KR101493585B1

KR101493585B1 - 퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101493585B1
Application number: KR1020130003648A
Authority: KR
Inventors: 최수진; 최향; 강민선; 전성후; 이경민; 엄혜원; 양영렬
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2013-01-11
Publication date: 2015-02-16
Also published as: IN2014MN01331A; US9677099B2; DK2803721T3; MY170632A; EP2803721B1; WO2013105827A3; AU2016203949B2; JP2015507479A; EP2803721A4; US20150104838A1; JP5878246B2; ES2655764T3; RU2014128243A; KR20130082478A; AU2013208344A1; EP2803721A2; AU2016203949A1; PL2803721T3; CN104066835B; BR112014017091A2

Abstract

본 발명은 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움속 미생물에서 NCgl1469 활성이 약화되어 높은 수율로 퓨트레신을 생산할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법 {MICROORGANISMS FOR PRODUCING PUTRESCINE AND PROCESS FOR PRODUCING PUTRESCINE USING THEM}

본 발명은 퓨트레신의 분해능을 약화시킴으로써 퓨트레신 생산능이 향상된 변이 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

퓨트레신(putrescine 또는 1,4-butanediamine)은 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine) 등과 같은 폴리아민(polyamine)의 일종으로, 그람 음성 박테리아나 곰팡이에서 발견되며, 다양한 종에서 고농도로 존재하기 때문에 미생물의 대사에 중요한 역할을 수행할 것으로 예측되고 있다. 퓨트레신은 주로 프로필렌(propylene)으로부터 아크릴로니트릴 (acrylonitrile) 및 숙시노니트릴(succinonitrile)을 거치는 화학 합성법으로 생산된다. 이 화학 합성법은 석유 화학 물질 유래로 출발하며 유독성 물질 등을 사용하여 환경친화적이지 못하며 석유자원의 고갈문제를 안고 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 보다 환경친화적이고 에너지소비를 절감할 수 있도록 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생합성하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 지금까지 알려진 바에 의하면, 퓨트레신은 미생물에서 두가지 경로를 통하여 생합성될 수 있다. 하나는 글루타메이트(glutamate)로부터 오르니틴(ornithine)을 생성하고, 상기 오르니틴을 디카복실화(decarboxylation)시켜서 퓨트레신을 합성하는 경로이고, 다른 하나는 상기 합성된 오르니틴으로부터 합성된 아르기닌을 사용하여 아그마틴(agmatine)을 생성하고, 상기 아그마틴으로부터 퓨트레신을 합성하는 경로이다. 아울러, 이처럼 공지된 퓨트레신 합성경로에 관여하는 효소를 이용하여 목적하는 미생물을 형질전환 시켜서 퓨트레신을 합성하는 방법 역시 연구되고 있다. 예를 들어, WO09/125924에는 대장균에 존재하는 퓨트레신의 분해 및 이용에 관여하는 경로를 불활성화 시키고, 퓨트레신의 전구체인 오르니틴이 아르기닌으로 전환되는 경로를 불활성화 시키며, 오르니틴 생합성 경로를 강화함으로써 퓨트레신을 고수율로 제조하는 방법이 개시되어 있다. 2009년에 발표된 논문에서는 퓨트레신 생산능이 없는 코리네박테리움 속 균주에 오르니틴을 퓨트레신으로 전환시키는 단백질을 도입하고, 활성을 강화하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 개시되어 있다(Qian et al., Biotechnol Bioeng, 104:4, 651-662, 2009).

상기 생산된 퓨트레신은 미생물에 의하여 분해되거나 또는 다른 대사에 이용될 수 있다. 예를 들어, 대장균, 코리네박테리움 글루타미쿰 등에서 발현되는 스퍼미딘 신테이즈(spermidine synthase, EC:2.5.1.16, speE)는 퓨트레신으로부터 스퍼미딘을 합성하고, 캔디다 보이디니에서 발현되는 아세틸 트랜스퍼레이즈(N-acetyltransferase)는 퓨트레신을 N-아세틸 퓨트레신(N-acetylputrescine)으로 아세틸화시킨다. 대장균에서는 상기아세틸 트랜스퍼레이즈와 높은 상동성을 나타내는 스퍼미딘 아세틸 트랜스퍼레이즈(EC: 2.3.1.57. speG)의 활성이 약화되도록 변이시킬 경우 퓨트레신을 고농도로 생산할 수 있다고 알려져 있다(한국등록특허 제1188432호).

아직까지는 코리네박테리움 속 미생물에 있어서 퓨트레신을 N-아세틸 퓨트레신으로 아세틸화시키는 효소가 규명되어 있지 않으나, 히스톤 아세틸 트랜스퍼레이즈 HPA2 및 관련 아세틸 트랜스퍼레이즈(histone acetyltransferase HPA2 and related acetyltransferase)인 NCgl1469를 암호화하는 것으로 알려진 유전자를 결손시켰을 때 다이아민류인 카다베린의 N-아세틸화가 특이적으로 감소되는 것으로 알려져 있다(Kind et al ., Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175-5180, 2010). 그러나, 상기 NCgl1469는 퓨트레신 및 1,3-diaminopropane을 기질로 사용하지 않은 것으로 확인되었으며, 즉, 상기 NCgl1469가 다이아민 중 카다베린에만 특이적 활성을 가지는 것으로 추정되었다. 한편, 고농도 오르니틴 및 아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl1469는 아세틸 글루타메이트 신테이즈 및 오르니틴 아세틸 트랜스퍼레이즈 활성을 나타내며, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰에서 NCgl1469를 과발현시키면 오르니틴 및 아르기닌을 고수율로 생산할 수 있다고 알려져 있다(한국등록특허 제1174267호). 이처럼 NCgl1469는 글루타메이트 및 카다베린에 대한 특이적 활성과 오르니틴의 생산성을 증가시키는 효과에 대하여는 알려져 있으나, 퓨트레신의 생산과 관련하여서는 전혀 알려지지 않았다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 퓨트레신을 생산하도록 변이된 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl1469의 활성을 저하시키면 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 NCgl1469의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시킴으로써, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 고농도로 퓨트레신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 NCgl1469 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명의 용어 "NCgl1469 단백질"은 코리네박테리움 글루타미쿰에서 히스톤 아세틸 트렌스퍼레이즈 HPA2 및 관련 아세틸 트렌스퍼레이즈(histone acetyltransferase HPA2 and related acetyltransferase)로 정의되는 단백질로 그 기능이 구체적으로 밝혀지지 않았지만, 글루타메이트 및 카다베린을 아세틸화시키는 것으로 확인된 바 있다(대한민국 특허공개번호 제10-2011-0080475호, Hwang et al ., J Ind Microbiol Biotechnol , 37:11, 1131-1136, 2010, Kind et al ., Appl Environ Microbiol, 76:15, 5175-5180, 2010).

본 발명의 NCgl1469 단백질은 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다. 그러나 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명에서 제시한 대로 단백질의 활성을 약화시킴으로써 퓨트레신 생산성 증가에 도움이 될 수 있는 단백질인 한, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열의 하나 이상의 위치에서의 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가 등을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질 돌연변이체 또는 인위적인 변형체일 수 있다. 여기에서, "수개"란, 단백질의 아미노산 잔기의 입체 구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 20개, 바람직하게는 2에서 10개, 보다 바람직하게는 2에서 5개이다. 또한, 이러한 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위 등에는 상기 폴리펩티드의 활성을 함유하는 미생물의 개체 또는 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 생기는 돌연변이 또는 인위적인 변이(variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다.

본 발명에 기재된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032유래의 NCgl1469 단백질은 서열번호 18로 기재되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열과 99% 상동성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl1469 단백질은 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 NCgl1469 단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호 18 또는 서열번호 20의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 각각 서열번호 17 또는 서열번호 19로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17 또는 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프로브(probe)와 "엄격한 조건"에서 혼성화될 수 있으며, 정상적으로 기능하는 단백질을 암호화하는 변이형일 수 있다. 본 발명에서 "엄격한 조건(stringent conditions)"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미하는 것이며, 예를 들어, Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al ., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989) 또는 Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있으며, 예컨대, 65℃의 혼성화 완충액(3.5 × SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5　mM NaH₂PO₄ (pH 7), 0.5% SDS, 2　mM EDTA)에서의 혼성화를 기재하고 있다. SSC는 pH 7의 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을 실온에서 2 X SSC로 세척하고 나서, 68℃의 온도에서 0.1 내지 0.5 X SSC/0.1 X SDS로 세척한다.

본 발명에서 NCgl1469 단백질의 활성 약화는 단백질의 활성이 내재적 활성보다 감소되거나 활성이 제거되는 것을 의미하며, 1) 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 또는 4) 이의 조합에 의해 달성될 수 있다.

상기 방법 중에서, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 2에서 300개, 바람직하게는 2에서 100개, 보다 바람직하게는 1에서 5개이다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 본 발명의 단백질을 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

한편, 본 발명의 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물은 퓨트레신의 전구체인 오르니틴을 세포내에 축적하기 위하여, 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF) 및 글루타메이트의 배출에 관여하는 단백질(NCgl1221)의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시키도록 추가로 변이될 수 있다. 뿐만 아니라, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성을 도입하도록 변이될 수 있고, 퓨트레신 전구체인 오르니틴 생합성 경로 강화를 위해 글루타메이트를 아세틸 글루타메이트로 전환시키는 아세틸 글루타메이트 신테이즈 또는 아세틸 오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸 트랜스퍼레이즈(ArgJ), 아세틸 글루타메이트를 아세틸 글루타밀 포스페이트로 전환시키는 아세틸 글루타메이트 카이네이즈(ArgB), 아세틸 글루타밀 포스페이트를 아세틸 글루타메이트 세미알데하이드로 전환시키는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕테이즈(ArgC) 및 아세틸 글루타메이트 세미알데하이드를 아세틸 오르니틴으로 전환시키는 아세틸 오르니틴 아미노 트랜스퍼레이즈(ArgD)의 활성을 내재적 활성에 비하여 증대시키도록 추가로 변이될 수 있다.

이때, 상기 ArgF, NCgl1221, ODC, ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 각각 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)"란, 오르니틴을 이용하여 퓨트레신을 생성하는 효소를 의미하는데, 상기 ODC는 조효소로서 피리독살 포스페이트 (Pyridoxal 5'-phosphate, PLP)를 필요로 하고 대부분의 그람음성균에 존재하며, 그람 양성균 중에서 락토바실러스(Lactobacillus)와 같은 장내 세균중의 일부에 존재할 수 있다. 대장균의 경우 ODC를 암호화하는 유전자는 두 종류가 있는데, 그 중 하나인 speC는 지속적으로 일정 농도로 발현되고, 다른 하나인 speF는 특정 조건 (오르니틴이 일정농도 이상 존재 및 낮은 pH 조건)하에서 발현이 유도되는 유전자이다. 종에 따라 대장균처럼 2종류의 ODC를 가진 종도 있고, 한가지 종류만 갖는 있는 종도 있다. 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 등의 종에서는 두 종류의 ODC (speC, speF)를, 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) 등의 균주는 한 종류의 ODC (speC)를 갖는다. 유산균의 경우 ODC가 한 종류의 유전자 (speF)에서 발현되며, 낮은 pH나 오르니틴(ornithine)과 히스티딘(histidine)이 풍부한 조건에서 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 재조합 코리네박테리움 속 미생물은 상기 여러 종 유래의 ODC 코딩 유전자를 이용하여 ODC 활성이 도입될 수 있다.

상기 ODC를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 23의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

아울러, 미생물에 오르니틴 디카르복실라아제(ODC)의 활성을 도입하는 것은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어, ODC를 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 ODC를 도입하는 방법, ODC를 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 ODC를 코딩하는 염기서열을 도입할 경우, 이의 발현을 조절하기 위한 프로모터로서 공지된 CJ7 프로모터를 사용할 수 있다.

아울러, 상기 ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD의 활성증대는 1) 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는 구체적으로, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 pACYC177, pCL, pCC1BAC 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 숙주세포로 형질전환되어 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입시킬 수 있는 벡터로 바람직하게는 대장균과 코리네형 세균에서 양방으로 자가복제가 가능한 셔틀벡터 pECCG112 벡터(특허공개번호 1992-0000933)를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 신규 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동 재조합을 일으켜서, 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있는데, 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질이 발현될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하든지 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기 용어 "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드 발현단위의 상단부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터 혹은 pcj7 프로모터가 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있다. 여기서 lysCP1 프로모터는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 부위 염기서열 치환을 통해 개량한 프로모터로서 아스파테이트 키나제 유전자의 발현량 증대를 통해 당 효소의 활성을 야생형 대비 5배 정도 높일 수 있는 강력한 프로모터이다 (국제 공개특허 제2009-096689호). 또한 pcj7 프로모터는 코리네박테리움 암모니아게네스로부터 강력한 프로모터 서열을 갖는 영역을 탐색하던 중 코리네박테리움 암모니아게네스 및 에세리키아에서 발현가능하고, 강력한 프로모터 활성을 갖는 것이 확인된 프로모터로서 코리네박테리움 글루타미쿰에서 역시 높은 강도로 발현 가능한 프로모터이다 (대한민국 등록특허 제0620092호).

아울러, 3) 본 발명의 효소를 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 미생물은 퓨트레신 생산능이 향상된 미생물로서, 상기 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 단백질이 발현되는 원핵 미생물을 포함하며, 이의 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.)에 속하는 미생물일 수 있다.

바람직하게 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이며, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태에서는 글루타메이트에서 퓨트레신 생성 경로가 강화되어 고농도 퓨트레신 생산능을 갖는, 기탁번호 KCCM11138P의 코리네박테리움 속 미생물 (대한민국 특허공개번호 제2012-0064046호)을 변이시켰다. 구체적으로, 퓨트레신 생산균주 KCCM11138P는 ATCC13032 균주에서 오르니틴 축적을 위한 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF)를 코딩하는 유전자 및 세포내 글루타메이트를 증가시키기 위한 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 코딩하는 유전자가 결손되며, 오르니틴 디카르복실라아제(speC)를 코딩하는 유전자가 도입되고, 오르니틴 생합성 유전자(argCJBD)의 발현량이 증가된 퓨트레신 과생산 균주이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 상기 KCCM11138P와 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a를 변이시켰다. 구체적으로, 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수한 ATCC13869 균주에서 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF)를 코딩하는 유전자 및 글루타메이트 배출 단백질 NCgl1221을 코딩하는 유전자는 결손되고, 대장균 유래 오르니틴 디카르복실라아제(OCD)를 코딩하는 유전자(speC)가 도입되며, 오르니틴 생합성 유전자 오페론(argCJBD)의 프로모터가 개량된 프로모터로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, argF 및 NCgl1221가 결손되고, speC 도입 및 argCJBD가 강화되어 고농도 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 KCCM11138P(대한민국 특허공개번호 제2012-0064046호)에서 서열번호 18로 기재되는 NCgl1469 단백질의 활성을 약화시키거나 결실시켜 퓨트레신 생산능이 증가한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다(도 1 참조).

상기에서 NCgl1469 단백질의 활성이 결실된 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) CC01-0163으로 명명하고, 2011년 12월 26일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11240P로 기탁하였다. 상기 균주의 배양 결과, N-아세틸 퓨트레신이 생성되지 않고, 퓨트레신 생산성이 향상되었으며, 상기 향상된 수준은 생성되지 않은 N-아세틸 퓨트레신의 수준과 유사하여, NCgl1469가 퓨트레신을 아세틸레이션시키는 활성을 가짐을 알 수 있었다.

또한, 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a에서 서열번호 20으로 기재되는 NCgl1469 단백질의 활성을 결실시켜 퓨트레신 생산능이 증가한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DAB12-a△NCgl1469를 제작하였으며, 균주의 배양 결과, N-아세틸 퓨트레신이 생성되지 않고, 퓨트레신 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명은 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 NCgl1469 단백질의 활성을 약화시킨, 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및

상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조절할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 원하는 퓨트레신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. 퓨트레신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 수집 및 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다.

본 발명에서는 NCgl1469 단백질의 활성을 내재적 활성보다 약화시켜 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였으며, 이를 이용하여, 산업적으로 널리 사용되는 퓨트레신을 고농도로 생산할 수 있다.

도 1은 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 퓨트레신 생합성 경로와 관련 유전자를 나타낸 개략도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1. NCgl1469 활성이 결실된 균주

실시예 1-1. ATCC13032 기반 퓨트레신 생산균주에서의 NCgl1469 결손균주 제작

본 발명자들의 특허출원(특허공개 제2012-0064046호)에 개시된, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC13032에서 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자(argF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자가 결손되고, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)가 염색체 내에 도입되며, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 유전자군의 프로모터를 치환함으로써 제작된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물(KCCM11138P(ATCC13032ΔargFΔNCgl1221P(CJ7)-argCJBD bioAD::P(CJ7)-speC(Ec))을 기초로 하여, 세포내에서 퓨트레신이 N-아세틸 퓨트레신으로 합성되는 경로를 차단시키기 위하여 NCgl1469을 코딩하는 유전자를 결실시킨 변이균주를 제작하였다.

구체적으로, ATCC13032 균주의 유전자 NCgl1469의 염기서열(서열번호 17)을 바탕으로 NCgl1469의 N-말단 부분의 상동 재조합 단편을 얻기 위한 프라이머로 NCgl1469-del-F1_BamHI, NCgl1469-del-R1_SalI을 제작하였고, NCgl1469의 C-말단 부분의 상동 재조합 단편을 얻기 위한 프라이머로 NCgl1469-del-F2_SalI, NCgl1469-del-R2_XbaI를 제작하였다(표 1).

[표 1]

NCgl1469 유전자의 N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편을 얻기 위해, ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 하고, 상기 프라이머 조합(NCgl1469-del-F1_BamHI & NCgl1469-del-R1_SalI와 NCgl1469-del-F2_SalI & NCgl1469-del-R2_XbaI)을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다.

PCR 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제한 뒤, N-말단 부분과 C-말단 부분의 PCR 산물을 각각 BamHI & SalI과 SalI & XbaI를 처리하고, BamHI & XbaI으로 처리한 pDZ 벡터에 클로닝하였다. 그 결과 얻어진 NCgl1469 결실에 사용할 플라스미드를 pDZ-NCgl1469(K/O)라 명명하였다.

KCCM11138PΔNCgl1469 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZ-NCgl1469(K/O) 벡터를 KCCM11138P 균주에 전기 천공법을 이용하여 도입한 뒤 kanaymycine(25 ㎍/㎖)이 함유된 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/L, sorbitol 91 g/L, agar 2%, 1L 기준)에 도말하였다.

벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부로 판별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕 배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차(crossover)에 의해 최종 NCgl1469 유전자 결실 균주를 선별하고 추가적으로 NCgl1469-del-F1_BamHI과 NCgl1469-del-R2_XbaI 프라이머를 이용해 PCR로 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM11138PΔNCgl1469로 명명하였다.

실시예 1-2. ATCC13869 기반 퓨트레신 생산균주에서의 NCgl1469 결손균주 제작

상기의 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주 KCCM11138P를 제작한 방법과 동일하게, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869를 기반으로 염색체 내 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자(argF) 및 글루타메이트 배출에 관여하는 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)를 암호화하는 유전자를 결손시키고, 야생형 대장균 W3110 균주 유래의 오르니틴 디카복실레이즈(ODC)를 암호화하는 유전자(speC)를 염색체 내에 도입시키고, 글루타메이트에서 오르니틴 합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있는 argCJBD 유전자군의 프로모터를 치환함으로써 퓨트레신 생산균주를 제작하였으며, 제작된 퓨트레신 생산 균주를 DAB12-a(argF 결손, NCgl1221 결손, 대장균 speC 도입, arg 오페론 프로모터 치환)로 명명하고, 이를 대상으로 NCgl1469 결손 균주를 제작하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl1469를 코딩하는 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질 서열을 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 5 및 6 (NCgl1469-F, NCgl1469-R)의 프라이머 쌍(표 2)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 53℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 2분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후 서열분석을 수행한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl1469를 코딩하는 유전자는 서열번호 19로 기재되는 염기서열을 포함하며, 이로부터 코딩되는 단백질은 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 확인되었다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl1469와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl1469의 아미노산 서열을 비교한 결과, 이들은 99%의 서열 상동성을 갖는 것으로 확인되었다.

[표 2]

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl1469를 코딩하는 유전자를 결실시키기 위해 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 표 3에 기재된 2쌍의 프라이머를 이용하여 NCgl1469 유전자의 N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편을 PCR로 증폭시키고, PCR 산물을 각각 BamHI & SalI과 SalI & XbaI으로 처리하고, BamHI & XbaI을 처리한 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-2'NCgl1469(K/O)를 제작하였다.

[표 3]

상기 플라스미드 pDZ-2'NCgl1469(K/O)를 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a에 형질전환하여 NCgl1469를 코딩하는 유전자가 결실된 균주를 선발하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-a△NCgl1469로 명명하였다.

실시예 2. NCgl1469 의 활성이 약화된 균주

퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물 KCCM11138P(대한민국 특허공개번호 제2012-0064046호)에서 퓨트레신이 N-아세틸 퓨트레신으로 합성되는 경로를 약화시키기 위해 NCgl1469의 개시코돈이 치환된 균주를 제작하였다.

구체적으로, ATCC13032 균주의 유전자 NCgl1469의 염기서열을 근간으로 N-말단 부분의 상동 재조합 단편을 얻기 위한 프라이머로 NCgl1469-gtg-F1, NCgl1469-gtg-R1을 제작하였고, C-말단 부분의 상동 재조합 단편을 얻기 위한 프라이머로 NCgl1469-gtg-F2, NCgl1469-gtg-R2를 제작하였다(표 4). N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편이 결합되는 부위는 NCgl1469 유전자의 개시코돈인 ATG 염기서열 대신 GTG 염기서열로 치환되도록 하였다.

[표 4]

ATCC13032 균주의 NCgl1469 유전자의 N-말단 부분 단편과 C-말단 부분 단편을 얻기 위해, ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 하고 상기 프라이머 2가지 조합(NCgl1469-gtg-F1 & NCgl1469-gtg-R1와 NCgl1469-gtg-F2 & NCgl1469-gtg-R2)을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 pfu polymerase (Strategene 제품)를 이용하여, 변성(Denaturation) 95℃ 40초, 어닐링(Annealing), 52℃ 40초, 신장(Elongation) 72℃ 30초를 30회 반복 수행하였다.

PCR 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제한 뒤, ATCC13032 균주의 NCgl1469 유전자의 N-말단 부분과 C-말단 부분의 PCR 산물을, BamHI & XbaI을 처리한 pDZ 벡터에 각각 퓨전(fusion) 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 그 결과 수득한 NCgl1469 개시코돈 치환에 사용할 플라스미드를 pDZ-NCgl1469(gtg)로 명명하였다.

KCCM11138P NCgl1469(gtg) 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZ-NCgl1469(gtg) 벡터를 KCCM11138P 균주에 전기 천공법(electroporation)을 이용하여 도입한 뒤 kanaymycine(25 ㎍/㎖)이 함유된 BHIS 평판 배지 (Braine heart infusion 37 g/L, sorbitol 91 g/L, agar 2%, 1L 기준)에 도말하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부로 판별하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕 배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차(crossover)에 의해 최종 NCgl1469 개시코돈 치환 균주를 선별하고 추가적으로 NCgl1469-del-F1_BamHI과 NCgl1469-del-R2_XbaI 프라이머를 이용해 PCR 후, 서열을 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM11138P NCgl1469(gtg)로 명명하였다.

실시예 3. NCgl1469 활성이 강화된 균주

오르니틴을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 NCgl1469의 활성이 증가된 변이균주에서는 오르니틴의 생산성이 증가된다고 알려져 있으므로(Hwang et al., J Ind Microbiol Biotechnol, 37:11, 1131-1136, 2010), 오르니틴의 생산성을 증대시키기 위하여 NCgl1469를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 형태 또는 염색체 내 삽입 형태로 도입하여 그의 효과를 확인하고자 하였다.

실시예 3-1: NCgl1469 를 코딩하는 유전자의 클로닝 및 형질전환체의 제작

NCgl1469 유전자(프로모터 부위 포함)의 카피수 증가를 통한 오르니틴과 퓨트레신 고생산 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 개시된 KCCM11138P를 기초로 하여 NCgl1469가 플라스미드 형태로 도입된 변이균주를 제작하였다.

구체적으로, 상기 ATCC13032 균주의 유전자 NCgl1469를 주형으로 하고, 상기 NCgl1469를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 프라이머(NCgl1469-300-F_KpnI 및 NCgl1469-R_XbaI)를 사용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여, 약 900bp의 크기를 가지는 유전자 단편을 수득하였다(표 5).

[표 5]

상기 수득한 유전자 단편을 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 처리하고, 동일한 제한효소로 처리된 pHC139T-gfp 벡터(한국등록특허 제620092호)에 클로닝하여, 발현벡터 pHC139T-NCgl1469를 제작하였다.

균주 내 오르니틴 및 퓨트레신 생산량을 증가시키기 위해 상기 제작한 pHC139T-NCgl1469 벡터를 퓨트레신 생산능을 갖는 균주 KCCM11138P에 도입하였다. 전기 천공법을 이용하여 균주에 도입한 뒤 25 ㎍/㎖ kanaymycine이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하여 형질 전환체를 선별하였다. 선별된 균주를 KCCM11138P/ pHC139T-NCgl1469로 명명하였다.

실시예 3-2: NCgl1469 를 코딩하는 유전자가 염색체내로 도입된 변이균주

NCgl1469 유전자(프로모터 부위 포함)의 염색체 내로의 추가 삽입을 통한 오르니틴과 퓨트레신 고생산 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 개시된 KCCM11138P을 기초로 하여 NCgl1469가 염색체내에 도입된 변이균주를 제작하였다.

코리네박테리움 속 미생물의 트렌스포존 유전자 부위를 이용하여 염색체 내 유전자 도입을 가능하게 하는 형질전환용 벡터 pDZTn(대한민국 공개출원번호 제2008-0033054호)은 본 발명자들이 개발한 벡터로서 pDZ 벡터를 사용한 유전자 도입 방법과 동일하게 진행할 수 있다.

NCgl1469 유전자는 ATCC13032 균주의 염색체를 주형으로 하고 NCgl1469-300-F_SpeI, NCgl1469-R_XhoI 프라이머(표 6)를 이용하는 PCR에 의해 약 900 bp의 크기를 가지는 유전자 단편을 수득하였다.

[표 6]

PCR 조건은 pfu polymerase(Strategene 제품)를 이용하여, 변성(Denaturation) 95℃ 40초, 어닐링(Annealing) 52℃ 40초, 신장(Elongation) 72℃ 60초를 30회 반복 수행하였다. PCR 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. SpeI & XhoI로 처리한 pDZTn 벡터에 상기에서 얻어진 NCgl1469 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드를 pDZTn-NCgl1469라 명명하였다.

KCCM11138P Tn::NCgl1469 균주를 얻기 위해, 상기에서 제작된 pDZTn-NCgl1469 벡터를 KCCM11138P 균주에 전기 천공법을 이용하여 도입한 뒤 kanaymycine(25 ㎍/㎖)이 함유된 BHIS 평판 배지에 도말하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입 판별은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 트렌스포존 유전자 위치에 NCgl1469 유전자가 삽입된 균주를 선별하고, 추가적으로 NCgl1469-300-F_SpeI_Tn과 NCgl1469-R_XhoI_Tn 프라이머를 이용해 PCR로 확인하였다. 확인된 균주를 KCCM11138P Tn::NCgl1469 라 명명하였다.

실시예 4. 퓨트레신 생산능의 비교

NCgl1469 유전자의 유전자 결실, 개시코돈 치환, 발현양 강화, 염색체 내 도입으로 인한 효과를 알아보기 위해, 상기 제작된 균주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 평가하였다.

구체적으로, 상기에서 제작된 균주들을 1 mM 아르기닌이 포함된 CM 평판 배지(포도당 1%, polypeptone 1%, 효모추출물 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 ㎕, agar 2%, pH 6.8, 1L 기준)에서 30℃에서 16시간 배양한 후, 표 7의 25 ㎖ 역가 배지에 한 백금이 정도 접종한 다음, 이를 30℃에서 200rpm으로 96시간동안 진탕배양하였다. 제작된 모든 균주의 경우 발효시 배지에 1mM 아르기닌을 첨가하여 배양하였다.

[표 7]

그 결과, 하기 표 8에서 보는 바와 같이, 퓨트레신 생산균주 KCCM11138P에서 NCgl1469 유전자를 결실시켜 그 기능이 불활성화된 경우, N-아세틸 퓨트레신이 생성되지 않고, 퓨트레신 생산이 대조 균주 대비 2.6 g/L 증가하여, 퓨트레신이 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

또한, NCgl1469 유전자의 개시코돈을 치환시켜 그 기능이 약화된 경우, 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물 KCCM11138P 균주에서 생성되었던 N-아세틸 퓨트레신이 3 g/L 감소하여, N-아세틸 퓨트레신 생산량이 절반 이하로 감소함을 확인할 수 있었다.

KCCM11138P와 마찬가지로 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산균주 DAB12-a에서 NCgl1469 유전자를 결실시켜 그 기능이 불활성화된 경우에도 N-아세틸 퓨트레신이 생성되지 않았으며 퓨트레신 생산성이 향상되었다.

상기와 같은 결과는 NCgl1469 유전자의 약화 또는 결실에 의해, 퓨트레신에서 N-아세틸 퓨트레신으로의 경로가 약화되거나 차단되었음을 보여주며, NCgl1469 유전자로부터 발현된 단백질이 퓨트레신을 아세틸레이션(acetylation) 시키는 기능을 한다는 것을 보여준다.

한편, NCgl1469의 활성을 증가시킨 경우에는 대조군에 비하여 배양물내의 N-아세틸 퓨트레신의 함량이 증가하였으며, 유전자의 플라스미드 발현의 경우와 염색체내 유전자 추가도입의 경우의 모두 NCgl1469의 활성을 증가시킨 방법에 따른 차이는 나타나지 않았다.

종래의 오르니틴 생산 균주에서 NCgl1469 유전자를 강화시켰을 때, 글루타메이트에서 아세틸 글루타메이트로 전환 경로가 강화되었고, 오르니틴 생산이 증가된 것을 확인한 바 있는데(대한민국공개특허 제2011-0080475호), 본 발명에서는 오르니틴이 퓨트레신으로 대부분 전환되어 오르니틴은 축적되지 않았다.

이는 NCgl1469 유전자로부터 발현된 단백질이 글루타메이트보다는 퓨트레신을 쉽게 인지하여 아세틸 글루타메이트 생성 반응보다 N-아세틸 퓨트레신 생성 반응이 더 강화된 것으로 추정되어 종래의 기술과 차별화된 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

[표 8]

본 발명자는 상기 실시예 <1-1>에서 제작된, 퓨트레신 생산능을 갖는 형질전환된 코리네박테리움 속 미생물 KCCM11138P(대한민국 특허공개번호 제2012-0064046호)에서 NCgl1469 유전자를 결실시켜 N-아세틸 퓨트레신을 생성하지 않고 퓨트레신 생산량이 증가된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 Corynebacterium glutamicum CC01-0163으로 명명하고, 2011년 12월 26일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11240P로 기탁하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터

KCCM11240P

20111226

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> MICROORGANISMS FOR PRODUCING PUTRESCINE AND PROCESS FOR PRODUCING PUTRESCINE USING THEM <130> PA121207KR <150> KR 10-2012-0003634 <151> 2012-01-11 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 cgggatccaa ccttcagaac gcgaatac 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 cgcgtcgact tggcactgtg attaccatc 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 cgcgtcgact tgggttatat cccctcaga 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tgctctagat agtgagccaa gacatggaa 29 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 catcctgggg aattcatttg tcat 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggcgttcgac aaagcctaat aag 23 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cgggatccgt ggctgccagg aatggctcc 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 tgctctagac ccaaaacatc ctggcggc 28 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 cgggatcctg cattgtatac tgcgaccac 29 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 caaaacggtg ggactcacgg ataccagaat agc 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gctattctgg tatccgtgag tcccaccgtt ttg 33 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tgctctagat taaacagttg gcatcgctgg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cggggtacct tccaacgctg ctcggatgac 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tgctctagat taaacagttg gcatcgctgg 30 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tgtcgggccc actagtttcc aacgctgctc ggatgac 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gaatgagttc ctcgagttaa acagttggca tcgctgg 37 <210> 17 <211> 612 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 17 atgagtccca ccgttttgcc tgctacacaa gctgacttcc ctaagatcgt cgatgttctg 60 gttgaagcat tcgccaacga tccagcattt ttacgatgga tcccgcagcc ggaccccggt 120 tcagcaaagc ttcgagcact tttcgaactg cagattgaga agcagtatgc agtggcggga 180 aatattgatg tcgcgcgtga ttctgaggga gaaatcgtcg gcgtcgcgtt atgggatcgg 240 ccagatggta atcacagtgc caaagatcaa gcagcgatgc tcccccggct cgtctccatt 300 ttcgggatca aggctgcgca ggtggcgtgg acggatttga gttcggctcg tttccacccc 360 aaattccccc attggtacct ctacaccgtg gcaacatcta gttctgcccg tggaacgggt 420 gttggcagtg cgcttcttaa tcacggaatc gctcgcgcgg gtgatgaagc tatctatttg 480 gaggcgacgt cgactcgtgc ggctcaacta tataaccgtc tgggatttgt gcccttgggt 540 tatatcccct cagatgatga tggcactcct gaactggcga tgtggaaacc gccagcgatg 600 ccaactgttt aa 612 <210> 18 <211> 203 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 18 Met Ser Pro Thr Val Leu Pro Ala Thr Gln Ala Asp Phe Pro Lys Ile 1 5 10 15 Val Asp Val Leu Val Glu Ala Phe Ala Asn Asp Pro Ala Phe Leu Arg 20 25 30 Trp Ile Pro Gln Pro Asp Pro Gly Ser Ala Lys Leu Arg Ala Leu Phe 35 40 45 Glu Leu Gln Ile Glu Lys Gln Tyr Ala Val Ala Gly Asn Ile Asp Val 50 55 60 Ala Arg Asp Ser Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Ala Leu Trp Asp Arg 65 70 75 80 Pro Asp Gly Asn His Ser Ala Lys Asp Gln Ala Ala Met Leu Pro Arg 85 90 95 Leu Val Ser Ile Phe Gly Ile Lys Ala Ala Gln Val Ala Trp Thr Asp 100 105 110 Leu Ser Ser Ala Arg Phe His Pro Lys Phe Pro His Trp Tyr Leu Tyr 115 120 125 Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Ala Arg Gly Thr Gly Val Gly Ser Ala 130 135 140 Leu Leu Asn His Gly Ile Ala Arg Ala Gly Asp Glu Ala Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Ala Thr Ser Thr Arg Ala Ala Gln Leu Tyr Asn Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Val Pro Leu Gly Tyr Ile Pro Ser Asp Asp Asp Gly Thr Pro Glu Leu 180 185 190 Ala Met Trp Lys Pro Pro Ala Met Pro Thr Val 195 200 <210> 19 <211> 612 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 19 atgagtccca ccgttttgcc tgctacacaa gctgacttcc ctaagatcgt cgatgttctg 60 gttgaagcat tcgccaacga tccagcattt ttacgatgga tcccgcagcc ggaccccggt 120 tcagcaaagc ttcgagcact tttcgaactg cagattgaga agcagtatgc agtggcggga 180 aatattgatg tcgcgcgtga ttctgaggga gaaatcgtcg gcgtcgcgtt atgggatcgg 240 ccagatggta atcacagtgc caaagatcaa gcagcgatac tcccccggct cgtctccatt 300 ttcgggatca aggctgcgca ggtggcgtgg acggatttga gttcggctcg tttccacccc 360 aaattccccc attggtacct ctacaccgtg gcaacatcta gttctgcccg tggaacgggt 420 gttggcagtg cgcttcttaa tcacggaatc gctcgcgcgg gtgatgaagc tatctatttg 480 gaggcgacgt cgactcgtgc ggctcaacta tataaccgtc tgggatttgt gcccttgggt 540 tatatcccct cagatgatga tggcactcct gaactggcga tgtggaaacc gccagcgatg 600 ccaactgttt aa 612 <210> 20 <211> 203 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 20 Met Ser Pro Thr Val Leu Pro Ala Thr Gln Ala Asp Phe Pro Lys Ile 1 5 10 15 Val Asp Val Leu Val Glu Ala Phe Ala Asn Asp Pro Ala Phe Leu Arg 20 25 30 Trp Ile Pro Gln Pro Asp Pro Gly Ser Ala Lys Leu Arg Ala Leu Phe 35 40 45 Glu Leu Gln Ile Glu Lys Gln Tyr Ala Val Ala Gly Asn Ile Asp Val 50 55 60 Ala Arg Asp Ser Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Ala Leu Trp Asp Arg 65 70 75 80 Pro Asp Gly Asn His Ser Ala Lys Asp Gln Ala Ala Ile Leu Pro Arg 85 90 95 Leu Val Ser Ile Phe Gly Ile Lys Ala Ala Gln Val Ala Trp Thr Asp 100 105 110 Leu Ser Ser Ala Arg Phe His Pro Lys Phe Pro His Trp Tyr Leu Tyr 115 120 125 Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Ala Arg Gly Thr Gly Val Gly Ser Ala 130 135 140 Leu Leu Asn His Gly Ile Ala Arg Ala Gly Asp Glu Ala Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Ala Thr Ser Thr Arg Ala Ala Gln Leu Tyr Asn Arg Leu Gly Phe 165 170 175 Val Pro Leu Gly Tyr Ile Pro Ser Asp Asp Asp Gly Thr Pro Glu Leu 180 185 190 Ala Met Trp Lys Pro Pro Ala Met Pro Thr Val 195 200 <210> 21 <211> 319 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 21 Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu 1 5 10 15 Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys 20 25 30 Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala 35 40 45 Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser 65 70 75 80 Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Ser Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu 85 90 95 Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn 100 105 110 Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu 115 120 125 Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile 130 135 140 Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys 145 150 155 160 Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr 165 170 175 Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro 180 185 190 Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg 195 200 205 Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu 210 215 220 Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly 225 230 235 240 Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln 245 250 255 Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu 260 265 270 His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile 275 280 285 Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His 290 295 300 Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala Asn Gln Pro Arg 305 310 315 <210> 22 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser 420 425 430 Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser 435 440 445 Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr 450 455 460 Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val Glu Thr Gln Gln Glu 465 470 475 480 Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu 485 490 495 Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr 500 505 510 Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala 515 520 525 Pro Thr Ser Thr Pro 530 <210> 23 <211> 711 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 23 Met Lys Ser Met Asn Ile Ala Ala Ser Ser Glu Leu Val Ser Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ser His Arg Arg Val Val Ala Leu Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp 20 25 30 Val Ala Ala Val Val Ile Thr Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Ile Leu 35 40 45 Ala Leu Leu Lys Arg Thr Gly Phe His Leu Pro Val Phe Leu Tyr Ser 50 55 60 Glu His Ala Val Glu Leu Pro Ala Gly Val Thr Ala Val Ile Asn Gly 65 70 75 80 Asn Glu Gln Gln Trp Leu Glu Leu Glu Ser Ala Ala Cys Gln Tyr Glu 85 90 95 Glu Asn Leu Leu Pro Pro Phe Tyr Asp Thr Leu Thr Gln Tyr Val Glu 100 105 110 Met Gly Asn Ser Thr Phe Ala Cys Pro Gly His Gln His Gly Ala Phe 115 120 125 Phe Lys Lys His Pro Ala Gly Arg His Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Glu 130 135 140 Asn Val Phe Arg Ala Asp Met Cys Asn Ala Asp Val Lys Leu Gly Asp 145 150 155 160 Leu Leu Ile His Glu Gly Ser Ala Lys Asp Ala Gln Lys Phe Ala Ala 165 170 175 Lys Val Phe His Ala Asp Lys Thr Tyr Phe Val Leu Asn Gly Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Asn Lys Val Val Thr Asn Ala Leu Leu Thr Arg Gly Asp Leu 195 200 205 Val Leu Phe Asp Arg Asn Asn His Lys Ser Asn His His Gly Ala Leu 210 215 220 Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Val Tyr Leu Glu Ala Ser Arg Asn Pro 225 230 235 240 Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ile Asp Ala His Cys Phe Asn Glu Glu Tyr 245 250 255 Leu Arg Gln Gln Ile Arg Asp Val Ala Pro Glu Lys Ala Asp Leu Pro 260 265 270 Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Ile Ile Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr 275 280 285 Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp 290 295 300 Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro 305 310 315 320 Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp 325 330 335 Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe 340 345 350 Ser Gln Thr Ser Gln Ile His Lys Lys Asp Asn His Ile Arg Gly Gln 355 360 365 Ala Arg Phe Cys Pro His Lys Arg Leu Asn Asn Ala Phe Met Leu His 370 375 380 Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Leu Phe Ala Ala Leu Asp Val Asn 385 390 395 400 Ala Lys Ile His Glu Gly Glu Ser Gly Arg Arg Leu Trp Ala Glu Cys 405 410 415 Val Glu Ile Gly Ile Glu Ala Arg Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Lys 420 425 430 Leu Phe Arg Pro Phe Ile Pro Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Trp Gln 435 440 445 Asp Tyr Pro Thr Ser Val Leu Ala Ser Asp Arg Arg Phe Phe Ser Phe 450 455 460 Glu Pro Gly Ala Lys Trp His Gly Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Asp Gln 465 470 475 480 Tyr Phe Val Asp Pro Cys Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Gly Ile Asp 485 490 495 Ala Glu Thr Gly Glu Tyr Ser Asp Phe Gly Val Pro Ala Thr Ile Leu 500 505 510 Ala His Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Ile Val Pro Glu Lys Cys Asp Leu 515 520 525 Asn Ser Ile Leu Phe Leu Leu Thr Pro Ala Glu Ser His Glu Lys Leu 530 535 540 Ala Gln Leu Val Ala Met Leu Ala Gln Phe Glu Gln His Ile Glu Asp 545 550 555 560 Asp Ser Pro Leu Val Glu Val Leu Pro Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro 565 570 575 Val Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Gln Glu Met His 580 585 590 Asp Leu Tyr Val Ser Phe Asp Val Lys Asp Leu Gln Lys Ala Met Phe 595 600 605 Arg Gln Gln Ser Phe Pro Ser Val Val Met Asn Pro Gln Asp Ala His 610 615 620 Ser Ala Tyr Ile Arg Gly Asp Val Glu Leu Val Arg Ile Arg Asp Ala 625 630 635 640 Glu Gly Arg Ile Ala Ala Glu Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val 645 650 655 Leu Cys Val Val Pro Gly Glu Val Trp Gly Gly Ala Val Gln Arg Tyr 660 665 670 Phe Leu Ala Leu Glu Glu Gly Val Asn Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro 675 680 685 Glu Leu Gln Gly Val Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Lys Arg 690 695 700 Leu Tyr Gly Tyr Val Leu Lys 705 710 <210> 24 <211> 357 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 Met Ile Met His Asn Val Tyr Gly Val Thr Met Thr Ile Lys Val Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly Glu Ile Leu Arg Leu Leu 20 25 30 Leu Gly His Pro Ala Tyr Ala Ser Gly Glu Leu Glu Ile Gly Ala Leu 35 40 45 Thr Ala Ala Ser Thr Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Leu Met Pro His 50 55 60 Ile Pro Gln Leu Ala Asp Arg Val Ile Gln Asp Thr Thr Ala Glu Thr 65 70 75 80 Leu Ala Gly His Asp Val Val Phe Leu Gly Leu Pro His Gly Phe Ser 85 90 95 Ala Glu Ile Ala Leu Gln Leu Gly Pro Asp Val Thr Val Ile Asp Cys 100 105 110 Ala Ala Asp Phe Arg Leu Gln Asn Ala Ala Asp Trp Glu Lys Phe Tyr 115 120 125 Gly Ser Glu His Gln Gly Thr Trp Pro Tyr Gly Ile Pro Glu Met Pro 130 135 140 Gly His Arg Glu Ala Leu Arg Gly Ala Lys Arg Val Ala Val Pro Gly 145 150 155 160 Cys Phe Pro Thr Gly Ala Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Val Gln Ala 165 170 175 Gly Leu Ile Glu Pro Asp Val Ser Val Val Ser Ile Thr Gly Val Ser 180 185 190 Gly Ala Gly Lys Lys Ala Ser Val Ala Leu Leu Gly Ser Glu Thr Met 195 200 205 Gly Ser Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Ser Gly Lys His Arg His Thr Pro 210 215 220 Glu Ile Ala Gln Asn Leu Gly Glu Val Ser Asp Lys Pro Val Lys Val 225 230 235 240 Ser Phe Thr Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro Arg Gly Ile Leu Thr Thr 245 250 255 Ala Thr Ala Pro Leu Lys Glu Gly Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg Ala 260 265 270 Val Tyr Glu Glu Phe Tyr Ala Gln Glu Thr Phe Val His Val Leu Pro 275 280 285 Glu Gly Ala Gln Pro Gln Thr Gln Ala Val Leu Gly Ser Asn Met Cys 290 295 300 His Val Gln Val Glu Ile Asp Glu Glu Ala Gly Lys Val Leu Val Thr 305 310 315 320 Ser Ala Ile Asp Asn Leu Thr Lys Gly Thr Ala Gly Ala Ala Val Gln 325 330 335 Cys Met Asn Leu Ser Val Gly Phe Asp Glu Ala Ala Gly Leu Pro Gln 340 345 350 Val Gly Val Ala Pro 355 <210> 25 <211> 388 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 25 Met Ala Glu Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala 1 5 10 15 Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val 20 25 30 Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn 35 40 45 Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp 50 55 60 Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys 65 70 75 80 Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu 85 90 95 Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr 100 105 110 Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Ala Gly Ile 115 120 125 Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val 145 150 155 160 Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met 165 170 175 Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala 180 185 190 Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala 195 200 205 Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp 210 215 220 Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln 225 230 235 240 Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala 245 250 255 Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr 260 265 270 Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr 275 280 285 Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro 290 295 300 Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met 305 310 315 320 Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Gly Gln Ala Val Cys Leu 325 330 335 Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala 340 345 350 Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala 355 360 365 Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser 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Ile Tyr Asn Ile 180 185 190 Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu 195 200 205 Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp Pro 210 215 220 Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu Ala 225 230 235 240 Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser Cys 245 250 255 Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp Gly 260 265 270 Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly Ile 275 280 285 Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro Glu 290 295 300 Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu 305 310 315 <210> 27 <211> 391 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 27 Met Ser Thr Leu Glu Thr Trp Pro Gln Val Ile Ile Asn Thr Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Pro Pro Val Glu Leu Val Ser Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Asp 20 25 30 Asp Gln Gly Asn Val Tyr Ile Asp Leu Leu Ala Gly Ile Ala Val Asn 35 40 45 Ala Leu Gly His Ala His Pro Ala Ile Ile Glu Ala Val Thr Asn Gln 50 55 60 Ile Gly Gln Leu Gly His Val Ser Asn Leu Phe Ala Ser Arg Pro Val 65 70 75 80 Val Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Arg Phe Ser Leu Asp Asp Ala 85 90 95 Thr Leu Ala Ala Gln Thr Arg Val Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu 100 105 110 Ala Asn Glu Ala Ala Phe Lys Ile Ala Arg Leu Thr Gly Arg Ser Arg 115 120 125 Ile Leu Ala Ala Val His Gly Phe His Gly Arg Thr Met Gly Ser Leu 130 135 140 Ala Leu Thr Gly Gln Pro Asp Lys Arg Glu Ala Phe Leu Pro Met Pro 145 150 155 160 Ser Gly Val Glu Phe Tyr Pro Tyr Gly Asp Thr Asp Tyr Leu Arg Lys 165 170 175 Met Val Glu Thr Asn Pro Thr Asp Val Ala Ala Ile Phe Leu Glu Pro 180 185 190 Ile Gln Gly Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Pro Glu Gly Phe Leu Lys 195 200 205 Ala Val Arg Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Leu Met Ile Thr Asp 210 215 220 Glu Val Gln Thr Gly Val Gly Arg Thr Gly Asp Phe Phe Ala His Gln 225 230 235 240 His Asp Gly Val Val Pro Asp Val Val Thr Met Ala Lys Gly Leu Gly 245 250 255 Gly Gly Leu Pro Ile Gly Ala Cys Leu Ala Thr Gly Arg Ala Ala Glu 260 265 270 Leu Met Thr Pro Gly Lys His Gly Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Val 275 280 285 Ala Cys Ala Ala Ala Lys Ala Val Leu Ser Val Val Asp Asp Ala Phe 290 295 300 Cys Ala Glu Val Ala Arg Lys Gly Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Ala 305 310 315 320 Lys Val Asp Gly Val Val Asp Val Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly 325 330 335 Val Val Leu Glu Arg Asp Val Ala Lys Gln Ala Val Leu Asp Gly Phe 340 345 350 Lys His Gly Val Ile Leu Asn Ala Pro Ala Asp Asn Ile Ile Arg Leu 355 360 365 Thr Pro Pro Leu Val Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ala Asp Ala Val Lys 370 375 380 Ala Ile Ala Glu Thr Ile Ala 385 390

Claims

오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입되어 퓨트레신을 생산할 수 있도록 변이된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 ODC는 서열번호 23의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
제 1항에 있어서, 추가로 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼레이즈(ArgF) 및 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된 것인 미생물.
제 4항에 있어서, ArgF는 서열번호 21의 아미노산 서열을 가지고, NCgl1221은 서열번호 22의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
제 1항에 있어서, 추가로 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕테이즈(ArgC), 아세틸 글루타메이트 신테이즈 또는 오르니틴 아세틸 트랜스퍼레이즈(ArgJ), 아세틸 글루타메이트 카이네이즈(ArgB), 및 아세틸 오르니틴 아미노 트랜스퍼레이즈(ArgD)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 활성이 증가된 것인 미생물.
제6항에 있어서, 상기 ArgC, ArgJ, ArgB 및 ArgD는 각각 서열번호 24, 25, 26, 및 27의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자 발현의 감소, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변이 또는 4) 이의 조합에 의해 수행되는 것인 미생물.
제1항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인 미생물.
서열번호 18 또는 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화 또는 결실된, 제1항에 따른 향상된 퓨트레신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 단계에서 수득되는 배양물로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는 퓨트레신 생산 방법.
제 10항에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 퓨트레신 생산 방법.