CN1082092C - 物质的生产方法 - Google Patents

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Abstract

通过提高微生物细胞的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的产率，来提高微生物发酵中一些物质，例如L-氨基酸、抗生素、维生素、生长因子和生理活性物质的产率。

Description

物质的生产方法
               技术领域
本发明涉及利用微生物来生产目的物质的方法。本发明的典型微生物包括属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物和棒状杆菌，它们被传统用于多种物质生产中。所生产的目的物质，包括L-氨基酸、抗生素、维生素、生长因子、生理活性物质，以及其他传统由微生物生产的物质。本发明公开了在利用微生物的物质生产方法中，提高最终目的产物产率所使用的方法。
               技术背景
L-氨基酸发酵是使用微生物生产目的产物的公知方法的典型例证。L-氨基酸不仅被用于调味品和食品，也用于作各种的医药营养混合物组分，用作动物饲料添加剂，制药业及化学工业中的药剂，以及作为利用微生物产生L-氨基酸如L-赖氨酸和L-高丝氨酸等的生长因子。作为用于发酵法生产L-氨基酸的微生物，众所周知的有棒状杆菌属于埃希氏杆菌属、棒状杆菌属(Bacillus)、及沙雷氏菌属(Serratia)的微生物。
野生型微生物(野生型株)、由野生株诱导而得的营养缺陷株、作为多种耐药性突交株的、由野生株诱导而得的代谢调节变异株以及既有营养缺陷株和代谢调节变异株两方面性质的株都可用于发酵法生产L-氨基酸。营养缺陷株所需物质随不同的株而不同，并且，对于同种物质，不同的营养缺陷株要求程度亦不同。同样，对于作为耐药性变异株的代谢调节变异株亦有多样性。
近年来，使用了重组DNA技术进行L-氨基酸的发酵生产。此技术的原理是在宿主微生物中，富集L-氨基酸生物合成酶(系)，强化宿主微生物的L-氨基酸生物合成系统。参见「氨基酸发酵学会出版中心1986」。
但是，传统用于发酵法生产L-氨基酸的微生物，其L-氨基酸生物合成途径、以及辅酶的生物合成途径等，与野生型微生物的生物合成途径没有什么不同。即，L-氨基酸生产微生物的育种，对于在L-氨基酸生物合成途径中存在的最终产物或类似物是脱敏的。为了如此育种，对微生物细胞提供营养要求性及耐药性，用重组DNA技术，进行生物合成酶(系)基因的扩增。
另外，除L-氨基酸以外，利用微生物发酵法生产的物质有很多。例如抗生素和维生素。抗生素有各种各样的种类，有多种物质作为其生物合成的前体。如糖、氨基酸、醋酸、丙酸、甲羟戊酸等。通过前体之外的多种代谢物的转换过程，从这种前体中产生目的抗生素。对于维生素和其他生物产生物质也有同样的机制。
在利用微生物生产上述各种物质的时候，每种物质都是由微生物细胞内的生物合成途径来生产的。有一种重要的辅酶是生物合成体系中相应酶充分起作用所必需的，它就是还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸(以下称作NADPH)，但是，对于NADPH和利用微生物生产物质的关系，尚未报导。
与NADPH的产生有关的酶之一是烟酰胺二核苷酸转氢酶(以下称作转氢酶)。该酶被公认存在于包括埃希氏杆菌属微生物的各种生物中。大肠杆菌是埃希氏杆菌属的典型微生物，其转氢酶的纯化(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Eur.J.Biochem.，149，517-523(1985))，其编码基因的克隆(David M.Clarke and Philip D.Bragg，J.Bacteriology，162，367-373(1985))，基因的核苷酸序列的测定(David M.Clarke，Tip W.Loo，Shirley Gillam，and PhilipD.Bragg，Eur.J.Biochem.158，647-653(1986))已进行，也明确了该酶的存在。然而，该酶的生理活性几乎未知。这一点被该酶缺陷株没有表现型表达的事实所证明。
               发明公开内容
本发明的主题是，提高微生物产生目的物质的产率，包括步骤：在培养基中培养微生物，使目的物质在该培养基中生成并蓄积，收集该目的物质。
传统的提高目的物质的方法是：对于目的物质的生物合成途径产生的终产物或其他物质引起的合成调节的失敏，或对于存在于微生物细胞中的目的物质合成所必需的辅酶的失敏。本发明是根据提及以外的全新的原理，给出一种提高目的物质产率的方法。
对于在生物体内进行的物质如L-氨基酸的生物合成，要起多种还原反应。辅酶NADPH被生理性用作生活期内还原物质。例如，对于L-谷氨酸的生物合成途径，谷氨酸脱氢酶要求NADPH作为辅酶。对于L-赖氨酸的生物合成途径中，天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸还原酶也要求NADPH作为辅酶。
对于其他L-氨基酸的生物合成途径也是同样，NADPH作为辅酶起到了重要的作用。并且，对于多数L-氨基酸的生物合成途径，L-谷氨酸为氨基的供给源是必要的，因此，在L-氨基酸生物合成中NADPH是供给氨基必不可少的。
NADPH大部分是由在含有葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶和磷酸葡萄糖脱氢酶的磷酸戊糖循环中，葡萄糖被代谢而生成的。由于磷酸戊糖循环，可以释放出二氧化碳，因此，NADPH的产率，可以按每一个葡萄糖分子，相对于12个NADPH分子来计算。
另一方面，虽然还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下简称为NADH)与NADPH是极为相似的分子，但在许多情况下则不能作为L-氨基酸生物合成的辅酶。NADH在TCA循环中被生物合成，通常大量存在于细胞内。
对于L-氨基酸的生物合成途径，由葡萄糖生物合成所需L-氨基酸过程中，在很多情况下，产生了不能够有效地被利用的生物体内的成份。通常这样的成份在TCA循环中被氧化，结果产生很多NADH。
本发明提出了一种假说，对于利用微生物生产目的物质的方法，在生产目的物质时，需要大量的NADPH，为提供这种MADPH，就要不可避免地消耗葡萄糖，结果引起每消耗糖量的目的物质产率的降低(假说1)。
并且，发明者提出了一种假说，对于利用微生物生产目的物质的方法，在生产目的物质时，不能被有效地利用的生物体内成份会不可避免地蓄积起来，在TCA循环中被代谢，结果引起的细胞内NADH浓度上升(假说2)。
基于上述假说1和假说2，如果细胞内的NADH能够充分地转交成NADPH，就可以节约NADPH的生物合成所需要的糖，微生物就可以以更高的产率生产目的物质。同时假定，作为在TCA循环中所生成的NADH转变成NADPH的这种方法，也可以考虑利用转氢酶。
发明者，以上述概念为基础进行了研究。深入研究的结果，从埃希氏杆菌中获得含有转氢酶基因的DNA片段，使用此DNA片段，能够成功地使微生物的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的生产能力上升。因此，上述具有提高的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的生产能力的微生物能够提高目的物质的产率。
即，本发明具有以下特征：
(1)一种使用微生物生产目的物质的方法，包括步骤：在培养基中培养微生物，在该培养基中，使目的物质生成并蓄积，以及
从培养基中收集目的物质
这个利用微生物生产还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的产率得到提高。
(2)(i)的方法：其中目的物质是L-氨基酸
(3)(2)的方法：其中L-氨基酸选自L-苏基酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或是L-苯丙氨酸；
(4)(1)或(2)的方法：其中微生物属于埃希氏杆菌；
(5)(1)或(2)的方法：其中微生物属于棒状杆菌；
(6)(1)或(5)的方法：其中通过提高微生物细胞内烟酰胺核苷酸转氢酶的酶活性而提高微生物还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的产率。
(7)(6)的方法通过增加微生物细胞内编码烟酰胺核苷酸转氢酶基因的表达数量，而提高微生物的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的产率。
(8)(7)的方法通过增加微生物细胞内的烟酰胺核苷酸转氢酶基因拷贝数，从而提高微生物的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸的产率。
本发明利用微生物所产生的目的物质是如L-苏基酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸等的各种L-氨基酸。除此之外，任何下面提及的微生物产生的，在其生物合成途径中必需NADPH的物质，如鸟苷酸、次黄苷酸等的核酸类、维生素类、抗生素、生长因子、生理活性物质等都是可应用的。另外，即使是不是利用微生物生产的物质，假如对于它的生物合成，NADPH是必要的物质，则一定可以使用本发明。
例如，生物合成链霉素，在从dTDP-葡萄酸到dTDP-4-氧-4，6-双脱氧-D-葡萄糖的合成中，要使用NADPH。另外，对于肽抗生素，由于氨基酸成为前体，对于它的生物合成，NADPH是必要的。青霉素是一种β-内酰胺抗生素其前体是L-缬氨酸、L-半胱基酸以及L-α-氨基已二酸，对于它的生物合成，NADPH也是必要的。
试图知道任何物质的生物合成需要NADPH时，假如生物合成途径被揭示，从其生物合成途径可以显而易见。
本发明所用的微生物，假如它属于那些用于生产的埃希氏杆菌属、棒状杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属等，并没有被特殊地限定。优选微生物，其DNA片段含有从微生物中分离得的质粒的复制起点，转氢酶基因机能，以及增高的转氢酶基因的拷贝数。另一方面，具有起始的目的物质的高生产能力的株，根据本发明，最优选为应用提高产率的菌株。因为高产率的菌株引起的上述假说1，假说2的现象更强，因此，利用本方法，产率的改良的效果应该表现得更为明显。例如，目的物质是L-苏基酸时，例举大肠杆菌
B-3996(VKPM B-3996)(RIA 1867)(参照美国专利第5,175,170号)、棒状杆菌。乙酰嗜酸菌AJ12318(FERM BP-1172)(参照美国专利第5,188,949号)等，L-赖氨酸时，例举大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185，FERM BP-1543)(参照美国专利第4,346,170号)、乳糖发酵短杆菌AJ 3990(ATCC 31269)(参照美国专利第4,066,501号)等，L-谷氨酸时，例举大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)(参照法国专利公开申请第2,680,178号)、乳糖发酵短杆菌，AJ12475(FERM BP-2922)(参照美国专利第5,272,067号)等，L-亮氨酸时，例举大肠杆菌AJ11478(FERM P-5274)(参见特公昭62-34397号)、乳糖发酵短杆菌AJ 3718(FERM P-2516)(参照美国专利第3,970,519号)等，L-异亮氨酸时，是大肠杆菌KX141(BKTTM B-4781(VKPM B-4781)(参照欧洲专利公开申请第519,113号)、乳糖发酵短杆菌AJ 12419(FERM BP-759)(参照美国专利第4,656,135号)等，L-缬氨酸时，是大肠杆菌VL1970(BKTTM B-4411(VKPM B-4411)(参照欧洲专利公开申请第519,113号)、乳糖发醇短杆菌，AJ 12341(FERM BP-1763)(参照美国专利第5,188,948号)等，L-苯丙氨酸时，是大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579)(参照欧洲专利公开申请第488,424号)、乳糖发酵短杆菌AJ12637(FERM BP-4160)(参照法国专利公开申请第2,686,898号)。
本发明使用的生产目的物质的培养基，可以使用对应于所采用的微生物，传统使用的众所周知的培养基。即含有碳源、氮源、无机离子以及优选其他有机成份的普通培养基。实施本发明无需特别的培养基。
作为碳源，可以使用例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉水解物等糖类、甘油和山梨醇等的醇类、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。
作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化胺、磷酸铵等的无机铵盐、大豆水解物等的有机氮、氨气、氨水等。
作为微量有机营养源，例如维生素B1、L-高丝氨酸、L-酪氨酸、酵母提取物等的必需物质，并且优选适量的含有。除此之外，少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等也是任选的。
对应于所采用的微生物，可以在传统使用的公知的条件下进行。例如，在有氧条件下可以培养16-120个小时，培养温度为25℃-45℃，培养中的pH值控制在5-8。另外，可以使用无机或有机的酸或碱物质以及氨气等调节pH值。
从培养结束后的培养基中收集代谢产物，本发明无须特别的方法。也就是说，本发明将传统的众所周知的离子交换树脂片，沉淀法及其他方法组合起来实施的。
作为使微生物的NADPH的生产能力上升的方法，可以例举微生物细胞内的转氢酶的酶活性上升。
作为使转氢酶的酶活性上升的方法之一，可以例举提高转氢酶的基因的表达量。另一种提高转氢酶酶活性的方法是修饰转氢酶基因以产生具有的升高活性的转氢酶。
微生物细胞内的转氢酶基因的表达数量上升的方法，可例举微生物细胞内的转氢酶的拷贝数提高。
为了提高转氢酶基因的拷贝数，含有上述基因的DNA片段是必要的。转氢酶基因已被克隆到埃希氏杆菌属的大肠杆菌K-12中，其核酸序列已被确定(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)。制备上述基因的DNA片段，可以使用D.M.Clarke et al.所揭示的方法。另外，使用参照D.M.Clarkeet al.所揭示的碱基序列制成的合成DNA探针进行杂交法，或使用按照上述碱基序列制成的合成DNA为引物的PCR法，用以上两种方法能够得到所期望的DNA片段。将能够在目的微生物内自主复制的质粒-DNA，与含有转氢酶基因的DNA片段相连，将其导入上述微生物，能够使转氢酶基因的拷贝数上升。
在使用PCR法从埃希氏杆菌属细菌中克隆转氢酶基因时，所使用的DNA引物，对于大肠杆菌，可以基于合适的已知的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)制成。由于转氢酶是两个亚基组成的，因此必须把它们各自的基因pntA pntB的扩增。能够扩增pntA，pntB两个基因的3Kb的区的两个引物、5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID N0：1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO：2)是适合的。这些引物与D.M.Clarke et al.，所报告的序列略有不同，然而由于其序列的变化，可以在pntA，pntB两个基因的上游导入BamH I酶切位点，在其下游导入Hind III酶切位点，BamH I和Hind III位点在两基因内以及它们附近都不存在。所以，当使用这些限制酶进行克隆扩增的DNA片段，以及转运到其他载体-DNA时，是很方便的。引物-DNA的合成，可以使用Applied Biosystems公司制造的DNA合成仪model 380 B，用phosphoamidite法(Tetrahedron letters，22，1859(19817)按常规进行。PCR反应，可用宝酒造有限公司制造的DNAサ-マルサィクゥ-PJ 2000型，使用Taq DNA聚合酶，依照厂家指定的方法进行。
含转氢酶基因的DNA片段，可以从埃希氏杆菌属细菌以外的微生物中取得，取得方法是参考D.M.Clarke et al.，公开的碱基序列，制备DNA探针进行杂交，或按照上述碱基序列合成DNA引物进行PCR，就可以得到所希望的DNA片段。
在杂交法中使用的DNA探针，或用PCR法克隆基因时使用的DNA引物，可以基于已知的序列，例如大肠杆菌的序列(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)适当地制成。预计对各种微生物，基因的碱基序列是不同的，主张制备的合成DNA应匹配于那些在来源于各种微生物转氢酶之间的保守的部分。
用PCR法扩增的转氢酶基因，在导入埃希氏杆菌属细菌时，连接到能够在埃希氏杆菌属细菌细胞中自主复制的载体DNA上，导入埃希氏杆菌属细菌细胞。
对于将得到的含有转氢酶基因的DNA片段，导入埃希氏杆菌属细菌以外的微生物时，将上述DNA片段连接到能够在待导入上述DNA片段的微生物细胞中自主复制的载体DNA上，导入上述细胞。
本发明使用的载体-DNA，优选质粒载体DNA。可例举pUC19、pUC 18、pBR 322、pHSG 299、pHSG 399、RSF 1010等。另外也可以使用噬菌体DNA载体。为有效地表达转氢酶，也可以使用微生物内起作用的启动子，如lac、trp和PL。另外，为使转氢酶基因拷贝数上升，可采用转座子(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1,417(1983))Mu噬菌体(专利申请平成2-109985)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor  Lab.1972))的方法，将含有上述基因的DNA(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))整合入染色体。
在导入基因的是微生物是棒状杆菌时，本发明能够使用的载体-DNA是棒状杆菌中能够自主复制的质粒载体、如pAM 330(参照专利申请平成1-11280公报)和pHM 519(参照专利申请昭和58-77895号公报)等。
从具有提高的转氢酶活性的可能性的待选株中，为了选择在实际上具有提高的转氢酶活性的株，可使用已知的方法(David M.Clarkeand Philip D.Bragg，Journal of Bacteriolony，162，367-373(1985))来确认转氢酶活性的增强。
               附图简述
图1、表示质粒pMW∷THY的制备。
图2、表示质粒pHSG∷THYB的制备。
图3、表示质粒pSU∷THY的制备。
         实施本发明的最佳方式
通过列举以下实施例，更加具体地说明本发明。
实施例1  转氢酶基因的克隆
编码大肠杆菌的转氢酶的pntA，pntB基因的碱基序列已经报导过(D.M.Clarke et al.，Eur.J.Biochem.，158，647-653(1986)、pntA编码502氨基酸残基的蛋白质、pntB编码462氨基酸的蛋白质。另外，这两种蛋白质对于转氢酶活性的表达都是必要的，两个基因在染色体DNA上连续排列因而两基因可作为1个DNA片段得以克隆。
本发明者，为以后的操作的方便，不仅克隆两个基因，并同时对于已知的存在于这些基因的上游的有启动子活性的区域，进行克隆。具体说就是用PCR法，放大含有基因和启动子区的DNA片段，进行克隆。
用常规法制备5′-CTGATTTTTGGATCCAGATCACAG-3′(SEQ ID N0：1)，5′-CGTTCTGTTAAGCTTTCTCAATAA-3′(SEQ ID NO：2)的二种合成DNA，作为PCR反应用的引物。对于PCR反应DNA模板，用斋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))制备大肠杆菌K-12 MC 1061株的总染色体组DNA。使用两种引物-DNA和模板染色体DNA，根据Erlich等人的方法(PCR Technology，Stockton press(1989))进行PCR反应，进行最终DNA片段的扩增。另外，作为引物使用的两个合成DNA的碱基序列与D.M.Clarkeet al.报告的序列，在其合成DNA片段中央部分有若干不同。这是由于在设计合成寡核苷酸时，它们各自分别导入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点。这两个限制酶切位点，在将扩增的DNA片段插入载体时是必要的。在PCR反应时两限制酶切位点的导入，引起引物和染色体DNA之间失配，但由于这些限制酶切位点被限定在合成DNA片段的中央部位，PCR反应的DNA的扩增可以不受失配影响进行。可以用琼脂糖凝胶电泳，确认3.0KbDNA片段的扩增。
用BamH I和Hind III消化扩增的3.0Kb DNA片段。另和具有氨苄抗性标记的质粒载体-pMW 118(从Nippon Gene公司购入)。用DNA连结酶连结两片段。由此得到的重组DNA命名为pMW∷THY质粒(图1)
用pMW∷THY质粒转化大肠杆菌JM109(从宝酒造(株)公司购入)，得到转化子大肠杆菌JM109(pMW∷THY)。使用已知的方法(David M.Clarke and Philip D.Bragg，Journal ofBacteriolony，162，367-373(1985))，测定大肠杆菌JM109和大肠杆菌JM109(pMW∷THY)的细胞提取液中存在的转氢酶的活性，结果用表1表示。
                  表1菌株名                JM 109    JM 109 pMW∷THY转氢酶比活(u/mg proteion)    1.0            1.7
根据表1所示，将大肠杆菌JM109(pMW∷THY)株与大肠杆菌JM109株比较，可以看到前者的转氢酶的酶活性被提高了。其结果，证明在THY质粒中插入的DNA片段被确认含有转氢酶基因。具有pMW∷THY质粒的大肠杆菌起名为AJ 12929株。此菌株在平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通产省工业技术院生命工业技术研究所(邮政编号305，日本国茨城县っくば市未一街第一排3号)，以保藏号为FERM P-13890保藏，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根据布达佩斯条约由原保藏单位转移为国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4798。
用常规方法制备pMW∷THY质粒的DNA，用BamH I和HindIII切断，以分离含有转氢酶基因的3.0Kb DNA片段。另外，用BamH I和Hind III切断具有氯霉素抗性标记的质粒载体pHSG 399(从宝酒造购入)，并分离大片段。使用DNA-连结酶连结转氢酶基因的片段和pHSG 399的BamH I和Hind III大片段，以获得pHSG∷THY质粒。
虽然pHSG∷THY质粒，在埃希氏杆菌属细菌细胞内，能够自主复制，但不能稳定地存在于棒状杆菌细胞内，因此，从棒状杆菌衍生的自主复制质粒中获得复制起点，并将其引入质粒pHSG∷THY。
用BamH I酶切在棒状杆菌细胞内能自主复制的质粒pHM 1519(参照专利申请昭和58-77895号公报)，得到含有复制起点的3.0Kb DNA片段。另一方面，得到用BamH I酶切pHSG∷THY质粒而成的DNA片段。用DNA-连结酶，连结两DNA片段，制成质粒pHSG∷THYB(图2)，含有此pHSG∷THYB的大肠杆菌，命名为AJ12872株。此菌株，于平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通产省工业技术院生命工业技术研究所(日本国茨城县筑波市未一街第一排3号)保藏，保藏号为FERM P-13889，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根据布达佩斯条约，从原保藏单位移到国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4797。
并且，将在埃希氏杆菌属细菌细胞内能够自主复制的质粒pSU 18，用限制酶BamH I和Hind III酶切(Borja，Bartolome et al.，Gene，102，75-78(1991))，得到大片段。用DNA连结酶，将此大片段与上述的含转氢酶基因的3.0Kb DNA片段连结，制成质粒pSU∷THY(图3)。含有此pSU∷THY的大肠杆菌，命名为AJ 12930株。此菌株，平成5年10月4日(1993年10月4日)，在通产省工业技术院生命工业技术研究所保藏，保藏号为FERM P-13891，平成6年9月14日(1994年9月14日)，根据布达佩斯条约，从原保藏单位移至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-4799。
已证明通过增加细菌中的转氢酶活性，在埃希氏杆菌属和棒状杆菌的细菌细胞中对多种氨基酸的产率有何种影响。
实施例2具有导入转氢酶的菌株的L-苏氨酸的发酵生产
作为L-苏氨酸大肠杆菌生产菌，到现在所知，B-3996(参照日本专利公开NO.3-501682(PCT))具有最高的生产能力，因此，对于评价转氢酶的提高效果，可以将B-3996作为宿主以评价转氢酶的提高效果，B-3996菌株含有质粒pVIC 40(InternationalPublication Pamphlet WO90/04636)。质粒pVIC 40是在含有链霉素抗性标记的广泛宿主范围的质粒载体pAYC32(参见chistorerdov，A.Y.Tsgankov Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)中插入苏氨酸操纵子而得到的。B-3996株，以保藏号RIA1867保藏于USSR Antibiotics Research Institute(VNIIA)。
根据Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，从实施例1中所得到的大肠杆菌AJ 12929株中，回收pMW∷THY质粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-logy，68,326(1979))在B-3996株中导入所得到的pMW∷THY质粒，命名为B-3996(pMW∷THY)。在以下条件下培养B-3996株和B-3996(pMW∷THY)。
使用含有表2记载的组成成份的培养基，培养时间为38小时，温度为37℃，搅拌114-116rpm进行培养。如表2所示，分别制备A成份、B成份、C成份、杀菌、冷却后，按A成份为16/20体积、B成份4/20体积、C成份30g/L的比例混合，培养结果用表3表示。对于L-苏氨酸埃希氏杆菌属细菌生产菌，根据细胞内的转氢酶活性的增强，可以判明L-苏氨酸的产率被政善。
表2    苏氨酸生产培养基
                     (g/l)(A) (NH4)2SO4         16
KH2PO4             1
MgSO4 7H2O         1
FeSO4 7H2O         0.01
MnSO4 5H2O         0.01
Yeast Ext.(Difco)    2
L-甲硫氨酸           0.5用KOH调pH值为7.0并于115℃下高压灭菌10分钟(16/20体积)(B)20％葡萄糖
115℃下高压10分钟(4/20容体积)(C)药典CaCO3
180℃下，干热2天(30g/l)
抗生素(链霉素100μg/ml，卡那霉素5μg/ml)
表3
菌株名         B-3996    B-3996(pMW∷THY)
苏氨酸(g/l)    12.97     13.99
实施例3    导入转氢酶的菌株的L-赖氨酸的发酵生产
对于L-赖氨酸生产棒状杆菌，根据细胞内的转氢酶活性的增强，可以确定L-赖氨酸产率是否被改善。作为棒状杆菌的L-赖氨酸生产菌，可以使用乳糖发酵短杆菌AJ 3990 (BrevibacteriumLactofermentum)。AJ 3990株从昭和52年2月8日起(1977年2月8日)，以保藏号ATCC 31269保藏于美国。类型，培养，收集，核对(American Type Culture Collection：美国、马里兰20852、罗克维尔、バクロニドぅィブ10301)、平成6年10月11日(1994年10月11日)，根据布达佩斯条约，从原保藏单位移交国际保藏单位，保藏号相同。
用Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor laboratory Press I.，21(1989))，从实施例1中所得到的大肠杆菌AJ 12872株中，回收pHSG∷THYB质粒，用电脉冲法(参照专利申请平成2-207791号公报)，将所得到的质粒导入AJ 3990。将导入pHSG∷THYB AJ 3990株命名为AJ 3990(pHSG∷THYB)。在如下的条件下，培养AJ 3990株和AJ 3990(pHSG∷THYB)。
使用含有表4记载的组成成份的培养基，培养时间为72小时，温度为31.5℃，搅拌114-116rpm，进行培养。三种不同的糖，葡萄糖、蔗糖和果糖被用作糖源。培养结果用表5表示。已证明对于L-赖氨酸生产棒状杆菌，通过提高细胞内转氢酶活性而提高L-赖氨酸产率。
表4    赖氨酸生产培养基
糖               36    g/l
NH4Cl           20    g/l
KH2PO4         1     g/l
MgSO47H2O      0.4   g/l
FeSO47H2O      10    mg
MnSO47H2O      8     mg
大豆蛋白水解物   1     mg
(作为氮源)
Thiamine-HCl    100    mg
生物素          300    mg
在115℃下高压10分钟后，添加3％分别杀菌的碳酸钙
表5
赖氨酸盐酸蓄积量(g/l)
AJ3990    AJ3990  (pHSG∷THYB)
葡萄糖      13.6    14.5
蔗糖        11.1    12.6
果糖         8.2    11.9
实施例4    导入转氢酶的菌株的苯丙氨酸的发酵生产
对于苯丙氨酸生产埃希氏杆菌属细菌，可以确认在细胞内的转氢酶活性的增强之后，苯丙氨酸生产性是否被改善。作为埃希氏杆菌属细菌的苯丙氨酸生产菌，可以使用大肠杆菌AJ 12604株。 AJ 12604株具有质粒pBR-aroG以及质粒pACMAB。质粒pBR-aroG是在含有氨苄抗性标记的载体-质粒pBR 322中插入突变型aroG基因而得到的。质粒pACMAB是在含有氯霉素抗性标记的载体-质粒pALYC 184中插入突变型RheA基因而得到的(参照专利申请平成5-344881号公报)。AJ 12604株，平成3年1月28日(1994年1月28日)，以保藏号为FERM P-11975保藏于通产省工业技术院生命工业技术研究所，平成3年9月26日(1994年9月26日)，根据布达佩斯条约，从原保藏单位移交国际保藏单位，保藏号为FERM BP-3579。用Maniatis的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Moleculan，Cold Spring Harbor  laboratory Press I.，21(1989))，从实施例1中所得到的大肠杆菌AJ12930株中，回收pSU∷THY质粒，用D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymo-logy，68，326(1979))在AJ 12604株中导入所得到的质粒。将导入pSU∷THY，AJ 12604株命名为AJ 12604(pSU∷THY)株。在以下条件下培养AJ 12604株和AJ 12604(pSU∷THY)。
使用含有表6中记载的组成成份的培养基，培养时间为16小时，温度为37℃，搅拌114-116rpm进行培养。培养结果用表7表示。对于L-苯丙氨酸生产埃希氏杆菌属细菌，根据细胞内的转氢酶活性的增强，可以判明L-苯丙氨酸的产率被改善。
表6    苯丙氨酸生产培养基
              g/l
葡萄糖          20
Na2 HPO4      29.4
KH2 HPO4      6
NaCl            1
NH4Cl          2
柠檬酸钠        20
L-谷氨酸单钠    0.4
MgSO4 7H2O    3
CaCl2          0.23
Thiamine-HCl    2mg
L-酪氨酸        75mg
在115℃下高压10分钟后，添加3％分别灭菌的碳酸钙。
    表7
AJ 12604    AJ 12604(pSU∷THY)
苯丙氨酸       4.28    4.89
蓄积量(g/l)    3.75    4.28
      在生产上利用的可能性
依据本发明，在培养基中培养微生物，使目的物质在该培养基中蓄积，并取得这种目的物质，关于这个利用微生物制造目的物质的方法，用与传统不相同的方法，能够改善目的物质产率。
         序列表(1)一般资料(i)申请人：Ajinomoto Co.Inc.(ii)发明题目：物质生产方法(iii)序列数：2(iv)通讯地址：
(A)地址：
(B)街道：
(C)城市：
(D)州：
(E)国家：
(F)邮编：(vi)目前申请资料：
(A)申请号：
(B)提交日：
(C)分类：(vii)先有申请资料：
(A)申请号：
(B)提交日：(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：
(B)注册号：
(C)查询/案号：(ix)电信信息：
(A)电话：
(B)电传：(2)SEQ ID NO：1信息：(i)：序列特征：
(A)长度：24
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓朴：线性(i i)分子类型：其他..合成DNA(iii)假设：无(xi)SEQ ID NO：1序列描述：
CTGATTTTTG GATCCAGATC ACAG                           24(2)SEQ ID NO：2信息：(i)：序列特征：
(A)长度：24
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓朴：线性(ii)分子类型：其他..合成DNA(iii)假设：无(xi)SEQ ID NO：2序列描述CGTTCTGTTA AGCTTTCTCA ATAA                          24

Claims (7)

1.使用微生物生产目的物质的方法，包括步骤：
在培养基中培养微生物以在所述培养基中产生及蓄积目的物质，
以及
从所述培养基收集目的物质，
其中所述目的物质是其生物合成需要还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸，以及
其中所述微生物的还原型烟酰胺腺苷二核苷酸磷酸产率通过提高所述微生物细胞中烟酰胺核苷酸转氢酶的活性而提高。
2.权利要求1的方法，其中所述目的物质是L-氨基酸。
3.权利要求2的方法，其中所述L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。
4.权利要求1的方法，其中所述微生物属于埃希氏杆菌(Escherichia)属。
5.权利要求1的方法，其中所述微生物是棒状杆菌。
6.权利要求1的方法，其中通过增加所述微生物细胞内的烟酰胺核苷酸转氢酶编码基因的表达数量来提高所述微生物细胞的烟酰胺核苷酸转氢酶的酶活性。
7.权利要求6的方法，其中通过增加所述微生物细胞内的烟酰胺核苷酸转氢酶编码基因的拷贝数来提高所述微生物细胞的编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因的表达数量。
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