のユーザーマニュアルの表III内の突然変異化反応4を条件にして行われた。そのために、下記配列番号35及び36のプライマー対を用い、95℃で30秒の変性と68℃で30秒の伸長過程を25回繰り返し行った。
このことから、塩基置換変異がランダムに導入されたCimA(M)遺伝子変異体のプール(mutated art cimA DNA pool)をPCR結果物として収得した。前記PCR結果物(以下、「CimA(M)m断片」と命名した)を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、溶離して収得した。
プライマーcimA−5−NdeI(配列番号35):
5’−GCATCATATGATGGTAAGGATATTC−3’
プライマーcimA−3−XbaI(配列番号36):
5’−CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT−3’
<1−6>p117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリーの作製
前記実施例<1−2>で作製した組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)を制限酵素NdeIとXbaIで処理した後、同じ制限酵素で処理された前記実施例<1−5>で収得されたCimA(M)m断片とライゲーションした。
5’−GCATCATATGATGGTAAGGATATTC−3’
プライマーcimA−3−XbaI(配列番号36):
5’−CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT−3’
<1−6>p117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリーの作製
前記実施例<1−2>で作製した組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)を制限酵素NdeIとXbaIで処理した後、同じ制限酵素で処理された前記実施例<1−5>で収得されたCimA(M)m断片とライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターを大腸菌DH5α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン25μg/mlを含有するLB固体培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。前記培養したコロニーを集めてプラスミドミニプレップキットを用いプラスミドDNAを回収して、「p117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリー」を作製した。
実施例2:cimA遺伝子導入を通じたL−イソロイシン生産能付与の確認
メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムに導入した場合、L−イソロイシン生産能が付与されるかどうかを確認するために、まず、トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)をコードするilvA遺伝子が除去された菌株を作製し、この菌株にcimA遺伝子を導入してL−イソロイシン生産能が回復されるかどうかを確認した。
メタノカルドコッカス由来のcimA遺伝子をコリネバクテリウム・グルタミカムに導入した場合、L−イソロイシン生産能が付与されるかどうかを確認するために、まず、トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)をコードするilvA遺伝子が除去された菌株を作製し、この菌株にcimA遺伝子を導入してL−イソロイシン生産能が回復されるかどうかを確認した。
トレオニンデヒドラターゼは、L−イソロイシン生合成の前駆体であるL−トレオニンを2−ケト酪酸に転換させる酵素である。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来のトレオニンデヒドラターゼは、配列番号23に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするilvA遺伝子は、配列番号24に記載される塩基配列を有する。また、実質的にトレオニンデヒドラターゼ活性を有するタンパク質であれば、制限なく本出願の範囲に含まれる。
<2−1>ilvA遺伝子欠損ベクターの製作
ilvA遺伝子の断片を得るために、ジェノミックチップシステム(Qiagen)を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号37及び38のプライマー対と、配列番号39及び40のプライマー対とを用いてそれぞれPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で45秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
ilvA遺伝子の断片を得るために、ジェノミックチップシステム(Qiagen)を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号37及び38のプライマー対と、配列番号39及び40のプライマー対とを用いてそれぞれPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で45秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、それぞれ547bp及び467bpサイズのバンドを溶離して収得した。
前記で収得したilvA遺伝子の両断片を鋳型にして、下記配列番号37及び40のプライマー対を用いる融合PCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
前記で収得したilvA遺伝子の両断片を鋳型にして、下記配列番号37及び40のプライマー対を用いる融合PCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1014bpサイズのバンドを溶離収得した。このように収得されたilvA遺伝子が欠損された断片を「DilvA」と命名した。
前記で収得したDilvA断片を制限酵素XbaIで処理した後、同じ制限酵素でpDZベクター(特許文献4)を処理して得られた線形pDZ断片とライゲーションしてilvA遺伝子欠損組み換えベクターを作製した。
このように製作された組み換えベクターを大腸菌DH5α細胞に熱ショックで形質転換させ、これをカナマイシン25μg/mlを含有するLB固体培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン25μg/mlを含有するLB液体培地3mlに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドDNAを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素XbaIで処理して確認し、下記配列番号41及び42のプライマー対を用いて、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「pDZ−ilvA(Del)」と命名した。
プライマーilvA−5−XbaI(配列番号37):
5’−GCATCTAGAGAACACGGACAATGCCAC−3’
プライマーilvA−Del−R(配列番号38):
5’−CAAACAGCGTGATGTCCTGAGTGAGCTGCGCT−3’
プライマーilvA−Del−F(配列番号39):
5’−AGCGCAGCTCACTCAGGACATCACGCTGTTTG−3’
プライマーilvA−3−XbaI(配列番号40):
5’−GCATCTAGAACCTGCGGCACACCTTGGGC−3’
プライマーTopo−F(配列番号41):
5’−GCAGTGAGCGCAACGCAAT−3’
プライマーTopo−R(配列番号42):
5’−CGTTGTAAAACGACGGCCA−3’
<2−2>ilvA遺伝子欠損菌株の製作
親菌株として、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に前記実施例<2−1>で製造された組み換えベクターであるpDZ−ilvA(Del)を電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
5’−GCATCTAGAGAACACGGACAATGCCAC−3’
プライマーilvA−Del−R(配列番号38):
5’−CAAACAGCGTGATGTCCTGAGTGAGCTGCGCT−3’
プライマーilvA−Del−F(配列番号39):
5’−AGCGCAGCTCACTCAGGACATCACGCTGTTTG−3’
プライマーilvA−3−XbaI(配列番号40):
5’−GCATCTAGAACCTGCGGCACACCTTGGGC−3’
プライマーTopo−F(配列番号41):
5’−GCAGTGAGCGCAACGCAAT−3’
プライマーTopo−R(配列番号42):
5’−CGTTGTAAAACGACGGCCA−3’
<2−2>ilvA遺伝子欠損菌株の製作
親菌株として、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に前記実施例<2−1>で製造された組み換えベクターであるpDZ−ilvA(Del)を電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
このことから2次継代(passage)によりpDZ−ilvA(Del)ベクターが染色体内に導入された菌株をそれぞれ選抜した。前記選抜された各菌株から収得したgDNAを鋳型にして、下記配列番号43及び44のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから、ilvA遺伝子が欠損した菌株を獲得し、これを「ATCC13032△ilvA」菌株と命名した。
プライマーCFilvA(配列番号43):
5’−GATCTGTGATGAGGTGATG−3’
プライマーCRilvA(配列番号44):
5’−CGTCCTTCCATGACTCTCA−3’
<2−3>L−イソロイシン生合成経路に関与する遺伝子断片の準備
L−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のlysC、asd、hom、thrB、thrC及びilvA遺伝子断片を下記のように準備した。
プライマーCFilvA(配列番号43):
5’−GATCTGTGATGAGGTGATG−3’
プライマーCRilvA(配列番号44):
5’−CGTCCTTCCATGACTCTCA−3’
<2−3>L−イソロイシン生合成経路に関与する遺伝子断片の準備
L−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、コリネバクテリウム属微生物由来のlysC、asd、hom、thrB、thrC及びilvA遺伝子断片を下記のように準備した。
まず、アスパラギン酸キナーゼ(aspartate kinase)及びアスパラギン酸−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(aspartate−β−semialdehyde dehydrogenase)をコードするlysC−asd遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号45及び46のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、2666bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「lysC−asd断片」と命名した。
プライマーlysC−5−KpnI(配列番号45):
5’−TGAGGTACCCATGCGATTGTTAATGC−3’
プライマーasd−3−SfoI(配列番号46):
5’−CTAGGCGCCAGTGTAGCACTCAAGCGGA−3’
ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase)及びホモセリンキナーゼ(homoserine kinase)をコードするhom−thrB遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号47及び48のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
5’−TGAGGTACCCATGCGATTGTTAATGC−3’
プライマーasd−3−SfoI(配列番号46):
5’−CTAGGCGCCAGTGTAGCACTCAAGCGGA−3’
ホモセリンデヒドロゲナーゼ(homoserine dehydrogenase)及びホモセリンキナーゼ(homoserine kinase)をコードするhom−thrB遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号47及び48のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で90秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、2633bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「hom−thrB断片」と命名した。
プライマーhom−5−BamHI(配列番号47):
5’−CTAGGATCCCTCACCATTCTCAATGGT−3’
プライマーthrB−3−BamHI(配列番号48):
5’−CTAGGATCCGCCTTCCTTGTTGGGC−3’
トレオニンシンターゼ(threonine synthase)をコードするthrC遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号49及び50のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
5’−CTAGGATCCCTCACCATTCTCAATGGT−3’
プライマーthrB−3−BamHI(配列番号48):
5’−CTAGGATCCGCCTTCCTTGTTGGGC−3’
トレオニンシンターゼ(threonine synthase)をコードするthrC遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号49及び50のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1703bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「thrC断片」と命名した。
プライマーthrC−5−SpeI(配列番号49):
5’−TGCACTAGTGAGAACATACAGGTTCCA−3’
プライマーthrC−3−ilvA(配列番号50):
5’−GGCATTGTCCGTGTTCTTACTTCACGGAAGTG−3’
トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)をコードするilvA遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号51及び52のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
プライマーthrC−5−SpeI(配列番号49):
5’−TGCACTAGTGAGAACATACAGGTTCCA−3’
プライマーthrC−3−ilvA(配列番号50):
5’−GGCATTGTCCGTGTTCTTACTTCACGGAAGTG−3’
トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)をコードするilvA遺伝子のORFを含むDNA断片を得るために、前記実施例<2−1>に記載したように、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032から抽出したゲノムDNAを鋳型にして、下記配列番号51及び52のプライマー対を用いてPCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で60秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1862bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「ilvA断片」と命名した。
プライマーilvA−5−thrC(配列番号51):
5’−CACTTCCGTGAAGTAAGAACACGGACAATGCC−3’
プライマーilvA−3−SpeI(配列番号52):
5’−TGCACTAGTACCTGCGGCACACCTTGGGC−3’
前記で獲得したthrC断片とilvA断片を鋳型にして、配列番号49及び52のプライマー対を用い融合PCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で120秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
プライマーilvA−5−thrC(配列番号51):
5’−CACTTCCGTGAAGTAAGAACACGGACAATGCC−3’
プライマーilvA−3−SpeI(配列番号52):
5’−TGCACTAGTACCTGCGGCACACCTTGGGC−3’
前記で獲得したthrC断片とilvA断片を鋳型にして、配列番号49及び52のプライマー対を用い融合PCRを行った。この時、PCR反応は、95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で120秒の伸長過程を30回繰り返し行った。
このことから増幅されたPCR結果物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、3565bpサイズのバンドを溶離して収得し、これを「thrC−ilvA断片」と命名した。
<2−4>L−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化ベクターの製作
L−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例<2−3>で獲得したlysC−asd断片を制限酵素KpnIとSfoIで処理した後、KpnIとEcoRVで処理された線形p117断片とライゲーションした。
L−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターを製造するために、前記実施例<2−3>で獲得したlysC−asd断片を制限酵素KpnIとSfoIで処理した後、KpnIとEcoRVで処理された線形p117断片とライゲーションした。
前記実施例<1−2>と同様の方法でプラスミドDNAを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で100秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「p117−lysC−asd」と命名した。
前記実施例<2−3>で収得されたhom−thrB断片を制限酵素BamHIで処理した後、BamHIで処理された線形p117−lysC−asd断片とライゲーションした。
前記実施例<1−2>と同様の方法でプラスミドDNAを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で180秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。このことから収得された組み換えベクターを「p117−lysC−asd−hom−thrB」と命名した。
前記実施例<2−3>vthrC−ilvA断片を制限酵素SpeIで処理した後、SpeIで処理された線形p117−lysC−asd−hom−thrB断片とライゲーションした。
前記実施例<1−2>と同様の方法でプラスミドDNAを回収した。組み換えベクターの作製有無は、配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で300秒の過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。
このことから収得された組み換えベクターを「p117−IBGC(IsoleuCine Biosynthesisgenes Cluster)」と命名し、これはL−イソロイシン生合成に関与する6種のlysC、asd、hom、thrB、thrC及びilvA遺伝子断片を含むL−イソロイシン生合成経路の遺伝子強化の組み換えベクターである。
<2−5>L−イソロイシン生産能の比較
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株の実施例<1−2>、<1−4>及び<2−4>で製造した組み換えベクターであるp117−cj7−CimA(M)、p117−cj7−cimA(M)−leuBCD及びp117−IBGCをそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。このことから選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム「ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)」、「ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD」及び「ATCC13032/p117−IBGC」と命名した。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032菌株の実施例<1−2>、<1−4>及び<2−4>で製造した組み換えベクターであるp117−cj7−CimA(M)、p117−cj7−cimA(M)−leuBCD及びp117−IBGCをそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。このことから選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム「ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)」、「ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD」及び「ATCC13032/p117−IBGC」と命名した。
また、前記実施例<2−2>で製造したコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032△ilvA菌株も、前記のようにp117−cj7−CimA(M)及びp117−cj7−CimA(M)−leuBCDをそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。このことから選別された菌株をそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカム「ATCC13032△ilvA/p117−cj7−CimA(M)」及び「ATCC13032△ilvA/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD」と命名した。
このように用意されたコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032、ATCC13032/p117−IBGC、ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)、ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD、ATCC13032△ilvA、ATCC13032△ilvA/p117 −cj7−CimA(M)及びATCC13032△ilvA/p117−cj7−CimA(M)−leuBCDを対象にL−イソロイシン生産性の力価の評価を行った。
具体的に、下記表1の組成のようにブドウ糖が含まれた25mlの力価培地を含有した250ml三角フラスコに、前記菌株をそれぞれ接種した後、これを32℃、200rpmの培養器で30時間培養した。このことから生産されたL−イソロイシン濃度は、下記表2に示した。
前記表2に記載されたように、ilvA遺伝子が欠損しない野生型菌株ATCC13032は0.02g/LのL−イソロイシンを生産しており、L−イソロイシン生合成経路の遺伝子6種を同時に導入した形質転換菌株ATCC13032/p117−IBGCは0.70g/LのL−イソロイシンを生産して、野生型に比べて3400%が向上されたL−イソロイシン生産能を示した。
また、形質転換菌株ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)とATCC13032/p117−cj7−CimA(M)−leuBCDは、それぞれ0.83g/Lと1.25g/LのL−イソロイシンを生産しており、これはL−イソロイシン生産能が野生型に比べて、それぞれ4050%及び6150%が向上されたものである。
このことから、L−イソロイシン生合成経路のそれ自体を強化した形質転換菌株ATCC13032/p117−IBGCより、従来のL−イソロイシン生合成経路にcimA遺伝子を追加導入した形質転換菌株ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)のL−イソロイシン生産能がより優れていることを確認した。また、leuBCD遺伝子をさらに強化した形質転換菌株ATCC13032/p117−cj7−CimA(M)−leuBCDのL−イソロイシン生産能は、より優れていることを確認した。
一方、ilvA遺伝子を欠損したATCC13032△ilvA菌株はL−イソロイシンの生産能を喪失したが、ここにcimA遺伝子が導入されたATCC13032△ilvA/p117−cj7−CimA(M)菌株は、0.08g/L、cimA遺伝子が導入されてleuBCD遺伝子を強化したATCC13032△ilvA/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD菌株は、0.15g/LのL−イソロイシンを生産した。
前記結果は、L−トレオニンを前駆体として用いる既存のL−イソロイシン生合成経路ではなく、cimA遺伝子導入を通じた新規生合成経路を用いてL−イソロイシン生産が可能であることを示す。
実施例3:形質転換された組み換え菌株の製造及びL−イソロイシン生産性の比較
<3−1>野生型コリネバクテリウム属微生物を用いた遺伝子組み換え菌株の製造
cimA遺伝子の前駆体として用いられるアセチルCoA(acetyl−CoA)の供給のために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)をコードするaceE遺伝子が欠損した酢酸(acetate)要求性菌株を製造し、この菌株を「ATCC13032△aceE」と命名した(非特許文献7)。
<3−1>野生型コリネバクテリウム属微生物を用いた遺伝子組み換え菌株の製造
cimA遺伝子の前駆体として用いられるアセチルCoA(acetyl−CoA)の供給のために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)をコードするaceE遺伝子が欠損した酢酸(acetate)要求性菌株を製造し、この菌株を「ATCC13032△aceE」と命名した(非特許文献7)。
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032由来のピルビン酸デヒドロゲナーゼは、配列番号25に記載されるアミノ酸配列を有し、これをコードするaceE遺伝子は、配列番号26に記載される塩基配列を有する。
前記実施例1で製造した組み換えベクターであるp117−cj7−CimA(M)とp117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリーを、前記で製造したATCC13032△aceE菌株に電気穿孔法で導入した。このように製作された菌株をそれぞれ「ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)」及び「ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリー」と命名した。
前記菌株ATCC13032△aceE、ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)及びATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)m突然変異ライブラリーをカナマイシン25μg/mlを含む固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した後、選別された菌株を対象にL−イソロイシン生産性に対する力価の評価を行った。
具体的に、力価の評価は表3の組成のように酢酸アンモニウム(Ammonium acetate)の形態で酢酸を含有した力価培地を用いて行われた。25mlの力価培地を含有した250ml三角フラスコに前記菌株を接種した後、これを32℃、200rpmの培養器で30時間培養した。このことから、L−イソロイシン濃度が増加したコロニー7種を選別し、そのリストと生産されたL−イソロイシン濃度を下記表4に示した。
その結果、前記表4に記載されたように、親菌株であるATCC13032△aceE菌株は0.05g/LのL−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株は、0.84〜2.23g/LのL−イソロイシンを生産して親菌株に比べて向上されたL−イソロイシン生産能を示し、これは親菌株に比べてL−イソロイシン生産能は約1580%から4360%向上されたものである。これらの中でも、特に形質転換菌株ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)m3が親菌株であるATCC13032△aceEに比べて最も高いL−イソロイシン生産能を示した。
表4に示したように、L−イソロイシン生産能の増加を示して、選別された変異型CimA(M)遺伝子の変異の位置と、各変異の置換されたアミノ酸を確認するためにシーケンシング(sequencing)を行った。
その結果、CimA(M)m突然変異ライブラリーとして、
CimA(M)m1は配列番号3のアミノ酸配列を有し、これは配列番号4の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、これは配列番号6の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m3は配列番号7のアミノ酸配列を有し、これは配列番号8の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m4は配列番号9のアミノ酸配列を有し、これは配列番号10の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m5は配列番号11のアミノ酸配列を有し、これは配列番号12の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m6は配列番号13のアミノ酸配列を有し、これは配列番号14の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m7は配列番号15のアミノ酸配列を有し、これは配列番号16の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよい。
CimA(M)m1は配列番号3のアミノ酸配列を有し、これは配列番号4の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m2は配列番号5のアミノ酸配列を有し、これは配列番号6の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m3は配列番号7のアミノ酸配列を有し、これは配列番号8の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m4は配列番号9のアミノ酸配列を有し、これは配列番号10の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m5は配列番号11のアミノ酸配列を有し、これは配列番号12の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m6は配列番号13のアミノ酸配列を有し、これは配列番号14の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよく;
CimA(M)m7は配列番号15のアミノ酸配列を有し、これは配列番号16の塩基配列を有するポリヌクレオチドからコードされてもよい。
<3−2>選別されたp117−CimA(M)m突然変異ライブラリーの中で最も活性が高いp117−cj7−CimA(M)m3を用いた遺伝子組み換え菌株の製造
前記実施例<3−1>で最も高いL−イソロイシン生産能を示すものとして選別されたp117−cj7−CimA(M)m3ベクターをXbaIで処理した後、実施例<1−3>で収得したleuBCD断片を制限酵素XbaIで処理して獲得したDNA断片とライゲーションした。
前記実施例<3−1>で最も高いL−イソロイシン生産能を示すものとして選別されたp117−cj7−CimA(M)m3ベクターをXbaIで処理した後、実施例<1−3>で収得したleuBCD断片を制限酵素XbaIで処理して獲得したDNA断片とライゲーションした。
このことから製作された組み換えベクターで大腸菌DH5α細胞を熱ショックによって形質転換させ、これをカナマイシン25μg/mlを含有するLB固体培地に塗抹し、37℃で一晩培養した。前記培養したコロニーの一白金耳をカナマイシン25μg/mlを含有するLB液体培地3mlに接種して一晩培養した後、プラスミドミニプレップキットを用いて、プラスミドDNAを回収した。
組み換えベクターの作製有無は、制限酵素XbaIで処理して確認し、配列番号29及び30のプライマー対で95℃で30秒の変性、56℃で30秒のアニーリング、及び72℃で180秒の伸長過程を30回繰り返す条件でPCRを行い、クローンを確認した。前記組み換えベクターを「p117−cj7−CimA(M)m3−leuBCD」と命名した。
前記実施例<1−2>のp117−cj7−cimA(M)、実施例<1−4>のp117−cj7−cimA(M)−leuBCD、実施例<3−1>のp117−cj7−cimA(M)m3及び実施例<3−2>のp117−cj7−cimA(M)m3−leuBCDを実施例<3−1>で用いたATCC13032△aceE菌株にそれぞれ電気穿孔法で導入した後、カナマイシン25μg/mlを含む固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
選別された菌株を前記表3の組成に応じてブドウ糖が含まれた25mlの力価培地を含有した250ml三角フラスコに接種した後、これを32℃、200rpmの培養器で30時間培養してL−イソロイシン生産性を確認した。その結果を下記表5に示した。
前記表5に記載されたように、親菌株ATCC13032△aceEは、0.04g/LのL−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)は、0.98%g/L、ATCC13032△ aceE/p117−cj7−CimA(M)−leuBCDは、2.09g/Lであって、親菌株よりそれぞれ0.94g/L及び2.05g/Lが上昇したL−イソロイシン生産量を示した。
また、実施例<3−1>で収得したCimA(M)m3変異型遺伝子を含む形質転換菌株ATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)m3とATCC13032△aceE/p117−cj7−cimA(M)m3−leuBCDは、それぞれ2.22g/Lと3.76g/LのL−イソロイシン生産量を示した。これは親菌株に比べて5450%と9300%増加したものとして、CimA(M)m3変異型がその野生型よりL−イソロイシン生産能の増加に効果的であることを示す結果である。
前記実施例を通じて獲得した形質転換菌株の中でATCC13032△aceE/p117−cj7−CimA(M)m3を「コリネバクテリウム・グルタミカムCA10−1002」と命名し、ブダペスト条約下、2015年2月27日付で韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM)に寄託し、寄託番号KCCM11672Pを与えられた。
<3−3>L−イソロイシン生産菌株KCCM11248Pを用いた遺伝子組み換え菌株の製造
前記実施例<3−1>及び<3−2>で使用された組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)、p117−cj7−CimA(M)−leuBCD、p117−cj7−CimA(M)m3及びp117−cj7−CimA(M)m3−leuBCDをそれぞれL−イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11248P(特許文献5)に電気穿孔法で導入し、カナマイシン25μg/mlが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
前記実施例<3−1>及び<3−2>で使用された組み換えベクターp117−cj7−CimA(M)、p117−cj7−CimA(M)−leuBCD、p117−cj7−CimA(M)m3及びp117−cj7−CimA(M)m3−leuBCDをそれぞれL−イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11248P(特許文献5)に電気穿孔法で導入し、カナマイシン25μg/mlが含まれた固体培地に塗抹して、単一コロニーを選別した。
選別された菌株をそれぞれKCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)、KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD、KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3及びKCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3−leuBCDと命名した。
これらの菌株を下記表6の組成で作製されたイソロイシン力価培地を用いて、三角フラスコで以下に記述した方法のように培養し、L−イソロイシン生産性を確認した。
具体的に、親菌株KCCM11248Pと、形質転換菌株KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)、KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)−leuBCD、KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3及びKCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3−leuBCDを表6の組成のようにブドウ糖が含まれた25mlの力価培地を含有した250ml三角フラスコに接種した後、これを32℃、200rpmの培養器で60時間培養した。その結果を下記表7に示した。
前記表7に記載されたように、親菌株KCCM11248Pは、3.33g/LのL−イソロイシンを生産したが、形質転換菌株KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)は、4.04g/L、KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)−leuBCDは、4.82g/Lであって、親菌株よりそれぞれ0.71g/L及び1.49g/Lが増加したL−イソロイシン生産量を示した。
一方、形質転換菌株KCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3とKCCM11248P/p117−cj7−CimA(M)m3−leuBCDは、それぞれ4.71g/Lと11.21g/LのL−イソロイシン生産量を示し、これは親菌株に比べて、41.4%と236.6%が増加した。
これはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032を用いた実施例<3−2>の結果と同様に、CimA(M)m3変異型がその野生型よりL−イソロイシン生産能の増加に効果的であることを再び証明する結果である。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例及び実験例は、すべての面で例示的なものであり、本出願の範囲を限定するものではないと理解するべきである。本出願の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (12)
- 下記段階を含むL−イソロイシンを生産する方法:
シトラマレートシンターゼ(citramalate synthase)の活性を有するタンパク質を含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び
前記微生物または培地からL−イソロイシンを回収する段階。 - 前記シトラマレートシンターゼが、メタノカルドコッカス属(genus Methanocaldococcus)微生物に由来する、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- 前記シトラマレートシンターゼが、配列番号1、3、5、7、9、11、13及び15で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ(3−isopropylmalate dehydrogenase)及びイソプロピルマレートデヒドラターゼ(3−isopropylmalate dehydratase)をさらに含む、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼ(pyruvate dehydrogenase)をさらに含む、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物の培養段階で酢酸がさらに供給される、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項1に記載のL−イソロイシンを生産する方法。
- シトラマレートシンターゼの活性を有するタンパク質を含む、L−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記シトラマレートシンターゼが、配列番号1、3、5、7、9、11、13及び15で構成された群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項8に記載のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記微生物が、活性が強化されたイソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ及びイソプロピルマレートデヒドラターゼタンパク質をさらに含む、請求項8に記載のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記微生物が、不活性化されたピルビン酸デヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項8に記載のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項8に記載のL−イソロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
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