CN101389765B - 生产尸胺的方法 - Google Patents

Abstract

通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法，所述重组微生物具有去调节的赖氨酸脱羧酶基因和至少一种去调节的选自组(i)的基因，组(i)由下列组成：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶，条件是如果天冬氨酸激酶作为基因(i)被去调节，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二种基因(i)必须被去调节。

Description

生产尸胺的方法

发明领域

本发明涉及生产尸胺的方法。更特别地，本发明涉及重组微生物的用途，所述重组微生物包含生产尸胺所必需的以去调节形式存在的DNA分子。

现有技术

JP 2002223770公开了通过将赖氨酸脱羧基因和/或赖氨酸-尸胺反向转运蛋白基因引入赖氨酸生产微生物来生产尸胺的方法。JP 2004222569公开了通过培养具有赖氨酸脱羧酶活性和高丝氨酸营养缺陷型的重组棒杆菌来生产尸胺。

发明简述

在一方面，本发明提供了通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法，所述重组微生物具有去调节的赖氨酸脱羧酶和至少一种去调节的基因，该基因选自那些在赖氨酸的生物合成途径中所必需的基因。在另一方面，本发明提供了用于生产聚酰胺的方法，其包括如上所述的用于生产尸胺的步骤，并将尸胺与二羧酸相反应。

发明详述

在接下来的说明书中，广泛地使用了大量术语。此处提供了定义来促进对发明的理解。

术语尸胺意味着1，5-二氨基戊烷。

启动子。指导结构基因转录产生mRNA的DNA序列。通常启动子定位于基因的5’区域，邻近结构基因的起始密码子。如果启动子是诱导型启动子，那么转录效率会响应于诱导试剂而提高。相反，如果启动子是组成型启动子，转录效率则不受诱导试剂调节。

增强子。启动子元件。增强子可增加特定基因转录成mRNA的效率，无论增强子相对于转录起始位点的距离或方向。

表达。表达是从结构基因生产多肽的过程。该过程涉及将基因转录成mRNA并将此mRNA翻译成多肽。

克隆载体。DNA分子，例如质粒、粘粒、噬菌粒、或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力，并可用来转化细胞用于基因操作。克隆载体通常含有一个或少数的限制性内切核酸酶识别位点，外源DNA序列可以确定的形式在不损失载体的必需生物功能的情况下插入这些位点，以及适合用于鉴定和筛选克隆载体转化过的细胞的标志基因。标志基因通常包括那些提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

表达载体。包含克隆的编码外源蛋白质的结构基因的DNA分子，所述DNA分子提供外源蛋白质在重组体宿主中的表达。通常，将克隆基因的表达置于特定调节序列例如启动子和增强子序列的控制下(即，有效连接)。启动子序列可为组成型的或诱导型的。

重组宿主。重组宿主可以是任何原核的或真核的细胞，其含有克隆载体或表达载体。该术语也意味着包括那些经遗传工程操作的在宿主细胞染色体或基因组中含有克隆基因的原核或真核细胞。合适宿主的例子见Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)[″Sambrook″]。

如此处所用的，基本纯的蛋白质意味着目的纯化蛋白是基本上无污染的细胞组分，如通过在聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)之后的单条带所证实的。术语“基本上纯的”进一步意味着描述某分子通过本领域技术人员所用的一种或多种纯度或均一性特征来表征是均一的。例如，基本上纯的赖氨酸脱羧酶在某些参数标准的实验偏差内将显示恒定的和可重复的特征，所述参数如下：分子量、色谱迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封闭的或未封闭的N末端、HPLC洗脱图谱、生物活性、和其它此类参数。然而，该术语并不意味着排除赖氨酸脱羧酶与其它化合物的人工的或合成的混合物。另外，该术语并不意味着排除分离自重组宿主的赖氨酸脱羧酶融合蛋白。

在第一方面，本发明提供了一种用于通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法，所述微生物具有去调节的赖氨酸脱羧酶基因和至少一种去调节的选自下列的基因：(i)包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(succinylase)、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶，如果天冬氨酸激酶作为基因(i)而去调节，则必须有除天冬氨酸激酶之外的另一种基因(i)被去调节。

本发明的方法描述了如此处所述的和/或以导致尸胺产生的方式培养的重组微生物，其优选地包括载体或基因(例如，野生型和/或突变型基因)。

术语“重组”微生物包括已经遗传改变、修饰或工程化(例如遗传工程化的)的微生物(例如，细菌、酵母细胞、真菌细胞等等)，以便其展示与其所来源的天然存在的微生物相比改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。

术语“去调节的”包括基因产物的表达(例如，赖氨酸脱羧酶)处于低于或高于在微生物操作前或在未经操作的相当的微生物中所表达水平的表达水平。在一个实施方案中，微生物可经遗传操作(例如，遗传工程化的)来表达比微生物操作前所表达的水平或未经操作的相当微生物中的表达水平更低或更高水平的基因产物。遗传操作可包括但不限于，改变或修饰调节序列或与特定基因的表达相关的位点(例如，通过除去强启动子，诱导型启动子或多重启动子)、修饰特定基因的染色体位置、改变与特定基因例如核糖体结合位点或转录终止子邻近的核酸序列、减少特定基因的拷贝数量、修饰涉及特定基因的转录和/或特定基因产物的翻译的蛋白质(例如，调节蛋白质、抑制子、增强子、转录激活因子等等)、或本领域中惯用的去调节特定基因表达的其它常规方法(包括但不限于使用翻译核酸分子、或其它方法来敲除或阻断靶蛋白的表达)。

术语“去调节基因活性”例如去调节的赖氨酸脱羧酶，还意味着将基因活性例如赖氨酸脱羧酶活性引入微生物，所述微生物中各自基因活性例如脱羧酶活性在此前并未发现过，例如优选通过遗传工程的方法将一个或多个拷贝的异源基因例如赖氨酸脱羧酶基因引入微生物。

赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸脱羧化为尸胺。该酶被分类为E.C.4.1.1.18。分离自大肠杆菌(Escherichia coli)的具有赖氨酸脱羧酶活性的酶是cadA基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，Entryb4131)和ldcC基因产物(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，EntryJW0181)。

SEQ ID NO：1公开了大肠杆菌cadA的氨基酸序列，SEQ ID NO：2公开了大肠杆菌ldcC的氨基酸序列。编码大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因的DNA分子可通过利用具有反向翻译自氨基酸序列SEQ ID NO：1或2的多核苷酸的探针筛选cDNA或基因组文库来获得。

备选地，大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因可通过利用相互引发长寡核苷酸来合成DNA分子而获得。见例如，Ausubel等人，(eds.)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，8.2.8至8.2.13页(1990)[″Ausubel″].另外，见Wosnick等人.，Gene 60：115(1987)；和Ausubel等人(eds.)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3版，8-8至8-9页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。利用聚合酶链式反应的确定技术提供了合成长度为至少2千碱基的DNA分子的可能。Adang等人，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)；Bambot等人，PCR Methods andApplications 2：266(1993)；Dillon等人，″Use of the Polymerase ChainReaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，″in METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.15：PCR PROTOCOLS：CURRENTMETHODS AND APPLICATIONS，White(ed.)，263-268页，(HumanaPress，Inc.1993)；Holowachuk等人，PCR Methods Appl.4：299(1995)。

可生产与母酶相比含有保守氨基酸改变的大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的变体。即，可获得含有SEQ ID NO：1或2的一个或多个氨基酸替换的变体，其中用烷基氨基酸替换赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的烷基氨基酸，用芳香族氨基酸替换大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的芳香族氨基酸，用含硫氨基酸替换大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的含硫氨基酸，用羟基氨基酸替换大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的含羟基氨基酸，用酸性氨基酸替换大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的酸性氨基酸，用碱性氨基酸替换大肠杆菌赖氨酸脱羧酶氨基酸序列中的碱性氨基酸。

在共同的氨基酸中，例如“保守氨基酸替换”可列举为下列组之一中的氨基酸间的替换：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸，(3)半胱氨酸和甲硫氨酸，(4)丝氨酸和苏氨酸，(5)天冬氨酸和谷氨酸，(6)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(7)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

大肠杆菌赖氨酸脱羧酶中的保守氨基酸改变可通过用核苷酸替换SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所述的核苷酸来引入。此类“保守氨基酸”变体可通过例如寡核苷酸定向诱变、接头扫描诱变、利用聚合酶链式反应的诱变等等得到。Ausubel等人，前述，8.0.3-8.5.9页；Ausubel等人(eds.)，SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第三版，8-10至8-22页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。通常还可见，McPherson(ed.)，DIRECTED MUTAGENESIS：A PRACTICAL APPROACH，IRL Press(1991)。此类变体将L-赖氨酸转换为尸胺的能力可利用标准的酶活性测定法例如此处所述的测定法来测定。

根据本发明的优选的赖氨酸脱羧酶是来自大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶及其等同基因，其与相应的“原始”基因产物有高达80％、优选地90％和最优选的95％和98％的序列同一性(基于氨基酸序列)，并仍具有赖氨酸脱羧酶的生物学活性。这些等同基因可容易地由本领域已知的方法通过引入核苷酸替换、缺失或插入来构建。

本发明的另一优选的实施方案是大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶(SEQ IDNO：1和NO：2)，通过应用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutmicum)的密码子选择将其回译成DNA。这些赖氨酸脱羧酶多核苷酸序列对于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物特别是谷氨酸棒杆菌中赖氨酸脱羧酶的表达是有用的。

除了去调节的赖氨酸脱羧酶基因外，根据本发明的微生物必须具有至少一种选自组(i)的去调节的基因。组(i)是在赖氨酸的生物合成中发挥关键作用的一组基因，并由下列基因组成：天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶。

根据本发明的方法至少一种组(i)的基因必须被去调节。优选地根据本发明的微生物中多于一种组(i)的基因，例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种基因被去调节。

组(i)的基因和基因产物是本领域中公知的。EP1108790公开了高丝氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶基因中的突变，其对于重组棒杆菌在赖氨酸生产中的生产能力具有有益影响。WO0063388公开了天冬氨酸激酶基因中的突变，其对重组棒杆菌在赖氨酸生产上的生产能力具有有益影响。引用EP1108790和WO0063388作为与上述这些基因突变有关的参考。

下列的表中提及了各个基因的每一种基因/基因产物可能的去调节方式。在表的“去调节”列中所引用的文献和文件在此引用作为与基因去调节有关的参考。表中所提到的方式是各自基因去调节的优选实施方案。

表1

酶(基因产物)	基因	去调节
			天冬氨酸激酶	ask	通过点突变和扩增达到释放反馈抑制(Eggeling等人，(eds.)，Handbook ofCorynebacteriumglutamicum，20.2.2页(CRCpress，2005))
天冬氨酸半醛脱氢酶	asd	扩增
			二氢吡啶二羧酸合酶	dapA	扩增
二氢吡啶二羧酸还原酶	dapB	扩增
			四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶	dapD	扩增
琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶	dapC	扩增
			琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶	dapE	扩增
二氨基庚二酸脱氢酶	ddh	扩增
			二氨基庚二酸表异构酶	dapF	扩增
精氨酰-tRNA合成酶	argS	扩增
			二氨基庚二酸脱羧酶	lysA	扩增
丙酮酸羧化酶	pycA	通过点突变(EP1108790)和扩增释放反馈抑制
			磷酸烯醇丙酮酸羧化酶	ppc	扩增
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶	zwf	通过点突变(US2003/0175911)和扩增释放反馈抑制
			转酮醇酶	tkt	扩增
转醛醇酶	tal	扩增
			6-磷酸葡糖酸内酯酶	pgl	扩增
果糖1，6-二磷酸酶	fbp	扩增

高丝氨酸脱氢酶	hom	通过点突变来减弱(EP1108790)
			烯醇丙酮酸磷酸羧激酶	pck	通过突变或其它来敲除或沉默
琥珀酰辅酶A合成酶	sucC	通过点突变来减弱(WO05/58945)
			甲基丙二酰辅酶A变位酶		通过点突变来减弱(WO05/58945)

天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸表异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶、精氨酰-tRNA合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶的基因去调节的优选方式是“向上”突变，其增加基因活性，例如通过利用强表达信号的基因扩增和/或增强酶活性的点突变。

高丝氨酸脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰辅酶A合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶的基因的优选去调节方式是“向下”突变，其降低基因活性，例如通过基因缺失或基因破坏、利用弱表达信号和/或破坏或降低酶活性的点突变。

如果天冬氨酸激酶作为基因(i)组的成员而被去调节，则除天冬氨酸激酶外的至少第二种基因(i)成员也必须被去调节。

观察到根据本发明的方法在微生物中生产的大部分尸胺是乙酰化的。为了阻断由乙酰辅酶A依赖型二胺乙酰转移酶导致的乙酰化反应，且为了增加尸胺的产量，本发明的优选实施方案是去调节生产微生物的二胺乙酰转移酶，特别地降低其活性(例如通过基因的缺失或破坏)。

为表达根据本发明的去调节基因，必须将编码酶的DNA序列有效连接至在表达载体中控制转录表达的调节序列上，然后将其引入原核或真核宿主细胞。除了转录调节序列，例如启动子和增强子，表达载体可包括翻译调节序列和适合用于筛选带有表达载体的细胞的标志基因。

用于在原核宿主中表达的启动子可以是可抑制型的、组成型的、或诱导型的。合适的启动子对本领域技术人员而言是众所周知的，且包括那些能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子、λ噬菌体的P_R和P_L启动子，大肠杆菌的trp、recA、热激、lacUV5、tac、lpp-lacλpr、phoA、gal、trc和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和σ²⁸-特异性启动子，芽孢杆菌属的噬菌体的启动子，链霉菌属启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)；Watson等人，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE，第4版，Benjamin Cummins(1987)；Ausubel等人，同上，和Sambrook等人，同上中对原核启动子进行了综述。

大肠杆菌赖氨酸脱羧酶表达的优选启动子是谷氨酸棒杆菌的sodA启动子。

在原核宿主中表达蛋白质的方法对于本领域技术人员而言是公知的。见，例如，Williams等人.，″Expression of foreign proteins in E.coli usingplasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies，″in DNACLONING 2：EXPRESSION SYSTEMS，第2版，Glover等人(eds.)，15-58页(Oxford Universlty Press 1995)。还可见，Ward等人，″GeneticManipulation and Expression of Antibodies，″in MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)；以及Georgiou，″Expression of Proteins inBacteria，″in PROTEIN ENGINEERING：PRINCIPLES ANDPRACTICE，Cleland等人(eds.)，101-127页(John Wiley & Sons，Inc.1996)。

可利用多种技术包括氯化钙转化、电穿孔等等将表达载体引入细菌宿主细胞。见，例如，Ausubel等人(eds.)，SHORT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，第3版，1-1至1-24页(John Wiley & Sons，Inc.1995)。

本发明的重要方面涉及培育或培养此处所述的重组微生物，以便生产目的化合物尸胺。术语“培养”包括维持和/或生长本发明的活的微生物(例如，维持和/或生长培养物或菌株)。在一个实施方案中，在液体培养基中培养本发明的微生物。在另一实施方案中，在固体培养基或半固体培养基中培养本发明的微生物。在优选的实施方案中，在包含必需用于或有益于微生物的维持和/或生长的营养物的培养基(例如，无菌的液体培养基)中培养本发明的微生物。

可用的碳源包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油；脂肪酸，例如软脂酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油和乙醇；以及有机酸，例如乙酸。在优选的实施方案中，将葡萄糖、果糖或蔗糖用作碳源。这些物质可分别或作为混合物使用。

可用的氮源包含含氮的有机化合物，例如蛋白胨，酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素、或者无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或作为混合物使用。可用作磷源的有磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或含有钠的相应的盐。培养基必须进一步含有生长羧必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸亚铁。最后，除了上述物质之外还可使用必要的生长促进物质例如氨基酸和维生素。可向培养基中进一步添加合适的前体。可将所述的喂饲物质作为单批加入培养物，或在培养过程中进行合适地喂饲。

优选地，在控制的pH下培养本发明的微生物。术语“控制的pH”包括可完成目的精细化学品例如尸胺生产的任何pH。在一个实施方案中，在大约7的pH下培养微生物。在另一实施方案中，在6.0至8.5的pH下培养微生物。可通过本领域技术人员已知的任何方法来维持目的pH。例如，将碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨、或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸用来合适地控制培养物的pH。

另外优选地，在控制的通气下培养本发明的微生物。术语“控制的通气”包括充足通气(例如，氧气)来导致目的精细化学品例如尸胺的生产。在一个实施方案中，通过调节培养物中的氧气水平例如通过调节溶解在培养基中的氧气的量来控制通气。优选地，培养物的通气通过搅拌培养物来控制。搅拌可通过推进器或类似的机械搅拌装置、通过旋转或振荡培养容器(例如，发酵罐)或通过各种泵送装置来提供。搅拌还可通过进一步通过将无菌空气或氧气通过培养基(例如，通过发酵混合物)来控制。另外优选地，本发明的微生物是在无过量泡沫的情况下培养的(例如，通过添加消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯)。

此外，本发明的微生物可在控制的温度下培养。术语“控制的温度”包括任何致使目的精细化学品例如尸胺产生的温度。在一个实施方案中，控制的温度包括15℃至95℃之间的温度。在另一实施方案中，控制的温度包括15℃至70℃之间的温度。优选的温度是20℃至55℃之间，更优选地在30℃至45℃之间或30℃至50℃之间。

可在液体培养基中培养微生物，且优选地连续或间歇地通过常规培养方法例如静止培养、试管培养、振荡培养(例如，旋转振荡培养、摇瓶培养等等)、通气旋动培养、或发酵来培养微生物。在优选的实施方案中，在摇瓶中培养微生物。在更加优选的实施方案中，在发酵罐中培养微生物(例如，发酵方法)。本发明的发酵方法包括但不限于，分批、补料分批和连续的发酵方法。术语“分批方法”或“分批发酵”指的是封闭系统，其中培养基、营养物质、补充添加剂的组分等在发酵之初加入，在发酵过程中并不进行改变，然而可以对诸如pH和氧气浓度的此类因素进行控制来防止过度的培养基酸化和/或微生物死亡。术语“补料分批方法”或“补料分批”发酵指的是分批发酵，只是随着发酵的进行加入一种或多种底物或补充物的(例如增量或连续加入)。术语“连续方法”或“连续发酵”指的是一种系统，其中向发酵罐中连续加入确定的发酵培养基，并同时移除等量已用的或“条件”培养基，优选地用于回收目的尸胺。多种此类方法已被开发且在本领域中是公知的。

本发明的方法可进一步包括回收尸胺的步骤。术语“回收”尸胺包括从培养基中提取、收获、分离或纯化化合物。可根据本领域中已知的任何常规分离或纯化方法来完成化合物的回收，所述方法包括但不限于用常规的树脂(例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等等)处理、用常规的吸附剂(例如，活性碳、硅酸、硅胶、纤维素、矾土等等)处理、改变pH、溶剂萃取(例如，用常规的溶剂例如醇、乙酸乙酯、己烷等等)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调节、冻干法等等。例如可通过首先除去微生物从培养基中回收尸胺。然后将除去生物量的发酵液通过或穿过阳离子交换树脂来去除不想要的阳离子，然后通过或穿过阴离子交换树脂上来除去不想要的无机阴离子和具有比尸胺更强酸度的有机酸。在另一方面，本发明提供了用于生产聚酰胺(例如nylon

)的方法，其包括如上所述的用于生产尸胺的步骤。将尸胺以已知的方式与二、三或多羧酸反应来获得聚酰胺。优选地将尸胺与含有4至10个碳的二羧酸例如琥珀酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸等等相反应。二羧酸优选地是游离酸。

实施例

1.赖氨酸脱羧酶基因的克隆

使用PCR引物WKJ12/WKJ13和WKJ35/WKJ34和大肠杆菌的染色体DNA作模板来分别扩增含有cadA和ldcC基因的DNA片段。纯化扩增的DNA片段、用限制酶消化，Asp718/NdeI用于cadA而XhoI/SpeI用于ldcC，并将其连接于用相同的限制酶消化的pClik5aMCS载体，从而分别得到的pClik5aMCS cadA和pClik5aMCS ldcC。

为增加ldcC基因的表达，将谷氨酸棒杆菌sodA启动子(Psod)在该基因的起始密码子之前替换。利用PCR引物从每个染色体DNA中扩增含有sodA启动子和ldcC基因编码区的DNA片段，其中WKJ31/OLD47用于Psod，而WKJ33/WKJ34用于ldcC，将所述DNA片段用作以WKJ31/WKJ34作引物的融合PCR的模板。纯化融合的PCR片段、用XhoI和SpeI消化片段、并将其插入pClik5aMCS载体的XhoI和SpeI剪切位点之间来构建pClik5aMCS Psod-ldcC。

所用的寡核苷酸引物：

WKJ12 caagctccttcgagctggca

WKJ13 gggtaacgtaaaccagagaa

WKJ31 gagagagactcgagtagctgccaattattccggg

WKJ33 acgaaaggattttttacccatgaacatcattgccattatg

WKJ34 ctctctctcactagtgctcaatcacatattgccca

WKJ35 gagagagactcgagccggaagcgatggcggcatc

OLD47 gggtaaaaaatcctttcgtag

2.构建尸胺生产菌株

为构建尸胺生产菌株，将赖氨酸生产菌LU11271用具有赖氨酸脱羧酶基因的重组质粒来转化，所述LU11271是通过将点突变T311I引入天冬氨酸激酶基因、复制二氨基庚二酸脱氢酶基因和破坏磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因而衍生于谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032。

3.摇瓶培养中的尸胺生产

对重组菌株进行摇瓶实验来测试尸胺生产。使用与WO2005059139中所述的赖氨酸生产相同的培养基和条件。对对照宿主菌株和具有pClik5aMCS的重组菌株进行平行测试。将菌株在CM琼脂上在30℃下预培养过夜。将培养的细胞收获入含有1.5ml的0.9％NaCl的微型管，并在旋涡后通过610nm的吸光度来测定细胞浓度。为进行主培养，将悬浮细胞接种入10ml的生产培养基中达到1.5的初始OD值，所述培养基盛装在含有0.5g的CaCO₃的高压灭菌的100ml锥形瓶中。主培养在旋转摇床(Infors AJ118，Bottmingen，瑞士)上，以200转/分在30℃下进行48-78小时。尸胺和赖氨酸的浓度利用HPLC(Agilent 1100系列LC系统)来测定。

在培养了含有赖氨酸脱羧酶基因的所有重组菌株的发酵液中，积累了大量的尸胺。相反，观察到赖氨酸生产能力的显著下降。考虑到赖氨酸向尸胺的完全转化，必须产生与赖氨酸相同数量的尸胺分子。然而，所积累的尸胺的量却少于宿主菌株所生产的赖氨酸的量，另一方面，相当大量的副产物乙酰基尸胺伴随地积累，导致了糖产量的降低。

除了HPLC分析，还通过质谱方法鉴定了尸胺和乙酰基尸胺。

4.乙酰基尸胺形成酶的鉴定

为鉴定乙酰基尸胺形成酶，进行了蛋白质纯化。收获了培养在CM液体中的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032或一些衍生物、将其洗涤并悬浮在0.5倍体积的标准缓冲液，所述缓冲液由50mM Tris-HCl(pH7.8)，0.02％Brij 35，蛋白抑制剂混合物(Complete，Roche)和20％甘油组成。利用微流器(M-110EH，Microfluidics Co.)裂解细胞悬浮物后利用微量过滤器(MF42，Satorius)进行过滤。

通过使用Q Sepharose(Q琼脂糖)(Amersham Bioscience，50×300mm，在10mM Tris(pH7.5)缓冲液中的0.0-0.5M NaCl的线性梯度，10ml/min的流速)、Phenyl Sepharose(苯基琼脂糖)(Amersham Bioscience，50×300mm，在10mM Tris(pH7.5)缓冲液中的1.5-0.0M乙酸铵的线性梯度，10ml/min的流速)、Superdex(Amersham Bioscience，26×600mm，10mM Tris(pH7.5)缓冲液，4ml/min的流速)、Mono-Q(AmershamBioscience，5×50mm，在10mM Tris(pH7.5)缓冲液中的0.0-0.5M-NaCl的线性梯度，1ml/min的流速)和Superose(Amersham Bioscience，15×300mm，10mM Tris(pH7.5)缓冲液，0.3ml/min的流速)一系列柱子来纯化滤液中的酶。整个纯化步骤中，对级分中的乙酰转移酶的酶活性和酶反应混合物中的乙酰基尸胺的存在进行监测。在下列条件下通过监测1ml的总体积中由于产生TNB(硫代硝基苯甲酸)而导致的412nm处吸收的增加来测定酶活性：10mM Tris-HCl(pH7.8)，0.1mM DTNB(5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸))，0.25mM乙酰辅酶A，5mM尸胺，酶溶液。

利用TNB的13.6mM^-1×cm^-1的摩尔消光系数来计算比活性。

将来自Superose柱子的含有酶活性的级分上样于SDS-PAGE凝胶。从考马斯染色凝胶切下后，用改良的胰蛋白酶(Roche，Mannheim)如Hermann等人所述(Electrophoresis(2001)，22，1712-1723)消化蛋白点。在nano-HPLC分离肽(LC Packings，RP18柱，长度15cm，i.d.75μm)之后，在LCQ advantage(Thermo Electron)上利用MASCOT软件(David et al.(1999)Electrophoresis，20，3551-3567)进行了质谱鉴定。结果，鉴定出作为潜在的乙酰基尸胺形成酶的乙酰转移酶(Genebank检索号：NP_600742)。

5.质粒构建和乙酰转移酶基因的破坏

为了进行所鉴定的编码乙酰转移酶的基因的染色体破坏，构建了重组质粒，其允许通过两次连续的同源重组事件的无标记操作。利用一套PCR引物(WKJ203/WKJ205用于上游而WKJ206/WKJ204用于下游)从谷氨酸棒杆菌染色体DNA扩增了含有基因的上游和下游区域的DNA片段，将所述片段用作模板利用PCR引物WKJ203/WKJ204进行融合PCR来制备除去了基因中间区域的融合片段。纯化了融合PCR的产物，用XhoI和SpeI进行消化，并将其插入用相同的限制酶消化的pClikintsacB载体，这使得序列在谷氨酸棒杆菌的基因组基因座处得以整合(Becker等人(2005)，Applied and Environmental Microbiology，71(12)，p.8587-8596)。然后将质粒用于破坏乙酰转移酶基因的天然编码区域。所用的菌株是LU11271LdcC，其中ldcC基因被整合入染色体的bioD基因座上，且其同时产生尸胺和乙酰基尸胺。两次连续的重组事件(在上游和下游区域各有一次)是破坏基因中间序列所必需的。所破坏的突变体通过利用引物WKJ203/WKJ204的PCR和DNA杂交分析来确认。

所用的寡核苷酸引物：

WKJ203 gctcctcgaggcattgtatactgcgaccact

WKJ204 cggtactagtgtagtgagccaagacatgg

WKJ205 cgattccgtgattaagaagcgcttcaaccagaacatcgac

WKJ206 gtcgatgttctggttgaagcgcttcttaatcacggaatcg

6.对乙酰基尸胺形成和尸胺生产能力的影响

为分析乙酰转移酶基因的破坏对乙酰基尸胺形成和尸胺生产能力的影响，对破坏的突变体进行了摇瓶实验。使用了与尸胺生产相同的培养基和条件(同上)。破坏的突变体没有显示处乙酰基尸胺的积累。这表明只有所鉴定的乙酰转移酶负责乙酰基尸胺的形成。因此，通过破坏所述基因致使乙酰基尸胺形成的消除提高了尸胺生产能力。

乙酰转移酶的基因序列和多肽序列如下所述：

乙酰转移酶基因序列：

ATGAGTCCCACCGTTTTGCCTGCTACACAAGCTGACTTCCCTAAGATCGTC-

GATGTTCTGGTTGAAGCATTCGCCAACGATCCAGCATTTTTACGATGGATCCCG-

CAGCCGGACCCCGGTTCAGCAAAGCTTCGAGCACTTTTCGAACTGCAGATTGAGAAG-

CAGTATGCAGTGGCGGGAAATATTGATGTCGCGCGTGATTCTGAGGGAGA-

AATCGTCGGCGTCGCGTTATGGGATCGGCCAGATGGTAATCACAGTGCCAAAGAT-

CAAGCAGCGATGCTCCCCCGGCTCGTCTCCATTTTCGGGATCAAGGCTGCG-

CAGGTGGCGTGGACGGATTTGAGTTCGGCTCGTTTCCACCCCAAATTCCCCCATTGG-

TACCTCTACACCGTGGCAACATCTAGTTCTGCCCGTGGAACGGGTGTTGG-

CAGTGCGCTTCTTAATCACGGAATCGCTCGCGCGGGTGATGAAGCTATCTATTTG-

GAGGCGACGTCGACTCGTGCGGCTCAACTATATAACCGTCTGG-

GATTTGTGCCCTTGGGTTATATCCCCTCAGATGATGATGGCACTCCTGAACTGGC-

GATGTGGAAACCGCCAGCGATGCCAACTGTTTAA

蛋白质序列：

MSPTVLPATQADFPKIVDVLVEAFANDPAFLRWIPQPDPGSAKLRALFELQIEKQYA-

VAGNIDVARDSEGEIVGVALWDRPDGNHSAKDQAAMLPRLVSIFGIKAAQVAWTDLS-

SARFHPKFPHWYLYTVATSSSARGTGVGSALLNHGIARAGDEAIYLEATSTRAAQ-

LYNRLGFVPLGYIPSDDDGTPELAMWKPPAMPTV

Claims (10)

1.通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法，所述重组微生物具有增量调节的赖氨酸脱羧酶基因、减量调节的二胺乙酰转移酶活性和至少一种增量调节或减量调节的选自组(i)的基因，组(i)由下列组成：增量调节的天冬氨酸激酶、增量调节的天冬氨酸半醛脱氢酶、增量调节的二氢吡啶二羧酸合酶、增量调节的二氢吡啶二羧酸还原酶、增量调节的四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、增量调节的琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、增量调节的琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、增量调节的二氨基庚二酸表异构酶、增量调节的二氨基庚二酸脱氢酶、增量调节的精氨酰-tRNA合成酶、增量调节的二氨基庚二酸脱羧酶、增量调节的丙酮酸羧化酶、增量调节的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、增量调节的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、增量调节的转酮醇酶、增量调节的转醛醇酶、增量调节的6-磷酸葡糖酸内酯酶、增量调节的果糖1，6-二磷酸酶、减量调节的高丝氨酸脱氢酶、减量调节的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、减量调节的琥珀酰辅酶A合成酶、减量调节的甲基丙二酰辅酶A变位酶，条件是如果天冬氨酸激酶作为基因(i)被增量调节，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二种基因(i)必须被增量或减量调节，其中所述微生物属于棒杆菌属。

2.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求1的方法，其中增量调节的赖氨酸脱羧酶对所述微生物是异源的。

4.根据权利要求1的方法，其中所述重组微生物具有来自埃希氏菌属的赖氨酸脱羧酶。

5.根据权利要求1的方法，其中所述赖氨酸脱羧酶具有SEQ ID NO：1或2的多肽序列，或与SEQ ID NO：1或2有至少80％同一性的具有赖氨酸脱羧酶活性的多肽序列。

6.根据权利要求1的方法，其中所述微生物的二氨基庚二酸脱氢酶活性被增量调节。

7.生产聚酰胺的方法，其包括根据权利要求1生产尸胺，并将尸胺与二羧酸反应。

8.重组微生物，其具有增量调节的赖氨酸脱羧酶基因、减量调节的二胺乙酰转移酶活性和至少一种增量调节或减量调节的选自组(i)的基因，组(i)由下列组成：增量调节的天冬氨酸激酶、增量调节的天冬氨酸半醛脱氢酶、增量调节的二氢吡啶二羧酸合酶、增量调节的二氢吡啶二羧酸还原酶、增量调节的四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、增量调节的琥珀酰-氨基-酮基庚二酸转氨酶、增量调节的琥珀酰-二氨基-庚二酸脱琥珀酰酶、增量调节的二氨基庚二酸表异构酶、增量调节的二氨基庚二酸脱氢酶、增量调节的精氨酰-tRNA合成酶、增量调节的二氨基庚二酸脱羧酶、增量调节的丙酮酸羧化酶、增量调节的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、增量调节的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、增量调节的转酮醇酶、增量调节的转醛醇酶、增量调节的6-磷酸葡糖酸内酯酶、增量调节的果糖1，6-二磷酸酶、减量调节的高丝氨酸脱氢酶、减量调节的烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、减量调节的琥珀酰辅酶A合成酶、减量调节的甲基丙二酰辅酶A变位酶，条件是如果天冬氨酸激酶作为基因(i)被增量调节，那么除天冬氨酸激酶外的至少第二种基因(i)必须被增量或减量调节，其中所述微生物属于棒杆菌属。

9.根据权利要求8的重组微生物，其中增量调节的赖氨酸脱羧酶来自于埃希氏菌属。

10.根据权利要求8的重组微生物，其中所述微生物的二氨基庚二酸脱氢酶活性被增量调节。