ES2331601T3 - Procedimiento para producir l-aminoacidos o acidos nucleicos utilizando microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir una sustancia diana seleccionada de entre el grupo constituido por L-aminoácidos y ácidos nucleicos utilizando un microorganismo, que comprende las etapas que consisten en cultivar el microorganismo en un medio para producir y acumular la sustancia diana en el medio y recoger la sustancia diana, en el que el microorganismo se construye a partir de una cepa parental del microorganismo que presenta como rutas de cadena respiratoria una ruta de cadena respiratoria de eficiencia energética elevada y una ruta de cadena respiratoria de eficiencia energética baja, y el microorganismo es una cepa mutante o una cepa recombinante genética que presenta la característica siguiente: la ruta de cadena respiratoria de eficiencia energética elevada se potencia incrementando el número de copias de un gen codificante de una oxidasa de tipo SoxM, la modificación de una secuencia reguladora de la expresión del gen codificante de la oxidasa de tipo SoxM, o una combinación de las mismas.
Description
Procedimiento para producir
L-aminoácidos o ácidos nucleicos utilizando
microorganismos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para producir sustancias mediante la utilización de
microorganismos. En la presente invención, el microorganismo
típicamente se selecciona de entre bacterias pertenecientes al
género Escherichia o bacterias corineformes, que se utilizan
convencionalmente para la producción de sustancias. Las sustancias
que deben producirse se seleccionan de entre
L-aminoácidos y ácidos nucleicos. La presente
invención da a conocer unos medios para mejorar la productividad de
las sustancias diana finales en procedimientos para producir
sustancias mediante la utilización de microorganismos.
Muchos organismos adquieren energía para las
actividades vitales mediante la respiración. En la respiración de
los microorganismos, diversos complejos enzimáticos generalmente
funcionan según la especie o ambiente de crecimiento, y la
eficiencia de captación de la energía también varía
significativamente. Los carbohidratos, proteínas y ácidos
alifáticos se convierten en acetil-CoA en la
glicólisis, en la \beta-oxidación y similares, y
se descomponen en el ciclo del ácido cítrico. La energía conservada
en forma de NADH se utiliza para la excreción de protones de las
células microbianas con la ayuda de la NADH deshidrogenasa (NDH) y
el posterior sistema de transferencia de electrones constituido por
oxidorreductasas, y de esta manera se forma un gradiente de
concentración de protones entre el interior y el exterior de la
membrana citoplasmática. Este gradiente de concentración de
protones se utiliza como fuerza motriz para la síntesis de adenosina
trifosfato (ATP). En la actualidad existe una ruta que muestra una
capacidad de elevada excreción de protones y una ruta que muestra
una capacidad de excreción baja de protones entre las rutas de
transferencia de electrones, dependiendo de la combinación de NDH y
oxidorreductasas. Se considera que una ruta con capacidad elevada de
excreción de proteínas muestra una eficiencia energética elevada y
que una ruta de capacidad baja de excreción de protones muestra una
eficiencia energética baja. De esta manera, un tipo de
microorganismo contiene simultáneamente una pluralidad de rutas
respiratorias de cadena de transferencia de electrones en paralelo,
y entre estas rutas se incluyen las de eficiencia energética
elevada y las de baja eficiencia energética.
Existen dos tipos de NDH y dos tipos de oxidasas
terminales en la cadena respiratoria de Escherichia coli
para un estado aeróbico. Es decir, respecto a NDH, son conocidos
NDH-1 (codificada por el operón nuo) de
eficiencia energética elevada, y NDH-II (codificado
por ndh) de eficiencia energética baja. Además, respecto a
la oxidasa terminal, es conocida la citocromo oxidasa tipo bo
(codificada por el operón cyoABCD), clasificada en tipo SoxM
(Castresana, J. y Saraste, M., Trends in Biochem. Sci.
20:443-448, 1995) y que muestra eficiencia
energética elevada, y la citocromo oxidasa tipo bd (codificada por
cydAB), que muestra una eficiencia energética baja. Aunque
es conocido que las cantidades de expresión de estos enzimas de
cadena respiratoria varían en respuesta al ambiente de crecimiento
(Minagawa et al., The Journal of Biological Chemistry
265:11198-11203, 1990; Tseng et al., Journal
of Bacteriology 178:1094-1098, 1996; Green et
al., Molecular Microbiology 12:433-444, 1994;
Bongaerts et al., Molecular Microbiology
16:521-534, 1995), todavía existen muchos aspectos
desconocidos sobre el significado fisiológico de los patrones de
expresión de los mismos.
Además, en Corynebacterium glutamicum
existe un complejo citocromo bc1 y se ha confirmado la presencia de
por lo menos dos tipos de oxidasa terminal: la oxidasa de tipo SoxM
y la citocromo oxidasa de tipo bd (The Second Symposium Concerning
Metabolic Engineering, Lecture Abstracts, 1999). Lo expuesto
anteriormente demuestra que la ruta de transferencia de electrones
desde el reservorio de quinona hasta la molécula de oxígeno incluye
dos tipos de ruta: una ruta que utiliza el complejo citocromo bc1 y
la oxidasa de tipo SoxM, y una ruta que utiliza únicamente la
citocromo oxidasa de tipo bd. Se considera que la primera es una
ruta de transferencia de electrones de eficiencia energética
elevada, en la que el valor de transferencia de protones para la
transferencia de un electrón es reducido.
Respecto a la oxidasa terminal de E.
coli, si se compara el rendimiento de crecimiento en un cultivo
aeróbico de una cepa mutante que presenta únicamente la citocromo
oxidasa de tipo bo, de una cepa mutante que presenta únicamente la
citocromo oxidasa de tipo bd y de una cepa salvaje que presenta
ambas, el rendimiento de crecimiento es más bajo en la cepa mutante
que presenta únicamente la citocromo oxidasa de tipo bd, y depende
del tipo y eficiencia de captación energética de la oxidasa
terminal (Annual Meeting of the Society for fermentation and
Bioengineering Japón, 1995, Lecture Abstracts, nº 357).
Además, se ha informado de la eficiencia
energética de mutantes deficientes en algunos enzimas de la cadena
respiratoria (Calhoun et al., Journal of Bacteriology
175:3020-3925, 1993).
Sin embargo, no se ha informado de cambios de la
eficiencia energética mediante amplificación de un gen de la cadena
respiratoria que proporciona eficiencia elevada, tal como aquellos
para la oxidasa de tipo NDH-I y de tipo SoxM, e
incluso no se conocen intentos para la utilización del mismo en la
producción de sustancias. Además, no se han realizado intentos para
utilizar la deleción de un enzima de cadena respiratoria de
eficiencia baja, tal como NDH-II y la citocromo
oxidasa de tipo bd, en la producción de sustancias.
Se requiere energía para la biosíntesis de
sustancias, tales como L-aminoácidos y ácidos
nucleicos en seres vivos. La mayor parte de la energía utilizada
consta de poder reductor de NDH, NADPH y similares, y de la energía
conservada en forma de ATP. Por lo tanto, en el contexto de la
presente invención se ha concebido que, si se incrementa el
suministro de energía utilizado en la producción de sustancias diana
en los procedimientos para producir sustancias diana mediante la
utilización de microorganismos, se mejoraría la productividad de
las sustancias diana. Basándose en este concepto, un objetivo de la
presente invención es concebir un microorganismo que muestre una
eficiencia energética mejorada y proporcionar un procedimiento para
producir una sustancia diana mediante la utilización del mismo.
En el contexto de la presente invención se ha
concebido que podría construirse un microorganismo que muestre un
suministro energético incrementado, potenciando una ruta de cadena
respiratoria que muestre una eficiencia elevada de captación
energética o haciendo deficiente la ruta de cadena respiratoria que
muestra una eficiencia baja de captación energética.
Específicamente, respecto a E. coli, se prepararon cepas que
se considera que presentan una eficiencia energética mejorada,
mediante la amplificación de un gen codificante de una citocromo
oxidasa de tipo bo a modo de enzima de cadena respiratoria de
eficiencia energética elevada, o delecionando un gen codificante de
NDH-II a modo de enzima de cadena respiratoria de
eficiencia energética baja. A continuación, se llevó a cabo la
producción de L-aminoácidos mediante la utilización
de dichas cepas y se encontró que la productividad de los
L-aminoácidos se encontraba incrementada en las
cepas en las que se había mejorado la eficiencia energética. De
esta manera se consiguió la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona lo
siguiente:
(1) un procedimiento para producir una sustancia
diana seleccionada de entre el grupo constituido por
L-aminoácidos y ácidos nucleicos, mediante la
utilización de un microorganismo, que comprende las etapas que
consisten en cultivar el microorganismo en un medio para producir y
acumular la sustancia diana en el medio, y recoger la sustancia
diana, en el que el microorganismo se construye a partir de una cepa
parental del microorganismo que presenta como rutas de cadena
respiratoria una ruta de eficiencia energética elevada y una ruta de
eficiencia energética baja, y el microorganismo es una cepa mutante
o una cepa genética recombinante que presenta la característica
siguiente:
la ruta de cadena respiratoria de eficiencia
energética elevada se potencia incrementando el número de copia de
un gen codificante para la oxidasa de tipo SoxM, modificando una
secuencia reguladora de la expresión del gen codificante de la
oxidasa de tipo SoxM o una combinación de las mismas.
(2) El procedimiento para producir una sustancia
diana según (1), en el que NDH-II se hace deficiente
en el micoorganismo.
(3) El procedimiento para producir una sustancia
diana según (1) o (2), en el que la oxidasa de tipo SoxM es una
citocromo oxidasa de tipo bo.
(4) El procedimiento para producir una sustancia
diana según (3), en el que dicha citocromo oxidasa de tipo bo se
encuentra codificada por el operón cyo.
(5) El procedimiento para producir una sustancia
diana según cualquiera de (1) a (4), en el que el microorganismo se
selecciona de entre el grupo constituido por una bacteria
perteneciente al género Escherichia y una bacteria
corineforme.
(6) El procedimiento para producir una sustancia
diana según cualquiera de (1) a (4), en el que el microorganismo es
Escherichia coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, en un procedimiento
para producir una sustancia diana mediante la utilización de un
microorganismo, que comprende cultivar el microorganismo en un medio
para producir y acumular la sustancia diana en el medio y recoger
la sustancia diana, puede mejorarse la productividad de la sustancia
diana basándose en un principio diferente del utilizado en la
estrategia convencional.
La figura 1 muestra la construcción del plásmido
pTS-\Deltandh para producir una cepa con
alteración del gen
NDH-II.
NDH-II.
La fig. 2 muestra la construcción de
pMAN997.
A continuación, se explica en detalle la
presente invención.
Las sustancias producidas mediante el
procedimiento de producción de la presente invención son
L-aminoácidos, tales como
L-treonina, L-lisina, ácido
L-glutámico, L-leucina,
L-isoleucina, L-valina y
L-fenilalanina, y ácidos nucleicos, tales como
ácido guanílico y ácido inosínico.
El microorganismo utilizado para la presente
invención es un microorganismo que presenta la capacidad de producir
una sustancia diana tal como se ha descrito anteriormente,
construida a partir de una cepa parental de un microorganismo que
presenta como rutas de cadena respiratoria una ruta de eficiencia
energética elevada y una ruta de eficiencia energética baja, y que
presenta las características definidas en la reivindicación 1.
En general, los microorganismos, incluyendo
E. coli y las bacterias corineformes, contienen
simultáneamente una pluralidad de cadenas respiratorias de
transferencia de electrones en paralelo, y estas rutas incluyen las
de elevado valor de transferencia de protones y las de valor
reducido de transferencia de protones por electrón. En E.
coli, por ejemplo, como donantes de electrones de NADH, existen
NDHI y NDHII, que catalizan la transferencia de protones desde NADH
hasta el reservorio de quinonas. Entre estos, NDHI muestra una
eficiencia energética elevada y NDHII muestra una eficiencia
energética baja. Es decir, NDHII muestra un número molecular de
protones que pueden excretarse con un electrón (valor de
transferencia de protones) de 0, mientras que para NDHI se
considera que es 2.
En la presente invención, dicha ruta que muestra
un elevado valor de transferencia de protones por electrón tal como
se ha descrito anteriormente, es decir una ruta de cadena
respiratoria de eficiencia energética elevada, se incrementa, y se
provoca que sea deficiente una ruta de cadena respiratoria de
eficiencia energética baja. La ruta de cadena respiratoria de
eficiencia energética elevada puede potenciarse incrementando la
actividad de un enzima de la cadena respiratoria implicado en la
ruta de cadena respiratoria. La ruta de cadena respiratoria de
eficiencia energética baja puede hacerse deficiente reduciendo o
eliminando la actividad de un enzima de la cadena respiratoria
implicado en la ruta de la cadena respiratoria.
El enzima de cadena respiratoria implicado en
una ruta de cadena respiratoria no se encuentra particularmente
limitado con la condición de que sea un enzima que forme parte de la
ruta de cadena respiratoria. Específicamente, entre los ejemplos de
la misma se incluyen deshidrogenasas que catalizan la transferencia
de electrones de un donante de electrones hasta el reservorio de
quinonas, tales como la ubiquinona, la desmetilmenaquinona y la
menaquinona, y oxidasas que catalizan la transferencia de electrones
desde el reservorio de quinonas hasta un donante de electrones.
Las oxidasas que catalizan una reacción que
produce una molécula de agua mediante transferencia de electrones
desde un reservorio de quinonas se clasifican en tipo SoxM (tipo bo)
y tipo bd. El valor de transferencia de protones de las oxidasas de
tipo bo es 2, mientras que para las de tipo bd es 1. Por lo tanto,
el tipo bo muestra una eficiencia energética más elevada.
En la presente invención, los términos
"alto" y "bajo" utilizados para la eficiencia energética
no se utilizan con significados absolutos, sino que se utilizan
para referirse a conceptos relativos, tales como los descritos
anteriormente.
Los medios para incrementar la actividad de una
oxidasa de tipo SoxM, es decir un enzima de cadena de eficiencia
energética elevada, se explican a continuación en la presente
memoria.
Con el fin de incrementar la actividad de un
enzima de cadena respiratoria de eficiencia energética elevada, por
ejemplo puede prepararse un ADN recombinante mediante ligación de un
fragmento génico codificante del enzima, con un vector que funcione
en una célula de microorganismo, preferentemente un vector de tipo
multicopia, e introducirse en el microorganismo para transformar la
célula. De esta manera se incrementa el número de copia del gen
codificante del enzima en la célula de la cepa transformante y, como
resultado, se amplifica la actividad enzimática. Este procedimiento
se explica a continuación en la presente memoria mediante el ejemplo
del operón cyo (cyoABCDE) codificante de una
citocromo oxidasa de tipo bo como gen de enzima de cadena
respiratoria de eficiencia energética elevada.
La secuencia del operón cyo de E.
coli ya ha sido informada (Chepuri et al., The Journal of
Biological Chemistry 265:11185-11192, 1990) y por
lo tanto el operón puede clonarse basándose en dicha secuencia.
También resulta posible utilizar un gen de bacteria perteneciente
al género Escherichia, o un gen derivado de otros
organismos, tales como bacterias corineformes, como el operón
cyo.
Como vector utilizado para la clonación del gen
y la introducción del mismo en un microorganismo, puede utilizarse,
por ejemplo, un plásmido de replicación autónoma en células de E.
coli. Entre los ejemplos específicos del mismo se incluyen
pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010,
pSTV29 y similares. Para la introducción del gen en bacterias
corineformes, preferentemente puede utilizarse un vector lanzadera
de replicación autónoma en bacterias corineformes y en E.
coli. A continuación se mencionan ejemplos de plásmidos de
replicación autónoma en bacterias corineformes.
pAM330 (ver la publicación de patente japonesa
no examinada (Kokai) nº 58-67699),
pHM1519 (ver la publicación de patente japonesa
no examinada nº 58-77895),
pAJ655 (ver la publicación de patente japonesa
no examinada nº 58-192900),
pAJ611 (ver la publicación de patente japonesa
no examinada nº 58-192900),
pAJ1844 (ver la publicación de patente japonesa
no examinada nº 58-192900),
pCG1 (ver la publicación de patente japonesa no
examinada nº 57-134500),
pCG2 (ver la publicación de patente japonesa no
examinada nº 58-35197),
pCG4 (ver la publicación de patente japonesa no
examinada nº 57-183799),
pCG11 (ver la publicación de patente japonesa no
examinada nº 57-183799),
pHK4 (ver la publicación de patente japonesa no
examinada nº 5-7491).
Con el fin de ligar un fragmento de ADN que
contiene el operón cyo y un vector para formar un ADN
recombinante, en primer lugar el vector se digiere con un enzima de
restricción adecuado para los extremos del operón cyo. La
ligación habitualmente se lleva a cabo mediante la utilización de
una ligasa, tal como la ADN ligasa de T4.
Para introducir el ADN recombinante preparado
tal como se ha descrito anteriormente en un microorganismo, puede
utilizarse cualquier procedimiento de transformación conocido. Por
ejemplo, puede utilizarse un procedimiento para tratar las células
receptoras con cloruro de calcio de manera que se incremente la
permeabilidad del ADN, que se ha informado para E. coli
K-12 (Mandel, M. e Higa, A., J. Mol. Biol. 53:159,
1970); y un procedimiento para preparar células competentes a
partir de células que se encuentran en la etapa de crecimiento,
seguido de la introducción del ADN en las mismas, que se ha
informado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A.
y Young, F.E., Gene 1:153, 1977). Además de dichos procedimientos,
también puede utilizarse un procedimiento para convertir células
receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos, que pueden
incorporar fácilmente ADN recombinante, seguido de la introducción
del ADN recombinante en las células; procedimiento que es conocido
que resulta aplicable a Bacillus subtilis, a actinomicetes y
a levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., Molec. Gen. Genet. 168:111,
1979; Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., Nature 274:398, 1978;
Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA 75:1929,
1978). La transformación de bacterias corineformes puede
conseguirse mediante el procedimiento de pulso eléctrico (ver la
publicación de patente japonesa no examinada nº
2-207791).
La amplificación de la actividad de la citocromo
oxidasa de tipo bo también puede conseguirse permitiendo la
existencia de múltiples copias del operón cyo en ADN
cromosómico del huésped. Con el fin de introducir múltiples copias
del operón cyo en el ADN cromosómico de un microorganismo,
tal como una bacteria perteneciente al género Escherichia y
bacterias corineformes, se lleva a cabo recombinación homóloga
mediante la utilización de una secuencia, de la que existen
múltiples copias en el ADN cromosómico como dianas. Como secuencias
de las que existen múltiples copias en el ADN cromosómico puede
utilizarse ADN repetitivo o repeticiones invertidas en el extremo
del elemento transponible. Además, tal como se da a conocer en la
publicación de patente japonesa no examinada nº
2-109985, también resulta posible incorporar el
operón cyo en el transposón, permitiendo la transferencia
del mismo para introducir múltiples copias del operón cyo en
el ADN cromosómico. Mediante cualquiera de los procedimientos se
incrementa el número de copias del operón cyo dentro de las
células de la cepa transformante, y como resultado, se incrementa
la actividad de la citocromo oxidasa de tipo bo.
El incremento de la actividad de la citocromo
oxidasa de tipo bo también puede conseguirse, además de basándose
en la amplificación génica mencionada anteriormente, en la
sustitución de una secuencia reguladora de la expresión del operón
cyo, tal como un promotor, por uno más fuerte (ver la
publicación de patente japonesa no examinada nº
1-215280). Por ejemplo, se conocen como promotores
fuertes el promotor lac, el promotor trp, el promotor
trc, el promotor tac, el promotor P_{R} y el
promotor P_{L} del fago lambda, el promotor tet, el
promotor amyE y similares. La sustitución de estos promotores
incrementa la expresión del operón cyo y por lo tanto se
incrementa la actividad de la citocromo oxidasa de tipo bo. El
incremento de una secuencia reguladora de la expresión puede
combinarse con el incremento del número de copia del operón
cyo.
El incremento de la actividad de un enzima de
cadena respiratoria de eficiencia energética elevada también puede
conseguirse mediante la introducción de una mutación que permita
incrementar la actividad intracelular del enzima mediante un
tratamiento de mutagénesis del microorganismo. Este tipo de mutación
es una mutación en las secuencias reguladoras de la expresión que
incrementa el nivel de expresión del gen. Como tratamiento de
mutagénesis pueden mencionarse procedimientos que utilizan el
tratamiento mediante irradiación ultravioleta o el tratamiento con
un agente de mutagénesis habitualmente utilizado para el tratamiento
de mutagénesis, tal como la
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) y el ácido nitroso.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, se provoca la deficiencia en el microorganismo
del enzima NDH-II de la cadena respiratoria de
eficiencia energética baja.
La secuencia de ndh de E. coli ha
sido informado anteriormente (Young et al., European Journal
of Biochemistry 116:165-170, 1981) y por lo tanto el
gen puede clonarse basándose en la secuencia. También resulta
posible utilizar un gen de una bacteria perteneciente al género
Escherichia, o un gen derivado de otros organismos, tales
como bacterias corineformes, como el gen ndh.
Puede alterarse un gen ndh en un
cromosoma mediante la transformación de un microorganismo con ADN
que contenga un gen ndh modificado con una deleción interna
de manera que no produzca funcionalidad NDH-II
normalmente (gen ndh de tipo deleción), y que permita la
recombinación entre el gen ndh de tipo deleción y el gen
ndh en el cromosoma. Este tipo de destrucción génica mediante
recombinación homóloga ya ha sido establecido y existen
procedimientos que utilizan un ADN lineal, un plásmido que contiene
una región de control de replicación sensible a la temperatura,
etc. En la presente invención, resulta preferido el procedimiento
que utiliza un plásmido que contiene una región de control de la
replicación sensible a la temperatura.
Puede sustituirse un gen ndh en el
cromosoma del huésped por el gen ndh de tipo deleción, de la
manera siguiente. En primer lugar se prepara ADN recombinante
mediante la inserción de una región de control de la replicación
sensible a la temperatura, un gen ndh de tipo deleción y un
gen marcador para resistencia a un fármaco, ADN recombinante con el
que se transforma un microorganismo. Además, la cepa transformante
resultante se cultiva a una temperatura a la que no funciona la
región de control de la replicación sensible a la temperatura, y
después la cepa transformante puede cultivarse en un medio que
contiene el fármaco para obtener una cepa transformante en la que
se incorpora el ADN recombinante en el ADN cromosómico.
En dicha cepa en la que se ha incorporado ADN
recombinante en el ADN cromosómico, se recombina el gen ndh
de tipo deleción con el gen ndh originalmente presente en el
cromosoma, y los dos genes de fusión del gen ndh cromosómico
y el gen ndh de tipo deleción se insertan en el cromosoma de
manera que las demás partes del ADN recombinante (segmento de
vector, región de control de la replicación sensible a la
temperatura y marcador de resistencia a fármaco) deban encontrarse
presentes entre los dos genes de fusión. Por lo tanto, el
transformante expresa NDH-II debido a que el gen
ndh normal es dominante en este estado.
A continuación, con el fin de dejar únicamente
el gen ndh de tipo deleción en el ADN cromosómico, una copia
del gen ndh conjuntamente con el segmento de vector
(incluyendo la región de control de la replicación sensible a la
temperatura y el marcador de resistencia a fármaco) procedente del
ADN cromosómico se eliminan mediante recombinación de los dos genes
ndh. En este caso, se deja el gen ndh normal en el ADN
cromosómico y se extrae el gen ndh de tipo deleción del ADN
cromosómico, o a la inversa, el gen ndh normal se extrae del
ADN cromosómico. En ambos casos el ADN extraído puede conservarse en
la célula en forma de plásmido al cultivar la célula a una
temperatura a la que pueda funcionar la región de control de
replicación sensible a la temperatura. Posteriormente la célula se
cultiva a una temperatura a la que no pueda funcionar la región de
control de replicación sensible a la temperatura, para perder el
plásmido de ADN, obteniéndose el mutante por deleción del gen
ndh.
Entre los ejemplos del vector que presenta un
origen de replicación sensible a la temperatura para E. coli
se incluyen, por ejemplo, el plásmido pMAN997, descrito en la
publicación de patente internacional WO 99/03988 y similares, y
entre los ejemplos de vector que presenta un origen de replicación
sensible a la temperatura para bacterias corineformes se incluyen,
por ejemplo, el plásmido pHSC4, dado a conocer en la publicación de
patente japonesa no examinada nº 5-7491 y similares.
Sin embargo, los plásmidos no se encuentran limitados a los
mencionados anteriormente, y también pueden utilizarse otros
vectores.
Entre los ejemplos específicos del tipo de
microorganismo obtenido de la manera indicada anteriormente se
incluyen microorganismos en los que la oxidasa de tipo SoxM se
encuentra incrementada, y los microorganismos en los que la oxidasa
de tipo SoxM se encuentra incrementada, y en los que la actividad de
NDH-II se encuentra baja o ha sido eliminada. Más
específicamente puede mencionarse, por ejemplo, E. coli en el
que la actividad de la oxidasa de tipo SoxM se encuentra
incrementada y es deficiente en NDH-II. Entre los
ejemplos de oxidasa de tipo SoxM se incluyen la citocromo oxidasa
de tipo bo.
El microorganismo utilizado para la presente
invención no se encuentra particularmente limitado con la condición
de que pueda recibir las propiedades mencionadas anteriormente, y
entre los ejemplos del mismo se incluyen bacterias pertenecientes
al género Escherichia, tales como E. coli, bacterias
corineformes, tales como Brevibacterium lactofermentum
(Corynebacterium glutamicum), bacterias Bacillus,
tales como Bacillus subtilis, bacterias Serratia,
tales como Serratia marcescens, levaduras, tales como
Saccharomyces cerevisiae y similares.
Específicamente, pueden mencionarse, en el caso
de que el producto de fermentación sea L-treonina,
E. coli VKPM B-3996 (RIA 1867) (ver la
patente US nº 5.175.107), Corynebacterium acetoacidophilum
AJ12318 (FERM BP-1172) (ver la patente US nº
5.188.949) y similares; para la L-lisina, puede
mencionarse E. coli AJ11442 (NRRL B-12185,
FERM BP-1543) (ver la patente US nº 4.346.170),
E. coli W3110 (tyrA) (esta cepa se obtiene eliminando el
plásmido pHATerm de E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm (FERM
BP-3653), ver la publicación de patente
internacional WO 95/16042), Brevibacterium lactofermentum
AJ12435 (FERM BP-2294) (patente US nº 5.304.476),
Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC nº 31269) (ver la
patente US nº 4.066.501), etc.; para el ácido
L-glutámico puede mencionarse E. coli AJ12624
(FERM BP-3853) (ver la publicación de patente
francesa no examinada nº 2.680.178), Brevibacterium
lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172)
(publicación de patente japonesa no examinada nº
5-26811, publicación de patente francesa no
examinada nº 2.701.489), Brevibacterium lactofermentum
AJ12475 (FERM BP-2922) (ver la patente US nº
5.272.067), Brevibacterium lactofermentum AJ13029 (FERM
BP-5189) (ver la solicitud de patente internacional
JP nº 95/01586), etc.; para L-leucina, puede
mencionarse E. coli AJ11478 (FERM P-5274)
(ver la publicación de patente japonesa (Kokoku) nº
62-34397), Brevibacterium lactofermentum
AJ3718 (FERM P-2516) (ver la patente US nº
3.970.519), etc.; para la L-isoleucina puede
mencionarse E. coli KX141 (VKPM B-4781) (ver
la publicación de patente europea no examinada nº 519.113),
Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP-759)
(ver la patente US nº 4.656.135), etc.; para la
L-valina puede mencionarse E. coli VL1970
(VKPM B-4411) (ver la publicación de patente europea
no examinada nº 519.113), Brevibacterium lactofermentum
AJ12341 (FERM BP-1763) (ver la patente US nº
5.188.948), etc.; para la L-fenilalanina puede
mencionarse E. coli AJ12604 (FERM BP-3579)
(publicación de patente japonesa no examinada nº
5-236947, publicación de patente europea no
examinada nº 488.424), Brevibacterium lactofermentum AJ12637
(FERM BP-4160) (ver la publicación de patente
francesa no examinada nº 2.686.898) y similares.
En el microorganismo utilizado para la presente
invención, dependiendo de la sustancia diana, puede incrementarse
la actividad de un enzima implicado en la biosíntesis de la
sustancia diana. Además, puede reducirse o eliminarse la actividad
de un enzima desventajosa para la producción de la sustancia
diana.
Puede producirse una sustancia diana mediante el
cultivo de un microorganismo tal como el indicado anteriormente, en
un medio para producir y acumular la sustancia diana en el medio, y
recoger la sustancia diana.
El medio utilizado para la producción de
sustancia diana puede ser un medio bien conocido utilizado
convencionalmente, seleccionado de entre el microorganismo que debe
utilizarse. Es decir, el medio puede ser un medio habitual que
contiene una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, iones
inorgánicos, así como otros componentes orgánicos, en caso
necesario. No resulta necesario ningún medio especial para la
práctica de la presente invención.
Como fuente de carbono, resulta posible utilizar
azúcares tales como glucosa, lactosa, galactosa, fructosa o
hidrolizado de almidón; alcoholes, tales como glicerol o sorbitol;
ácidos orgánicos, tales como ácido fumárico, ácido cítrico o ácido
succínico y similares.
Como fuente de nitrógeno, resulta posible
utilizar sales amónicas inorgánicas, tales como sulfato amónico,
cloruro amónico o fosfato amónico; nitrógeno orgánico, tal como
hidrolizado de soja; gas amonio; amonio acuoso y similares.
Resulta deseable permitir que contenga
sustancias necesarias, tales como vitamina B1,
L-homoserina y L-tirosina o
extracto de levadura en cantidades apropiadas como nutrientes traza
orgánicos. Además de lo mencionado anteriormente, se añaden en
cantidades bajas fosfato de potasio, sulfato de magnesio, ión
hierro, ión manganeso y similares, en caso necesario.
El cultivo puede llevarse a cabo bajo
condiciones bien conocidas utilizadas convencionalmente,
seleccionadas según el microorganismo que deba utilizarse. Por
ejemplo, el cultivo preferentemente se lleva a cabo bajo
condiciones aeróbicas durante 16 a 120 horas. La temperatura de
cultivo preferentemente se controla entre 25ºC y 45ºC, y el pH
preferentemente se controla a valores de entre 5 y 8 durante el
cultivo. Para el ajuste del pH pueden utilizarse sustancias
inorgánicas u orgánicas, ácidas o alcalinas, así como gas amonio o
similares.
Para la recolección del producto metabólico del
medio después del cultivo, no resulta necesario ningún procedimiento
especial para la presente invención. Es decir, la presente
invención puede ponerse en práctica mediante la utilización de una
combinación de técnicas de intercambio iónico, de precipitación y
otras técnicas bien conocidas convencionalmente.
A continuación se explica la presente invención
más específicamente, haciendo referencia a los ejemplos
siguientes.
Ejemplo
1
La secuencia del operón cyo
(cyoABCDE) codificante de la citocromo oxidasa de tipo bo de
E. coli ha sido informada anteriormente (Chepuri et
al., The Journal of Biological Chemistry
265:11185-11192, 1990) y por lo tanto el operón se
clonó basándose en la secuencia.
Específicamente, se obtuvo el gen diana del
operón cyo a partir de la biblioteca fágica de Kohara (Kohara
et al., Cell 50:495-508, 1987) que contiene
el operón cyo. Se obtuvo ADN fágico a partir del clon fágico
147[2H5] de Kohara que contiene el operón, mediante la
utilización del kit Wizard lambda prep (Promega). El fago DNA
147[2H5] obtenido se digirió con PshBI, y se crearon extremos
romos en el fragmento de 5,5 kb obtenido que contenía el operón
cyo, y se insertó en el sitio SmaI de pMW119 (Nippon Gene)
para clonar el operón cyo que contenía una región promotora.
En el plásmido obtenido, se insertó el operón cyo en la
dirección reversa con respecto al promotor del operón lactosa en
pMW119. Este plásmido se denominó pMW(CYO)B.
Se introdujo el plásmido pMW(CYO)B
en la cepa W3110 de E. coli (obtenida del National Institute
of Genetics, Mishima, Shizuoka, Japón), obteniendo
W3110/pMW(CYO)B. Se midió la actividad de ubiquinol
oxidasa presente en extractos celulares de las cepas W3110 y
W3110/pMW(CYO)B como actividad de oxidasa terminal mediante
la utilización de un procedimiento conocido (Kita et al., The
Journal of Biological Chemistry 259:3368-3374,
1984). Se muestran los resultados en la Tabla 1.
Se descubrió que la actividad de oxidasa
terminal se encontraba incrementada en la cepa en la que se había
introducido pMW(CYO)B, tal como se muestra en la Tabla 1.
Este incremento de la actividad de la oxidasa terminal se considera
que está causado por el incremento de la actividad de citocromo
oxidasa de tipo bo mediante la potenciación del operón
cyo.
Ejemplo
2
Con el fin de producir una cepa deficiente en
NDH-II, se preparó una secuencia internamente
cortada de NDH-II (gen NDH-II de
tipo alterado). La secuencia parcial de NDH-II se
clonó basándose en la secuencia conocida del gen ndh
codificante de NDH-II de E. coli (Young et
al., European Journal of Biochemistry
116:165-170, 1981).
Específicamente, el gen NDH-II
de tipo alterado se produjo de la manera siguiente (fig. 1). En
primer lugar, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente
2,4 kb que contenía la secuencia parcial de NDH-II a
partir de ADN cromosómico de E. coli mediante PCR utilizando
ndh-1 (SEC ID nº 1) y ndh-2 (SEC ID
nº 2) como cebadores. Este fragmento se clonó en el vector
pGEM-T (Promega) para obtener
pGEM-ndh. Se digirió pGEM-ndh con
los enzimas de restricción EcoRI y StuI, y se recogió el fragmento
de ADN de 0,5 kb obtenido y se ligó a pTWV229 (Takara Shuzo)
digerido con EcoRI y SmaI, obteniendo pTWV-ndh.
A continuación, se digirió
pGEM-ndh con el enzima de restricción StuI y el
fragmento de ADN obtenido de 0,9 kb se recogió y se insertó en el
sitio HincII de pTWV-ndh. De esta manera, se obtuvo
pTWV\Deltandh que contenía una parte de los sitios de
multiclonación de pTWV229 en la secuencia parcial de ndh. El
plásmido pTWV\Deltandh contenía la secuencia ndh insertada
con una secuencia de 17 pb derivada de pTWV229 en el sitio StuI en
la secuencia de ndh. Posteriormente, se insertó un fragmento
de 1,5 kb obtenido mediante digestión de pTWV\Deltandh con
HindIII y EcoRI entre los sitios HindIII y EcoRI del plásmido
sensible a la temperatura pMAN997 (ver la publicación de patente
internacional WO 99/03988), obteniendo
pTS-\Deltandh. Se llevó a cabo la recombinación
homóloga entre el plásmido pTS-\Deltandh y el
genoma de la cepa W3110 para ndh mediante una técnica habitual de
recombinación homóloga utilizando la sensibilidad térmica de
pTS-\Deltandh (Matuyama et al., Journal of
Bacteriology 162:1196, 1985), obteniendo una cepa W3110(ndh)
que no expresaba proteína NDH-II normal debido a
que la secuencia de 17 pb derivada de pTWV229 se encontraba
insertada en la región codificante de ndh en el genoma. A
partir de W3110(tyrA), se introdujo la deficiencia de
tyrA en la cepa W3110(ndh) mediante transducción P1
utilizando resistencia a la tetraciclina como marcador, obteniendo
una cepa W3110(ndh, tyrA).
El plásmido pMAN997 mencionado anteriormente se
obtuvo mediante el intercambio de los fragmentos
VspI-HindIII de pMAN031 (J. Bacteriol. 162:1196,
1985) y pUC19 (Takara Shuzo) (fig. 2).
Además, aunque la cepa W3110(tyrA) se
detalle en la publicación de patente europea no examinada nº 488424/
1992, el procedimiento de preparación de la misma se explica
brevemente a continuación.
Se obtuvo la cepa W3110 de E. coli del
National Institute of Genetics (Mishima, Shizuoka). Se sembró esta
cepa en una placa LB que contenía estreptomicina, y se seleccionó la
cepa que formó una colonia, obteniendo una cepa resistente a la
estreptomicina. Se combinaron la cepa resistente a la estreptomicina
seleccionada y la cepa E. coli K-12 ME8424,
y se cultivaron en un medio completo (caldo L:
Bacto-triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%,
NaCl al 0,5%) a 37ºC durante 15 minutos en forma de cultivo
estacionario para inducir la conjugación. La cepa E. coli
K-12 ME8424 presenta las características genéticas
siguientes: (HfrPO45, thi, relA1,
tyrA::Tn10, ung-1, nadB)
y puede obtenerse del National Institute of Genetics. Después, se
sembró el cultivo en un medio completo (caldo L:
Bacto-triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%,
NaCl al 0,5%, ágar al 1,5%) que contenía estreptomicina,
tetraciclina y L-tirosina, y se seleccionó la cepa
que formó colonias. Esta cepa se diseñó como cepa E. coli
W3110(tyrA).
La publicación de patente europea no examinada
nº 488424/1992 da a conocer muchas cepas obtenidas mediante la
introducción de un plásmido en la cepa anteriormente indicada. Por
ejemplo, se diseñó una cepa obtenida mediante la introducción del
plásmido pHATerm como E. coli W3110(tyrA)/pHATerm,
depositada el 16 de noviembre de 1991 en el National Institute of
Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade
and Industry (1-3 Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón,
código postal: 305) (en la actualidad, la corporación
administrativa independiente, National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology, depositario de organismos de
patente internacional (Chuo Dai-6,
1-1 Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón,
código postal: 305-5466) como depósito internacional
bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, y recibió el número
de acceso FERM BP-3653. La cepa E. coli
W3110(tyrA) puede obtenerse mediante la eliminación del
plásmido pHATerm de la cepa anteriormente indicada de una manera
convencional.
Ejemplo
3
Se introdujo el plásmido pMW(CYO)B
obtenido en el Ejemplo 1 en la cepa W3110(tyrA) y en la cepa
W3110(ndh, tyrA) obtenida en el Ejemplo 2, con el fin
de obtener W3110(tyrA)/pMW(CYO)B y
W3110(ndh, tyrA)/pMW(CYO)B,
respectivamente. De manera similar, se introdujo pMW119 en
W3110(tyrA), obteniendo la cepa W3110(tyrA)/
pMW119. Se evaluó la productividad de L-lisina de dichas cepas W3110(tyrA)/pMW(CYO)B, W3110(ndh, tyrA)/
pMW(CYO)B y W3110(tyrA)/pMW119 como control, mediante cultivo en matraz. El cultivo se llevó a cabo mediante la utilización de un medio que presentaba la composición siguiente a 37ºC durante 24 a 48 horas bajo agitación. Se muestran los resultados en la Tabla 2.
pMW119. Se evaluó la productividad de L-lisina de dichas cepas W3110(tyrA)/pMW(CYO)B, W3110(ndh, tyrA)/
pMW(CYO)B y W3110(tyrA)/pMW119 como control, mediante cultivo en matraz. El cultivo se llevó a cabo mediante la utilización de un medio que presentaba la composición siguiente a 37ºC durante 24 a 48 horas bajo agitación. Se muestran los resultados en la Tabla 2.
- Glucosa
- 40 g/l
- MgSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 1 g/l
- KH_{2}PO_{4}
- 1 g/l
- FeSO_{4}\cdot7H_{2}O
- 0,01 g/l
- MnSO_{4}\cdot5H_{2}O
- 0,01 g/l
- Extracto de levadura (Difco)
- 2 g/l
- L-tirosina
- 0,1 g/l o 0,05 g/l
Se ajustó el pH del medio a 7,0 con KOH y se
sometió a autoclave a 115ºC durante 10 minutos. Sin embargo, se
esterilizaron separadamente la glucosa y el
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O. Además, antes del cultivo se añadieron
al medio 30 g/l de CaCO_{3} según la Farmacopea Japonesa, que se
sometió a esterilización seca a 180ºC, y 100 \mug/l del
antibiótico ampicilina.
Se descubrió que la productividad de
L-lisina mejoraba en E. coli productor de
L-lisina incrementando la actividad de la citocromo
oxidasa de tipo bo. Se consideró que lo expuesto anteriormente
estaba causado por el incremento de la eficiencia de captación
energética debido a la potenciación de la ruta de cadena
respiratoria de eficiencia energética elevada, y la energía se
utilizó para la producción de L-lisina.
También se descubrió que se mejoraba la
productividad de L-lisina en E. coli
productor de L-lisina haciendo que fuera
deficiente en NDH-II. Lo expuesto anteriormente se
consideró que estaba causado por la mejora de la eficiencia de
captación energética debido a la deficiencia de la ruta de cadena
respiratoria de la eficiencia energética baja, y se utilizó la
energía para la producción de L-lisina.
Ejemplo
4
Se introdujo el plásmido pMW(CYO)B
obtenido mediante el procedimiento mencionado anteriormente en una
bacteria productora de L-treonina, E. coli
VKPM B-3996 (RIA 1867) (ver la patente US nº
5.175.107, en adelante denominada cepa
"B-3996"), obteniendo la cepa
B-3996/pMW(CYO)B. La cepa
B-3996 alojaba un plásmido pVIC40 (publicación de
patente internacional WO 90/04636) obtenida mediante la inserción
del operón treonina en un vector plásmido pAYC32 de amplio rango de
huésped que contenía un marcador de resistencia a la estreptomicina
(ver Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid
16:161-167, 1986). La cepa B-3996 se
encuentra depositada en el USSR Antibiotics Research Institute
(VNIIA) bajo el número de registro RIA1867.
Como control se obtuvo
B-3996/pMW119 mediante la introducción de pMW119 en
B-3996. Se evaluó la productividad de
L-treonina en
B-3996/pMW(CYO)B y en
B-3996/pMW119 mediante cultivo en matraz. Se llevó a
cabo el cultivo mediante la utilización de un medio que presentaba
la composición mencionada en la Tabla 3, a una temperatura de 37ºC
durante 38 horas bajo agitación a 114-116 rpm. Los
componentes A, B y C mencionados en la Tabla 3 se prepararon y
esterilizaron separadamente y después se enfriaron y se mezclaron en
una proporción de 16/20 de componente A, 4/20 de componente B y 30
g/l de componente C. Se muestran los resultados en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que la productividad de
L-treonina de E. coli productor de
L-treonina podía mejorarse incrementando la
actividad de la citocromo oxidasa de tipo bo.
Ejemplo
5
Se recogió un plásmido pACMAB de la cepa E.
coli W3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 según
un procedimiento habitual de purificación para el plásmido. El
plásmido era un plásmido obtenido mediante la inserción de un
fragmento de ADN que contiene un gen para la corismato mutasa de
tipo desensibilizado/prefenato deshidratasa
(CM-PDH) en el sistema de biosíntesis de
L-fenilalanina correcto entre los sitios de corte
BamHI y HindIII del vector plásmido pACYC184 (Ap^{r}) (ver la
publicación de patente internacional WO 97/08333). La cepa
W3310(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 (denominada
AJ12604) se depositó el 28 de enero de 1991 en el National
Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry (1-3 Higashi
1-Chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón, código postal: 305) y recibió
el número de acceso FERM P-11975. A continuación, se
transfirió a un depósito internacional bajo las disposiciones del
Tratado de Budapest el 26 de septiembre de 1996, y recibió el número
de acceso FERM BP-3579.
Se crearon extremos romos en el plásmido pACMAB
mediante digestión con SalI. En éste se insertó un fragmento de ADN
de extremos romos que contenía el operón cyo de 5,5 kb, que se
obtuvo a partir del fago DNA 147[2H5] anteriormente indicado
de Kohara mediante digestión con PshBI. Se introdujo el plásmido
pACMAB-cyo obtenido en
W3110(tyrA/pBR-aroG4). La cepa transformante
obtenido se cultivo en un medio para la producción de
L-fenilalanina (que contenía 20 g de glucosa, 29,4 g
de hidrogenofosfato disódico, 6 g de dihidrogenofosfato potásico, 1
g de cloruro sódico, 2 g de cloruro amónico, 10 g de citrato sódico,
0,4 g de glutamato sódico, 3 g de sulfato de magnesio heptahidrato,
0,23 g de cloruro de calcio, 2 mg de hidrocloruro de tiamina y 100
mg de L-tirosina en 1 litro de agua, pH 7,0) a 37ºC
durante 40 horas. Se cuantificó la L-fenilalanina
contenida en el medio mediante cromatografía líquida de alto
rendimiento. Se muestran los resultados en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se descubrió que la productividad de
L-fenilalanina de E. coli productor de
L-fenilalanina se mejoraba incrementando la
actividad de la citocromo oxidasa de tipo bo.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para producir
sustancias mediante la utilización de microorganismos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-53668
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2000-204252
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-07-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen NDH-II
(ndh-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar el gen NDH-II
(ndh-2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (6)
1. Procedimiento para producir una sustancia
diana seleccionada de entre el grupo constituido por
L-aminoácidos y ácidos nucleicos utilizando un
microorganismo, que comprende las etapas que consisten en cultivar
el microorganismo en un medio para producir y acumular la sustancia
diana en el medio y recoger la sustancia diana, en el que el
microorganismo se construye a partir de una cepa parental del
microorganismo que presenta como rutas de cadena respiratoria una
ruta de cadena respiratoria de eficiencia energética elevada y una
ruta de cadena respiratoria de eficiencia energética baja, y el
microorganismo es una cepa mutante o una cepa recombinante genética
que presenta la característica siguiente:
la ruta de cadena respiratoria de eficiencia
energética elevada se potencia incrementando el número de copias de
un gen codificante de una oxidasa de tipo SoxM, la modificación de
una secuencia reguladora de la expresión del gen codificante de la
oxidasa de tipo SoxM, o una combinación de las mismas.
2. Procedimiento para producir una sustancia
diana según la reivindicación 1, en el que el NDH-II
se hace deficiente en el microorganismo.
3. Procedimiento para producir una sustancia
diana según la reivindicación 1 ó 2, en el que la oxidasa de tipo
SoxM es la citocromo oxidasa de tipo bo.
4. Procedimiento para producir una sustancia
diana según la reivindicación 3, en el que dicha citocromo oxidasa
de tipo bo se encuentra codificada por el operón cyo.
5. Procedimiento para producir una sustancia
diana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el
microorganismo se selecciona de entre el grupo constituido por una
bacteria perteneciente al género Escherichia y la bacteria
corineforme.
6. Procedimiento para producir una sustancia
diana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el
microorganismo es Escherichia coli.
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