CN1280419C - 利用微生物生产物质的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用微生物生产靶物质的方法，包括：在一培养基中培养该微生物，从而在该培养基中生产并积聚该靶物质，并将该靶物质收集，该微生物使用由具有高能效呼吸链路径和低能效呼吸链路径作为呼吸链路径的该微生物的亲株构建的突变株或基因重组珠，并具有以下特征之一或两者：(A)高能效呼吸链路径得到提高，(B)低能效呼吸链路径有缺陷。

Description

利用微生物生产物质的方法
本发明涉及一种利用微生物生产一物质的方法。在本发明中，微生物典型地选自属于埃希氏杆菌属或棒状杆菌的细菌，通常将它们用于生产物质。生产的物质可以选自使用微生物按常规生产的那些，例如L-氨基酸、核酸、抗生素、维生素、生长因子、生物活性物质等。本发明公开了提高利用微生物生产物质的方法中的最终靶物质的生产能力的方法。
许多生物体通过呼吸获取生命活力所需的能量。在微生物呼吸时，各种酶复合体通常根据种类或生长环境起作用，并且能量获取效率也大不相同。通过糖酵解、β-氧化等将碳水化合物、蛋白质和脂肪酸转变成乙酰-辅酶A，并在柠檬酸循环中分解。将然后以NADH的形式贮藏的能量借助NADH脱氢酶(NDH)和接下来由氧化还原酶组成的电子转移系统用于从微生物细胞中排泄质子，由此在胞质膜的内外之间形成一质子浓度梯度。该质子浓度梯度被用作三磷酸腺苷(ATP)合成的驱动力。此时，显示高质子排泄能力的路径和显示低质子排泄能力的路径为电子转移路径的出口，这取决于NDH和氧化还原酶的组合。考虑到高质子排泄能力的路径显示高能效，低质子排泄能力的路径显示低能量排泄效率。因此，一类微生物同时含有多个并联的呼吸链电子转移路径，并且这些路径包括高能效和低能效的那些。
在用于需氧条件的大肠埃希氏杆菌的呼吸链中有两种NDH和两种末端氧化酶。即，关于NDH，已知有高能效的NDH-I(由nuo操纵子编码)和低能效的NDH-II(由ndh编码)。而且，关于末端氧化酶，已知有细胞色素bo型氧化酶(由cyoABCD操纵子编码)和显示低能效的细胞色素bd型氧化酶(由cydAB编码)，细胞色素bo型氧化酶分成SoxM型(Castresana，J.和Saraste，M.，《生物化学科学的趋势》20，443-448(1995))并显示出高的能效。尽管已知这些呼吸链酶的表达量响应生长环境而变化(Minagawa等人，《生物化学杂志》265：11198-11203(1990)；Tseng等人，《细菌学杂志》178：1094-1098(1996)；Green等人，《分子微生物学》12：433-444(1994)；Bongaerts等人，《分子微生物学》16“521-534(1995))，关于其表达模式的生物方式仍然有许多未知点。
而且，在谷氨酸棒杆菌中，有一细胞色素bc1复合体，并证实有至少两种末端氧化酶，SoxM型氧化酶和细胞色素bd型氧化酶，(新陈代谢工程第二次讨论会，演讲摘要，1999)。这说明，从醌集合体到氧分子的电子转移路径包括两种路径，一种路径利用细胞色素bc1复合体和SoxM型氧化酶，一种路径仅利用细胞色素bd型氧化酶。考虑到前者为高能效的电子转移路径，其中用于转移一个电子的质子转移值高，并且后者为低能效的电子转移路径，其中用于转移一个电子的质子转移值低。
就大肠杆菌的末端氧化酶而言，如果比较仅有细胞色素bo型氧化酶的突变株、仅有细胞色素bd型氧化酶的突变株和具有两者的野生株的好氧培养的生长收率，在仅有细胞色素bd型氧化酶的突变株中的生长收率最低，并且它取决于末端氧化酶的种类和能量获取效率(日本发酵和生物工程协会的年会，1995，演讲摘要，第357号)。
而且，报道了一些呼吸链酶的缺失突变体的能效(Calhoun等人，《细菌学杂志》175：3020-3925(1993))。
然而，通过扩增具有高效率的呼吸链酶如用于NDH-I和SoxM型氧化酶的那些，没有发现能效的变化，甚至不知道尝试利用其生产物质。而且，未曾尝试利用低效率的呼吸链酶如NDH-II和细胞色素bd型氧化酶的缺失生产物质。
在活体中生物合成例如L-氨基酸和核酸的物质需要能量。所用的大多数能量由NADH、NADPH等的还原能组成并且能量以ATP贮藏。因此，本发明的发明人认为，如果在利用微生物生产靶物质的方法中增加生产靶物质所用的能量供应，那么靶物质的生产能力将提高。基于这种观点，本发明的目的是构建一种显示提高的能效的微生物并提供了一种通过利用它生产一种靶物质的方法。
本发明的发明人认为，显示增加的能量供应的微生物可以通过强化显示高能量获取效率的呼吸链路径或使显示低能量获取效率的呼吸链路径有缺陷来构建。特别是，就大肠杆菌而言，认为具有提高的能效的株的制备是：将编码细胞色素bo型氧化酶的基因作为高能效的呼吸链酶扩增，或者使编码NDH-II的基因作为低能效的呼吸链酶缺失。然后，使用它们生产L-氨基酸，并发现在能效得到提高的株中L-氨基酸的生产能力也提高。因此完成了本发明。
即，本发明提供了如下几个方面。
(1)一种利用微生物生产靶物质的方法，包括在一培养基中培养该微生物，从而在该培养基中生产并积聚该靶物质，并将该靶物质收集，其中该微生物由具有高能效呼吸链路径和低能效呼吸链路径作为呼吸链路径的该微生物的亲株构建，并且该微生物为具有以下特征之一或两者的突变株或基因重组株：
(A)高能效呼吸链路径得到提高，
(B)低能效呼吸链路径有缺陷。
(2)如(1)的靶物质的生产方法，其中高能效呼吸链路径通过增加编码呼吸链中涉及的酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达调节序列得到提高。
(3)如(1)或(2)的靶物质的生产方法，其中通过破裂编码呼吸链中所涉及的酶的基因使低能效呼吸链路径有缺陷。
(4如(1)-(3)任一的靶物质的生产方法，其中高能效呼吸链的酶包括SoxM型氧化酶、bc1复合体、NDH-I或其中两种或三种。
(5)如(1)-(4)任一的靶物质的生产方法，其中低能效的呼吸链的酶包括细胞色素bd型氧化酶、NDH-II或其两者。
(6)如(1)-(5)任一的靶物质的生产方法，其中在该微生物中使SoxM型氧化酶的活性提高并且使NDH-II有缺陷。
(7)如权利要求(1)-(6)任一的靶物质的生产方法，其中该SoxM型氧化酶为细胞色素bo型氧化酶。
(8)如(1)-(7)任一的靶物质的生产方法，其中该微生物为属于埃希氏杆菌属或棒状杆菌的细菌。
(9)如(1)-(8)任一的靶物质的生产方法，其中靶物质为L-氨基酸或核酸。
根据本发明，一种利用微生物生产靶物质的方法，包括：在一培养基中培养该微生物，从而在该培养基中生产并积聚该靶物质，并将该靶物质收集，靶物质的生产能力可以与常规策略不同的原理为基础提高。
图1显示了生产NDH-II基因破裂株用的质粒pTS-Δndh的构建。
图2显示了pMAN997的构建。
下面详细解释本发明。
通过本发明的生产方法生产的物质没有特别限制，只要它为可以通过微生物生产的物质。其例子包括例如各种L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸；核酸如鸟苷酸和肌苷酸；维生素；抗生素；生长因子；生物活性物质等。
本发明所用的微生物为具有生产上述靶物质的能力的微生物，它由具有高能效呼吸链路径和低能效呼吸链路径作为呼吸链路径并具有以下特征之一或两者的微生物亲株构建：
(A)高能效呼吸链路径得到提高，
(B)低能效呼吸链路径有缺陷。
一般说来，包括大肠杆菌和棒状杆菌的微生物同时含有许多并联的呼吸链电子转移路径，并且这些路径包括单位电子的高质子转移值的那些和低质子转移值的那些。在大肠杆菌中，例如就NADH的电子供体而言，有NDHI和NDHII作为NADH脱氢酶，它催化质子从NADH转移到醌集合体。其中，NDHI显示高能效，NDHII显示低能效。即，NDHII显示用一个电子能够排泄的质子的分子数(质子转移值)为0，而NDHI的认为是2。
在本发明中，如上所述显示单位电子的高质子转移值的这种路径，即高能效呼吸链路径，得到提高，并且使低能效呼吸链路径有缺陷。高能效呼吸链路径可以通过提高呼吸链路径中涉及的呼吸链酶的活性来提高。通过降低或消除呼吸链路径中涉及的呼吸链酶的活性可以使低能效呼吸链路径有缺陷。
对呼吸链路径中涉及的呼吸链酶没有特别的限制，只要其为构建呼吸链路径的酶。尤其是，其例子包括催化电子从电子供体转移到醌集合体如泛醌、二甲基甲萘醌和甲萘醌的脱氢酶，以及催化电子从醌集合体向电子供体转移的氧化酶。
催化通过从醌集合体转移电子生产水分子的反应的这些氧化酶分成SoxM型(Bo型)和bd型。bo型的质子转移值为2，而bd型的为1。因此，bo型显示高的能效。
在本发明中，用于能效的术语“高”和“低”其含义并不是绝对的，它们可以是如上所述的相对概念。
下面解释提高高能效呼吸链酶的活性的方法和降低或消除低能效呼吸链酶的活性的方法。
为了提高高能效呼吸链酶的活性，例如，可以如下制备一重组DNA：将编码该酶的基因片段与在微生物细胞中起作用的载体，优选一多拷贝型载体连接，并将其加入该微生物中，从而转化该细胞。编码该酶的基因在转化株的细胞中的拷贝数因此增加，结果酶活性扩增。下面通过作为高能效呼吸链酶基因的编码细胞色素bo型氧化酶的cyo操纵子(cyoABCDE)为例解释该步骤。
已报道了大肠杆菌的cyo操纵子的序列(Chepuri等人，《生物化学杂志》265：11185-11192(1990))，因此可以其序列为基础将该操纵子克隆。还可以使用埃希氏杆菌属的细菌的基因、或者由其它生物体如棒状杆菌获得的基因作为该cyo操纵子。
作为基因克隆和基因加入微生物所用的载体，例如可以使用可以在大肠杆菌细胞中自主复制的质粒。其具体例子包括pUC19、pUS18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pSTV29等。为了将该基因引入棒状杆菌中，可以优选使用可以在棒状杆菌和大肠杆菌中自主复制的穿梭载体。可在棒状杆菌中自主复制的质粒的例子列如下。
pAM 330(参见日本专利未审公开(特开)58-67699)
pHM 1519(参见日本专利未审公开58-77895)
pAJ 655(参见日本专利未审公开58-192900)
pAJ 611(参见日本专利未审公开58-192900)
pAJ 1844(参见日本专利未审公开59-192900)
pCG 1(参见日本专利未审公开57-134500)
pCG 2(参见日本专利未审公开58-35197)
pCG 4(参见日本专利未审公开57-183799)
pCG 11(参见日本专利未审公开57-183799)
pHK 4(参见日本专利未审公开5-7491)
为了将含有cyo操纵子的DNA片段与一载体连接形成一重组DNA，首先将该载体用适合cyo操纵子末端的限制酶消化。通常使用例如T4 DNA连接酶的连接酶进行该连接。
为了将如上所述制备的重组DNA引入一微生物，可以使用任意已知的转化法。例如，可以使用一种为了增加DNA渗透性而用氯化钙处理受体细胞的方法，已报道该方法用于大肠杆菌K-12(Mandel，M和Higa，A.《分子生物学杂志》53，159(1970))；和一种由处于生长相的细胞制备感受态细胞之后向其中引入DNA的方法，已报道该方法用于枯草杆菌(Duncan，C.H.、Wilson，G.A.和Young，F.E.，《基因》1，153(1977))。除了这些之外，还可以使用一种将DNA-感受态细胞制成原生质体或原生质球的方法，它可以容易地摄取重组DNA，之后将该重组DNA引入这些细胞中，该方法已知可用于枯草杆菌、放线菌和酵母菌(Chang，S.和Choen，S.N.《分子基因工程》168，111(1979)；Bibb，M.J.、Ward，J.M.和Hopwood，O.A.《自然》274，398(1978)；Hinnen，A.、Hicks，J.B.和Fink，G.R.《美国国家科学院院报》75，1929(1978))。通过电脉冲法可以使棒状杆菌转化(参见日本专利未审公开2-207791)。
细胞色素bo型氧化酶活性的扩增也可以通过在宿主的细胞色素DNA上存在该cyo操纵子的多拷贝来获得。为了将该cyo操纵子的多拷贝引入例如属于埃希氏杆菌属和棒状杆菌的细菌的微生物的细胞色素DNA中，通过使用在作为靶子的细胞色素DNA中存在多拷贝的序列进行同源重组。作为在细胞色素DNA中存在多拷贝的序列，可以使用重复DNA或者存在于转座因子末端的反向重复。同样，正如日本专利未审公开2-109985中公开的，还可以将该cyo操纵子引入转座子，使其被转移将该cyo操纵子的多拷贝引入到细胞色素DNA中。通过两种方法之一，转化株的细胞中的cyo操纵子的拷贝数增加，结果细胞色素bo型氧化酶活性得到提高。
除了以前述基因扩增为基础之外，细胞色素bo型氧化酶活性的提高还可以通过将cyo操纵子的表达调节序列例如启动子用更强的一个替换(参见日本专利未审公开1-215280)。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE启动子等为强启动子。这些启动子的替换增强了cyo操纵子的表达，因此该细胞色素bo型氧化酶活性得到提高。表达调节序列的提高可以与该cyo操纵子的拷贝数的增加一起进行。
通过引入如下突变：高能效的呼吸链酶的胞内活性应通过微生物的诱变处理来增加，也可以达到提高该酶的活性。这种突变的例子包括增加酶的比活的编码区的突变、增加基因的表达量的表达调节序列的突变等。作为这种诱变处理，可以利用的方法有紫外线辐照处理或用常用于突变处理的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和硝酸的处理。
为了降低或消除低能效呼吸链酶的活性，可以在该酶的基因中引入一突变，诱变将该酶的胞内活性降低或消除，或者破坏微生物细胞色素的基因，诱变使该基因不正常作用。之后，以编码NDH-II的ndh作为低能效呼吸链酶为例，解释破坏该ndh基因的方法。
大肠杆菌的ndh序列已有报道(Young等人，《欧洲生物化学杂志》116：165-170(1981))，因此可以该序列为基础克隆该基因。也可以使用属于埃希氏杆菌属的细菌的基因或者由其它微生物如棒状杆菌获得的基因作为ndh基因。
通过用含有经内部缺失修饰的ndh基因的DNA转化一微生物，以便不产生正常作用的NDH-II(缺失型ndh基因)，并在缺失型ndh基因和细胞色素的ndh基因之间重组，可以破坏细胞色素的ndh基因。通过同源重组的这种基因破坏已经建立，并且有利用线性DNA、含有温度敏感的复制控制区的质粒等的方法。在本发明中，优选利用含有温度敏感的复制控制区的方法。
宿主细胞色素的ndh基因可以用缺失型ndh基因按如下复制。即，通过插入温度敏感的复制控制区、缺失型ndh基因和耐药的标记基因首先制备重组DNA，用该重组DNA转化一微生物。而且，将所得转化株在温度敏感的复制控制区不作用的温度下培养，然后可以将该转化株在含有该药物的培养基中培养，从而获得重组DNA引入该细胞色素DNA中的转化株。
在这种重组DNA引入细胞色素DNA中的菌株中，该缺失型ndh基因与最初存在于该细胞色素中的ndh基因重组，并将该细胞色素ndh基因和该缺失型ndh基因的这两个融合基因插入该细胞色素中，这样重组DNA的其它部分(载体片段、温度敏感的复制控制区和耐药标记物)应存在于两个融合基因之间。由于在该状态下正常ndh基因为显性，因此该转化体报道NDH-II。
然后，为了仅将缺失型ndh基因留在细胞色素DNA上，一个拷贝的该ndh基因与载体片段(包括温度敏感的复制控制区和耐药标记物)一起从细胞色素DNA中通过将这两种ndh基因重组剔除。这种情况下，正常ndh基因留在该细胞色素DNA上，并且将该缺失型ndh基因从细胞色素DNA切除，或者与之相反，缺失型ndh基因留在细胞色素DNA上，将正常ndh基因从细胞色素DNA切除。在这两种情况下，当该细胞在温度敏感的复制控制区可以作用的温度下培养时，切除的DNA可以质粒形式留在细胞中。之后，细胞在温度敏感的复制控制区不能作用掉出质粒DNA的温度下培养，并且可以获得ndh基因缺失突变体。
具有大肠杆菌的温度敏感的复制起点的载体的例子包括例如国际专利公开WO99/03988中所示的质粒pMAN997等，具有棒状杆菌的温度敏感的复制起点的载体的例子包括例如日本专利未审公开5-7491中所示的质粒pHSC4等。然而，质粒并不限于这些，也可以使用其它载体。
以上述方式获得的这种微生物的特定例子包括SomM型氧化酶或NDH-I、或者它们两者都提高的微生物、细胞色素bd型氧化酶或NDH-II的活性、或者两者的活性都降低或消除的微生物、以及SomM型氧化酶或NDH-I、或者它们两者都提高并且细胞色素bd型氧化酶或NDH-II的活性、或者两者的活性都降低或消除的微生物。更具体地说，可以提到的有例如SomM型氧化酶的活性提高且使NDH-II有缺陷的大肠杆菌。SomM型氧化酶的例子包括细胞色素bd型氧化酶。
用于本发明的微生物没有特别限制，只要其可以赋予前述性质，其例子包括使用如大肠杆菌的埃希氏杆菌属的细菌、如谷氨酸棒杆菌的棒状杆菌、如枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌、如粘质沙雷氏菌的沙雷氏菌、如酿酒酵母的酵母菌等。
特别地，当发酵产物为L-苏氨酸时，可以提到的有大肠杆菌VKPM B-3996(RIA 1867)(参见US3,175,107)谷氨酸棒杆菌AJ12318(FERM BP-1172)(参见US5,198,949)等；就L-赖氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌AJ11442(NRRL B-12185，FERM BP-1543)(参见US4346170)、大肠杆菌W3110(tyrA)(该菌株是通过从大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm(FERM BP-3653)中剔除质粒pHATerm获得的，参见国际专利公开WO95/16042)、谷氨酸棒杆菌AJ12435(FERM BP-2294)(US5,304,476)、棒杆菌AJ3990(ATCC31269)(参见US4,066,501)等；就L-谷氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)(参见法国专利未审公开2,680,178)、谷氨酸棒杆菌AJ12821(FERM BP-4172)(日本专利未审公开5-26811，法国专利未审公开2,701,489)、谷氨酸棒杆菌AJ12475(FERM BP-2922)(参见US5,272,067)、谷氨酸棒杆菌AJ13029(FERM BP-5189)(参见国际专利申请JP95/01586)等；就L-亮氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌AJ11478(FERM P-5274)(参见日本专利公布(特许)62-34397)、谷氨酸棒杆菌AJ3718(FERMP-2516)(参见US3,970,519)等；就L-异亮氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌KX141(VKPM B-4781)(参见欧洲专利未审公开519,113)、谷氨酸棒杆菌AJ12149(FERM BP-759)(参见US4,656,135)等；就L-缬氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌VL1970(VKPM B-4411)(参见欧洲专利未审公开519,113)、谷氨酸棒杆菌AJ12341(FERM BP-1763)(参见US5,188,948)等；就L-苯丙氨酸而言，可以提到的有大肠杆菌AJ12604(FERM BP-3579)(日本专利未审公开5-236947，欧洲专利未审公开488,424)、谷氨酸棒杆菌AJ12637(FERM BP-4160)(参见法国专利未审公开2,686,898)等。
在用于本发明的这些微生物中，根据靶物质，可以将靶物质生物合成时涉及的酶的活性提高。而且，可以将不利于生产靶物质的酶的活性降低或消除。
靶物质的生产可以是：将如上所述的这种微生物在一培养基中培养，从而在该培养基中生产和积聚该靶物质，并收集该靶物质。
用于生产靶物质的培养基可以为常用的公知培养基，它可以根据所用的微生物进行选择。即，该培养基可以为含有碳源、氮源、无机离子、以及如果需要的话其它有机组分的常规培养基。不需要任意特定的培养基实施本发明。
作为碳源，可以使用糖，例如葡萄糖、乳糖、果糖或淀粉水解物；醇，例如甘油或山梨糖醇；有机酸，例如富马酸、柠檬酸或琥珀酸等。
作为氮源，可以使用无机铵盐，例如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮，例如大豆水解物；氨气；氨水等。
理想地含有适宜量的作为有机痕量营养素的所需物质如维生素B1、L-高丝氨酸、L-酪氨酸或酵母浸出物。除了上述的之外，如果需要的话，加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
可以在常用的公知条件下进行培养，该条件可以根据所用的微生物进行选择。例如，优选在需氧条件下培养16-120小时。培养温度优选控制在25-45℃，培养时pH优选控制在5-8。可以使用无机或有机、酸性或碱性物质以及氨气等调节pH。
培养之后，为了从该培养基中收集代谢产品，本发明不需要任意特定方法。即，本发明可以使用常规公知的离子交换技术、沉淀技术和其它技术的组合进行。
下面，参照以下实施例更具体地解释本发明。
实施例1：克隆细胞色素bo型氧化酶基因
用于编码大肠杆菌的细胞色素bo型氧化酶的cyo操纵子的序列(cyoABCDE)已有报道(Chepuri等人，《生物化学杂志》265：11185-11192(1990))，因此以该序列为基础克隆该操纵子。
特别地，该靶cyo操纵子基因从含有该cyo操纵子的Kohara的噬菌体库获得(Kohara等人，《细胞》50：495-508(1987))。噬菌体DNA由含有该操纵子的Kohara的噬菌体克隆147[2H5]使用Wizard lambda prep(Promega)获得。所得噬菌体DNA 147[2H5]用pshBI消化，获得的5.5kb含有cyo操纵子的片段经平端，并插入pMW119(Nippon基因)的SmaI位点，从而克隆含有一启动子区的cyo操纵子。在所得质粒中，以与pMW119的乳糖操纵子启动子相反的方向将该cyo操纵子插入。该质粒命名为pMW(CYO)B。
将该质粒pMW(CYO)B引入大肠杆菌W3110菌株(从日本Sbizuoka Mishima全国基因学学会获得)，从而获得W3110/pMW(CYO)B。使用已知方法(Kita等人，《生物化学杂志》259：3368-3374(1984)测定W3110和W3110/pMW(CYO)B菌株的细胞浸出物中存在的泛醇氧化酶活性作为最终氧化酶活性。结果示于表1。
表1：泛醇氧化酶活性
    菌株 泛醇氧化酶活性(mmol/min/mg)蛋白质
    W3110/pMW119 0.28
    W3110/pMW(CYO)B 0.56
如表1所示，发现用pMW(CYO)B引入的菌株中最终氧化酶活性提高。最终氧化酶活性的这种提高被认为是因细胞色素bo型氧化酶活性通过cyo操纵子的提高而提高引起的。
实施例2：NDH-II缺陷菌株的获取
为了生产NDH-II缺陷菌株，制备NDH-II的内裂部分序列(破坏型NDH-II基因)。以用于编码大肠杆菌的NDH-II的基因ndh的已知序列为基础克隆NDH-II的该部分序列(Young等人，《欧洲生物化学杂志》116：165-170(1981))。
特别地，破坏型NDH-II基因的制备如下(图1)。首先，将约24kb的含有NDH-II的部分序列的DNA片段使用ndb-1(SEQ ID NO：1)和ndh-2(SEQ IDNO：2)作为引物通过PCR由大肠杆菌细胞色素DNA扩增。将该片段克隆到pGEM-T载体(Promega)中，从而获得pGEM-ndh。该pGEM-ndh用限制酶EcoRI和StuI消化，收集0.5kb所得DNA片段，并将其连接到用EcoRI和SmaI消化的pTWV229(Takara Shuzo)上，从而获得pTWV-ndh。
然后，pGEM-ndh用限制酶StuI消化，收集到0.9kb所得DNA片段，并将其插入pTWV-ndh的HincII位点。因此，获得在ndh的部分序列中含有pTWV229的部分多克隆位点的pTWVΔndh。该质粒pTWVΔndh含有在ndh部分序列中在StuI位点用由pTWV229获得的17bp序列插入的ndh序列。接着，将通过用HindIII和EcoRI消化pTWVΔndh获得的1.5kb片段插入温度敏感的质粒pMAN997的HindIII和EcoRI位点之间(参见国际专利公开WO99/03988)，从而获得pTS-Δndh。通过利用pTS-Δndh的温度敏感性的常规同源重组技术就ndh在该质粒pTS-Δndh和W3110菌株的基因组之间进行同源重组(Matuyama等人，《细菌学杂志》162：1196(1985))，由于在该基因组上在ndh的编码区内插入由pTWV229获得的17bp序列，因此获得不表达正常NDH-II蛋白质的W3110(ndh)菌株。由W3110(tyrA)，使用四环素抗性作为标记通过P1转导将tyrA缺陷引入W3110(ndh)菌株，从而获得W3110(ndh，tyrA)菌株。
通过交换pMAN031(《细菌学杂志》162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)的VspI-HindIII片段获得前述的pMRN997(图2)。
而且，尽管欧洲专利未审公开488424/1992中详述了该W3110(tyrA)菌株，但是其制备方法简单解释如下。
该大肠杆菌W3110菌株由全国基因学会(kishima，Shizuoka)获得。将该菌株接种在含有链霉素的LB平皿上，选择形成一菌落的菌株，从而获得一耐链霉素的菌株。将所选的耐链霉素的菌株和大肠杆菌K-12 ME8424菌株混合，并在一完全培养基(L-Broth：1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、0.5％NaCl)中于37℃下静止培养15分钟，从而诱导接合。该大肠杆菌K-12 ME8424菌株具有(HfrPO45、thi、relA1、tyrA∷Tn10、ung-1、nadB)的遗传性状，并且可以从全国基因学会获得。之后，将该培养物接种在一含有链霉素、四环素和L-酪氨酸的完全培养基(L-Broth：1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、0.5％NaCl、1.5％琼脂)中，并选择形成菌落的菌株。该菌株被命名为大肠杆菌W3110(tyrA)菌株。
欧洲专利未审公开488424/1992公开了通过将一质粒引入上面菌株中获得的许多菌株。例如，通过引入质粒pHATerm获得的菌株命名为大肠杆菌W3110(tyrA)/pHATerm，于1991年11月16日将其保藏在国际贸易和工业部的产业科学和技术代理处的全国生物科学和人技术协会(1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305)(目前为独立管理公司，全国先进产业科学和技术协会，国际专利生物体保藏处(Chue Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305-5466)，该处为布达佩斯条约规定的国际保藏处，并收到一登记号FERM BP-3653。大肠杆菌W3110(tyrA)菌株可以常规方式由上面菌株剔除质粒pHATerm获得。
实施例3：生产L-赖氨酸
将实施例1中获得的质粒pMW(CYO)B引入实施例2获得的W3110(tyrA)菌株和W3110(ndh，tyrA)菌株，从而分别获得W3110(tyrA)/pMW(CYO)B和W3110(ndh，tyrA)/pMW(CYO)B。相似地，将pMW119引入W3110(tyrA)，从而获得W3110(tyrA)/pMW119菌株。通过在烧瓶中培养评价这些W3110(tyrA)/pMW(CYO)B菌株、W3110(ndh，tyrA)/pMW(CYO)B菌株和作为对照的W3110(tyrA)/pMW119的L-赖氨酸生产能力。使用具有以下组成的培养基在37℃下边搅拌边培养24-48小时。结果示于表2。
(培养基组成)
葡萄糖                40g/L
MgSO4.7H2O         1g/L
KH2PO4             1g/L
FeSO4.7H2O         0.01g/L
MnSO4.5H2O         0.01g/L
酵母浸出物(Difco)    2g/L
L-酪氨酸             0.1g/L或0.05g/L
用KOH将该培养基调整至pH7.0，并在115℃下高压灭菌10分钟。但是，将葡萄糖和MgSO4.7H2O分开灭菌。而且，在培养之前，将30g/L日本药典的CaCO3在180℃下进行干灭菌，并将100μg/L抗生素-氨苄青霉天加入该培养基。
表2：L-赖氨酸的产量
    菌株     L-赖氨酸(g/L)
    W3110(tyrA)/pMW119     0.29
    W3110(tyrA)/pMW(CYO)B     0.48
    W3110(ndh，tyrA)/pMW(CYO)     0.53
发现，在大肠杆菌生产L-赖氨酸时通过提高细胞色素bo型氧化酶活性提高了L-赖氨酸生产能力。这被认为是由于通过改善高能效呼吸链路径提高了能量获取效率，并将该能量用于该L-赖氨酸生产引起的。
还发现，在大肠杆菌生产L-赖氨酸时通过使NDH-II缺陷型提高了L-赖氨酸生产能力。这被认为是由于通过使低能效呼吸链路径有缺陷提高了能量获取效率，并将该能量用于L-赖氨酸生产引起的。
实施例4：生产L-苏氨酸
将通过前述方法获得的质粒pMW(CYO)B引入L-苏氨酸生产菌-大肠杆菌VKPM B-3996(RIA 1867)(参见US5,175,107，下文称之为“B-3996”菌株)，从而获得B-3996/pMW(CYO)B菌株。该B-3996菌株藏匿通过将该苏氨酸操纵子插入含有耐链霉素的标记的野生宿主载体质粒pAYC32中获得的质粒pVIC40国际专利公开WO90/04636)(参见Chistorerdov，A.Y.、Tsygankov，YD.《质粒》1986，16，161-167)。该B-3996菌株以登记号RIA1867保藏在USSR抗生素研究协会(VNIIA)。
作为对照，B-3996/pMW119是通过将pMW119引入B-3996获得的。通过在烧瓶中培养评价这些B-3996/pMW(CYO)B和B-3996/pWW119的L-苏氨酸的生产能力。使用表3中所述组成在37℃、114-116rpm的搅拌下培养38小时。将表3中所述的组分A、组分B和组分C分别制备并杀菌，然后将它们冷却并以比例：16/20体积的组分A、4/20体积的组分B和30g/L组分C混合。结果示于表4。
表3：苏氨酸生产培养基
A (NH4)2SO4KH2PO4FeSO4.7H2OMnSO4.4H2O酵母浸出物(Difco)L-异亮氨酸烟酸     16g/L1g/L0.01g/L0.01g/L2g/L50mg/L10mg/L
用KOH调整至pH7.0，并在115℃下高压灭菌10分钟(16/20体积)
B 20％在115℃下高压灭菌10分钟的葡萄糖(4/20体积)
MgSO4.7H2O     1g/L
C 日本药典的CaCO3，在180℃下进行干灭菌(30g/L)抗生素(100μg/L氨苄青霉素和5μg/L卡那霉素)
表4：L-苏氨酸的产量
    菌株     L-Thr(g/L)
    B-3996/pWM119     13.1
    B-3996/pMW(CYO)B     14.3
发现，通过提细胞色素bo型氧化酶活性可以提高生产L-苏氨酸的大肠杆菌的L-苏氨酸生产能力。
实施例5：生产L-苯丙氨酸
按照质粒的常规提纯方法从大肠杆菌W3110(tyrA)/pACMAB、pBR-aroG4菌株收集质粒pACMAB该质粒为在适宜的L-苯丙氨酸生物合成系统中在质粒载体pACYC184(Apz)的BamHI和HindIII断裂位点之间插入含有脱敏型分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(CM-PDH)基因的DNA片段获得的质粒(参见国际专利公开WO97/08333)。1991年1月28日将该W3110(tyrA)/pACMAB、pBR-aroG4菌株(命名为AJ12604)保藏在国际贸易和工业部的产业科学和技术代理处的全国生物科学和人类技术协会(1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，邮政编码：305)并收到一登记号FERM BP-11975。然后，在1991年9月26日将其转移至布达佩斯条约规定的国际保藏处，并收到一登记号FERM BP-3579。
通过用SalI消化将该质粒pACMAB平端。向其中插入通过PshBI消化从前述Kohara噬菌体DNA147[2H5]获得的含5.5kb cyo操纵子的平端DNA片段。将获得的质粒pACWAB-cyo引入W3110(tyrA)/pBR-aroG4。获得的转化株在用于L-苯丙氨酸生产的培养基(在1L水中含20g葡萄糖、29.4g磷酸氢二钠、6g磷酸二氢钾、1g氯化钠、2g氯化铵、10g柠檬酸钠、0.4g谷氨酸钠、3g七水硫酸镁、0.23g氯化钙、2mg盐酸硫胺和100mg L-酪氨酸，pH7.0)中于37℃下培养40小时。该培养基中所含的L-苯丙氨酸通过高效液相色谱定量。结果示于表5。
表5：L-苯丙氨酸的产量
  菌株     L-Phe(g/L)
  W3110(tyrA)/pACMAB、pBR-aroG4     3.9
  W3110(tyrA)/pACMAB-cyo、pBR-aroG4     4.2
发现，通过提高细胞色素bo型氧化酶活性提高了生产L-苯丙氨酸的大肠杆菌的L-苯丙氨酸生产能力。
序列表
<110>Ajinomoto公司
<120>利用微生物生产物质的方法
<130>OP1186
<141>2000-07-05
<150>JP 2000-204252
<151>2001-07-
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于扩增NDH-II基因(Ndh-1)的引物
<400>1
cgqtggaagc ttccgcgatt atggg
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213)人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于扩增NDH-II基因(ndh-2)的引物
<400>2
aagcgcggaa ttcgtccttc aatcatc

Claims (7)

1.一种利用属于埃希氏杆菌属的微生物生产L-氨基酸的方法，包括以下步骤：在一培养基中培养该微生物，从而在该培养基中生产并积聚L-氨基酸，并将L-氨基酸收集，其中该微生物由具有高能效呼吸链路径和低能效呼吸链路径作为呼吸链路径的该微生物的亲株构建，并且该微生物为具有以下特征之一或两者的基因重组株：
(A)高能效呼吸链路径得到提高，
(B)低能效呼吸链路径有缺陷。
2.如权利要求1的L-氨基酸的生产方法，其中高能效呼吸链路径通过增加编码呼吸链中涉及的酶的基因的拷贝数或修饰该基因的表达调节序列得到提高。
3.如权利要求1的L-氨基酸的生产方法，其中通过破裂编码呼吸链中所涉及的酶的基因使低能效呼吸链路径有缺陷。
4.如权利要求1的L-氨基酸的生产方法，其中高能效呼吸链的酶包括SoxM型氧化酶、bc1复合体、NDH-I或其中两种或三种。
5.如权利要求1的L-氨基酸的生产方法，其中低能效的呼吸链的酶包括细胞色素bd型氧化酶、NDH-II或其两者。
6.如权利要求1的L-氨基酸的生产方法，其中在该微生物中使SoxM型氧化酶的活性提高并且使NDH-II有缺陷。
7.如权利要求4的L-氨基酸的生产方法，其中该SoxM型氧化酶为细胞色素bo型氧化酶。
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