CN1181785A

CN1181785A - 抗应激性微生物及发酵产物的制备方法

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Publication number: CN1181785A
Application number: CN96193336.4A
Authority: CN
Inventors: 木村英一郎; 河原义雄; 后藤慎也; 中松亘; 菊池庆实; 仓桥修
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-02-20
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1998-05-13
Also published as: DE69617454D1; EP0864654B1; BR9607342A; EP0864654A4; DE69617454T2; WO1996026289A1; US6338956B1; PE18097A1; ES2169225T3; EP0864654A1; US6156532A; JP3861290B2

Abstract

通过在培养基中培养微生物使其在培养基中长生和积累发酵产物以及收集发酵产物而利用一种微生物发酵产生有用的如氨基酸等物质等方法,其中所说的微生物由于导入至少一种编码热应激蛋白和编码特异性作用于热应激蛋白,增加其在细胞中的表达量的σ因子的基因而被修饰,从而所述微生物可增加对应激压力的抗性,阻止了应激压力对微生物的生长和/或发酵产物的产生的抑制,否则的话该应激压力会抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生。

Description

抗应激性微生物及发酵产物的制备方法

技术领域

本项发明系关于发酵产物的制备方法，具体说就是通过微生物发酵，制取氨基酸等有益物质的方法，以及对抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生的应激压力具有抗性的微生物。

背景技术

细胞一旦处于高温、高渗透压、代谢阻滞、重金属存在、病毒感染等应激状态，在很短时间内就可以诱导合成一种称为热应激蛋白的蛋白质(以下简称[HSP])，以防御应激反应。这种HSP，从原核细胞到真核细胞具有广泛的同源性，可分成这几个大组(HSP60组、HSP70组、HSP90组、TRiC组、其它组)(Hendrick，J.P.and Hartl F-V生物化学年评，62,349-384(1993))。

HSP之所以具有抗应激性，是因为HSP具有形成蛋白质高级结构的功能(蛋白质的折叠)。即蛋白质因应激反应而变性、不能形成正常高级结构，HSP与其相结合，该蛋白质重新形成正确的高级结构(再折叠)使其恢复正常功能。

在蛋白质形成高级结构的过程中，HSP不仅对已变性蛋白质发挥作用，即使是正常状态的细胞，HSP也作为伴侣分子参与到蛋白质的折叠、组装、转运等过程中，现在人们已经意识到它的重要性，给予很大关注(Ellis，R.J.等科学250，954-959(1990)。所谓伴侣分子就是辅助的意思，因HSP可与各种蛋白质相结合发挥作用而被命名的。

HSP是在细胞处于上述应激状态的诱导之下发现的。通常情况下，这种诱导是暂时的，不久就会减退，重新达到一个新的稳定状态。这种诱导HSP的方法，是在转录水平进行的(Cowing D.C.等，美国国家科学院院报，80，2679-2683(1985)，Zhou，Y.N.等，细菌学杂志，170，3640-3649(1988))。HSP基因中有一称为热应激启动子的结构，其中存在对该热应激启动子特异起作用的σ因子中的一种σ³²。σ³²是由rpoH基因编码半衰期很短(约1分钟)的一种蛋白质，它与短时诱导HSP密切相关(Straus，D.B.等，自然，329，348-351(1987))。σ³²的自身调节是靠转录及翻译进行的，但主要依靠翻译调节。

由热应激方式诱导HSP的方法，主要取决于σ³²合成量的增加和稳定性的增加二方面的机制。其中将σ³²的结构进行热处理，促进其翻译功能，可增加它的合成量(Yura.T.等，微生物学年评，47，321-351(1993))；关于σ³²稳定性问题，现在认为σ³²的降解过程与HSP(Dnak等)有关，通过HSP反馈抑制其活动，达到一定状态(Tilly，K等，细胞，34，641-646(1983)，Liberek，K，美国国家科学院院报8935116-3520(1994)。

我们已经了解：大肠杆菌(E.coli)在应激状态下HSP与细胞生长之间的关系(Meury，J.等，欧洲微生物学联合会微生物学快报，113 93-100(1993))、dnaK对人成长过程中激素产生的影响及groE对胶原酶原分泌的影响(Hockney，R.C.，生物工程动态12，456(1994))，但还不清楚氨基酸核酸等发酵产物与HSP之间的关系。而且还尚不清楚棒杆状细菌中HSP与生长的关系和HSP与发酵产物之间的关。

发明公开

本发明以明确HSP与微生物生长和发酵的关系为课题，在氨基酸等有益物质的发酵过程中，减少应激压力对微生物的生长/或发酵产物产生的影响，从而改善生产及收获率低下。

本发明人，为解决上述课题进行了专门的研究，将编码HSP的基因或编码HSP中有特殊功能的σ因子的基因导入微生物中，结果发现这样可使HSP活性增强，从而使微生物的生产性及生长等得到改善，及至最终完成本发明。

本发明也即包括如下特征的方法：在培养基中培养微生物，使发酵产物在培养基中生成和积聚，然后提取该发酵产物，再利用微生物制备发酵产物的方法，将前面提到的微生物中编码HSP的基因或编码HSP中有特殊功能的σ因子的基因，至少一个导入该发酵产物的细胞中，使HSP活性增强，减少应激反应对微生物的生长/或发酵产物产生的抑制。

另一方面，本发明涉及一种产生发酵产物用的微生物，其中该微生物由于导入至少一种编码HSP的基因和在细胞中特异性增强HSP表达量的σ因子的基因而被修饰，从而该微生物对应激压力的抗性增强，否则的话应激压力将抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生。

在一优选的实施方案中，根据本发明的方法和微生物涉及各种发酵产物包括，例如，L-苏氨酸，L-赖氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鸟苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物质如维生素和抗生素。

在另一优选的实施方案中，应激压力包括温度，培养基的渗透压，和对微生物的生长不利的高浓度的发酵产物。

在另一个优选的实施方案中，编码热应激蛋白的基因具体包括groE而编码σ因子的基因具体包括rpoH。

在另一个优选的实施方案中，本发明使用的微生物包括属于大肠杆菌属的细菌和棒杆状细菌。

下面将详细描述本发明。

本发明所使用的发酵产物没有具体限制，只要它是可用微生物发酵产生的产物即可。发酵产物这些由微生物产生的如，各种L-氨基酸如L-苏氧酸，L-赖氨酸，L-谷氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-苯丙氨酸；核酸或核苷如鸟苷酸，肌苷，和肌苷酸；以及其它物质如维生素和抗生素。甚至一些目前不是用微生物产生的物质，本发明可用于这些物质使它们可用微生物产生，例如作为基因重组的后续结果。在上述的物质中，本发明的方法优选用于那些被分泌到培养基中的物质，尤其是氨基酸，以便增加培养基的渗透压。

对因导入至少一种编码HSP的基因和编码σ因子的基因而被修饰的微生物没有特别限制，只要该微生物能通过发酵产生发酵产物即可，其中编码σ因子的基因可特异性的作用于HSP基因以增加其在细胞中的表达量，从而增加了对抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生的应激压力的抗性。该微生物包括那些以被用于产生物质的，例如属于大肠杆菌属的细菌，棒杆状细菌，属于枯草杆菌属的细菌，以及属于沙雷氏菌属的细菌。优选的微生物是其中以获得了一个含质粒的复制起点的DNA片段，HSP基因或对HSP基因特异的基因的操纵子，而且这些基因的拷贝数在微生物中增加。上述的棒杆状细菌是一组如伯杰氏鉴定细菌学手册，第8版，599页(1974)

中所定义的微生物，它们是好氧和抗酸的不具孢子形成能力的革兰氏阳性杆状菌，属于棒杆菌属的细菌，属于短杆菌属的目前已被划分到短杆菌属但现在仍与属于棒杆菌属的细菌一致的细菌，和属于与棒杆菌属密切相关的短杆菌属的细菌。

具体地说，每种发酵产物的代表性微生物如下。适于L-苏氨酸包括大肠杆菌VKPM B 3996(RIA)(参见美国专利5,175,107)，和噬乙酰乙酸棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172)(参见美国专利5,188,949)。适用于L-赖氨酸的包括，例如大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185，FERM BP-1543)(参见美国专利4,346,170)，大肠杆菌W3110(tyrA)(该菌株可通过从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3635)中去除质粒pHATerm而得到，参见WO 95/16042国际专利公报)，乳发酵短杆菌AJ12435(FERM BP-2294)(参见美国专利5,304,476)，和乳发酵短杆菌AJ3990(ATCC31269)(参见美国专利4,066,501)。适于L-谷氨酸的包括，例如大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3835)(参见法国专利公开2,680,178)，乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172)(参见日本专利公开5-26811，法国专利公开2,701,489)，乳发酵短杆菌AJ12475(FERM BP-2922)(参见美国专利5,272,067)，和乳发酵短杆菌AJ 13029(FERM BP-5189)(参见JP 95/01586国际专利公报)。适于L-亮氨酸的包括，例如，大肠杆菌AJ11478(FERMP-5274)(参见日本专利公报62-34397)，以及乳发酵短杆菌AJ3718(FERM P-2516)(参见美国专利3,970,519)。适于L-异亮氨酸包括，例如，大肠杆菌KXI41(VKPM B-4781)(参见欧洲专利公报519,113)，黄色短杆菌AJ12149(FERM BP-759)(参见美国专利4,656,135)。适于L-缬氨酸的包括，例如，大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411)(参见欧洲专利公报519,113)，乳发酵短杆菌AJ12341(FERM BP-1763)(参见美国专利5,188,948)。适于L-苯丙氨酸的包括，例如，大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579)(参见日本专利公开5-236947和欧洲专利公报488,424)，乳发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160)(参见法国专利公报2,686,898)。

用于本发明方法的微生物包括上述的微生物，在所定义的由导入了至少一种编码HSP的基因和特异性作用于HSP以增强HSP在细胞内的表达量的σ因子的基因而被修饰的微生物的范围以内，从而使该微生物增加了对抑制微生物生长和/或发酵产物的产生的应激压力的抗性。将被导入进微生物中的基因可以是编码HSP的基因和编码特异性作用于HSP基因的σ因子的基因中的任一个或二者。

术语“增加HSP的表达量”指增加原先产HSP的微生物的HSP的产物量，还意谓着使在原先的状态不表达HSP的微生物变德表达HSP。具体地说，HSP表达量的增加可这样实现，例如，通过将外来或外源HSP基因导入微生物的细胞中并使其在细胞中表而实现。在这样的方法中，可用能在微生物细胞中自主复制的载体，特别是多拷贝类型的质粒作为载体使细胞中的HSP基因的拷贝数增加。可替代地，HSP的表达可用具有高表达效率的启动子增加每单位HSP基因的表达量而被有效的增强。可替代地，HSP还可通过向微生物细胞中导入一个特异性用作HSP基因的内在启动子的σ因子的基因而被增强。

编码HSP的基因包括，例如，groE(GroELS的基因)，dnaK(DnaK的基因)，以及dnaJ(DnaJ的基因)。其中，优选groE。特异性作用于这些基因的σ因子以编码σ³²的rpoH为代表。作为这些基因来源低得微生物没有特别限制，只要每种基因能够在大肠杆菌属的或棒杆状细菌的微生物细胞中起作用，且具体的以属于大肠杆菌属和棒杆状细菌的微生物为代表。

已经报道了大肠杆菌的rpoH基因和groE基因的核苷酸序列(rpoH：细菌学杂志，170，3479-3484(1988)；groE：自然，333，330-334(1988))。这些基因可用在这些序列的基础上合成的寡核苷酸引物通过PCR方法(聚合酶链式反应)从大肠杆菌染色体中得到。扩增rpoH基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQ ID NOS 1和2所示。扩增groE基因的引物的核苷酸序列代表性地如SEQ ID NOS 3和4所示。

据报道已用PCR方法分离了黄色短杆菌的dnaK和groE基因，所用的引物是在来源于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的dnaK和groE基因中保守的氨基酸序列的基础上制备的，且这些基因与来源于其它微生物的dnaK和groE基因高度同源(1994年日本分子生物学联合会会议报告摘要，395页)。根据以上事实，预测编码其它HSP基因(dnaJ和rpoE基因等)也与其它来源于大肠杆菌的每一种基因高度同源。因此，认为可以很容易地使用来源于大肠杆菌的编码HSP的基因通过杂交方法，或者利用这些基因的部分序列通过PCR方法从棒杆状细菌中分离这些基因。

为了将如上所述得到的基因导入大肠杆菌属的细菌中，例如，将含有该基因的DNA片段与可在大肠杆菌属的细菌细胞中自主复制的载体连接，并可用得到的大肠杆菌属的重组载体转化大肠杆菌的细菌。为了将上述的基因大肠杆菌属细菌以外的其它微生物中，将含有该基因的DNA片段与可在微生物细胞中自主复制的载体连接，并可用得到的大肠杆菌属的重组载体转化该微生物。

质粒载体DNA是本发明中可使用的优选的载体DNA。这些适于以大肠杆菌属细菌作为导入用微生物的质粒包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，he RSF1010。可替代地，也可使用噬菌体DNA。为了有效地促进HSP的表达，可用在微生物中起操纵作用的启动子如lac，trp，和PL代替HSP的内在启动子。为了将HSP基因或特异性地对HSP基因起作用的σ因子导入微生物中，可用转座子的方法(Berg，D.E.和Berg，C.M.，生物和工程学，1，417(1983))，μ噬菌体(日本专利公开2-109985)，或同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室，1972)将含有该基因的DNA整合到微生物的染色体中。

当导入该基因用的微生物是棒杆状细菌时，可用于本发明的载体DNA包括能在棒杆状细菌自主复制的质粒载体，如pAM330(参见日本专利公报1-11280)，和pHM1519(参见日本专利公开58-77859)。

转化方法与制备微生物转化子的普通方法没有特别不同。例如，对属于大肠杆菌属的细菌，可根据D.M.Morrison的方法(酶学方法，68，326(1979))，用氯化钙处理受体细胞以增加对DNA的通透性的方法(Mandel，M和Higa，A，分子生物学杂志，53，159(1970))。棒杆状细菌根据Mandel等的方法转化，或者如在枯草芽孢杆菌中所述的在增殖期导入的方法(以提供所谓的感受态细胞(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，基因，1，153(1977))。可替代地，重组DNA可在将DNA受体细胞转变为原生质体或原生质球后被导入，如在枯草芽孢杆菌，放线菌和酵母中已知的那样可以容易地整合重组DNA(Chang，S和Choen，S.N.，分子和普通遗传学，168，111(179)，Bibb，M.J.，Ward，J.M.，和Hopwood，O.A，自然，274，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.Fink，G.R.，美国国家科学院院报，75，1929(1978))。可替代地，也可用电脉冲方法将重组DNA导入属于短杆菌属或棒杆菌属的细菌中(杉木等，日本专利公开2-207791)。

普通微生物在受到培养温度增加，由发酵产物或高浓度的培养基成分引起的高渗透压，或与目标发酵产物相关的代谢异常等应激压力的影响时，其生长受抑制，发酵产物的产量和产率下降。相反地，可能通过增强HSP的表达增加对此类应激压力的抗性。结果，可以在受上述应激压力影响的环境下增加发酵产物的产量。对应激压力的抗性不是指完全的抗性，因此还包括减少由应激压力引起的影响的特征。根据将被导入基因的类型和宿主微生物的类型，不是生长的抑制和发酵产物产量和产率的下降都必须脱敏。有时尽管生长受到抑制，但发酵产物的产率确有提高。根据本发明的方法可以增加对其抗性的应激压力包括，如温度，培养基的渗透压和培养基中对微生物的生长非优选的高浓度的氨基酸。

根据所用的微生物，用于本发明方法的发酵生产培养基可以是已知的培养基。即，是含碳源，氮源，无机离子和任选的其它有机成分的普通培养基。实现本发明不需要特殊的培养基。

这些可用作碳源的包括，例如，糖类如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖和淀粉水解产物；醇类如甘油和山梨糖醇；有机酸如富马酸，柠檬酸，和琥玻酸。

可用作氮源的包括，例如，无机氨盐如硫酸铵，氯化铵，和磷酸铵；有机氮如大豆水解产物，氨气，和氨水。

还希望含有合适量的作为有机微量营养源的所需物质如维生素B1，L-高丝氨酸，和L-酪氨酸；酵母提取物等。处此之外，如果需要还要加入小量的磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等。

根据所用的微生物，可在已知的培养条件下进行培养。优选培养在通气条件下进行16-120小时。在培养中温度控制在25℃-45℃，pH控制在5-8。调节pH可以使用无机或有机的，酸性或碱性的物质，氨气等。

在本发明中，在发酵完成之后从培养基液体中收集发酵产物，不需要任何特殊方法。即，本发明可综合使用离子交换树脂，沉淀和其它已知的方法进行。

实施本发明的最佳方式

下面将参照实施例对本发明进行更详细地描述。

实施例1：制备导入rpoH基因和groE基因用的质粒

<1>rpoH基因和groE基因的克隆

根据PCR方法(聚合酶链式反应)对大肠杆菌的rpoH基因和groE基因进行了克隆。PCR方法中所用的引物是在已报道的大肠杆菌的rpoH基因(细菌学杂志.，170，3479-3484(1988))和groE基因(自然，333，330-334(1988))序列的基础上合成的。合成了具有如SEQ ID NO：1(5’端)和SEQ ID NO：2(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作为扩增rpoH基因的引物。合成了具有如SEQ ID NO：3(5’端)和SEQ IDNO：4(3’端)所示的核苷酸序列的寡核苷酸作为扩增groE基因的引物。

(扩增rpoH基因的引物)

5′端-CGGAACGAAGTTTGATATCA-3′(SEQ ID NO：1)

3′端：5′-ATCCAGGGTTCTCTGCTTAA-3′(SEQ ID NO：2)

(扩增groE基因的引物)

5′端：5′-GACGTCGATAGCAGGCCAAT-3′(SEQ ID NO：3)

3′端：5′-GACGCACTCGCGTCGTCCGT-3′(SEQ ID NO：4)

采用齐藤法(Saito H.and Miura，K，生物化学和生物物理学报，72，619(1963))从大肠杆菌K-12菌株中提取染色体DNA，以此为模板，使用上述的寡核苷酸作为引物，进行PCR反应

PCR反应即：热变性(94℃下1分钟)、退火(37℃下2分钟)、聚合反应(72℃下3分钟)如此反复25次。

用市场上销售的DNA未端平齐化试剂盒(宝酒造社制Blunting kit)，将获取的扩增产物的两末端平齐化处理，之后，将产物分别在载体质粒pSTV28的HincII位点导入，即得到了质粒pSTV28-rpoH和pSTV28-groE

<2>在含有rpoH基因和groE基因的质粒中导入棒杆状菌的复制起点

为了使pSTV28-rpoH能在棒杆状细菌细胞内自主复制，一个来源于已得到的可在棒杆状细菌内自主复制的pHM1519质粒(Miwa，K等，农业生物化学，48(1984)2901-2903)的复制起点(日本专利公开5-007491)导入pSTV28-rpoH中。具体地，用限制酶BamHI和KpnI消化pHM1519以得到含复制起点的DNA片段。用DNA末端平齐化试剂盒(宝酒造社制)将得到的片段末端平齐化，然后将KpnI接头(宝酒造社制)与该末端连接。该片段被插入了pSTV28-rpoH质粒的KpnI位点以得到pRPH。另一方面。用不含rpoH基因的质粒pHSG399作为对照。还用SalI接头(宝酒造社制)将来源于pHM1519的复制起点对照质粒的SalI位点已得到pSAC4。

实施例2用导入了rpoH基因的产谷氨酸细菌生产谷氨酸

如上所述得到的pRPH和pSAC4被导入了具有产L-谷氨酸能力的乳发酵短杆菌AJ12821(FERM BP-4172)中。对含各个导入质粒的转化子的谷氨酸产量进行评估。用电脉冲方法将质粒导入乳发酵短杆菌的细胞中(日本专利公开2-207791) 。

将含导入的质粒的转化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培养基(1L纯水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克琼脂，pH7.2)上筛选。

对得到的转化子的谷氨酸的产力进行了如下评价。在CM2G平板培养基中培养各转化子，进行细胞更新，在1L纯水中含葡萄糖80g、KH₂PO₄1g、MgSO₄.7H₂O 0.4g、(NH₄)₂SO₄ 30g、FeSO₄.7H₂O 0.01g、MnSO₄·7H₂O 0.01g、大豆水解液15ml、盐酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO₃ 50g这样的培养基中培养更新的各转化子(用KOH调节PH在8.0)。优选31-32℃培养20小时。

培养后，测定菌体浓度和积聚在培养基中的L-谷氨酸的浓度。用Asahi化学公司的Biotec AnalyzerAs-210定量测定L-谷氨酸。把培养液用0.2N盐酸稀释51倍，通过它在660nm时的吸光度(OD₆₆₀)菌体浓度。结果如表-1所示。

表1

菌株	L-谷氨酸(g/dl)	OD₆₆₀
菌株	L-谷氨酸(g/dl)	OD₆₆₀	AJ12821/pSAC4AJ12821/pRPH	3.34.3	0.980.68

这一结果表明：导入了rpoH基因的乳发酵短杆菌谷氨酸生产菌，它的生长被抑制，而谷氨酸的产生量却增加了。

实施例3导入了rpoH基因的赖氨酸生产菌赖氨酸的产生

上述制备的pRPH和pSAC4被导入了从乳发酵短杆菌ATCC13869突变而来的抗S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸并能产生L-赖氨酸的乳发酵短杆菌AJ12435(FERM BP-2294)中。测定了携带有各导入质粒的转化子的L-赖氨酸的产力。

用电脉冲的方法(日长专利公开2-207791)将质粒导入了乳发酵短杆菌的细胞中。

将含导入的质粒的转化子在含4μg/ml氯霉素的CM2G的平板培养基(1L纯水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15免琼脂，pH7.2)上筛选。

对得到的转化子的L-赖氨酸的产力进行了如下评价。在CM2G平板培养基中培养各转化子，进行细胞更新，在1L纯水中含葡萄糖80g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄.7H₂O 0.4g、(NH₄)₂SO₄ 30g、FeSO₄.7H₂O 0.01g、MnSO₄·7H₂O 0.01g、大豆水解液15ml、盐酸硫胺200μg、生物素300μg、氯霉素4mg及CaCO₃ 50g这样的培养基中培养更新的各转化子(用KOH调节PH在8.0)。培养后，测定菌体浓度和积聚在培养基中的L-谷氨酸的浓度。用Asahi化学公司的Biotec AnalyzerAs-210定量测定L-赖氨酸。把培养液用0.2N盐酸稀释51倍，通过它在660nm时的吸光度(OD₆₆₀)菌体浓度。结果如表-2所示。

表2

菌株	L-赖氨酸(g/dl)	OD₆₆₀
菌株	L-赖氨酸(g/dl)	OD₆₆₀	AJ11446/pSAC4AJ11446/pRPH	2227	0.781.15

如表2所示，导入了rpoH基因的乳发酵短杆菌的细菌生长良好，L-赖氨酸的产量也有增加。猜想该结果收由于L-赖氨酸的积聚而来的渗透压的增加波动的影响。

实施例4导入了groE基因的L-苯丙氨酸生产菌苯丙氨酸的产生

将按上述方法制备的pSTV28-groE或pSTV28导入培养自大肠杆菌K12株的苯丙氨酸生产菌AJ12604菌株(FERM BP-3579)中。对导入质粒的各转化子产生苯基丙氨酸的情况进行评价。

通过电子脉冲法(日本专利公开2-207791)导入质粒。

将含导入的质粒的转化子在含40μg/ml氯霉素的CM2G的平板培养基(1L纯水中含10克蛋白胨(polypeptone)，10克酵母提取物，5克葡萄糖，5克NaCl，15克琼脂，pH7.2)上筛选。

对得到的转化子产生苯基丙氨酸的性能进行了如下评价。在含40 mg/L氯霉素的L平板培养基中培养各转化子，进行细胞更新。在1L纯水中含葡萄糖20g、Na₂HPO₄ 29.4g、KH₂PO₄ 6g，NaCl 1g，NH₄Cl 2g，10g柠檬酸钠，0.4g谷氨酸钠，MgSO₄.7H₂O 3g、0.23g Kcl，2mg盐酸硫胺，75mgL-酪氨酸和40mg氯霉素，这样的培养基中培养更新的各转化子(用KOH调节PH在7.0)。培养后，测定菌体浓度和积聚在培养基中的L-苯丙氨酸的浓度。用Asahi化学公司的Biotec AnalyzerAs-210定量测定L-赖氨酸。把培养液用纯水稀释51倍，通过它在660nm时的吸光度(OD₆₆₀)菌体浓度。结果如表-3所示。

表3

菌株	L-苯丙氨酸(g/dl)	OD₆₆₀
菌株	L-苯丙氨酸(g/dl)	OD₆₆₀	AJ12604/pSTV28AJ12604/pSTV28-groE	1.52.0	0.1430.146

这一结果表明：导入groE基因的大肠杆菌的L-苯丙氨酸的产生量增加了。

实施例5 导入了rpoH基因的具有了产生L-赖氨酸能力的大肠杆菌L-赖氨酸的产生

使用大肠杆菌W3110(tyrA)株作为生产赖氨酸的宿主。在欧洲专利公开92年488424号公报中详细记载W3110(tyrA)株，以下就简要地介绍其制备方法。

从国立遗传学研究所(静冈县三岛)获得大肠杆菌W3110。将该菌株涂布在含有链霉素的LB平板上，从形成的菌落中可取得耐链霉素株。把选择出的耐链霉素株和大肠杆菌ME8424株混和，在完全培养基(L-肉汤：1％细菌培养用胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCI)37℃的条件下，15分钟静置培养，诱导融合。大肠杆菌K-12 ME8424株有(hfrP045，thi，relA1，tryA：Tn10，ung-1，nadB)的遗传特征，能够从国立遗传学研究所取得。然后，把培养物放入含有链霉素、四环素以及L-酪氨酸的完全培养基(L-肉汤：1％细菌培养用胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物，0.5％NaCl)中，选择形成菌落的菌株，将此株命名为大肠杆菌(tyrA)株。

在欧洲专利公报488424(1992)中描述了许多把质粒导入而形成的菌株。例如，将导入了质粒pHATerm的菌株命名为大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm，根据布达佩斯条约于1991年11月16以登记号FERM BP-3635保藏于通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(邮编305日本茨城县筑波市东1区1条3号)。可用常规方法将质粒pHATerm从该菌株去除而得到大肠杆菌W3110(tyrA)。

根据实施例4的方法，把携带有赖氨酸合成基因的质粒RSFD80导入了大肠杆菌W3110(tyrA)菌株。RSFD80在WO 95/16042国际专利公报中有描述，它含有对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的编码二氢叶酸还原酶的DNA，和对L-赖氨酸反馈抑制脱敏的编码天冬氨酸激酶的DNA。携带RSFD80质粒的大肠杆菌JM109菌株被命名为AJ12396，并于1993年10月28号以登记号FERM P-13936保藏于通商产业省工业技术院生命工业技术研究所(邮编305日本茨城县筑波市东1区1条3号)，并根据1994年11月1日布达佩斯条约转移为国际保藏，保藏号FERM BP-4859。

导入了RSFD80的W3110(tyrA)的转化子在含50μg/ml的链霉素的平板培养基上进行筛选。

另一方面，为导入rpoH基因用的质粒构建如下。根据实施例1<1>中的PCR方法扩增rpoH基因。用商业购德的DNA末端平齐化试剂盒使得到的扩增产物两端平齐化(宝酒社造制)，然后将其克隆进质粒载体pMW119(和光纯药社制)的HincII位点。根据上述方法将该质粒导入大肠杆菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株中。在含50μg/ml的链霉素和50μg/ml的氨苄青霉素的L平板培养基上进行筛选。

对上述得到的大肠杆菌W3110(tyrA)/RSFD80菌株和大肠杆菌W3110(tyrA)/RSFD80+pMWrpoH菌株的L-赖氨酸产力进行评价。

对得到的转化子的L-赖氨酸的产力评价如下。将转化子培养在L平板培养基上使细胞更新。每个更新的转化子在37℃在如下培养基中培养30小时，其中培养基在1L纯水中含有：40g葡萄糖，1gKH₂PO₄，0.01gMnSO₄.7H₂O，0.01gFeSO₄.7H₂O，2g酵母提取物，0.1gL-酪氨酸，1gMgSO₄，和25gCaCO₃(用KOH调pH值为7.0)。除了在最初加入40g/L盐酸L-赖氨酸外，在本该转化子也被培养在相同的培养基中。用旭化成(株)制造的Biotec分析仪AS210对L-赖氨酸进行定量测定。表4示以盐酸L-赖氨酸表示的L-赖氨酸量的增加(在培养后从培养基中L-赖氨酸的量中去除初始加入的L-赖氨酸的量)。

表4

菌株	盐酸L-赖氨酸的量(g/L)初始加入的盐酸L-赖氨酸的量(g/L)0 40
菌株	盐酸L-赖氨酸的量(g/L)初始加入的盐酸L-赖氨酸的量(g/L)0 40	W3110(tyrA)/RSFD80W3110(tyrA)/RSFD80+pMWrpoH	9.17 6.439.22 7.64

根据以上结果，与不含导入的rpoH基因的菌株相比，即使在高浓度的L-赖氨酸的存在下，大肠杆菌的L-赖氨酸的产率也有提高。

用于产业中的可能性

通过本发明，明确了HSP与微生物生长和发酵产物发酵之间的关系，能够在氨基酸等有益物质的发酵过程中，减少应激反应的影响，改善生产和收获率低下。

序列表(1)一般信息申请人：味素株氏会社发明名称：抗应激性微生物及发酵产物的制备方法序列数：4联络方法：

A会社名称：味素株氏会社

B会社地址：京桥1丁目15-1

C市：中央区

D州：东京都 E国：日本F邮区：104计算机可读形式A媒体：B计算机：C操作系统：D软件：当前申请数据A申请号：B申请日：C分类：代理人/事物所信息A名字：B登记号：C整理号：通信方法：A电话号码：B传真号码：(2)有关SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征：A长度：20B种类：核酸C链型：单链D拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列说明：SEQ ID NO：1CGGAACGAAG TTTGATATCA20(2)有关SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征：

A长度：20

B种类：核酸

C链型：单链

D拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列说明：SEQ ID NO：2号序列ATCCAGGGTT CTCTGCTTAA20(2)有关SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征：

A长度：20

B种类：核酸

C链型：单链

D拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列说明：SEQ ID NO：3GACGTCGATAGCAGGCCAAT 20(2)有关SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征：

A长度：20

B种类：核酸

C链型：单链

D拓扑学：线性(ii)分子类型：其它核酸合成寡核苷酸(xi)序列说明：SEQ ID NO：4GACGCACTCGCGTCGTCCGT 20

Claims

1.一种用微生物制备发酵产物的方法，其特征在于包括在培养基中培养微生物使其在培养基中长生和积累发酵产物以及收集发酵产物的步骤，其中：

所说的微生物由于导入至少一种编码热应激蛋白和编码特异性作用于热应激蛋白，增加其在细胞中的表达量的σ因子的基因而被修饰，从而所述微生物可增加对应激压力的抗性，否则的话该应激压力会抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生。

2.权利要求1的方法，其中发酵产物是氨基酸。

3.权利要求1的方法，其中所述应激压力是温度，培养基的渗透压，或对微生物的生长不利的目标发酵产物。

4.权利要求1的方法，其中所述编码热应激蛋白的基因是groE。

5.权利要求1的方法，其中所述编码σ因子的基因是rpoH基因。

6.权利要求1的方法，其中所述微生物是属于大肠杆菌属的细菌，或者是棒杆状细菌。

7.一种用于产生发酵产物的微生物，其中所说的微生物由于导入至少一种编码热应激蛋白和编码特异性作用于热应激蛋白，增加其在细胞中的表达量的σ因子的基因而被修饰，从而所述微生物可增加对应激压力的抗性，否则的话该应激压力会抑制微生物的生长和/或发酵产物的产生。