JP5878246B2 - プトレシン生産能が向上した組換え微生物およびそれを用いてプトレシンを生産する方法 - Google Patents

Description

本発明は、プトレシン分解能を低下させることによりプトレシン生産能が向上した変異微生物およびそれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。

プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅまたは１，４−ｂｕｔａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）は、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、スペルミン（ｓｐｅｒｍｉｎｅ）などのポリアミンの一種であり、グラム陰性バクテリアやカビから発見され、様々な種に高濃度で存在するので、微生物の代謝に重要な役割を果たすことが予測されている。プトレシンは、主にプロピレン（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）からアクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）およびスクシノニトリル（ｓｕｃｃｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）を経由する化学合成法で生産される。この化学合成法は、石油化学物質を出発物質とし、有毒性物質などを用いるので、環境に優しいものではなく、石油資源の枯渇問題を抱えている。

上記問題を解決するために、より環境にやさしく、エネルギー消費を削減できるように、微生物を用いてプトレシンを生合成する方法を開発する研究が盛んに行われている。従来技術によれば、プトレシンは微生物から２つの経路を経て生合成することができる。一方はグルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）からオルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を生成し、前記オルニチンを脱カルボキシル化（ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）してプトレシンを合成する経路であり、他方は前記合成されたオルニチンから合成されたアルギニンを用いてアグマチン（ａｇｍａｔｉｎｅ）を生成し、前記アグマチンからプトレシンを合成する経路である。また、このように公知のプトレシン合成経路に関与する酵素を用いて目的とする微生物を形質転換することによりプトレシンを合成する方法も研究されている。例えば、特許文献１には、大腸菌に存在するプトレシンの分解および利用に関与する経路を不活性化し、プトレシンの前駆体であるオルニチンがアルギニンに変換される経路を不活性化し、オルニチン生合成経路を強化することにより、プトレシンを高収率で製造する方法が開示されている。２００９年に発表された論文においては、プトレシン生産能のないコリネバクテリウム属菌株に、オルニチンをプトレシンに変換するタンパク質を導入し、活性を向上させることにより、プトレシンを高濃度で生産する方法が開示されている（非特許文献１）。

前述したように生産されたプトレシンは、微生物によって分解されるか、または他の代謝に用いられる。例えば、大腸菌、コリネバクテリウムグルタミカムなどで発現するスペルミジンシンターゼ（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ＥＣ： ２．５．１．１６， ｓｐｅＥ）はプトレシンからスペルミジンを合成し、カンジダボイジニイで発現するアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）はプトレシンをＮ−アセチルプトレシン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）にアセチル化する。大腸菌においては、前記アセチルトランスフェラーゼと高い相同性を示すスペルミジンアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ： ２．３．１．５７． ｓｐｅＧ）の活性が低下するように変異させると、プトレシンを高濃度で生産できることが知られている（特許文献２）。

現在のところ、コリネバクテリウム属微生物において、プトレシンをＮ−アセチルプトレシンにアセチル化する酵素は解明されていないが、ヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２および関連アセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＨＰＡ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）であるＮＣｇｌ１４６９をコードすることが知られている遺伝子を欠損させると、ジアミン類であるカダベリンのＮ−アセチル化が特異的に減少することが知られている（非特許文献２）。しかし、前記ＮＣｇｌ１４６９はプトレシンおよび１，３−ジアミノプロパンを基質として用いないことが確認されているので、前記ＮＣｇｌ１４６９はジアミンのうちカダベリンに対してのみ特異的に活性を有するものと推定される。一方、高濃度のオルニチンおよびアルギニンを生産するコリネバクテリウムグルタミカムにおいて、ＮＣｇｌ１４６９はアセチルグルタメートシンターゼおよびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を示し、前記コリネバクテリウムグルタミカムにおいて、ＮＣｇｌ１４６９を過剰発現させると、オルニチンおよびアルギニンを高収率で生産できることが知られている（特許文献３）。このように、ＮＣｇｌ１４６９は、グルタメートおよびカダベリンに対する特異的活性とオルニチンの生産性を向上させる効果については知られているものの、プトレシンの生産については全く明らかにされていない。

国際公開第０９／１２５９２４号 韓国登録特許第１１８８４３２号公報 韓国登録特許第１１７４２６７号公報 韓国公開特許第１０−２０１１−００８０４７５号 韓国公開特許第１９９２−００００９３３号公報 国際公開第２００９／０９６６８９号 韓国登録特許第０６２００９２号公報 韓国公開特許第２０１２−００６４０４６号公報 韓国公開特許第２００８−００３３０５４号公報

Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ， １０４：４，６５１−６６２， ２００９ Ｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ７６：１５，５１７５−５１８０， ２０１０ Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ３７：１１，１１３１−１１３６， ２０１０ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｉｔｏｒｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９ Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ "Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ" ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１

こうした背景の下、本発明者らは、プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム属微生物において、ＮＣｇｌ１４６９の活性を低下させると、プトレシンを高収率で生産できることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明は、ＮＣｇｌ１４６９の活性を内在的活性より低下させることにより、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記コリネバクテリウム属微生物を用いて高濃度でプトレシンを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明においては、ＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を内在的活性より低下させることにより、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株を作製し、それを用いて、産業的に広く用いられるプトレシンを高濃度で生産することができる。

コリネバクテリウムグルタミカムにおけるプトレシン生合成経路と関連遺伝子を示す概略図である。

上記目的を達成するために、本発明は、プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物において、配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を有するＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性が内在的活性より低下または欠失した、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明における用語「ＮＣｇｌ１４６９タンパク質」とは、コリネバクテリウムグルタミカムにおけるヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２および関連アセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＨＰＡ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と定義されるタンパク質であり、その機能は具体的に明らかにされていないが、グルタメートおよびカダベリンをアセチル化することが確認されている（特許文献４，非特許文献２，非特許文献３）。

本発明のＮＣｇｌ１４６９タンパク質は、配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を含む。しかし、微生物の種または菌株によって前記活性を示すタンパク質のアミノ酸配列が異なることがあるので、これらに限定されるものではない。すなわち、本発明に示すようにタンパク質の活性を低下させることにより、プトレシン生産性の向上を助けるタンパク質であれば、配列番号１８または２０のアミノ酸配列の少なくとも１つの位置における１個または複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入または添加などを含むアミノ酸配列を有するタンパク質突然変異体または人為的な改変体であってもよい。ここで、「複数」とは、タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には２個〜２０個、好ましくは２個〜１０個、より好ましくは２個〜５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、添加または逆位などには、前記ポリペプチドの活性を有する微生物の個体または種の違いに基づく場合など、天然に生じる突然変異または人為的な変異（ｖａｒｉａｎｔ）により発生するものも含まれる。

本発明におけるコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ１４６９タンパク質は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列と９９％の相同性を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ１４６９タンパク質は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含む。

本発明の前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、本発明のＮＣｇｌ１４６９タンパク質に類似した活性を有するものであれば、配列番号１８または２０のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよく、最も好ましくはそれぞれ配列番号１７または１９で表されるポリヌクレオチド配列を含む。

前記用語「相同性」とは、２つのアミノ酸配列間の同一性を示すものであり、スコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などのパラメーター（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を計算するＢＬＡＳＴ２．０を用いる、当業者に周知の方法で決定されうる。

また、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１７もしくは１９のポリヌクレオチド配列または前記ヌクレオチド配列から製造されたプローブ（ｐｒｏｂｅ）と「ストリンジェントな条件」でハイブリダイズすることができ、正常に機能するタンパク質をコードする変異型であってもよい。本発明における「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイズを可能にする条件を意味し、具体的にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（非特許文献４）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（非特許文献５）に記載されており、例えば６５℃のハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ，０．０２％フィコール，０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％牛血清アルブミン，２．５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ７），０．５％ＳＤＳ，２ｍＭ ＥＤＴＡ）におけるハイブリダイゼーションが記載されている。ＳＳＣは、ｐＨ７の０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡが転写されているメンブランを室温にて２×ＳＳＣで洗浄し、その後６８℃の温度にて０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで洗浄する。

本発明におけるＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性低下とは、タンパク質の活性が内在的活性より減少すること、または活性が除去されることを意味し、１）前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全部の欠失、２）前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列の改変、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の改変、または４）それらの組み合わせにより達成することができる。

上記方法のうち、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部または全部を欠失させる方法は、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内に内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって異なるが、具体的には２個〜３００個、好ましくは２個〜１００個、より好ましくは１個〜５個である。

また、前記ポリヌクレオチドの発現が減少するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、および転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれる。

また、本発明のタンパク質をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記配列の活性がより低下するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より低い活性を有するように改良された核酸配列に置換することにより行うこともできる。

一方、本発明のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物は、プトレシンの前駆体であるオルニチンを細胞内に蓄積するために、オルニチンにおいて、アルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｒａｓｅ， ＡｒｇＦ）、およびグルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）の活性を内在的活性より低下するようにさらに変異させてもよい。それだけでなく、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ， ＯＤＣ）の活性を導入するように変異させてもよく、プトレシン前駆体であるオルニチン生合成経路の強化のために、グルタメートをアセチルグルタメートに変換させるアセチルグルタメートシンターゼ、またはアセチルオルニチンをオルニチンに変換させるオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェートに変換させるアセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒドに変換させるアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、およびアセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチンに変換させるアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性を内在的活性より向上するようにさらに変異させてもよい。

ここで、前記ＡｒｇＦ、ＮＣｇｌ１２２１、ＯＤＣ、ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢおよびＡｒｇＤは、特にこれらに限定されるものではないが、好ましくは、それぞれ配列番号２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７のアミノ酸配列、またはそれらと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

本発明における用語「オルニチンデカルボキシラーゼ」とは、オルニチンを用いてプトレシンを生成する酵素を意味するが、前記ＯＤＣは補酵素としてピリドキサールホスフェート（Ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ＰＬＰ）を必要とし、ほとんどのグラム陰性菌に存在し、グラム陽性菌のうちラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）などの腸内細菌の一部に存在する。大腸菌の場合、ＯＤＣをコードする遺伝子は２つあるが、一方のｓｐｅＣは持続的に一定濃度で発現し、他方のｓｐｅＦは特定条件（一定濃度以上のオルニチンの存在および低いｐＨ条件）下で発現が誘導される遺伝子である。種によって、大腸菌のように２種類のＯＤＣを有する種もあり、１種類しかない種もある。エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）などの種は２種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ，ｓｐｅＦ）を有し、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）などの菌株は１種類のＯＤＣ（ｓｐｅＣ）を有する。乳酸菌の場合、ＯＤＣが１種類の遺伝子（ｓｐｅＦ）から発現し、低いｐＨやオルニチンとヒスチジンが豊富な条件で発現が誘導されることが知られている。

本発明の組換えコリネバクテリウム属微生物は、前述した様々な種由来のＯＤＣコード遺伝子を用いてＯＤＣ活性を導入することができる。

前記ＯＤＣをコードするポリヌクレオチドは、特にこれらに限定されるものではないが、配列番号２３のアミノ酸配列、またはそれと７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。

また、微生物にオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性を導入することは当該分野で周知の様々な方法で行うことができ、例えばＯＤＣをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを染色体に挿入する方法、前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入して微生物に導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の上流に改良された活性を示すプロモーターを導入するか、プロモーターに変異を入れたＯＤＣを導入する方法、ＯＤＣをコードする塩基配列の変異体を導入する方法などを用いることができ、好ましくは、前記ＯＤＣをコードする塩基配列を導入する場合は、この発現を調節するためのプロモーターとして公知のＣＪ７プロモーターを用いることができる。

また、前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢおよびＡｒｇＤの活性向上は、１）前記酵素をコードするポリヌクレオチドのコピー数増加、２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、３）前記酵素の活性が向上するように染色体上のポリヌクレオチド配列の改変、４）それらの組み合わせにより向上するように改変する方法などにより行うことができる。

具体的には、前記１）ポリヌクレオチドのコピー数増加は、ベクターに作動可能に連結した形態で行うか、宿主細胞内の染色体内に挿入することにより行うことができる。より具体的には、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞に導入することにより行うことができ、前記ポリヌクレオチドを作動可能に連結した、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞に導入することにより前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加する方法で行うことができる。

本発明における用語「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、好適な宿主内に形質転換された後、主ゲノムに関係なく複製および機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい

本発明において用いられるベクターは、宿主内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。本発明において使用可能なベクターは、特に限定されるわけではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。最も好ましくは、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＬ、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターを用いることができる。

また、宿主細胞を形質転換し、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体内に挿入することのできるベクターの好ましい例としては、大腸菌とコリネフォルム細菌の両方で自己複製可能なシャトルベクターｐＥＣＣＧ１１２ベクター（特許文献５）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

また、細菌内染色体挿入ベクターにより染色体内に内在的な標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを新規ポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で公知の任意の方法、例えば相同組換えにより行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるので、前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカーをさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチドが挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬剤耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与するマーカーを用いてもよい。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）で処理された環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

本発明における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現するようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体以外に位置するかに関係なく、それらを全て含むものである。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセットの形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

また、前記用語「作動可能に連結」とは、本発明の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始および媒介するようにプロモーター配列と前記遺伝子配列を機能的に連結することを意味する。

また、本発明の２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、前記発現調節配列の活性がさらに向上するように、核酸配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有する核酸配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。

前記ポリヌクレオチド発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されるが、前記強力なプロモーターの例としては、ｐｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡまたはａｃｅＢプロモーターなどが挙げられ、より好ましくは、コリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーターまたはｐｃｊ７プロモーターが作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができる。ｙｓＣＰ１プロモーターは、アスパラギン酸キナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドのプロモーター部位の塩基配列の置換により改良されたプロモーターであり、アスパラギン酸キナーゼ遺伝子の発現量増大により当酵素の活性を野生型に比べて約５倍向上させることのできる強力なプロモーターである（特許文献６）。また、ｐｃｊ７プロモーターは、コリネバクテリウムアンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索する際にコリネバクテリウムアンモニアゲネスおよびエシェリキアから発現可能なプロモーターであり、かつ強力なプロモーター活性を有することが確認されているプロモーターであり、コリネバクテリウムグルタミカムにおいても高い強度で発現可能なプロモーターである（特許文献７）。

また、３）本発明の酵素をコードする、染色体上のポリヌクレオチド配列を改変する方法は、前記配列の活性がより向上するように、核酸配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、またはそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より高い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。

本発明の微生物は、プトレシン生産能が向上した微生物であり、前記配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質が発現される原核微生物を含み、その例としては、エシェリキア属、シゲラ属、シトロバクター属、サルモネラ属、エンテロバクター属、エルシニア属、クレブシエラ属、エルウィニア属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍａｎａｓ ｓｐ．）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）に属する微生物が挙げられる。

好ましくは、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より好ましくは、コリネバクテリウムグルタミカムである。

本発明の一実施形態においては、グルタメートからのプトレシン生成経路が強化されて高濃度プトレシン生産能を有する、寄託番号ＫＣＣＭ１１１３８Ｐのコリネバクテリウム属微生物（特許文献８）を変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐは、ＡＴＣＣ１３０３２菌株において、オルニチン蓄積のためのオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子、および細胞内のグルタメートを増加させるためのグルタメートエクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、オルニチンデカルボキシラーゼ（ｓｐｅＣ）をコードする遺伝子が導入され、オルニチン生合成遺伝子（ａｒｇＣＪＢＤ）の発現量が増加したプトレシン過剰生産菌株である。

本発明の他の実施形態においては、前記ＫＣＣＭ１１１３８Ｐと同じ遺伝子型を有するコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａを変異させた。具体的には、プトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ； ＡＴＣＣ）から入手したＡＴＣＣ１３８６９菌株において、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）をコードする遺伝子およびグルタメート排出タンパク質ＮＣｇｌ１２２１をコードする遺伝子が欠損し、大腸菌由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＣＤ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が導入され、オルニチン生合成遺伝子オペロン（ａｒｇＣＪＢＤ）のプロモーターが改良されたプロモーターに置換されたことを特徴とする。

本発明の具体的な一実施態様においては、ＡｒｇＦおよびＮＣｇｌ１２２１が欠損し、ｓｐｅＣが導入され、ａｒｇＣＪＢＤが強化された、高濃度プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ（特許文献８）において、配列番号１８で表されるＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を低下または欠失させることにより、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株を作製した（図１参照）。

前述したようにＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性が欠失した菌株をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＣＣ０１−０１６３と命名し、２０１１年１２月２６日付けで韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ， 以下「ＫＣＣＭ」という）に受託番号ＫＣＣＭ１１２４０Ｐとして寄託した。前記菌株を培養した結果、Ｎ−アセチルプトレシンが生成されず、プトレシン生産性が向上し、前記向上したレベルは生成されないＮ−アセチルプトレシンのレベルと同程度であることから、ＮＣｇｌ１４６９がプトレシンをアセチル化する活性を有することが分かった。

また、プトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａにおいて、配列番号２０で表されるＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を欠失させ、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミカム菌株ＤＡＢ１２−ａΔＮＣｇｌ１４６９を作製し、菌株を培養した結果、Ｎ−アセチルプトレシンが生成されず、プトレシン生産性が向上することが確認された。

また、本発明は、配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を含むＮＣｇｌ１４６９タンパク質の活性を低下させた、向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシン生産方法に関する。

本発明の前記培養過程は、当業界で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。前記培養方法の例としては、回分培養、連続培養および流加培養が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

培養に用いられる培養培地は、特定の菌株の要件を適切に満たさなければならない。各微生物の培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。培地内の炭素供給源としては、糖および炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプンおよびセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリンおよびエタノール）、並びに有機酸（例えば、酢酸）などを用いることができる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕およびウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）を用いることができる。これらの物質も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、またはそれらに相当するナトリウム含有塩を用いることができる。また、培養培地は、成長に必要な金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）を含有してもよい。最後に、前述した物質以外にも、アミノ酸やビタミンなどの成長に必要な促進物質をさらに用いてもよい。好適な前駆体を前記培養培地にさらに加えてもよい。前記供給物質は、培養物に一度に全て加えてもよく、培養中に適宜供給してもよい。

培養物のｐＨは、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を適宜用いることにより調節することができる。発泡は、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることにより調節することができる。酸素または酸素を含むガス混合物、例えば空気を培養物中に導入することにより、好気性条件を維持することができる。培養温度は、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養は、プトレシンの所望の生成量が得られるまで続ける。これらの目的は、通常１０〜１６０時間で達成される。プトレシンは、培養培地中に排出されるか、細胞中に含まれている場合もある。

本発明の前記培養工程で生産されたプトレシンを収集および回収する方法は、培養方法、例えば回分培養、連続培養、流加培養方法などにより、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から標的アミノ酸を収集することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：ＮＣｇｌ１４６９活性が欠失した菌株
実施例１−１．ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株におけるＮＣｇｌ１４６９欠損菌株の作製
本発明者らの特許出願（特許文献８）に開示された、野生型コリネバクテリウムグルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２において、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡｒｇＦ）およびグルタメート排出に関与するグルタメートエクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子を欠損させ、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）を染色体に導入し、グルタメートからのオルニチン合成に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターを置換することにより作製された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物（ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ（ＡＴＣＣ１３０３２ΔＡｒｇＦΔＮＣｇｌ１２２１Ｐ（ＣＪ７）−ａｒｇＣＪＢＤ ｂｉｏＡＤ：：Ｐ（ＣＪ７）−ｓｐｅＣ（Ｅｃ））に基づいて、細胞内でプトレシンがＮ−アセチルプトレシンに合成される経路を遮断するために、ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させた変異菌株を作製した。

具体的には、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の遺伝子ＮＣｇｌ１４６９の塩基配列（配列番号１７）に基づいて、ＮＣｇｌ１４６９のＮ末端部分の相同組換え断片を得るためのプライマーとしてＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩ、ＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ１＿ＳａｌＩを作製し、ＮＣｇｌ１４６９のＣ末端部分の相同組換え断片を得るためのプライマーとしてＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ２＿ＳａｌＩ、ＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩを作製した（表１）。

ＮＣｇｌ１４６９遺伝子のＮ末端部分の断片とＣ末端部分の断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、前記プライマーの組み合わせ（ＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩ＆ＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ１＿ＳａｌＩとＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ２＿ＳａｌＩ＆ＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸張を３０サイクル行った。

ＰＣＲ生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製し、次いでＮ末端部分とＣ末端部分のＰＣＲ産物をそれぞれＢａｍＨＩ＆ＳａｌＩとＳａｌＩ＆ＸｂａＩで処理し、ＢａｍＨＩ＆ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにクローニングした。結果として得られた、ＮＣｇｌ１４６９欠失に用いるプラスミドをｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）と命名した。

ＫＣＣＭ１１１３８ＰΔＮＣｇｌ１４６９菌株を得るために、前述したように作製したｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）ベクターをＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株に電気穿孔法で導入し、その後カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩＳ平板培地（ブレインハートインフュージョン ３７ｇ／Ｌ， ソルビトール ９１ｇ／Ｌ， 寒天 ２％， １Ｌ中）に塗抹した。

ベクターの染色体挿入の成否は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かで判別した。染色体に１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、その後それぞれ１０^−４から１０^−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）による最終のＮＣｇｌ１４６９遺伝子欠失菌株を選択し、さらにＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩおよびＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩプライマーを用いてＰＣＲで確認した。確認された菌株をＫＣＣＭ１１１３８ＰΔＮＣｇｌ１４６９と命名した。

実施例１−２．ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株におけるＮＣｇｌ１４６９欠損菌株の作製
前記コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐを作製した方法と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９に基づいて、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ＡｒｇＦ）およびグルタメート排出に関与するグルタメートエクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）をコードする遺伝子を欠損させ、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）を染色体に導入し、グルタメートからのオルニチン合成に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターを置換することによりプトレシン生産菌株を作製し、作製されたプトレシン生産菌株をＤＡＢ１２−ａ（ＡｒｇＦ欠損，ＮＣｇｌ１２２１欠損，大腸菌ｓｐｅＣ導入，ａｒｇオペロンプロモーター置換）と命名し、これを対象にＮＣｇｌ１４６９欠損菌株を作製した。

具体的には、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子およびそれから発現するタンパク質配列を確認するために、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５および６（ＮＣｇｌ１４６９−Ｆ，ＮＣｇｌ１４６９−Ｒ）のプライマー対（表２）を用いてＰＣＲを行った。ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で２分３０秒間の伸張を３０サイクル行った。こうして得られたＰＣＲ産物を電気泳動で分離し、その後配列分析を行った結果、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子は配列番号１９で表される塩基配列を含み、それによりコードされるタンパク質は配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むことが確認された。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＮＣｇｌ１４６９とコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ１４６９のアミノ酸配列を比較した結果、これらは９９％の配列相同性を有することが確認された。

コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来のＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子を欠失させるために、前記実施例１−１と同様に、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３に示す２組のプライマーを用いてＮＣｇｌ１４６９遺伝子のＮ末端部分断片とＣ末端部分断片をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物をそれぞれＢａｍＨＩ＆ＳａｌＩとＳａｌＩ＆ＸｂａＩで処理し、ＢａｍＨＩ＆ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにクローニングすることにより、プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）を作製した。

前記プラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ１４６９（Ｋ／Ｏ）を実施例１−１と同様の方法でコリネバクテリウムグルタミカムＤＡＢ１２−ａに形質転換することにより、ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子が欠失した菌株を選択した。こうして選択されたコリネバクテリウムグルタミカム変異株をＤＡＢ１２−ａΔＮＣｇｌ１４６９と命名した。

実施例２：ＮＣｇｌ１４６９の活性が低下した菌株
プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ（特許文献８）において、プトレシンがＮ−アセチルプトレシンに合成される経路を低下させるために、ＮＣｇｌ１４６９の開始コドンが置換された菌株を作製した。

具体的には、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の遺伝子ＮＣｇｌ１４６９の塩基配列に基づいて、Ｎ末端部分の相同組換え断片を得るためのプライマーとしてＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｆ１、ＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｒ１を作製し、Ｃ末端部分の相同組換え断片を得るためのプライマーとしてＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｆ２、ＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｒ２を作製した（表４）。Ｎ末端部分の断片とＣ末端部分の断片が結合される部位は、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の開始コドンであるＡＴＧ塩基配列の代わりにＧＴＧ塩基配列に置換されるようにした。

ＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ１４６９遺伝子のＮ末端部分の断片とＣ末端部分の断片を得るために、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、前述したプライマーの２つの組み合わせ（ＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｆ１＆ＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｒ１とＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｆ２＆ＮＣｇｌ１４６９−ｇｔｇ−Ｒ２）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いて、９５℃で４０秒間の変性、５２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸張を３０サイクル行った。

ＰＣＲ生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製し、次いでＡＴＣＣ１３０３２菌株のＮＣｇｌ１４６９遺伝子のＮ末端部分とＣ末端部分のＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ＆ＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターにそれぞれフュージョン（ｆｕｓｉｏｎ）クローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。結果として得られたＮＣｇｌ１４６９開始コドン置換に用いるプラスミドをｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（ｇｔｇ）と命名した。

ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ ＮＣｇｌ１４６９（ｇｔｇ）菌株を得るために、前述したように作製したｐＤＺ−ＮＣｇｌ１４６９（ｇｔｇ）ベクターをＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で導入し、その後カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩＳ平板培地（ブレインハートインフュージョン ３７ｇ／Ｌ， ソルビトール ９１ｇ／Ｌ， 寒天 ２％， １Ｌ中）に塗抹した。ベクターの染色体挿入の成否は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含む固体培地で青色を示すか否かで判別した。染色体に１次挿入された菌株を栄養培地で振盪培養（３０℃，８時間）し、その後それぞれ１０^−４から１０^−１０に希釈し、Ｘ−ｇａｌを含む固体培地に塗抹した。ほとんどのコロニーが青色を示すのに対して、低い割合で出現する白色のコロニーを選択することにより、２次交差による最終のＮＣｇｌ１４６９開始コドン置換菌株を選択し、さらにＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｆ１＿ＢａｍＨＩおよびＮＣｇｌ１４６９−ｄｅｌ−Ｒ２＿ＸｂａＩプライマーを用いてＰＣＲを行い、その後配列を確認した。確認された菌株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ ＮＣｇｌ１４６９（ｇｔｇ）と命名した。

実施例３：ＮＣｇｌ１４６９活性が向上した菌株
オルニチンを生産するコリネバクテリウムグルタミカム菌株において、ＮＣｇｌ１４６９の活性が向上した変異菌株においてはオルニチンの生産性が向上することが知られているので（非特許文献３）、オルニチンの生産性を向上させるために、ＮＣｇｌ１４６９をコードするポリヌクレオチドをプラスミド形態または染色体内挿入形態で導入し、その効果を確認した。

実施例３−１：ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子のクローニングおよび形質転換体の作製
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子（プロモーター部位を含む）のコピー数増加によるオルニチンとプトレシンの高生産効果を確認するために、実施例１に開示されたＫＣＣＭ１１１３８Ｐに基づいて、ＮＣｇｌ１４６９がプラスミド形態で導入された変異菌株を作製した。

具体的には、前記ＡＴＣＣ１３０３２菌株の遺伝子ＮＣｇｌ１４６９を鋳型とし、前記ＮＣｇｌ１４６９をコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー（ＮＣｇｌ１４６９−３００−Ｆ＿ＫｐｎＩおよびＮＣｇｌ１４６９−Ｒ＿ＸｂａＩ）を用いて、実施例１と同じ条件でＰＣＲを行い、約９００ｂｐのサイズを有する遺伝子断片を得た（表５）。

前述したように得られた遺伝子断片を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで処理し、同じ制限酵素で処理したｐＨＣ１３９Ｔ−ｇｆｐベクター（特許文献７）にクローニングすることにより、発現ベクターｐＨＣ１３９Ｔ−ＮＣｇｌ１４６９を作製した。

菌株内のオルニチンおよびプトレシン生産量を増加させるために、前述したように作製したｐＨＣ１３９Ｔ−ＮＣｇｌ１４６９ベクターをプトレシン生産能を有する菌株ＫＣＣＭ１１１３８Ｐに導入した。電気穿孔法で菌株に導入し、その後カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選択した。選択された菌株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ／ｐＨＣ１３９Ｔ−ＮＣｇｌ１４６９と命名した。

実施例３−２：ＮＣｇｌ１４６９をコードする遺伝子が染色体に導入された変異菌株
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子（プロモーター部位を含む）の染色体内への追加挿入によるオルニチンとプトレシンの高生産効果を確認するために、実施例１に開示されたＫＣＣＭ１１１３８Ｐに基づいて、ＮＣｇｌ１４６９が染色体に導入された変異菌株を作製した。

コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内への遺伝子導入を可能にする形質転換ベクターｐＤＺＴｎ（特許文献９）は、本発明者らが開発したベクターであり、ｐＤＺベクターを用いた遺伝子導入方法と同様に用いることができる。

ＮＣｇｌ１４６９遺伝子は、ＡＴＣＣ１３０３２菌株の染色体を鋳型とし、ＮＣｇｌ１４６９−３００−Ｆ＿ＳｐｅＩ、ＮＣｇｌ１４６９−Ｒ＿ＸｈｏＩプライマー（表６）を用いたＰＣＲにより、約９００ｂｐのサイズを有する遺伝子断片を得た。

ＰＣＲ条件は、ｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）を用いて、９５℃で４０秒間の変性、５２℃で４０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸張を３０サイクル行った。ＰＣＲ生成物を０．８％アガロースゲルで電気泳動し、その後所望のサイズのバンドを溶離して精製した。ＳｐｅＩ＆ＸｈｏＩで処理したｐＤＺＴｎベクターに、前述したように得られたＮＣｇｌ１４６９ ＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いた。結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ−ＮＣｇｌ１４６９と命名した。

ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：：ＮＣｇｌ１４６９菌株を得るために、前述したように作製したｐＤＺＴｎ−ＮＣｇｌ１４６９ベクターをＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株に電気穿孔法で導入し、その後カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＢＨＩＳ平板培地に塗抹した。ベクターの染色体挿入の成否の判別を実施例１と同様の方法で行い、トランスポゾン遺伝子位置にＮＣｇｌ１４６９遺伝子が挿入された菌株を選択し、さらにＮＣｇｌ１４６９−３００−Ｆ＿ＳｐｅＩ＿ＴｎおよびＮＣｇｌ１４６９−Ｒ＿ＸｈｏＩ＿Ｔｎプライマーを用いてＰＣＲで確認した。確認された菌株をＫＣＣＭ１１１３８Ｐ Ｔｎ：：ＮＣｇｌ１４６９と命名した。

実施例４：プトレシン生産能の比較
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の遺伝子欠失、開始コドン置換、発現量増加、染色体内への導入による効果を確認するために、前述したように作製された菌株を対象にプトレシン生産能を評価した。

具体的には、前述したように作製された菌株を、１ｍＭアルギニンを含むＣＭ平板培地（ブドウ糖 １％， ポリペプトン １％， 酵母抽出物 ０．５％， 牛肉エキス ０．５％， ＮａＣｌ ０．２５％， 尿素 ０．２％， ５０％ ＮａＯＨ １００μｌ， 寒天 ２％， ｐＨ ６．８， １Ｌ中）で３０℃にて１６時間培養し、その後表７の力価培地２５ｍｌに１白金耳ほど接種し、次いでこれを３０℃にて２００ｒｐｍで９６時間振盪培養した。作製された全ての菌株において、発酵の際に培地に１ｍＭアルギニンを添加して培養した。

その結果、下記表８に示すように、プトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１１３８ＰにおいてＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させてその機能を不活性化した場合、Ｎ−アセチルプトレシンが生成されず、プトレシン生産が対照菌株に比べて２．６ｇ／Ｌ増加したので、プトレシンの生産性が向上することが確認された。

また、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の開始コドンを置換してその機能を低下させた場合、プトレシン生産能を有する微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ菌株において生成されたＮ−アセチルプトレシンが３ｇ／Ｌ減少し、Ｎ−アセチルプトレシン生産量が半分以下に減少することが確認された。

ＫＣＣＭ１１１３８Ｐと同様に、ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａにおいてＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させてその機能を不活性化した場合も、Ｎ−アセチルプトレシンが生成されず、プトレシン生産性が向上した。

これらの結果は、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の低下または欠失により、プトレシンからＮ−アセチルプトレシンへの経路が低下または遮断されたことを示し、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子から発現したタンパク質がプトレシンをアセチル化する機能を有することを示すものである。

一方、ＮＣｇｌ１４６９の活性を向上させた場合は、対照群に比べて培養物内のＮ−アセチルプトレシンの含有量が増加し、遺伝子のプラスミド発現の場合と、染色体内への遺伝子の追加導入の場合の両方においては、ＮＣｇｌ１４６９の活性を向上させた方法による差は現れなかった。

従来のオルニチン生産菌株においてＮＣｇｌ１４６９遺伝子を強化すると、グルタメートからアセチルグルタメートに変換経路が強化され、オルニチン生産が増加することが確認されているが（特許文献４）、本発明においては、オルニチンがプトレシンにほとんど変換されるので、オルニチンは蓄積されなかった。

これは、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子から発現したタンパク質がグルタメートよりプトレシンのほうを容易に認識し、アセチルグルタメート生成反応よりＮ−アセチルプトレシン生成反応のほうが強化されたものと推定されるので、従来技術と差別化された結果を示すものである。

本発明者らは、前記実施例１−１で作製した、プトレシン生産能を有する形質転換されたコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ（特許文献８）において、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させることにより、Ｎ−アセチルプトレシンを生成せず、プトレシン生産量が増加したコリネバクテリウムグルタミカム菌株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１−０１６３と命名し、２０１１年１２月２６日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに受託番号ＫＣＣＭ１１２４０Ｐとして寄託した。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は、明細書ではなく特許請求の範囲の意味および範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態を含むものであると解釈すべきである。

Claims (11)

1. プトレシンを生産するように変異させたコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物において、配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が内在的活性より低下または欠失した、プトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物。
2. さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ， ＯＤＣ）の活性が導入された請求項１に記載の微生物。
3. 前記ＯＤＣが配列番号２３のアミノ酸配列を含む請求項２に記載の微生物。
4. オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）およびグルタメートエクスポーター（ＮＣｇｌ１２２１）からなる群から選択される少なくとも１種の活性が内在的活性より低下した、請求項１に記載の微生物。
5. ＡｒｇＦが配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＮＣｇｌ１２２１が配列番号２２のアミノ酸配列を含む請求項４に記載の微生物。
6. アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタメートシンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、およびアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）からなる群から選択される少なくとも１種の活性がさらに向上した、請求項１に記載の微生物。
7. 前記ＡｒｇＣ、ＡｒｇＪ、ＡｒｇＢおよびＡｒｇＤが、それぞれ配列番号２４、２５、２６および２７のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の微生物。
8. 活性低下が、１）前記タンパク質をコードする遺伝子の一部または全部の欠失、２）前記遺伝子発現の減少、３）前記タンパク質の活性が低下するように染色体上の前記遺伝子配列の変異、または４）それらの組み合わせにより行われる、請求項１に記載の微生物。
9. コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載の微生物。
10. 配列番号１８または２０で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が内在的活性より低下または欠失し、向上したプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する工程と、
    前記工程で得られた培養物からプトレシンを分離する工程とを含むプトレシンの生産方法。
11. コリネバクテリウム属微生物がコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である請求項１０に記載のプトレシンの生産方法。

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