CN104066835A - 提高腐胺生产能力的重组微生物以及利用其制备腐胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有增强腐胺生产能力的高产率重组微生物,其通过在经修饰产生腐胺的棒状杆菌属微生物中弱化NCgl1469的活性而获得,和利用其生产腐胺的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高腐胺产量的重组微生物,其经修饰而弱化了腐胺降解能力,以及利用所述微生物生产腐胺的方法。
背景技术
腐胺(或1,4-丁二胺)是一种聚胺,例如亚精胺和精胺,其存在于革兰氏阴性细菌和真菌中。由于腐胺在很多物种中出现的浓度范围很大,因此其在微生物代谢中扮演着重要的角色。腐胺主要通过源于丙烯的琥珀腈和丙烯腈化学合成而得。所述化学合成采用了石油化工的衍生物质作为起始原料和有毒的化学物质,因此该方法并不是环境友好的而且具有石油消耗的问题。
为了解决这些问题,很多研究都致力于开发一种利用微生物来生物合成腐胺的方法,其更为环境友好并能减少能源消耗。根据现有的知识,可通过两种微生物途径生物合成腐胺。一种途径是,谷氨酸盐产生鸟氨酸,而鸟氨酸脱羧基合成腐胺。另一种途径是,鸟氨酸合成精氨酸,通过精氨酸产生胍丁胺,然后再从胍丁胺合成腐胺。此外,还有其他合成腐胺的方法,其将腐胺合成途径中涉及的已知酶转化入目标微生物中。例如,WO09/125924公开的高收率生产腐胺的方法有:使E.coli中腐胺分解和利用的途径失活、使腐胺前体鸟氨酸转化为精氨酸的途径失活、和增强鸟氨酸生物合成途径。一篇在2009年出版的文献公开了一种生产高浓度腐胺的方法,所述方法将能够使鸟氨酸转化为腐胺的蛋白导入无法产生腐胺的棒状杆菌(Corynebacterium)菌株中,并提高其活性(Qian et al.,Biotechnol Bioeng,104:4,651-662,2009)。
所产生的腐胺可由微生物分解或用于其他代谢。例如,亚精胺合酶(EC:2.5.1.16,speE),其在E.coli以及谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中表达并能将腐胺合成为亚精胺,和乙酰转移酶(N-乙酰转移酶),其在假丝酵母菌(Candida boidinii)中表达,能将腐胺乙酰化为N-乙酰腐胺的。已知在修饰后弱化了亚精胺乙酰转移酶(EC:2.3.1.57.speG)活性的E.coli菌株中,可产生高 浓度的腐胺,该酶与上述的乙酰转移酶具有高度的同源性(韩国专利No.1188432)。
尽管在棒状杆菌属微生物中尚未鉴定出将腐胺乙酰化为N-乙酰腐胺的酶,但已知当将NCgl1469(一种组蛋白乙酰化酶HPA2)以及相关乙酰化酶的已知编码基因去除时,尸胺(一种二元胺)的N-乙酰化作用就显著地减弱了(Kind et al.,Appl Environ Microbiol,76:15,5175-5180,2010)。然而,据报道,NCgl1469并非利用腐胺和1,3-丙二胺作为底物。换言之,NCgl1469可能在以上所有不同的二元胺中仅对尸胺具有特定活性。另一方面,NCgl1469具有乙酰谷氨酸合成酶活性且在谷氨酸棒状杆菌中具有鸟氨酸乙酰转移酶的活性,从而能产生高浓度的鸟氨酸和精氨酸,而当在谷氨酸棒状杆菌中过表达NCgl1469之后,鸟氨酸和精氨酸的收率很高(Korea Patent No.1174267)。同样地,NCgl1469对谷氨酸和尸胺具有特异性活性,且NCgl1469对提高鸟氨酸产量的效果是已知的,但NCgl1469与腐胺的产量是否有关仍然是未知。
公开内容
技术问题
本发明人发现,通过在经修饰产生腐胺的棒状杆菌属微生物中弱化NCgl1469的活性,能够高收率地生产腐胺,从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的在于提供一种经修饰的棒状杆菌属微生物,通过弱化NCgl1469的活性(与其内源性的活性相比)而具有提高的腐胺产生能力。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述棒状杆菌属微生物高收率生产腐胺的方法。
有益效果
在本发明中,生产腐胺能力增强的谷氨酸棒状杆菌属菌株制备如下:使NCgl1469的活性较其内源性活性有所弱化,就可将其用于生产高浓度的、广泛应用于工业的腐胺。
附图说明
图1的示意图显示了谷氨酸棒状杆菌的腐胺生物合成途径和相关基因。
最佳实施方式
为了达到以上目的,本发明提供了一种经修饰的棒状杆菌属微生物,其具有增强的腐胺产生能力,其中,氨基酸序列如SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示的NCgl1469蛋白活性相对于内源性的活性而言有所弱化或剔除。
如本文所用,术语“NCgl1469蛋白”指这样一种蛋白:组蛋白乙酰基转移酶HPA2或谷氨酸棒状杆菌中相关的乙酰基转移酶,据报道,其对乙酰谷氨酸盐和尸胺不具备特异性识别功能(韩国专利No.10-1174267,Hwang et al.,J Ind Microbiol Biotechnol,37:11,1131-1136,2010,Kind et al.,Appl Environ Microbiol,76:15,5175-5180,2010)。
本发明所述的NCgl1469蛋白含有如SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示的氨基酸序列。然而,根据不同的微生物种类或菌株,不同氨基酸序列的蛋白也可表现出上述活性,因此并不仅限于上述序列。换言之,可以是突变蛋白或者人工变异体,只要可以通过弱化本发明所述蛋白活性从而有助于提高腐胺产量,其可包括对SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示序列进行替换、删除、插入,或在一个或多个位置进行一个或几个氨基酸的添加。在此,“几个”可以是不同的,取决于蛋白氨基酸残基的位置或三维结构类型,但尤其是指2-20个,优选2-10个,更优选为2-5个。此外,还包括基于微生物种类个体差异的天然突变或人工变异引起的氨基酸的替换、删除、插入、添加或倒置。
来源于本发明的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1469蛋白具有SEQ ID NO.:18所示的序列,而来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl1469蛋白与上述氨基酸序列具有99%的同源性,其具有如SEQ ID NO.:20所示的氨基酸序列。
编码本发明氨基酸序列的多核苷酸可包括编码所述蛋白的多核苷酸序列,只要所编码的蛋白具有与本发明NCgl1469蛋白相似的活性,且具有与SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示序列80%或更高,优选90%或更高,较优选95%或更高,更优选为97%或更高的同源性,最优选地,所述的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO.:17或SEQ ID NO.:19所示。
术语“同源性”指的是两个氨基酸序列中的同一性,且可采用广为本领域技术人员所知的方法检测,采用BLAST2.0来计算分值、同一性和相似性等参数。
此外,本发明的多核苷酸序列可与SEQ ID NO.:17或SEQ ID NO.:19所示的多核苷酸或在“严格条件”下根据其制备的探针杂交,也可以是编码具有正常功能蛋白的变异体。如本文所用,“严格条件”指的是可以使多核苷酸间进行特异性杂交的条件,具体说来,例如,在分子克隆学(实验室手册,J.Sambrook等编,第二版,冷泉港实验室出版,纽约冷泉港,1989)或现代分子生物学(F.M.Ausubel等编,John Wiley&Sons公司,纽约),其描述了例如在65℃的杂交缓冲液中的杂交(3.5×ssc,0.02%聚蔗糖,0.02%聚乙烯吡咯烷酮,0.02%牛血清白蛋白,2.5mM NaH2PO4(pH7),0.5%SDS,2mM EDTA)。SSC是pH为7的0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠。杂交之后,传递有DNA的膜在室温下采用2×SSC进行清洗,然后在68℃下采用0.1-0.5×ssc/0.1×SDS进行清洗。
在本发明中,NCgl1469活性的弱化指的是较其内源性的活性而言,NCgl1469活性有所降低或剔除。NCgl1469蛋白的活性可通过以下方法弱化:1)将所述蛋白的编码多核苷酸部分或完全删除,2)通过修饰表达调节性序列而降低所述多核苷酸的表达,3)对染色体上多核苷酸序列的进行修饰从而弱化所述蛋白的活性,或4)其组合。
在上述方法中,将所述蛋白的编码多核苷酸部分或完全删除可通过采用染色体基因插入载体,将编码内源性目标蛋白的多核苷酸替换成删除了部分核苷酸序列的多核苷酸,或替换成标记基因。“部分”删除的长度可根据多核苷酸的种类而不同,特别可以是2bp-300bp,优选为2bp-100bp,更优选地为2bp-5bp。
同样,通过修饰表达调控序列而降低多核苷酸序列表达可通过采用对核苷酸序列的删除、插入、保守或非保守性替换或其组合来对表达调控序列进行诱导突变,使得表达调控序列的活性进一步弱化,或通过将表达调控序列替换成活性更低的序列。表达调控序列包括一编码启动子的序列、操作序列、核糖体结合位点,以及控制转录和翻译终止的序列。
此外,为了弱化所述蛋白的活性而对染色体上多核苷酸序列进行的修饰,可通过采用对核苷酸序列的删除、插入、保守或非保守性替换或其组合来对序列进行诱导突变,使得所述序列的活性进一步弱化,或通过将多核苷酸序列替换成蛋白活性更低的经修饰序列。
同时,具有增强腐胺产生能力的本发明棒状杆菌属的微生物还可通过进一步修饰来降低在鸟氨酸合成精氨酸中涉及的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的活性和谷氨酸盐释放中涉及的蛋白(NCg11221)的活性至低于其内源型活性,从而 在细胞内积聚腐胺的前体——鸟氨酸。此外,棒状杆菌属微生物可通过额外导入鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性来进行修饰。同样,棒状杆菌属的微生物还可进行以下修饰来强化腐胺前体鸟氨酸的生物合成途径:相较于内源性活性,增强乙酰谷氨酸合成酶的活性从而将谷氨酸盐转化成乙酰谷氨酸盐,增强鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)的活性从而将乙酰鸟氨酸转化为鸟氨酸,增强乙酰谷氨酸激酶(ArgB)的活性从而将乙酰谷氨酸盐转化为乙酰谷氨酰磷酸盐,增强乙酰γ谷氨酰磷酸还原酶(ArgC)的活性从而将乙酰谷氨酰磷酸盐转化为乙酰谷氨酸半醛,和增强乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)从而将乙酰谷氨酸半醛转化为乙酰鸟氨酸。
在本发明中,ArgF、NCgl1221、ODC、ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD可分别具有(但不特定限于)如SEQ ID NO.:21、22、23、24、25、26、27所示的氨基酸序列,或具有与其80%或更高,优选90%或更高,较优选95%或更高,更优选为97%或更高的同源性的氨基酸序列。
如本文所用,术语“鸟氨酸脱羧酶(ODC)”指利用鸟氨酸产生腐胺的酶,所述ODC需要磷酸吡哆醛(吡哆醛5'-磷酸,PLP)作为辅酶,其存在于大部分革兰氏阴性菌中,也可存在于一些肠道菌群中,例如革兰氏阳性的乳酸菌。E.coli有两种编码ODC的基因,其一为speC,在特定浓度下持续表达,而另一种speF则在特定条件(在高于一定浓度的鸟氨酸存在下以及低pH值下)下诱导性表达。根据物种不同,某些物种,如E.coli有两种ODC,而其他仅有一种。有的物种有两种ODC(speC,speF),例如埃希氏菌属(Escherichia sp.)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、枸橼酸杆菌属(Citrobacter sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)和肠杆菌属(Enterobacter sp.),而耶尔森式菌属(Yersinia sp.)、克雷白氏菌属(Klebsiella sp.),欧文氏菌属(Erwinia sp.)等菌株则有一种ODC(speC)。在乳酸菌中,ODC以一种基因(speF)表达,其可以在低pH值或充足的鸟氨酸和组氨酸的条件下诱导性表达。
可采用来源于多个物种的ODC编码基因,将ODC的活性引入本发明棒状杆菌属的重组微生物中。
编码ODC的多核苷酸可包括(但不限于):所述多核苷酸编码的蛋白包含有如SEQ ID NO.:23所示的氨基酸序列,或者与其具有70%或更高、优选80%或更高,更优选90%或更高同源性的氨基酸序列。
此外,将鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性引入微生物中可通过现有技术中很多方法进行,例如,采用将具有编码ODC核苷酸序列的多核苷酸序列插入到染色 体的方法;通过导入载体系统而将所述多核苷酸导入所述微生物的方法;插入含有编码ODC核苷酸序列的多核苷酸、以及活性加强的启动子或对编码ODC核苷酸序列上游进行修饰的的方法;和插入引入了突变的编码ODC核苷酸序列的多核苷酸,更优选地,当导入了编码ODC的核苷酸序列,可采用已知的CJ7启动子作为启动子来控制其表达。
此外,ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD的活性增强可通过如下获得:1)增加编码所述酶的多核苷酸拷贝数;2)对表达调控序列进行修饰以提高多核苷酸的表达;3)对染色体上多核苷酸序列进行修饰从而增强所述酶的活性;或4)以上组合。
在方法1)中,增加编码所述酶的多核苷酸拷贝数可通过将所述多核苷酸操作性连接于所述的载体,或通过将其插入宿主细胞的染色体而获得。更具体地,宿主细胞多核苷酸的拷贝数可通过导入一个能够复制并独立行使功能的载体而增加,其中,编码本发明所述酶的多核苷酸是操作性连接的;也可以或通过导入能够将所述多核苷酸插入宿主细胞染色体的载体而增加,其中所述多核苷酸是操作性连接的。
如本文所用,术语“载体”指的是含有编码目标基因多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建物,其操作性连接于合适的调控序列以在合适的宿主中表达目标蛋白。调控序列包括发起转录的启动子、任意的控制转录的操作性序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列,和控制转录和翻译终止的序列。所述载体可转染至一适合的宿主,然后自宿主染色体进行复制并独立行使功能,并将其自身结合于染色体中。
在本发明中,可采用任何现有技术中已知的、能够在宿主中复制的载体,而无任何特殊限制。常用的载体有自然状态下或重组状态下的质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如,pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A和Charon21A可作为噬菌体载体或黏粒载体,而pBR系统、pUC系统、pBluescriptII系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统and pET系统可用作质粒载体。可用于本发明的载体没有特殊限制,可采用已知的表达载体。优选地,可采用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体。更优选地,可采用pACYC177、pCL、pCC1BAC载体。
此外,所述载体可通过转化入宿主细胞而将编码目标基因的多核苷酸插 入,优选地(但不限于),例如,穿梭载体pECCG112(韩国专利公开号No.1992-0000933),其可在E.coli和类棒状杆菌(Coryneform bacteria)中自我复制。
此外,在染色体中编码目标蛋白的多核苷酸可采用染色体基因插入载体替换成新的多核苷酸。染色体中多核苷酸的插入可采用现有技术中任何已知方法来完成,例如,通过同源重组。由于本发明载体可通过诱导同源重组来插入染色体,可采用额外的选择性标记物来确认基因成功插入染色体。选择性标记物用于筛选转化有载体的细胞,换言之,即为了检测目标多核苷酸是否插入。所述标记物可提供可选择的表型,例如可采用药物抗性、营养缺陷型、有毒物质抵抗性或表面蛋白表达型。在通过选择性物质处理的环境中,只有表达选择性标记的细胞可以存活,或者具有不同表型的细胞会出现,因此可通过这种方法来选择成功转化的细胞。
如本文所用,术语“转染”是指将含有编码目标蛋白的多核苷酸的载体导入到宿主细胞,从而使多核苷酸所编码的蛋白得以表达。被转染的多核苷酸包括所有编码目标蛋白的多核苷酸,其能在宿主细胞中表达而与其定位无关,无论插入到宿主细胞的染色体中还是定位在染色体之外。此外,所述的多核苷酸包括编码所述目标蛋白的DNA和RNA。只要能够导入到宿主细胞中并表达,所述多核苷酸可以任何形式导入。例如,所述多核苷酸可以基因构建物表达盒的形式导入宿主细胞,其含有自我表达所需的所有必须元件。所述表达盒尤其包括操作性连接于所述多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点,和翻译终止信号。表达盒可以是任何能够自我复制的表达载体的形式。此外,所述多核苷酸可以其自己的形式导入到宿主细胞,并操作性连接于宿主细胞表达所需的序列上。
如本文所用,术语“操作性连接”是指在启动或介导编码所述目标蛋白的多核苷酸转录的启动子与所述多核苷酸之间的功能性连接。
此外,所述方法2)修饰表达调节性序列而增强本发明所述多核苷酸的表达可进行如下:通过对核酸序列进行删除、插入、保守或非保守性替换、或其组合从而在所述序列中引入突变,或替换成具有活性增强的氨基酸序列。所述表达调控序列包括启动子、操纵子序列(operator sequence)、核糖体结合位点编码序列、和控制转录和翻译终止的序列。
可将强异源启动子连接于多核苷酸表达单元(unit)的上游以取代原始启动子,强启动子的例子有pcj7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等,更优选为操作性连接的棒状杆菌来源的lysCP1启 动子或pcj7启动子,用于增强编码酶的多核苷酸的表达。其中,lysCP1启动子,是天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的编码多核苷酸启动子核苷酸序列经替换后获得的增强启动子,通过强化天冬氨酸激酶基因的表达使得其较野生型的相应酶活性提高了5倍(国际申请公开号2009-096689)。此外,在搜索产氨棒状杆菌强启动子序列区域时,发现所述pcj7启动子在产氨棒状杆菌和埃希氏菌中表达并具有强启动子活性,且在谷氨酸棒状杆菌中也能够高强度表达。(韩国专利号No.0620092)。
此外,方法3)对染色体上的编码本发明所述酶的多核苷酸序列进行修饰可进行如下:通过对核酸序列进行删除、插入、保守或非保守性替换、或其组合,从而诱导突变以增强所述序列的活性,或可由具有增强活性的核酸序列替换而成。
本发明的微生物是腐胺产生能力增强的微生物,包括原核微生物,其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示,也可以例如是埃希氏菌属、志贺氏菌属、枸橼酸杆菌属、沙门氏菌属和肠杆菌属、耶尔森式菌属、克雷白氏菌属、欧文氏菌属、棒状杆菌属、枯草芽孢杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属(Sllenomanas sp.),和弧菌属。
本发明微生物优选为棒状杆菌属微生物,更优选为谷氨酸棒状杆菌。
在本发明的一个例子中,保藏号为KCCM11138P的棒状杆菌属微生物(韩国专利公开号No.2012-0064046)经突变后,通过增强腐胺生成途径而具有了产生高浓度腐胺的生产活性。具体地,生产腐胺的菌株KCCM11138P是腐胺产生过度的菌株,其中,删除了菌株ATCC13032中编码促进鸟氨酸积聚的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码增加细胞内谷氨酸的谷氨酸外向转运子(NCgl1221)基因,并导入了鸟氨酸脱羧酶(speC)的编码基因,从而增加了鸟氨酸生物合成酶基因(argCJBD)的表达水平。
在本发明的另一个例子中,基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺产生菌株DAB12-a与KCCM11138P突变后的基因型一致。具体地,腐胺产生菌株DAB12-a包括获自美国模式培养物集存库(ATCC)的ATCC13869,其中删除了鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的编码基因和释放谷氨酸的蛋白NCgl1221的编码基因,引入了源自E.coli的鸟氨酸脱羧酶(ODC)编码基因,而鸟氨酸生物合成基因操纵子(argCJBD)的启动子则由增强的启动子替换。
在本发明一个例子中,具有增强的腐胺产生能力的谷氨酸棒状杆菌菌株制备如下:弱化或剔除谷氨酸棒状杆菌KCCM1138P(韩国专利公开号No.2012-0064046)中如SEQ ID NO.:18所示的NCgl1469蛋白活性,其通过删除argF和NCg11221,引入speC并增强argCJBD而具有产生高浓度腐胺的能力(见图1)。
删除了NCgl1469蛋白活性的菌株被命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0163,保藏于韩国微生物保藏中心(在下文中记为KCCM),保藏日期2011年12月26日,批号KCCM11240P。对所述菌株的培养结果显示未产生N-乙酰腐胺,增强的腐胺生产率的增加水平与未产生的N-乙酰腐胺的水平相似,由此可见,NCgl1469具有乙酰化腐胺的活性。
此外,具有增强的腐胺生产能力的谷氨酸棒状杆菌菌株DAB12-aΔNCgl1469制备如下:去除腐胺生产菌株DAB12-a中如SEQ ID NO.:20所示NCgl1469蛋白的活性,菌株的培养结果显示无N-乙酰腐胺产生,且腐胺的产量有所增加。
同时,本发明涉及的生产腐胺的方法包括对腐胺产生能力增强的棒状杆菌属微生物进行培养,其中,将具有如SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示氨基酸序列的NCgl1469蛋白的活性弱化,和从所获得的培养液中分离腐胺。
本发明的培养方法具有现有技术中已知的合适的培养基和培养条件。本领域技术人员较易根据所选的菌株对培养方法进行调整和使用。培养方法的例子包括(但不限于)分批处理、连续和补料分批培养。所采用的培养基必须适当地满足具体菌株的需要。
所用的培养基必须适当地满足具体菌株的需要。用于不同微生物的培养基是已知的(例如,美国细菌学会(华盛顿,USA,1981)的“通用细菌学方法手册”)。可用作培养基的碳源有:糖和碳水化合物(例如,葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素),乳脂和脂肪(例如,大豆油、葵花籽油、花生油和椰油),脂肪酸(例如,棕榈酸、硬脂酸和亚油酸),酒精(例如,丙三醇和乙醇)以及有机酸(例如,醋酸)等。这些物质可单独或混合使用。可用作氮源的有:含氮有机化合物(例如,蛋白胨,酵母提取物,牛肉提取物,麦芽提取物,玉米浆,豆粕粉和尿素)或非有机化合物(例如,硫酸铵,氯化铵,磷酸铵,碳酸铵和硝酸铵),而这些物质也可以单独或混合使用。可用作磷源的有:磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其相应的含钠盐。此外,所述的培养基还可包括生长必要的金属盐(例如,硫酸镁或硫酸铁),最后,还可向上述提及的物质中额外加入必要的生长促进物质,例如氨基酸和维生素。 也可以向培养基中添加合适的前体。向培养基中所提供的供给物质可一次性全部供给或在培养过程中适当加入。
碱性化合物(例如,氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)的合理利用可对培养物的pH值进行调整。可采用发泡剂(例如脂肪酸聚乙二醇酯)来调整发泡。可引入氧气或含氧气体混合物来维持需氧环境,例如,向培养物通空气。代表性地,培养温度为20-45℃,优选为25-40℃。持续培养直至腐胺产生达到所需上限。通常在10-160小时内达到该目标。腐胺可释放入培养基,或存在于细胞中。
为了收集并聚积在本发明培养方法中生产的腐胺,可根据培养方法(例如,分批处理、连续或补料分批培养法)采用本领域所知的合适方法从培养基中收集目标物质。
本发明实施方式
在下文中,将参照实施例瑞本发明进行更具体的描述。然而,这些实施例仅作为举例目的,而本发明不受这些实施例所限。
实施例1 剔除NCgl1469活性的菌株
实施例1-1:根据腐胺产生菌株ATCC13032制备删除了NCgl1469的菌株
为了阻断细胞内腐胺合成N-乙酰腐胺的途径,根据本发明人专利申请中(专利公开号No.2012-0064046)公开的具有腐胺产生活性的棒状杆菌属微生物(KCCM11138P(ATCC13032ΔargFΔNCgl1221P(CJ7)-argCJBDbioAD::P(CJ7)-speC(Ec)),制备去除了NCgl1469编码基因的突变菌株,其制备如下:删除编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的内源性基因和编码涉及谷氨酸释放的谷氨酸外向转运子(NCg11221)的内源性基因,将源自野生型E.coli W3110的鸟氨酸脱羧酶(SpeC)的编码基因导入染色体,并在野生型谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032中替换涉及谷氨酸合成鸟氨酸的酶的编码基因组启动子argCJBD。
具体地,根据ATCC13032菌株的NCgl1469基因核酸序列(SEQ ID NO.:17)(表1),制备引物NCgl1469-del-F1_BamHI和NCgl1469-del-R1_SalI,用于获得 NCgl1469N末端结构域的同源重组片段,制备引物NCgl1469-del-F2_SalI和NCgl1469-del-R2_XbaI,用于获得NCgl1469C末端结构域的同源重组片段。
表1
根据ATCC13032来生产删除了NCgl1469的菌株的引物
NCgl1469-del-F1_BamH1(SEQ ID NO:1) | CGGGATCCAACCTTCAGAACGCGAATAC |
NCgl1469-del-R1_SalI(SEQ ID NO:2) | CGCGTCGACTTGGCACTGTGATTACCATC |
NCgl1469-del-F2_SalI(SEQ ID NO:3) | CGCGTCGACTTGGGTTATATCCCCTCAGA |
NCgl1469-del-R2_XbaI(SEQ ID NO:4) | TGCTCTAGATAGTGAGCCAAGACATGGAA |
为了获得NCgl1469基因的N末端片段和C末端片段,采用一组引物(NCgl1469-del-F1_BamHI&NCgl1469-del-R1_SalI,和NCgl1469-del-F2_SalI&NCgl1469-del-R2_XbaI)和ATCC13032菌株的染色体作为模板进行PCR。PCR反应进行30个循环:95℃下变性30秒、53℃下退火30秒、72℃下延长30秒。
PCR产物在跑过0.8%琼脂糖电泳后,分离并纯化出具有目标大小的DNA条带。然后,N末端结构域的PCR产物和C末端结构域的PCR产物分别采用BamHI&SalI和SalI&XbaI处理,然后克隆至经BamHI&XbaI处理的pDZ载体。所得的用于NCgl1469删除的质粒命名为pDZ-NCgl1469(K/O)。
为了生成KCCM11138PΔNCgl1469菌株,将上述制备的pDZ-NCgl1469(K/O)载体通过电穿孔导入到KCCM11138P菌株中,并置于含有卡那霉素(25μg/ml)的BHIS培养平板(脑心浸液37g/L,山梨醇91g/L,和每升2%的琼脂)。
通过在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的固体培养基中观察到蓝色即确认载体成功插入到染色体中。将单交换(single crossover)菌株在营养培养基中摇晃培养(30℃,8小时),且每一株自10-4至10-10进行连续稀释并置于含有X-gal的固体培养基上。大部分克隆表现为蓝色克隆,很小比例的克隆表现为白色克隆,通过选择白色克隆,就最终筛选出删除了NCgl1469基因的双交换菌株。采用引物为NCgl1469-del-F1_BamHI和NCgl1469-del-R2_XbaI进行PCR,可确认菌株中基因的成功敲除。经PCR确认的菌株命名为KCCM11138PΔNCgl1469。
实施例1-2 根据腐胺产生菌株ATCC13869制备删除NCgl1469的菌株
和根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13032制备腐胺产生菌株KCCM1138P的生产方法一样,本实施例根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13869,制备了另一株腐胺产生菌株,删除了编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的内源性基因和编码涉及谷氨酸释放的谷氨酸外向转运子(NCg11221)的内源性基因,将源自野生型E.coliW3110的鸟氨酸脱羧酶(SpeC)的编码基因引入染色体,并替换涉及谷氨酸合成鸟氨酸的酶的编码基因组启动子argCJBD。所制备的腐胺产生菌株命名为DAB12-a(删除了argF、删除了NCgl1221、引入E.coli speC以及替换了arg操纵子启动子的菌株),而删除了NCgl1469的菌株也根据相同方法制备。
具体地,为了鉴定源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl1469编码基因以及其表达的蛋白氨基酸序列,采用了谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板以及一组引物SEQ ID NO.:5和6(NCgl1469-F and NCgl1469-R)(表2)进行PCR。在此,PCR反应进行了30个循环,95℃下变性30秒、53℃下退火30秒、72℃下延长30秒。PCR产物经电泳分离并对其序列进行分析。通过序列分析,鉴定出源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl1469编码基因含有如SEQ ID NO.:19所示的核苷酸序列,其编码的蛋白含有如SEQ ID NO.:20所示的氨基酸序列。当将源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1469和源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl1469的氨基酸序列进行比较后,其显示出99%的序列同源性。
表2
鉴定源自ATCC13869编码基因的NCgl1469的引物
NCgl1469-F(SEQ ID NO:5) | CATCCTGGGGAATTCATTTGTCAT |
NCgl1469-R(SEQ ID NO:6) | GGCGTTCGACAAAGCCTAATAAG |
制备了命名为pDZ-2'NCgl1469(K/O)的质粒以删除源自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl1469编码基因。首先,采用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板以及如实施例<1-1>一样在表3中列出的引物,对NCgl1469基因的N末端结构域和C末端结构域进行PCR扩增。然后分别采用BamHI&SalI和SalI&XbaI对N末端和C末端结构域的PCR产物进行限制性内切酶消化,然后克隆至经BamHI&XbaI消化的pDZ载体,从而生成pDZ-2'NCgl1469(K/O)质粒。
表3
根据ATCC13869来生产删除了NCgl1469的菌株的引物
2'NCgl1469-del-F1_BamHI(SEQ ID NO:7) | CGGGATCCGTGGCTGCCAGGAATGGCTCC |
NCgl1469-del-H1-SAlI(SEQ ID NO:2) | CGCGTCGACTTGGCACTGTGATTACCATC |
NCgl1469-del-F2_SalI(SEQ ID NO:3) | CGCGTCGACTTGGGTTATATCCCCTCAGA |
2'NCgl1469-del-R2_XbaI(SEQ ID NO:8) | TGCTCTAGACCCAAAACATCCTGGCGGC |
采用实施例<1-1>相同方法,将质粒pDZ-2'NCgl1469(K/O)转染至谷氨酸棒状杆菌DAB12-a,并选择删除了NCgl1469编码基因的菌株。所选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-aΔNCgl1469。
实施例2 NCgl1469活性弱化的菌株
制备替换了NCgl1469起始密码子的菌株,以在能产生腐胺的棒状杆菌属微生物KCCM11138P(韩国专利公开号No.2012-0064046)中弱化腐胺合成N-乙酰腐胺的途径。
具体地,基于源自ATCC13032菌株的NCgl1469核苷酸序列,制备了NCgl1469-gtg-F1和NCgl1469-gtg-R1作为引物,用于获得NCgl1469N末端结构域的同源重组片段,制备了NCgl1469-gtg-F2and NCgl1469-gtg-R2作为引物,用于获得NCgl1469C末端结构域的同源重组片段(表4)。N末端片段和C末端片段结合的位点设计成由GTG替换NCgl1469的初始密码子ATG。
表4
用于生产替换了NCgl1469起始密码子菌株的引物
NCgl1469-gtg-F1(SEQ ID NO:9) | CGGGATCCTGGATTGTATACTGCGACCAC |
NCgl1469-gtg-R1(SEQ ID NO:10) | CAAAACGGTGGGACTCACGGATACCAGAATAGC |
NCgl1469-gtg-F2(SEQ ID NO:11) | GCTATTCTGGTATCCGTGAGTCCCACCGTTTTG |
NCgl1469-gtg-R2(SEQ ID NO:12) | TGCTCTAGATTAAACAGTTGGCATCGCTGG |
为了获得ATCC13032菌株NCgl1469基因的N末端片段和C末端片段,采用两组引物(NCgl1469-gtg-F1&NCgl1469-gtg-R1和NCgl1469-gtg-F2& NCgl1469-gtg-R2)和ATCC13032菌株的染色体作为模板进行PCR。PCR反应采用pfu聚合酶(Stratagene公司)进行30个循环:95℃下变性40秒、53℃下退火40秒、72℃下延长30秒。
当PCR产物在0.8%琼脂糖胶上进行电泳之后,对目标大小的DNA条带进行分离和纯化。然后,将ATCC13032菌株NCgl1469基因N末端结构域和C末端结构域的PCR产物分别融合克隆至经BamHI&XbaI消化的pDZ载体。采用了In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)用于融合克隆。所制备的用于替换NCgl1469起始密码子的质粒被命名为pDZ-NCgl1469(gtg)。
为了获得KCCM11138P NCgl1469(gtg)菌株,通过电穿孔向KCCM11138P中导入所制备的pDZ-NCgl1469(gtg)载体,将转化的细胞平铺置于含有卡那霉素(25μg/ml)的BHIS培养平板上(脑心浸液37g/L,山梨醇91g/L,2%的琼脂,1L基础液)。
通过在含有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的固体培养基中观察到蓝色克隆即确认载体成功插入到染色体中。将单交换(single crossover)菌株在营养培养基中摇晃培养(30℃,8小时),且将每一株自10-4至10-10进行连续稀释并置于含有X-gal的固体培养基上。大部分克隆表现为蓝色克隆,很小比例的克隆表现为白色克隆,通过选择白色克隆,就最终筛选出经双交换替换了NCgl1469基因起始密码子的菌株。此外,采用引物为NCgl1469-del-F1_BamHI和NCgl1469-del-R2_XbaI进行PCR,从而确定所选菌株中序列的替换。经确认的菌株命名为KCCM11138P NCgl1469(gtg)。
实施例3 NCgl1469活性增强的菌株
已知在NCgl1469活性增强的产鸟苷酸谷氨酸棒状杆菌菌株的突变菌株中,鸟苷酸的产量有所增加(Hwang et al.,J Ind Microbiol Biotechnol,37:11,1131-1136,2010),(本实施例)以质粒的形式或插入染色体的形式将编码NCgl1469的多核苷酸引入,用于提高鸟氨酸的产量,并对其效果进行了分析。
实施例3-1:NCgl1469编码基因的克隆并制备含有其的转化体
为了确认NCgl1469基因(包括启动子区域)拷贝数的增加对鸟氨酸和腐胺高产量的影响,实施例1描述了以质粒形式将NCgl1469导入KCCM11138P菌株后产生的突变菌株。
具体地,采用ATCC13032菌株的NCgl1469基因作为模板对NCgl1469编码多核苷酸进行PCR扩增,引物为NCgl1469-300-F_KpnI和NCgl1469-R_XbaI,条件与实施例1相同。通过PCR,可获得大小为900bp的基因片段(表5)。
表5
获得基因NCgl1469的引物
NCgl1469-300-F_KpnI(SEQ ID NO:13) | CGGGGTACCTTCCAACGCTGCTCGGATGAC |
NCgl1469-R_XbaI(SEQ ID NO:14) | TGCTCTAGATTAAACAGTTGGCATCGCTGG |
所获得的基因片段经KpnI和XbaI进行限制性内切酶消化,并克隆至经相同限制性内切酶消化处理的pHC139T-gfp载体内(韩国专利号No.620092),从而产生表达载体pHC139T-NCgl1469。
将所制备的pHC139T-NCgl1469载体导入能够生产腐胺的菌株KCCM11138P中,以提高菌株中的鸟氨酸和腐胺产量。采用电穿孔将载体导入到菌株内,所转化的细胞平铺置于含有25μg/ml卡那霉素的BHIS培养平板上,并选择成功的转化体。所选择的菌株命名为KCCM11138P/pHC139T-NCgl1469。
实施例3-2 染色体插入了NCgl1469编码基因的突变菌株
为了确认染色体额外插入NCgl1469基因(包括启动子区域)对高产鸟氨酸和腐胺的影响,实施例1中描述了通过向KCCM11138P染色体导入NCgl1469后生成的突变菌株。
本发明人开发了一种能够利用棒状杆菌微生物转座子基因定位而使基因插入染色体的转化载体pDZTn(韩国公开号2008-0033054),其也可以同样用于在利用pDZ载体进行的基因导入中。
利用ATCC13032菌株的NCgl1469基因作为模板,以及一组引物(NCgl1469-300-F_Spel和NCgl1469-R_Xhol引物)(表6),通过PCR获得了大小约为900bp的NCgl1469基因片段。
表6
获得NCgl1469基因的引物II
利用pfu聚合酶(Stratagene),PCR反应进行30个循环:95℃下变性40秒,52℃退火40秒,72℃延长60秒。当PCR产物在0.8%琼脂糖胶上进行电泳之后,对目标大小的DNA条带进行分离和纯化。然后,将纯化的NCgl1469基因片段融合克隆至经Spel&Xhol限制性内切酶消化的pDZTn载体。采用了In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)用于融合克隆。所制备的质粒被命名为pDZTn-NCgl1469。
为了获得KCCM11138P Tn::NCgl1469菌株,通过电穿孔将制备的pDZ-NCgl1469载体导入到KCCM11138P菌株,并将所转化的细胞平铺置于含有卡那霉素(25μg/ml)的BHIS培养平板上。通过实施例1中描述的方法对载体成功插入染色体进行确认,并通过此选择在转座子基因位置插入NCgl1469基因的菌株。此外,通过一组引物(NCgl1469-300-F_SpeI_Tn和NCgl1469-R_XhoI_Tn)对突变菌株序列进行PCR验证。经验证的菌株命名为KCCM11138P Tn::NCgl1469。
实施例4 腐胺生产能力的比较
为了研究删除NCgl1469基因、替换起始密码子、提高表达水平和染色体插入基因所引起的效果,对上述制备的腐胺生产菌株的能力进行了评估。
具体地,所制备的菌株在含有1mM精氨酸的CM培养平板(每升中含1%葡萄糖、1%多聚蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%牛肉提取物、0.25%氯化钠、尿素0.2%、50%NaOH100μl、2%琼脂、pH值6.8)中于30℃下培养16小时。将一环细胞培养物接种于25ml表7中浓度的培养基,并于30℃下以200rpm摇晃培养96个小时。在发酵过程中,所有制备的菌株均在加入了1mM精氨酸的培养基中培养。
表7
组分 | 浓度 |
葡萄糖 | 8% |
大豆蛋白 | 0.25% |
玉米浆固体 | 0.50% |
(NH4)2SO4 | 4% |
尿素 | 0.15% |
KH2PO4 | 0.10% |
MgSO47H2O | 0.05% |
生物素 | 100μg |
盐酸硫胺素 | 3000μg |
泛酸钙 | 3000μg |
烟酰胺 | 3000μg |
CaCO3 | 5% |
结果如表8所示:当在腐胺产生菌株KCCM11138P中删除NCgl1469基因而使其功能失活,则无N-乙酰腐胺产生。同样,腐胺产量水平比对照组高2.6g/L,证明在删除了NCgl1469基因的菌株中,腐胺的产量有所提高。
此外,当替换了NCgl1469基因起始密码子,NCgl1469的功能有所减弱,在具有腐胺生产能力的KCCM11138P微生物中所正常产生的N-乙酰腐胺产生水平下降约达3g/L。这表示,N-乙酰腐胺的产生能力下降了一半。
与KCCM11138P相似,从源自ATCC13869的腐胺产生菌株DAB12-a中删除了NCgl1469基因后,NCgl1469基因功能失活,无N-乙酰腐胺产生,但腐胺的产量却上升了。
这些结果显示,弱化或剔除NCgl1469基因降低或阻断了腐胺向N-乙酰腐胺的生成途径,且NCgl1469基因的表达蛋白作用于乙酰腐胺。
同时,当NCgl1469的活性提高,细胞培养物中N-乙酰腐胺的比例高于对照组,但质粒的基因表达和染色体额外插入基因对于NCgl1469活性增加来说没有差异。
当在普通鸟氨酸产生菌株中增强NCgl1469基因活性时,谷氨酸向乙酰谷氨酸转化途径也增强,鸟氨酸的产量增加(韩国专利公开号No.2011-0080475)。然而,在本发明中,由于大部分鸟氨酸均转化为腐胺,因此并没有鸟氨酸的积聚。
与常规方法的结果不同可归结于NCgl1469基因表达蛋白更易识别腐胺而 非谷氨酸,因此,N-乙酰腐胺的产量就比乙酰谷氨酸该更高。
表8
本发明人通过在转化的能够产生腐胺的棒状杆菌微生物KCCM11138P(韩国专利公开号No.2012-0064046)(描述于实施例1-1)中删除NCgl1469基因,从而制备了腐胺产量提高而不产生N-乙酰腐胺的谷氨酸棒状杆菌菌株,该菌株命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0163,根据布达佩斯条约,在2011年12月26日保藏于国际保藏组织韩国微生物培养中心(在下文中记为“KCCM”),保藏号为KCCM11240P。
基于以上描述,本领域技术人员应理解,在不改变本发明技术理念或必要技术特征的情况下,可以其他形式对本发明进行实施。就这一点而言,以上所述的实施例用于对本发明进行各方面的描述,但本发明并不受限于此。应理解,本发明的范围包括对以下权利要求含义、范围和等同概念所衍生任何改变和修饰形式,而并非仅为以上的具体描述。
保藏证明
致:CJ第一制糖株式会社 由页面底部签章的国际保存管理机构
韩国,首尔 根据条约7.1的规定颁发的保藏证明
Claims (11)
1.一种经修饰的提高腐胺生产能力的棒状杆菌微生物,其中,具有如SEQ IDNO.:18或SEQ ID NO.:20所示氨基酸序列的蛋白活性与其内源性蛋白活性相比有所弱化或剔除。
2.如权利要求1所述的微生物,其特征在于,还向其引入了鸟氨酸脱羧酶(ODC)的活性。
3.如权利要求2所述的微生物,其特征在于,ODC具有如SEQ ID NO.:23所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的微生物,其特征在于,一种或多种选自下组物质的活性相较于其内源性的活性进一步有所弱化:鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)或谷氨酸外向转运子(NCgl1221)。
5.如权利要求4所述的微生物,其特征在于,ArgF具有如SEQ ID NO.:21所示的氨基酸序列,和NCgl1221具有如SEQ ID NO.:22所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的微生物,其特征在于,一种或多种选自下组物质的活性进一步有所提高:乙酰γ谷酰基磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合成酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB),和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。
7.如权利要求6所述的微生物,其特征在于,ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD分别具有如SEQ ID NO.:24、25、26和27所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的微生物,其特征在于,所述蛋白活性的弱化通过:1)将所述蛋白的编码多核苷酸部分或全部删除、2)降低多核苷酸的表达、3)对染色体的多核苷酸序列进行修饰从而弱化所述蛋白的活性,或4)其组合。
9.如权利要求1所述的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
10.一种生产腐胺的方法,包括对经修饰后具有增强的腐胺生产能力的棒状杆菌属微生物进行培养,其特征在于,具有如SEQ ID NO.:18或SEQ ID NO.:20所示氨基酸序列的蛋白的活性较其内源性活性有所弱化或剔除;和从所获得的细胞培养物中分离腐胺。
11.如权利要求10所示的生产腐胺的方法,其特征在于,所述棒状杆菌属微生物是谷氨酸棒状杆菌。
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