ES2347799T3 - Microorganismo productor de acido l-glutamico y procedimiento para la produccion de acido l-glutamico. - Google Patents

Microorganismo productor de acido l-glutamico y procedimiento para la produccion de acido l-glutamico. Download PDF

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Abstract

Microorganismo que presenta una capacidad de producir ácido L-glutámico, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen yhfK es potenciada aumentando el número de copias de dicho gen yhfK, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen yhfK, en el que dicho gen yhfK codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: (A) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº: 2 ó 4; y (B) una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº 2 ó 4, en la que dicha proteína incluye sustitución, deleción, inserción o adición de uno a 20 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico, y (C) una proteína que comprende una secuencia aminoácida que presenta el 90% o más de homología con respecto a la secuencia aminoácida total de SEC ID nº: 2 ó 4, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico.

Description

CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento para producir ácido L-glutámico. El ácido L-glutámico es muy utilizado como un material en bruto para condimentos y así sucesivamente.
ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA
El ácido L-glutámico se produce principalmente mediante fermentación, utilizando bacterias que producen ácido L-glutámico, que incluyen las bacterias corineformes que pertenecen al género Brevibacterium Corynebacterium o Microbacterium, o sus cepas mutantes (Kunihiko Akashi et al., Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center), páginas 195-215, 1986). También se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico mediante fermentación, utilizando otros microorganismos, y se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece al género Bacillus, Streptomyces, Penicillium
o similares, en la patente US nº 3.220.929. Se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo perteneciente al género Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida o similares, en la patente US nº 3.563.857. Se ha informado de procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece a los géneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (al que habitualmente se hace referencia como Enterobacter aerogenes)o similares, en JP32-9393B. Procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando una cepa mutante de Escherichia coli se han informado en JP5-244970A. Se ha informado de además, procedimientos para producir ácido L-glutámico utilizando un microorganismo que pertenece a los géneros Klebsiella, Erwinia, Pantoea o Enterobacter en US nº 6.197.559, US nº 6.331.419 y en la publicación de patente europea nº 0 999 282).
Además, se han dado a conocer procedimientos para potenciar las actividades de las enzimas biosintéticas del ácido L-glutámico utilizando técnicas del ADN recombinante para aumentar la capacidad de producción del ácido L-glutámico. Por ejemplo, se ha informado de que la capacidad productora del ácido L-glutámico de las bacterias Corynebacterium o Brevibacterium (JP7-121228B) podría potenciarse de forma efectiva introduciendo un gen codificante de la citrato sintasa derivado de Escherichia coli o de Corynebacterium glutamicum. Además, se ha informado asimismo de que la capacidad productora de ácido L-glutámico de las enterobacterias pertenecientes al género Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, o Escherichia (publicación de patente europea nº 0 999 282), podrían mejorar efectivamente introduciendo un gen de la citrato sintasa derivada de una bacteria corineforme.
Resultan conocidos procedimientos para mejorar las capacidades de las bacterias para producir sustancias tales como aminoácidos, modificando un sistema de absorción o de exportación de las sustancias. Como procedimiento para modificar un sistema de absorción para una sustancia, por ejemplo, se sabe de uno para eliminar o reducir la absorción celular de dicha sustancia. Específicamente, se conoce la mejora de la capacidad de producción del ácido L-glutámico eliminando o reduciendo la absorción celular del ácido L-glutámico, borrando (inactivando) el operón gluABCD o una parte suya (publicación de Patente europea nº 1 038 970), o reduciendo la absorción celular de los purínnucleótidos para potenciar la capacidad de producción de ellos (publicación de Patente europea nº 1 004 663).
Los procedimientos para modificar un sistema de exportación incluyen la potenciación de un sistema de exportación de una sustancia diana y eliminar o reducir un sistema de exportación de un intermediario o de un sustrato en un sistema biosintético de una sustancia diana. Por ejemplo, se ha informado de un procedimiento para producir L-lisina utilizando una cepa bacteriana de Corynebacterium en la que la expresión del gen de exportación de la L-lisina (lysE) se potencia (WO97/23597). Además, también se ha informado de un procedimiento para producir un L-aminoácido utilizando un microorganismo en el que la expresión de los genes rhtA, B y C se potencia (publicación de Patente europea nº 1 013 765). Se ha informado de que estos genes están implicados en la exportación de los L-aminoácidos. Como procedimiento para eliminar un sistema de exportación de un intermediario o de un sustrato en un sistema biosintético del ácido L-glutámico, se conoce la mutación o la interrupción del gen de la 2-oxoglutarato permeasa para reducir la exportación del 2-oxoglutarato, que es un intermediario de la biosíntesis del ácido L-glutámico (WO01/05959).
Además, se ha sugerido un procedimiento para la crianza de microorganismos (WO00/37647) en el que el transporte aminoácido a través de la membrana celular es modificado, utilizando un gen que codifica la superfamilia de cassettes de unión al ATP (portador ABC), que está implicado en la penetración de sustancias a través de una membrana celular.
En las bacterias corineformes, se ha informado de que la adición de biotina o de un surfactante cambia la permeabilidad de las membranas celulares, exportándose de este modo el ácido L-glutámico desde el interior celular, lo que sugiere que la exportación del ácido L-glutámico en las bacterias corineformes no es mediado por ningún gen exportador (Eiichiro Kimura, Metabolic Engineering of Glutamate Production, Advanced Biochemical Engineering Biotechnology, 79:37-57, 2003, Springer Verlag). Además, también se ha informado de que la eficiencia de la producción de ácido L-glutámico mejoró en las bacterias Escherichia mejorando la expresión del gen yfiK, que se piensa está implicado en la exportación del L-aminoácido (publicación de Patente europea 1 016 710).
Sin embargo, no se ha informado de un gen exportador del ácido L-glutámico para un microorganismo Pantoea u otros microorganismos, deseándose el descubrimiento de un nuevo gen exportador del ácido L-glutámico.
Alternativamente, se conoce un procedimiento para cultivar un microorganismo para producir y precipitar el ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas (publicación de Patente europea 1 078 989). Bacterias Enterobacter en las que la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa es eliminada o reducida se utilizan a menudo en la producción fermentativa de la precipitación del ácido L-glutámico (publicación de Patente europea 1 078 989).
En general, el ácido L-glutámico se convierte en una etapa en un intermediario del ciclo TCA, el 2-oxoglutarato, mediante la glutamato deshidrogenasa, después de que haya sido importado a las células, y por lo tanto, considerándose generalmente, por lo tanto, que el ácido L-glutámico que se importa a las células es fácilmente metabolizado. Sin embargo, cuando un microorganismo que tiene inactivada o reducida la actividad 2-oxoglutarato deshidrogenasa se cultiva bajo condiciones para la precipitación del ácido L-glutámico, la proporción del ácido L-glutámico libre sin carga eléctrica llega a ser más alta, y atraviesa fácilmente las membranas celulares, da lugar a un aumento en la concentración de ácido L-glutámico intracelular, y a por lo tanto, una disminución en el crecimiento celular bacteriano. En la publicación de patente europea 1 078 989, una cepa deficiente en 2-oxoglutarato deshidrogenasa que puede producir eficientemente y precipitar el ácido L-glutámico, se crió mediante tratamiento mutacional y se utilizó para la preducción del ácido L-glutámico. Sin embargo, se ha informado de algunas cepas distintas a las cepas anteriores que pueden producir ácido L-glutámico mientras también lo precipitan, y no se ha informado de ningún gen que pueda impartir a un microorganismo huésped la resistencia al ácido L-glutámico y la capacidad de producir ácido L-glutámico bajo condiciones que precipiten el ácido L-glutámico.
El gen yhfK es un gen que existe en el genoma de Escherichia coli (Science, 277 (5331):1453-74, 1997), y se ha informado que codifica un portador putativo basado en los motivos, tipología etc., de la secuencia aminoácida predicha (J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2(2):195-198, 2000). Sin embargo, no se ha informado previamente ni de la clonación ni del análisis de la expresión del gen. Además, la función actual del gen permanece desconocida.
Hoischen, C et al, Archives of Microbiology, Berlin, DE, vol 151, nº 4, 1989, páginas 342 a 347, da a conocer un sistema portador de flujo que está implicado en la secreción del glutamato por Corynebacterium glutamicum.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La siguiente invención proporciona lo siguiente:
(1)
Un microorganismo que presenta una capacidad para producir ácido L-glutámico, en que dicho microorganismo se modifica de forma que la expresión de un gen yhfK se potencia aumentando el número de copias de dicho gen yhfK, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen yhfK en la que dicho gen yhfK codifica una proteína que se selecciona de entre el grupo constituido por:
(A)
una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº: 2 ó 4; y
(B)
una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº 2 ó 4, en la que dicha proteína incluye sustitución, deleción, inserción o adición de uno a 20 residuos de aminoácidos, y en la que dicha proteína tiene capacidad para exportar ácido L-glutámico, y
(C)
una proteína que comprende una secuencia aminoácida que posee el 90% o más de homología con respecto a la secuencia aminoácida total de SEC ID nº: 2 ó 4, y en la que dicha proteína posee capacidad para exportar ácido L-glutámico.
(2)
El microorganismo según (1), en el que dicho gen yhfK es seleccionado de entre el grupo constituido por:
(a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1 o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3; y
b) un ADN que es capaz de hibridizarse a la secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1, o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3, bajo condiciones de astringencia que comprenden el lavado bajo 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68ºC y donde dicha secuencia codifica una proteína que posee capacidad para exportar el ácido L-glutámico.
(3)
El microorganismo según (1) o (2), en el que dicho microorganismo es una γ-proteobacteria.
(4)
El microorganismo según cualquiera de los ítems (1) a (3), en el que dicho microorganismo es una Enterobacteriácea, seleccionada de entre el grupo constituido por Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, y Serratia.
(5)
El microorganismo según (1) o (2), en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.
(6)
Procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo de un microorganismo según cualquiera de los ítems (1) a (5) en un medio, y la recuperación de dicho ácido L-glutámico a partir de dicho medio.
Utilizando el microorganismo de la presente invención, el ácido L-glutámico puede producirse de modo eficiente mediante fermentación. El gen de la presente invención puede utilizarse apropiadamente para llevar a cabo la crianza de microorganismos que producen ácido L-glutámico.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
La figura 1 muestra curvas de crecimiento de una cepa de control Pantoea ananatis (A) y una cepa de Pantoea ananatis que contiene el plásmido Lib10 que transporta el gen yhfK (B).
La figura 2 muestra los procedimientos de construcción de un plásmido para la amplificación del gen yhfK de Pantoea ananatis (A) y de un plásmido para la amplificación del gen yhfK de Escherichia coli (B).
La figura 3 muestra las curvas de crecimiento de una cepa de control, una cepa amplificada por el plásmido Lib10, y una cepa yhfK amplificada de Pantoea ananatis.
La figura 4 muestra una comparación de la relación de concentraciones de ácido L-glutámico intracelular y extracelular para cepas con un gen yhfK amplificado derivado de Escherichia coli o Pantoea ananatis.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS
<1> Microorganismo productor del ácido L-glutámico de la presente invención.
El microorganismo de la presente invención posee capacidad para producir ácido L-glutámico y se ha modificado de forma que se potencia o se sobreexpresa la expresión del gen yhfK. El término "capacidad para producir ácido L-glutámico (capacidad productora del ácido L-glutámico)", o "es capaz de producir ácido L-glutámico" que se utiliza en la presente memoria hace referencia a la capacidad de provocar la acumulación de ácido L-glutámico en un medio o en células del microorganismo, de tal forma que el ácido L-glutámico puede recuperarse a partir del medio o de las células, cuando el microorganismo de esta invención se cultiva en el medio. El microorganismo de la presente invención puede tener originariamente la capacidad de producir el ácido L-glutámico, o puede haber obtenido esa capacidad para producir el ácido L-glutámico modificando cepas parentales como las que se mencionan a continuación mediante mutación o mediante una técnica del ADN recombinante. Además, puede utilizarse un microorganismo provisto de la capacidad para producir ácido L-glutámico mediante la introducción o transformación del gen yhfK de la presente invención.
Los ejemplos de una cepa parental del microorganismo de la presente invención que puede modificarse, incluyen las de la familia de las Enterobacteriáceas clasificadas como γ-proteobacterias, tales como las del género Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, o similares, bacterias corineformes que pertenecen a los géneros Brevibacterium, Corynebacterium, o Microbacterium, microorganismos que pertenecen al género Allicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces, o similares, y así sucesivamente. Específicamente, pueden utilizarse los que pertenecen a las "γ-proteobacterias según la clasificación proporcionada por la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-postTaxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Además, las bacterias que asimilan el metanol tales como Methylophilus, Methylobacillus, y otros, pueden también utilizarse. Estos microorganismos pueden ser cultivados para la producción de L-aminoácidos en un medio que contenga metanol, que es un material en bruto de fermentación que está disponible a bajo coste en grandes cantidades. Estas cepas parentales pueden o no poseer inherentemente el gen yhfK, pero muestran una mejoría en la capacidad exportadora del ácido L-glutámico cuando el gen yhfK se introduce o se transforma.
Los ejemplos de bacterias Escherichia coli incluyen Escherichia coli y así sucesivamente. Cuando una cepa productora de ácido L-glutámico de Escherichia coli se cría utilizando una técnica de ingeniería genética, la cepa K12 de E.coli y sus derivados, por ejemplo, la cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC nº 47076, la cepa W3110 (ATCC nº 27325) y así sucesivamente, puede utilizarse como una cepa parental. La cepa K12 de Escherichia coli se aisló en la Stanford University en 1922 y es una bacteria lisogénica del fago λ Además, es una cepa versátil que posee el factor F, a partir de la cual pueden crearse mediante conjugación o similar, cepas genéticas recombinantes. Además, la secuencia genómica de la cepa K12 de Escherichia coli ya se ha determinado, y por tanto su información génica ya está disponible. La cepa K12 de Escherichia coli y sus derivados, pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC, dirección: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos de América.
Además, ejemplos de bacterias Enterobacter incluyen Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, y así sucesivamente, y ejemplos de bacterias Pantoea incluyen Pantoea ananatis. Algunas cepas de Enterobacter agglomerans se volvieron a clasificar recientemente como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii o similares, basándose en el análisis secuencial nucleótido del 16S ARNr, etc. En la presente invención, tanto las bacterias Enterobacter como Pantoea pueden utilizarse siempre que estén clasificadas como γ-proteobacterias. Cuando una cepa de Pantoea ananatis se cría mediante una técnica de ingeniería genética, pueden utilizarse la cepa AJ13355 de Pantoea ananatis (FERM BP-6614), la cepa AJ13356 (FERM BP-6615), la cepa AJ13601 (FERM BP-7207) y sus derivados. Estas cepas se identificaron como Enterobacter agglomerans cuando se aislaron y se depositaron como Enterobacter agglomerans. Sin embargo, se volvieron recientemente a reclasificar como Pantoea ananatis basándose en la secuenciación nucleótida del 16S rARN y así sucesivamente, tal como se ha descrito anteriormente.
Las bacterias corineformes a las que se hace alusión en la presente memoria, constituyen un grupo de microorganismos que se definen en el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8ª edición, pág 599, 1974. Son aeróbicas, gram positivas, y bacilos no ácidos rápidos que no pueden esporular, e incluyen bacterias que se han clasificado hasta la fecha en el género Brevibacterium, pero que actualmente se han unido en el género Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255, 1991), y también incluye bacterias que pertenecen al género Brevibacterium o Microbacterium, que están estrechamente relacionadas con el género Corynebacterium.
Los ejemplos de bacterias corineformes que son apropiadas para la producción de ácido L-glutámico de la presente invención, se mencionan a continuación:
Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) Corynebacterium melassecola Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagens (Corynebacterium ammoniagens) Brevibacterium album Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum
Específicamente, pueden ejemplificarse las cepas siguientes:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagens) ATCC 6871
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Los ejemplos específicos de bacterias Methylophilus incluyen Methylophilus methylotrophus, y ejemplos típicos de Methylophilus methylotrophus incluyen la cepa AS1 (NCIMB 10515) y así sucesivamente. La cepa Methylophilus methylotrophus AS1 (NCIMB 10515) está disponible en la National Collections of Industrial and Marine Bacteria (dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido).
Los ejemplos específicos de bacterias Methylobacillus incluyen Methylobacillus glycogenes, Methylobacillus flagellatum y así sucesivamente. Los ejemplos de Methylobacillus glycogenes incluyen la cepa T-11 (NCIMB 11375), cepa ATCC 21276, cepa ATCC 21371, cepa ATR80 (que se describe en Appl. Microbiol. Biotechnol., vol 42, pág 67-72, 1994), cepa A513 (que se describe en Appl. Microbiol. Biotechnol., vol 42, pág 67-72 (1994)) y así sucesivamente. La cepa de Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375 puede obtenerse a partir de la National Collections of Industrial and Marine Bacteria (dirección: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Reino Unido). Ejemplos de Methylobacillus flagellatum incluyen la cepa KT (Arch. Microbiol., vol 149, págs 441-446, 1988), y así sucesivamente.
<Impartición de la capacidad de producción del ácido L-glutámico >
Los procedimientos para conferir la capacidad de producción del ácido L-glutámico a los microorganismos que se mencionan anteriormente, incluyen, por ejemplo, la modificación de los microorganismos, de forma que la expresión de un gen que codifica una enzima implicada en la biosíntesis del ácido L glutámico se potencia y/o se sobreexpresa. Los ejemplos de enzimas implicadas en la biosíntesis del ácido L-glutámico incluyen la glutamato deshidrogenasa (a la que también se alude como "GDH" en adelante), glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (a la que se alude también como "CS" en adelante), foafoenolpiruvato carboxilasa (a la que se hace también referencia como "PEPC" en adelante), piruvato carboxilasa, piruvato deshidrogenasa, piruvato quinasa, fosfoenolpiruvato sintasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fructosa bifosfato aldolasa, fosfofructoquinasa, glucosa fosfato ismomerasa y así sucesivamente. De estas enzimas, resulta preferido que la actividad de una o más de CS, PEPC, y GDH se potencie, y resulta más preferido que las actividades de la totalidad de las tres enzimas se potencien.
En adelante se expondrán, los procedimientos para la modificación de los microorganismos, de forma que la expresión de un gen diana se potencie.
Un procedimiento es aumentar el número de copias de un gen diana, clonando el gen diana, insertándolo en un plásmido apropiado, y transformando el microorganismo huésped con el plásmido resultante. Por ejemplo, ya se ha informado de los genes que codifican CS (gen gltA), PEPC (gen ppc) y GDH (gen gdhA) de las bacterias Escherichia y Corynebacterium (Biochemistry, vol, 22, págs 5243-5249, 1983; J. Biochem., vol 95, págs 909-916, 1984; Gene, vol 27, págs 193-199, 1984; Microbiology, vol 140, págs 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., vol 218, págs 330-339, 1989; Molecular Microbiology, vol 6, págs 317-326, 1992), y por tanto estos genes ya pueden obtenerse mediante PCR utilizando cebadores basados en sus secuencias nucleótidas a partir de un ADN cromosómico de bacterias Escherichia o Corynebacterium.
Los ejemplos de plásmidos que pueden replicarse autónomamente en microorganismos que pertenecen a la familia de las Enterobacteriáceas y pueden utilizarse para la transformación, incluyen pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG y pSTV pueden obtenerse de Takara Bio), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (plásmidos de las series PMW pueden obtenerse a partir de Nippon Gene), y así sucesivamente. Ejemplos de plásmidos para las bacterias corineformes incluyen pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP5877895A), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (JP58-192900A), pCG1 (JP57-134500A), pCG2 (JP58-35197A), pCG4, pCG11 (JP57-183799A), pHK4 (JP5-7491A), y así sucesivamente. Los ADN fágicos pueden también utilizados como un vector en vez de un plásmido. Los ejemplos de un plásmido que puede utilizarse para potenciar simultáneamente las actividades de CS, PEPC, y GDH incluyen RSFCPG, que contiene los genes gltA, ppc, y gdhA (EP 0 952 221A).
Los ejemplos específicos de vectores que pueden replicarse en bacterias Methylobacillus incluyen RSF1010, que es un vector de huéspedes de amplio espectro, y sus derivados tales como pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161167, 1986), pMFY42 (Gene, 44, 53, 1990), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, 1980), y así sucesivamente.
Los ejemplos de procedimientos de transformación incluyen el tratamiento de las células receptoras con cloruro cálcico, de modo que se aumente la permeabilidad del ADN, lo que se ha informado para la K-12 de Escherichia coli (Mandel, M. y Higa, A., J.
Mol. Biol, 53, 159 (1970)), preparando células competentes a partir de células que están en la etapa de crecimiento, seguido por la transformación con ADN, lo que se ha informado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. y Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)), y así sucesivamente. Además de estos procedimientos, puede utilizarse la introducción de un ADN recombinante en protoplastos o esferoplastos como células receptoras, que se ha informado puede aplicarse a Bacillus subtilis, actinomicetos, y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Bibb, M.J., Ward, J.M. y Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Además, puede llevarse también a cabo la transformación de los microorganismos mediante el procedimiento de pulsación eléctrica (JP2-207791A).
El número de copias de un gen puede aumentarse asimismo integrando copias múltiples del gen en un ADN cromosómico de un organismo. Para integrar copias múltiples de un gen en un ADN cromosómico de un microorganismo, puede llevarse a cabo la recombinación homóloga (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab., 1972) haciendo diana en una secuencia que existe en copias múltiples en un ADN cromosómico. El ADN repetitivo y las repeticiones invertidas en un extremo de un trasposón puede utilizarse como una secuencia que existe en copias múltiples en un ADN cromosómico. Alternativamente, tal como se da a conocer en EP 0 332 488 B, es posible asimismo incorporar un gen diana en un trasposón, y dejar que se transfiera de forma que copias múltiples del gen se integren en el ADN cromosómico. Además, un gen diana puede también incorporarse a un cromosoma huésped utilizando el fago Mu (EP 0 332 488 B).
La potenciación de la expresión de un gen diana puede obtenerse asimismo reemplazando una secuencia reguladora de la expresión, tal como un promotor del gen diana, en un ADN cromosómico o en un plásmido con uno más fuerte, tal como se da a conocer en WO00/18935. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor pL y así sucesivamente, se conocen como promotores intensos. Además, también es posible introducir varias sustituciones nucleótidas en una región promotora de un gen, de forma que el promotor sea más potente. Puede realizarse la sustitución de la secuencia reguladora de la expresión de la misma forma, por ejemplo, que una sustitución génica, utilizando un plásmido termo sensible. Los ejemplos de un vector que posee un origen de replicación termosensible para Escherichia coli o Pantoea ananatis incluyen el plásmido pMAN997 que se describe en WO99/03988 y así sucesivamente. Además, la sustitución de una secuencia reguladora de la expresión puede llevarse a cabo utilizando la recombinasa Red del fago λ (Datsenko, K.A., PNAS, 97(12), 6640-6645, 2000). La modificación de una secuencia reguladora de la expresión, puede combinarse con el aumento de un número de copias del gen.
Los ejemplos de microorganismos modificados mediante el procedimiento tal como se describe anteriormente, de forma que la expresión del gen de la citrato sintasa, del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y/o del gen de la glutamato deshidrogenasa, son potenciadas, incluyen los microorganismos que se dan a conocer en la patente US nº 6.197.559, US nº 6.331.419 y las publicaciones de patentes europeas 0 999 282 y 1 078 989.
La modificación de un microorganismo para impartir la capacidad de producir el ácido L-glutámico puede obtenerse potenciando la actividad de la 6-fosfogluconato deshidratasa o la actividad de la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa. Los ejemplos de microorganismos modificados de forma que la expresión de estos genes se potencie, incluyen los microorganismos que se dan a conocer en la publicación de patente europea EP 1 352 966.
La modificación de un microorganismo para impartir la capacidad de producción del ácido L-glutámico puede obtenerse reduciendo o inactivando la actividad de una enzima que cataliza una reacción en una ramificación de la vía biosintética del ácido L-glutámico, y que produzca un compuesto distinto al ácido L-glutámico. Los ejemplos de enzimas que catalizan una reacción en una ramificación de la vía biosintética del ácido L-glutámico, y que produzcan un compuesto distinto al ácido L-glutámico incluyen la 2-oxoglutarato
deshidrogenasa,
isocitrato liasa, fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa,
acetohidroxiácido
sintasa, acetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato
deshidrogenasa,
glutamato descarboxilasa, 1-pirrolín deshidrogenasa, y así
sucesivamente. De estas enzimas, resulta preferido reducir o eliminar la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa.
Para reducir o inactivar las actividades de las enzimas anteriormente mencionadas, pueden introducirse mutaciones mediante procedimientos de tratamiento mutagénico habitual, o de ingeniería genética, para reducir o inactivar las actividades intracelulares enzimáticas. Los ejemplos de procedimientos de tratamiento mutagenético incluyen la irradiación con rayos X o ultravioletas, el tratamiento con un agente mutagenético tal como la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, y así sucesivamente. La mutación puede introducirse en una región codificante o en una región reguladora de la expresión, tal como un promotor. Los ejemplos de técnicas de ingeniería genética incluyen la recombinación genética, transducción, fusión celular, y así sucesivamente.
La actividad intracelular de la enzima diana y el grado de disminución en la actividad, pueden confirmarse midiendo la actividad enzimática, utilizando un extracto celular o una fracción purificada suya, obtenida a partir de una cepa candidata, y comparándolo con la actividad de una cepa de tipo salvaje o no modificada. Por ejemplo, la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa puede medirse mediante el procedimiento de Reed et al (Reed L.J. y Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, págs 55-61, 1969).
Los procedimientos para inactivar o reducir la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa en las bacterias Escherichia se dan a conocer en las patentes US nº 5.378.616, US nº 5.573.945 A, y así sucesivamente. Un procedimiento para inactivar o reducir la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa en las bacterias corineformes se da a conocer en WO95/34672. Además, un procedimiento para inactivar o reducir la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa en las bacterias Pantoea se da a conocer en la patente US nº 6.331.419.
Los ejemplos específicos de bacterias que tienen reducida o eliminada la actividad de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa incluyen las siguientes cepas:
Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853) Escherichia coli AJ12628 (FERM BP-3854)
Escherichia coli AJ12949 (FERM BP-4881) Brevibacterium lactofermentum ΔS strain (WO95/34672). Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207 EP 1 078 989 A) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615 Patente US nº 6.331.419) Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646) Klebsiella platicola AJ13410 (FERM BP-6617 Patente US nº 6.197.559)
La cepa SC17sucA es una cepa remediadora plasmídica procedente de la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, poseyendo un número privado de AJ417 y que se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566) el 26 de febrero de 2004, asignándole un número de registro de FERM BP-08646.
<Potenciación de la expresión del gen yhfK>
El microorganismo de la presente invención puede obtenerse modificando un microorganismo que tiene la capacidad de producir ácido L-glutámico, tal como los anteriormente mencionados, de forma que se potencie la expresión del gen yhfK. Alternativamente, la expresión del gen yhfK puede, en primer lugar, potenciarse, seguido por la impartición de una capacidad productora del ácido L-glutámico. Además, el microorganismo de la presente invención puede ser un microorganismo provisto de la capacidad productora del ácido L-glutámico, potenciando la expresión del gen yhfK.
La expresión del gen yhfK puede potenciarse potenciando la expresión del gen endógeno yhfK mediante la modificación de una secuencia reguladora de la expresión, tal como un promotor, o introduciendo exógenamente el gen yhfK utilizando un plásmido o similar. Esas técnicas pueden combinarse.
La potenciación de la expresión del gen yhfK puede confirmarse midiendo la cantidad de ARN transcrito a partir del gen yhfK en la bacteria de la presente invención mediante hibridización Northern o RT-PCR. (Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001, y comparándola con la de una cepa salvaje o no modificada. La expresión del gen yhfK en el microorganismo de la presente invención se potencia más que la de una cepa de tipo salvaje o no modificado, y preferentemente no es inferior a 1,5 veces, más preferentemente no es inferior a 2 veces, y muy preferentemente no es inferior a 3 veces la (expresión) de una cepa de tipo salvaje
o no modificada.
El "gen yhfK" que se utiliza en la presente invención incluye genes derivados de la familia Enterobacteriáceas, tales como el gen yhfK de Escherichia coli, el gen yhfK de Pantoea ananatis o de un homólogo suyo. Los ejemplos del gen yhfK de Escherichia coli incluye un gen que codifica una proteína que posee la secuencia aminoácida de SEC ID nº:4 (nº de entrada de Genbank NP_417817. [gi: 16131237], preferentemente un gen que tiene la secuencia nucleótida de los nucleótidos números 201 a 2288 en SEC ID nº:3. Los ejemplos del gen yhfK derivado de Pantoea ananatis incluyen un gen que codifica una proteína que tiene la secuencia aminoácida de SEC ID nº:2, preferentemente un gen que tiene la secuencia nucleótida de los nucleótidos números 1530 a 3620 en SEC ID nº:1. El gen yhfK puede ser el gen yhfK de Shigella flexneri, representado por los nucleótidos números 230947 a 233037 del número de registro AE016992 de GenBank, y el gen yhfK de Salmonella typhimurium, representado por los nucleótidos números 4272 a 6359 del número de registro AE008859 de Genbank. Un homólogo del gen yhfK de Escherichia coli
o Pantoea ananatis se refiere a un gen que muestra una acusada similitud estructural con ambos genes yhfK y potencia la capacidad exportadora del ácido L-glutámico, así como la capacidad productora del ácido L-glutámico del microorganismo huésped. Los ejemplos del gen yhfK homólogo incluyen un gen que codifica una proteína que posee una secuencia aminoácida de SEC ID nº 10, 11 ó 12. La secuencia aminoácida de SEC ID nº:10 es una secuencia que se conserva entre la proteína YhfK de Escherichia coli (SEC ID nº:2), la proteína YhfK de Pantoea ananatis (SEC ID nº:4), y los homólogos YhfK de Shigella flexneri y Salmonella typhimurium. La secuencia aminoácida de SEC ID n:11 es una secuencia que se conserva entre la proteína YhfK de Escherichia coli y la proteína YhfK de Salmonella typhimurium. La secuencia aminoácida de SEC ID nº:12 es una secuencia que se conserva entre la proteína YhfK de Escherichia coli y la proteína YhfK de la cepa Salmonella enterica_Paratyphi.
Además, el gen yhfK puede clonarse a partir de una γ-proteobacteria tal como las bacterias Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia y Yersinia, una bacteria corineforme tal como Corynebacterium glutamicum y Brevibacterium lactofermentum, bacterias Pseudomonas, tales como Pseudomonas aeruginosa, bacterias Mycobacterium, tales como Mycobacterium tuberculosis o similares, basándose en la homología con respecto a los genes que se han ejemplificado anteriormente. Las secuencias aminoácidas de las proteínas codificadas por los genes yhfK de Shigella flexneri y Salmonella typhimurium tienen homologías del 99% y 86% de la secuencia aminoácida de SEC ID nº:4, respectivamente, y homologías del 70% y 71% con respecto a la secuencia aminoácida de SEC ID n:2, respectivamente. Las secuencias aminoácidas de SEC ID nº: 2 y 4 tienen una homología del 70% entre ellas. La homología de la secuencia aminoácida y la secuencia del ADN puede determinarse utilizando el algoritmo BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, y 5873 (1993)) y FASTA (Methods Enzymol., 183, y 63 (1990)), por Karlin y Altschul. El programa denominado BLASTN y BLASTX se desarrolla basándose en este algoritmo BLAST (referencias en http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Los homólogos del gen yhfK incluyen un gen derivado de otro microorganismo, que presenta una acusada homología estructural con respecto a los genes yhfK de Escherichia coli y Pantoea ananatis y que tiene la capacidad de exportación del ácido L-glutámico. El gen yhfK derivado de otro microorganismo y que se contiene en el microorganismo según la presente invención es un gen que codifica una proteína que presenta una homología del 90% o más, con respecto a la secuencia aminoácido total de SEC ID nº: 2 ó 4, y que posee la capacidad para exportar el ácido L-glutámico.
El gen yhfK puede codificar una proteína que posee una secuencia aminoácida de SEC ID n: 2 ó 4, e incluye la sustitución, deleción, inserción o adición de uno o varios residuos aminoácidos en una o más posiciones tanto como se mantenga la actividad de la proteína codificada, principalmente, la capacidad de exportación del ácido L-glutámico. El número de "varios" residuos aminoácidos al que se hace referencia en la memoria, es de 2 a 20. Dichas sustituciones de aminoácidos que contienen mutaciones funcionalmente neutras con sentido, son sustituciones que se conservan.
En el caso de aminoácidos aromáticos, las sustituciones conservadoras incluyen cuando phe, trp o tyr se reemplazan mutuamente. En el caso de los aminoácidos hidrofóbicos, las sustituciones conservadoras incluyen cuando leu, ile, val se reemplazan mutuamente. En el caso de aminoácidos polares, las sustituciones conservadoras incluyen cuando gln y asn se sustituyen mutuamente. En el caso de aminoácidos básicos, las sustituciones conservadoras incluyen cuando arg, lys, his se reemplazan mutuamente. En el caso de aminoácidos ácidos, las sustituciones conservadoras incluyen cuando asp y glu se reemplazan mutuamente. En el caso de aminoácidos que contengan grupos hidroxilos, las sustituciones conservadoras incluyen cuando ser y thr se reemplazan mutuamente. Por ejemplo, la proteína YhfK que posee la misma función, puede obtenerse introduciendo las mutaciones que provocan las sustituciones conservadoras en los residuos X de SEC ID: 10, 11, 12, basados en la secuencia de tipo salvaje. Dicha sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora que incluye la sustitución de ser o thr por ala, la sustitución de gln, his o lys por arg, la sustitución de glu, gln, lys, his o asp por asn, la sustitución de asn, glu, o gln, por asp, la sustitución de ser o ala por cys, la sustitución de asn, glu, lys, his, asp o arg por gln, la sustitución de gly, asn, gln, lys o asp por flu, la sustitución de pro por gly, la sustitución de asn,lys, gln, arg o tyr por his, la sustitución de leu, met, val, o phe por ile, la sustitución de ile, met, val o phe por leu, la sustitución de asn, glu, gln, his o arg por lys, la sustitución de ile, leu, val o phe por met, la sustitución de trp, tyr, met, ile o leu por phe, la sustitución de thr o ala por ser, la sustitución de ser o ala por thr, la sustitución de phe o tyr por trp, la sustitución de his, phe
o trp por tyr, y la sustitución de met, ile o leu por val (ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMTHERAPY, julio del 2002, Vol. 146, nº7, páginas 2208-2218).
Además, la degeneración genética del gen yhfK es distinta de la cepa huésped en la que el gen yhfK se introduce, y los codones del gen yhfK pueden cambiar a codones que se utilizan frecuentemente en cada cepa huésped. El gen yhfK puede ser un gen que codifique una proteína que tenga una secuencia aminoácida de la proteína YhfK que incluya la adición o deleción de, por lo menos, un residuo aminoácido en el extremo N y /o en el extremo C de la secuencia. En este caso, aunque el número de residuos aminoácidos que van a añadirse o someterse a deleción en el extremo N y/o en el extremo C no está particularmente limitado a tanto cuanto se mantenga la capacidad para exportar el ácido L-glutámico, pueden ser no más de 50, preferentemente no más de 20, más preferentemente no más de 10, siendo particularmente preferido no más de 5.
Los genes que codifican el homólogo del gen yhfK pueden obtenerse modificando la secuencia nucleótida conocida en SEC ID nº:1 ó 3, o SEC ID nº 10, 11, 12, mediante, por ejemplo, mutagénesis puntual, de forma que dicha sustitución, deleción, inserción o adición del residuo o residuos aminoácidos se incluya en un sitio específico de la proteína codificada. Además, dicho gen puede también obtenerse mediante un tratamiento mutacional conocido convencionalmente. Ejemplos de tratamiento mutacional incluyen el tratamiento in vitro con hidroxilamina, de un gen que posee la secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:1 ó 3, y tratando a un microorganismo, por ejemplo, una bacteria Escherichia, que aloje el gen, mediante irradiación con rayos ultravioleta, o un agente mutagénico que se utilice en típicos tratamiento mutacionales tales como la N-metil-N'nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o EMS (etil metanosulfonato). La mutación para la sustitución, deleción, inserción, adición, inversión o similares de los residuos aminoácidos que se describe anteriormente, incluye asimismo una mutación que se presenta naturalmente que proviene de la diferencia individual y la diferencia en las especies de microorganismos que albergan el gen yhfK (mutante o variante). Puede confirmarse si estos genes codifican una proteína que tiene la capacidad exportadora del ácido L-glutámico expresando los genes, por ejemplo, en una célula apropiada y determinando si aumentó la cantidad de ácido L-glutámico que se ha exportado al medio.
El gen yhfK consistir también en un ADN capaz de hibridizarse con un ADN que posea la secuencia nucleótida de los números 1530 a 3620 en SEC ID nº:1, un ADN que tenga la secuencia nucleótida de los números 201 a 2288 en SEC ID nº:3, o una sonda que puede prepararse a partir de estas secuencias, bajo condiciones estrictas y que codifique una proteína que posea la capacidad de exportación del ácido L-glutámico. La instrucción de las secuencias del ADN mediante hibridización, puede encontrarse por un experto en la materia, en el Manual titulado "the DIG System Users Guide for Filter Hybridization" producido por Boehringer Mannhein GmbH.
"Condiciones estrictas", tal como se utiliza en la presente memoria, son condiciones bajo las cuales se forma un híbrido denominado específico, y no se forma un híbrido no específico, es decir, aquellas condiciones bajo las cuales los ADN se hibridizan entre ellos a una concentración salina con un lavado típico de la hibridización Southern, es decir, lavando sólo una vez o preferentemente 2-3 veces bajo 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68ºC.
En la presente invención, puede asimismo utilizarse una secuencia parcial del gen yhfK. Dicha sonda puede prepararse mediante PCR, utilizando oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia nucleótida del gen yhfK de un fragmento de ADN que incluya el gen de una forma bien conocida para los expertos en la técnica. Cuando un fragmento de ADN que posee una longitud de alrededor de 300 pares de bases, se utiliza como sonda, las condiciones de lavado después de hibridización, pueden ejemplificarse mediante 2 x SSC, 0,1% SDS a 50ºC.
La potenciación de la expresión del gen yhfK puede obtenerse aumentando el número de copias del gen yhfK, modificando una secuencia reguladora de la expresión del gen yhfK, amplificando un gen que codifica un factor regulatorio que aumenta la expresión del gen yhfK, o interrumpiendo o atenuando un gen que codifique un factor regulatorio que reduzca la expresión del gen yhfK, utilizando la transformación o una técnica de recombinación homóloga.
Por ejemplo, un ADN recombinante puede prepararse uniendo un fragmento génico que contenga el gen yhfK a un vector, preferentemente un vector multicopia, que puede replicarse en el microorganismo huésped, e introduciendo el vector resultante en el microorganismo huésped.
El gen yhfK de Escherichia coli puede obtenerse, por ejemplo, mediante la PCR (reacción en cadena de la polimerasa, referencia en White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), utilizando cebadores basados en la secuencia nucleótida de SEC ID nº:3, por ejemplo, cebadores que presenten una secuencia de SEC ID nº:7 u 8, y que utilicen ADN cromosómico de Escherichia coli como matriz. El gen yhfK de Pantoea ananatis puede obtenerse mediante, por ejemplo, PCR, utilizando cebadores que estén basados en una secuencia nucleótida de SEC ID nº: 1, cebadores que tengan, por ejemplo, una secuencia de SEC ID nº: 5 ó 6, y utilizando ADN cromosómico de Pantoea ananatis como matriz. El gen yhfK de otros microorganismos puede también utilizarse, y puede obtenerse a partir de su ADN cromosómico o de la biblioteca del ADN cromosómico mediante PCR, utilizando cebadores oligonucleótidos que se basen en una secuencia de su gen yhfK o de una secuencia homóloga suya o de la proteína YhfK de distintas especies de microorganismos, o mediante hibridización utilizando un sonda oligonucleótida preparada basándose en dicha información secuencial. Puede prepararse un ADN cromosómico a partir de un microorganismo que actúa como donador del ADN, mediante, por ejemplo, el procedimiento de Saito y Miura (referencia a H. Saito y K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963). Text for Bioengineering Experiments, editado por the Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, págs 97-98, Baifukan, 1992).
Entonces, se prepara un ADN recombinante uniendo el gen yhfK a un vector ADN capaz de replicarse en el microorganismo huésped. Preferentemente, se utilizan vectores que se replican autónomamente en el microorganismo huésped.
Los ejemplos de vectores que se repliquen autónomamente en Escherichia coli incluyen pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, (pHSG y pACYC pueden obtenerse de Takara Bio), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW puede obtenerse a partir de Nippon Gene), pTrc99A (Amann et al., Gene 69:301-315 (1988), y así sucesivamente.
Los ejemplos de vectores que sean replicables autónomamente en las bacterias corineformes incluyen pAM330 (JP58-67699A), pHM1519 (JP58-77895A), pVK7 (US20030175912), y pSFK6 (JP2000-262288A). Además, puede también utilizarse un vector lanzadera replicable autónomamente tanto en Escherichia coli como en bacterias Coryneformes.
Los ejemplos de vectores que pueden replicarse autónomamente en bacterias Methylophilus incluyen RSF1010, y sus derivados tales como pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, páginas 161-167, 1986)), pMFY42 (Gene, 44, p. 53, (1990)), pRK301 y pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)).
Para preparar un ADN recombinante uniendo el gen yhfK a cualquiera de los vectores anteriormente mencionados, el vector y un fragmento que contiene el gen yhfK se digieren con enzimas de restricción y se unen entre ellos, utilizando una ligasa tal como una ligasa T4 ADN.
Para introducir un ADN recombinante preparado tal como se ha descrito anteriormente, en un microorganismo, puede utilizarse cualquier procedimiento conocido de transformación. Estos procedimientos incluyen el tratamiento de las células receptores con cloruro cálcico, de forma que se aumente la permeabilidad del ADN, utilizando células competentes preparadas a partir de las células en crecimiento, introduciendo un ADN recombinante en las células receptoras de tipo protoplástico o esferoplástico, y el procedimiento de electropulso (pulsaciones eléctricas) que se ha descrito anteriormente.
El número de copias del gen yhfK puede aumentarse también integrando copias múltiples del gen en un ADN cromosómico de un microorganismo. Para integrar copias múltiples de un gen yhfK en un ADN cromosómico, puede llevarse a cabo una recombinación homóloga haciendo que una secuencia que exista en copias múltiples haga diana en un ADN cromosómico. Puede utilizarse el ADN repetitivo y las repeticiones inversas en el extremo de un trasposón. Alternativamente, tal como se da a conocer en JP2-109985A, es posible asimismo incorporar el gen yhfK a un trasposón, y dejar que se transfiera, de forma que se integren múltiples copias del gen en el ADN cromosómico. La integración del gen yhfK en el cromosoma puede confirmarse mediante hibridización Southern, utilizando una sonda que presente una secuencia parcial del gen yhfK.
La potenciación de la expresión del gen yhfK puede alcanzarse también reemplazando una secuencia reguladora de la expresión, que incluye un promotor del gen yhfK sobre un ADN cromosómico o sobre un plásmido, con un (promotor) más intenso, tal como se describe en WO00/18935. Por ejemplo, el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor PL, y así sucesivamente, son conocidos como promotores potentes. Además, también es posible introducir varias sustituciones nucleótidas en una región promotora para el gen yhfK, de modo que el promotor sea más potente. Un procedimiento para evaluar la intensidad de los promotores y ejemplos de promotores más intensos, se dan a conocer en Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128). Además, se sabe que una secuencia espaciadora entre el sitio de unión ribosómica (RBS) y el codón de inicio de la traducción, especialmente, varios nucleótidos justo por encima del codón de iniciación, posee una gran influencia en la eficiencia traductora. Por tanto, esta secuencia puede modificarse. Las secuencias reguladoras de la expresión del gen yhfK pueden identificarse utilizando un vector para la identificación del promotor o el programa de análisis genético como GENETYX. La expresión se mejora también prolongando la duración del ARNm. Además, la actividad enzimática también aumenta previniendo la degradación de la proteína enzimática.
La expresión del gen yhfK se potencia mediante dicha sustitución o la modificación de un promotor. La sustitución de una secuencia reguladora de la expresión puede también obtenerse mediante, por ejemplo, la utilización de un plásmido termosensible. Los ejemplos de un plásmido termosensible para las bacterias Corineformes incluyen p48K y pSFKT2 (JP2000-262288A), pHSC4 (referencia a la publicación de Patente Francesa sometida a examen nº: 2667875, 1922 y JP5-7491A), y así sucesivamente. Estos plásmidos pueden replicarse autónomamente a una temperatura de por lo menos 25ºC, pero no pueden replicarse autónomamente a una temperatura de 37ºC en las bacterias Corineformes. La modificación de la secuencia reguladora de la expresión, puede combinarse con el aumento del número de copias del gen yhfK.
Para potenciar una actividad de la proteína codificada por el gen yhfK, puede introducirse en el gen yhfK una mutación que aumente una capacidad exportadora del L-aminoácido. Los ejemplos de mutaciones que aumentan la actividad de la proteína codificada por el gen yhfK (proteína YhfK), incluyen una mutación de la secuencia promotora que aumenta la transcripción del gen yhfK y de un gen yhfK que codifica la mutación regional que aumenta la actividad específica de la proteína YhfK.
El microorganismo de la presente invención es preferentemente uno en el que la capacidad exportadora del ácido L-glutámico se potencia, debido a una modificación que da lugar a una potenciación de la expresión del gen yhfK. La expresión “la capacidad de exportación del ácido L-glutámico es potenciada” utilizada en la presente memoria hace referencia a que cuando se cultiva un microorganismo que ha sido modificado para potenciar la expresión del gen yhfk la cantidad del ácido L-glutámico que se exporta en el medio por el microorganismo es superior a la de un ácido L-glutámico que se exporte a partir de una cepa no modificada, tal como una cepa parental o una cepa correspondiente de tipo salvaje. El aumento en la capacidad exportadora del ácido L-glutámico se observa determinando el aumento en la concentración del ácido L-glutámico en el medio. Además, el aumento en la capacidad exportadora del ácido L-glutámico también se observa determinando la disminución en la concentración intracelular del ácido L-glutámico después de la introducción del gen yhfK en un microorganismo. La cantidad del ácido L-glutámico exportada a partir del microorganismo de la presente invención aumenta preferentemente en un 10% o más, más preferentemente en un 20% o más, particularmente de manera preferida en un 30% o más, cuando se compara con la cantidad del ácido L-glutámico que se exporta a partir de una cepa no modificada. La "capacidad absoluta de exportación del ácido L-glutámico" de un microorganismo puede determinarse midiendo la diferencia entre las concentraciones intracelular y extracelular del ácido L-glutámico. Además, la "capacidad de exportación del ácido L-glutámico puede determinarse asimismo indirectamente midiendo la absorción celular del ácido L-glutámico marcado radioactivamente utilizando vesículas membranosas invertidas J. Biol. Chem, vol 277, nº 51, páginas 49841-49849, 2002). Por ejemplo, vesículas membranosas invertidas se preparan a partir de células en las que se introduce el gen yhfK. Entonces, el ATP u otros sustratos que proporcionan energía conductora se añaden a las vesículas, midiéndose la absorción celular del ácido L-glutámico marcado radioactivamente. Alternativamente, la "capacidad de exportación del ácido L-glutámico" puede examinarse midiendo la tasa de la reacción de intercambio entre un ácido glutámico no marcado y un ácido glutámico marcado en las células activas.
El microorganismo de la presente invención puede ser un microorganismo que tenga capacidad para causar la acumulación del ácido L-glutámico en un medio líquido a una concentración que exceda de la concentración de saturación del ácido L-glutámico cuando se cultiva bajo condiciones ácidas (a esta capacidad se alude también en adelante como la "capacidad de acumulación del ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas"). Dicho microorganismo puede ser uno que pueda presentar la capacidad de acumulación del ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas, potenciando la expresión del gen yhfK,o (puede ser) un microorganismo que posea originariamente la capacidad de acumulación del ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas.
Los ejemplos de microorganismos que poseen originariamente la capacidad de acumular el ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas incluyen la cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), la cepa AJ13356 (FERM BP-6615), la cepa AJ13601 (FERM BP-7207) (publicación de Patente europea 1 078 989) y así sucesivamente. La cepa Pantoea ananatis AJ13355 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (habitualmente, National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; 1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 19 de febrero de 1998, proporcionándole un número de registro de FERM P-16644. El depósito se convirtió entonces en un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 11 de enero de 1999, proporcionándole un número de registro de FERM BP-6614. Esta cepa se identificó como Enterobacter agglomerans cuando se aisló y depositó como la cepa Enterobacter agglomerans AJ13355. Sin embargo, se volvió a clasificar recientemente como Pantoea ananatis, basándose en la secuenciación nucleótida del 16S rARN y así sucesivamente (se hace referencia a los ejemplos que se han descrito a continuación). Aunque las cepas AJ13356 y AJ13601 que se derivan de la cepa AJ13355 se depositaron también en el depósito mencionado anteriormente como Enterobacter agglomerans, se hace referencia a las mismas de modo similar como Pantoea ananatis en la presente memoria. La cepa AJ13601 se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry el 18 de agosto de 1999, proporcionándole un número de registro de FERM P-17516. El depósito se convirtió entonces en un depósito internacional bajo las provisiones del Tratado de Budapest el 6 de julio de 2000, proporcionándole un número de registro de FERM BP-7207.
<2> Procedimiento de la presente invención para producir ácido L-glutámico.
El ácido L-glutámico puede obtenerse cultivando el microorganismo de la presente invención en un medio para obtener y causar la acumulación del ácido L-glutámico en el medio, recuperando el ácido L-glutámico a partir de éste.
Como medio utilizado para el cultivo, puede utilizarse un medio convencional que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y sales inorgánicas, y, si son necesarias, cantidades traza de nutrientes orgánicos tales como aminoácidos y vitaminas. Puede utilizarse un medio sintético o natural. La fuente de carbono y la fuente de nitrógeno que se utilicen en el medio puede ser de cualquier tipo, siempre que puedan utilizarse por una cepa para ser cultivadas.
Como fuente de carbono, pueden utilizarse sacáridos tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizado de almidón, y molasas. Además, ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido cítrico, o alcoholes como metanol y etanol, pueden utilizarse solos o combinados con otra fuente de carbono si se emplea un microorganismo que utilice estas fuentes de carbono. Como fuente de nitrógeno pueden utilizarse amoníaco, sales amónicas tales como sulfato amónico, carbonato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico y acetato amónico, sales de nitrato, y así sucesivamente. Como cantidades traza de nutrientes orgánicos, pueden utilizarse aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, nutrientes que contienen estas sustancias tales como peptona, casaminoácidos, extracto de levadura, y productos de descomposición de proteínas de soja. Cuando se utiliza una cepa mutante auxotrófica que necesita un aminoácido o similar para el crecimiento, el nutriente requerido preferentemente se suplementa. Como sales minerales, pueden utilizarse fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso y así sucesivamente.
El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo se controla preferentemente entre 20 y 45ºC, y el pH se controla preferentemente entre 3 y 9 durante el cultivo. Cuando el pH disminuye durante el cultivo, el medio puede neutralizarse añadiendo, por ejemplo, carbonato sódico o un álcali tal como gas amoníaco. Una cantidad sustancial del ácido L-glutámico se acumula en el caldo de cultivo después de 10 a 120 horas del cultivo bajo las condiciones tal como se han descrito anteriormente.
Además, el cultivo puede realizarse bajo condiciones que propicien que el ácido L-glutámico precipite. Las condiciones bajo las que el ácido L-glutámico precipita incluyen condiciones ácidas, por ejemplo, condiciones de pH entre 5,0 y 4,0, preferentemente de 4,5 a 4,0, más preferentemente de 4,3 4,0, particularmente de modo preferente un pH de 4,0.
Después de que el cultivo ha finalizado, el ácido L-glutámico puede recuperarse a partir del caldo de cultivo mediante procedimientos conocidos de recuperación. Por ejemplo, el ácido L-glutámico puede recuperarse concentrando el caldo de cultivo a partir del cual se han eliminado las células y cristalizando el ácido L-glutámico, o aislando el ácido L-glutámico mediante cromatografía de intercambio iónico o similar. Cuando el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones que precipitan el ácido L-glutámico, el precipitado de ácido L-glutámico en el medio puede recuperarse mediante centrifugación, filtración o similares. En este caso, es posible asimismo cristalizar posteriormente el ácido L-glutámico que se disuelve en el medio y recuperar entonces el ácido L-glutámico.
EJEMPLOS
En adelante, la presente invención se explicará con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos.
EJEMPLO 1
<Rastreo del gen que exporta al ácido L-glutámico>
El rastreo del gen que exporta el ácido L-glutámico se llevó a cabo de la manera siguiente. Ya que el ácido L-glutámico se convierte en una etapa en un intermediario del ciclo del ácido tricarboxílico, 2-oxoglutarato, mediante la glutamato deshidrogenasa, se espera que el ácido L-glutámico que fluye a las células bajo condiciones ácidas, se metabolice fácilmente en muchos microorganismos que poseen la glutamato deshidrogenasa y el ácido del ácido tricarboxílico. Alternativamente, una cepa en la que el gen de la 2-oxoglutarato deshidrogenasa se interrumpe, muestra sensibilidad al ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas. En este ejemplo, utilizando la cepa SC17sucA de Pantoea ananatis (JP2001-333769A) como una cepa deficiente en 2-oxoglutarato deshidrogenasa, se intentó obtener un gen exportador del ácido L-glutámico basado en la resistencia al ácido L glutámico bajo condiciones ácidas.
Se extrajo el ADN cromosómico a partir de la cepa AJ13355 de Pantoea ananatis de una forma convencional, y se sometió a digestión parcial con la enzima de restricción Sau3AI. Entonces, se preparó una biblioteca plasmídica recuperando e introduciendo fragmentos que tenían una longitud de aproximadamente 10 kb en el sitio BamHI de pSTV28 (Takara Bio). Esta biblioteca plasmídica se introdujo en la cepa SC17sucA mediante electroporación de una forma convencional. La cepa S17sucA, una cepa a partir de la cual se puede obtener la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, posee un número privado de AJ417 y se depositó en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy Trade and Industry (1 1-3, Higashi Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, el 26 de febrero de 2004, proporcionándole un número de registro de FERM BP-08646.
La cepa SC17sucA que contenía la biblioteca plasmídica, tal como se ha descrito anteriormente, se seleccionó en una placa de medio L (medio que contenía 10 g de Bacto tryptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar por 1 l de agua pura, pH 7,0), se mezcló con ingredientes de medio mínimo (0,5 g de glucosa, 2 mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico por 1 l de agua pura), basándose en la resistencia al cloranfenicol, obteniéndose 4,33 x 105 colonias transformantes. Estas 4,33 x 105 transformantes se sembraron sobre un medio mínimo con un pH ajustado de 4,5. Los transformantes contienen una alta concentración de ácido glutámico donde la cepa SC17sucA no puede formar colonias. Específicamente, los transformantes se sembraron en un medio que comprende cada componente del medio mínimo, 30 g/l de ácido L glutámico, y 100 mg/l de cada uno de clorhidrato de L-lisina, DL-metionina y ácido ε-diaminopimélico, y glucosa y sacarosa como fuentes de carbono, ajustándose al pH de 4,5.
Los transformantes se cultivaron a 34ºC durante 3 días, y se analizó cada gen que se había insertado en el vector que se había introducido en las células contenidas en las colonias. Se extrajeron los plásmidos a partir de cada biblioteca y se trataron con enzimas de restricción para confirmar los tamaños del gen insertado. Como resultado, 15 de los 16 clones que se obtuvieron a partir del medio mínimo con sacarosa como fuente de carbono, mostraron el mismo patrón de tratamiento con enzimas de restricción. Un plásmido que mostraba el mismo patrón de tratamiento con enzimas de restricción se obtuvo también a partir de 11 clones que aparecieron en el medio mínimo con glucosa como fuente de carbono. El plásmido se denominó biblioteca plasmática Lib10.
Entonces, una cepa control SC17sucA y una cepa SC17sucALib10 que contenía la biblioteca plasmídica Lib10 se cultivaron cada una en un medio líquido preparado añadiendo 30 g/l de ácido L-glutámico, 100 mg/l de cada uno de lisina, metionina y ácido diaminopimélico al medio mínimo (medio que contenía 0,5 g de glucosa o sacarosa, 2 mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico en 1 l de agua pura), ajustándose el pH a 4,5. Se examinó el crecimiento de las cepas en el medio mínimo que contenía altas concentraciones de ácido L glutámico bajo condiciones ácidas.
Los resultados se muestran en la figura 1. Se encontró que el crecimiento de la cepa SC17sucALib10 que contenía la biblioteca plasmídica Lib10 mejoraba de forma notable, comparado con SC17sucA en presencia de altas concentraciones de ácido Lglutámico bajo condiciones ácidas. De acuerdo con esto, se determinó que Lib10 contiene un gen que confiere resistencia al ácido L glutámico bajo condiciones ácidas, y por tanto, se decidió determinar la secuencia nucleótida del gen contenido en Lib10 y estimar la función de la proteína codificada por el gen.
Las secuencias nucleótidas se determinaron de una forma convencional y se compararon con los genes registrados en Genbank con respecto a la homología. Como resultado, se encontró que esta región contiene genes que poseen homología con una parte de yhfK (AE 000411.1:9304...11394) de Escherichia coli MG1655. Pero la función de yhfK es desconocida.
EJEMPLO 2
<Efecto de la amplificación del gen yhfK>
A causa de que se sugirió que yhfK podría codificar un portador basándose en la búsqueda de motivos proteicos (K. Mol. Microbiol. Biotechnol., 2(2):195-198, 2000), se decidió examinar el efecto de la amplificación del gen yhfK entre los genes anteriormente mencionados.
El fragmento del gen yhfK se amplificó mediante PCR utilizando los oligonucleótidos yhfK F1 e yhfK R2, que tienen secuencias nucleótidas representadas en SEC ID nº: 5 y 6, respectivamente, y pertenecen a un ADN cromosómico de una cepa de tipo salvaje de Pantoea ananatis, nº 359 (AJ13355). pGEM-yhfK se preparó uniendo el fragmento obtenido a un vector de clonación TA, pGEM-Teasy (Promega). pGEM-yhfK se sometió a digestión con EcoRI y se unió a pSTV28 digerido por EcoRI (Takara Bio), para construir un vector pSTV-yhfK para la amplificación del gen yhfK. El esquema de la construcción del plásmido se muestra en la figura 2.
El vector pSTV-yhfK para la amplificación del gen yhfK y un plásmido de control, pSTV28, se introdujeron cada uno en la cepa SC17sucA mediante electroporación, y se seleccionaron los transformantes que mostraban resistencia al cloranfenicol. Se aislaron los plásmidos obtenidos y se confirmó la presencia de pSTV-yhfK. La cepa amplificada yhfK se denominó SC17sucA/pSTV-yhfK, y la cepa introducida PSTV de control se denominó SC17sucA/pSTV28.
SC17sucA y SC17sucA/pSTV-yhfK se sembraron en un medio preparado añadiendo 30 g/l de ácido L glutámico, 100 mg/l de cada uno de lisina, metionina y ácido diaminopimélico al medio mínimo (medio que contenía 0,5 g de glucosa o sacarosa, 2 mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico en 1 l de agua pura), ajustándose el pH a 4,5 con amoníaco acuoso, analizándose el crecimiento de estas cepas. Mientras que SC17sucA no pudo formar colonias, SC17sucA/pSTV-yhfK formó colonias sobre el medio mínimo que contenía altas concentraciones del ácido L-glutámico.
Entonces, las cepas se cultivaron en un medio líquido que se preparó añadiendo 30 g/l de ácido L-glutámico, 100 mg/l de cada uno de clorhidrato de L-lisina, DL metionina y ácido .. diaminopimélico al medio mínimo, (medio que contenía 0,5 g de glucosa o sacarosa, 2mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico en 1 l de agua pura), ajustándose el pH a 4,5 con amoníaco acuoso. El crecimiento en el medio mínimo que contenía altas concentraciones de ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas, se examinó entonces. Los resultados se muestran en la figura 3.
El crecimiento de la cepa SC17sucA/pSTV-yhfK mejoró, comparado con la cepa de control SC17sucA/pSTV28, como en el caso en el que se introdujo Lib10 y por, tanto, se reveló que el gen yhfK impartió el fenotipo de la resistencia al ácido L-glutámico bajo condiciones ácidas comparado con la cepa SC17sucA.
5
10
15
20
25
30
35 -22
EJEMPLO 3
<Efecto de la amplificación del gen yhfK en la producción de ácido L glutámico a pH neutro>
Entonces, para examinar el efecto de este gen en la producción de ácido L glutámico, el plásmido para la amplificación de yhfK, pSTV-yhfK, se introdujo en la bacteria SC17sucA/RSFCPG productora de ácido L glutámico, que contiene RSFCPG, un plásmido para la producción del ácido L-glutámico que tiene una secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:9 (publicación de Patente europea 1 078 989).
El plásmido pSTV-yhfK y el plásmido de control pSTV29 (Takara Bio) se introdujeron cada uno en SC17sucA/RSFCPG mediante electroporación, y los transformantes se seleccionaron basándose en la resistencia al cloranfenicol. Después de confirmar la presencia de los plásmidos, la cepa que contenía el plásmido para la amplificación de yhfK se denominó SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK, y la cepa de control que contenía pSTV29 se denominó SC17sucA/RSFCPG+pSTV29.
Entonces, se examinó la capacidad productora del ácido L glutámico cultivando la SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK y el control SC17sucA/RSFCPG+pSTV29, siendo la composición del medio la expuesta a continuación:
[Composición del medio de cultivo]:
Sacarosa 50 g/l MgSO4·7 H2O 0,4 l KH2PO4 2,0 g/l Extracto de levadura 4,0 g/l FeSO4.·7H2O 0,01 g/l MnSO4.·5 H2O 0,01 g/l Clorhidrato de L-lisina 0,4 g/l DL-metionina 0,4 g/l ácido ε-diaminopimélico 0,4 g/l Clorhidrato de tetraciclina 25 mg/l Cloranfenicol 25 mg/l
SC17sucA/RSFCPG+pSTV29 y SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK se precultivaron en el medio L (medio que contenía 10 g de Bacto triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar por 1 l de agua pura, pH 7,0), se mezclaron con ingredientes del medio mínimo (0,5 g de sacarosa, 2 mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico en 1 l de agua pura), 25 mg/l de cloranfenicol y 12,5 mg/l de tetraciclina, y las células que se recuperaron de una placa entera se inocularon en un fermentador y se cultivaron a 34ºC, pH 6,0 bajo aireación de 1/1 vvm con agitación controlada, de forma que la concentración de oxígeno fuera el 5% o más.
Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se encontró que la acumulación de ácido L-glutámico causada por la cepa yhfK amplificada SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK, aumentó en alrededor de 3 g/l, es decir, alrededor del 5% en términos del rendimiento por
azúcar, comparado con SC17sucA/RSFCPG+pSTV29. Tabla 1 Efecto de la amplificación del gen yhfK bajo condiciones neutras
OD 620 nm (x1/101)
Ácido L-glutámico (g/l)
SC17sucA/RSFCPG+pSTV29
0,381 22,6
SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK
0,351 25,4
EJEMPLO 4
10 <Efecto de la amplificación del gen yhfk de Escherichia coli y la producción de ácido L glutámico bajo condiciones ácidas>
Entonces, el gen yhfK de Escherichia coli se introdujo en la cepa 15 SC17sucA/RSFCPG de Pantoea ananatis, y se examinó el efecto de la introducción.
Se llevó a cabo la PCR, utilizando los oligonucleótidos que presentaban una
secuencia nucleótida que se muestra en SEC ID nº:7 y 8, diseñada basándose en la
secuencia de yhfK de Escherichia coli registrada en GeneBank como NC000913 (SEC ID
20 nº:3) y el ADN cromosómico de la cepa W3110 de Escherichia coli (ATCC 27325) se utilizó como matriz, obteniéndose un fragmento de alrededor de 2,4 kb que contenía el gen yhfK. Este fragmento se trató con EcoRI y PstI y se unió a pSTV29 (Takara Shuzo), que se había digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido obtenido para la amplificación de yhfK de Escherichia coli se denominó plásmido pSTV-EcoyhfK. El
25 esquema de construcción se muestra en la figura 2.
El plásmido obtenido pSTV-EcoyhfK se introdujo en la cepa SC17sucA/RSFCPG
mencionada anteriormente mediante electroporación, y se seleccionaron los
transformantes basándose en la resistencia al cloranfenicol. La cepa que se obtuvo de
30 Escherichia coli con el gen yhfK amplificado se denominó SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK.
Entonces, se produjo el ácido L-glutámico utilizando esta cepa. Es decir, se cultivaron las cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK, SC17sucA/RSFCPG+pSTV
35 EcoyhfK y la cepa de control SC17sucA/RSFCPG+pSTV29, y se examinó su capacidad de producción del ácido L-glutámico. El cultivo se llevó a cabo en dos etapas, es decir, el cultivo de la siembra para la formación celular y el cultivo principal para la producción del ácido L-glutámico.
40 El cultivo de la siembra se llevó a cabo utilizando un medio que tenía la siguiente composición:
[Composición del medio de cultivo de la siembra]
Sacarosa 50 g/l MgSO4·7 H2O 0,4 g/l
5
10
15
20
-24
GD113 0,1 ml/l (NH4)2SO4 4 g/l KH2PO4 2,0 g/l Extracto de levadura 4,0 g/l FeSO4·7H2O 0,01 g/l MnSO4·5 H2O 0,01 g/l Clorhidrato de L-lisina 0,4 g/l DL-metionina 0,4 g/l ácido ε-diaminopimélico 0,4 g/l Clorhidrato de tetraciclina 12,5 mg/l Cloranfenicol 25 mg/l
La cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTV29, la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK y la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK se precultivaron en el medio L (medio que contenía 10 g de Bacto tryptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua pura, pH 7,0), se mezclaron con ingredientes del medio mínimo (0,5 g de glucosa, 2 mM sulfato magnésico, 3 g de fosfato monopotásico, 0,5 g de cloruro sódico, 1 g de cloruro amónico y 6 g de fosfato disódico en 1 l de agua pura), 25 mg/l de cloranfenicol y 12,5 mg/l de tetraciclina, y las células que se recuperaron de una placa entera se inocularon en un fermentador y se cultivaron a 34ºC, pH 6,0, durante 14 horas, bajo aireación de 1/1 vvm con agitación controlada, de forma que la concentración de oxígeno fuera del 5% o más. El pH se controló a 6,0 añadiendo gas amoníaco durante el cultivo. El cultivo de la siembra se continuó hasta que el azúcar se agotó en el medio. Entonces, se llevó a cabo el cultivo principal en un medio que tenía la composición siguiente:
[Composición del principal medio de cultivo (se añaden las concentraciones después del 20% del medio del cultivo de siembra)]
Sacarosa 50 g/l
(NH4)2SO4 5,0 g/l
GD113 0,4 g/l
MgSO4·7 H2O 0,1 ml/l
Extracto de levadura 6,0 g/l
KH2PO4 6,0 g/l
NaCl 1,5 g/l
MnSO4·5 H2O 0,02 g/l
Clorhidrato de L lisina 0,02 g/l
DL metionina 0,8 g/l
Ácido .. diaminopimélico 0,6 g/l
Clorhidrato de tetraciclina 0,6 g/l
Cloranfenicol 12,5 mg/l
FeSO4.7H2O 25 mg/l
Cloruro cálcico dihidrato 0,75 g/l
Pantotenato cálcico 12 mg/l (añadido únicamente para el cultivo con
la adición del ácido pantoténico)
Las células que se obtuvieron en un volumen de 60 ml se añadieron a un minirrecipiente de un 1 l de volumen que contenía 240 ml del medio y se cultivaron a pH 4,7. Después de que se consumieran 50 g/l de sacarosa, que se contenían en el medio de cultivo principal, se suministraron, mediante una bomba, 700 g/l (peso/vol) de una solución de sacarosa (esterilizada mediante el autoclave) para controlar la concentración del azúcar de 5 a 20 g/l en el pequeño tanque de fermentación.
5
Los resultados se muestran en la Tabla 2. El cultivo principal se finalizó después de que el cultivo durara lo mismo para todas las cepas. Tanto para la cepa SC17SucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK, en la que el gen yhfK de la bacteria Escherichia se amplificó, como la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTV yhfK, en la que el gen yhfK de
10 Pantoea ananatis se amplificó, la producción del ácido L-glutámico aumentó de forma notable, y la tasa de consumo del azúcar fue más alta que comparada con las obtenidas con la cepa de control SC17sucA/RSFCPG+pSTV29. Así, se encontró que la amplificación del gen yhfK ejerció un efecto de mejora en el crecimiento en el cultivo de producción del ácido L-glutámico, además de un efecto de mejora en la producción del ácido L-glutámico.
15 Tabla 2
Resultados para la cepa amplificada por el yhfK derivada de Pantoea ananatis y de la cepa amplificada por el yhfK derivada de Escherichia coli bajo condiciones ácidas (cultivo 20 principal).
SC17sucA/ RSFCPG+ pSTV29
SC17sucA/ RSFCPG+ pSTV-yhfK SC17sucA/ RSFCPG+ pSTV-EcoyhfK
Acumulación del ácido L-glutámico producido (g/l)
46,0 100,0 76,0
Tiempo de cultivo
29,5 29,5 29,5
EJEMPLO 5
25 <Evaluación de la capacidad exportadora del gen yhfK del ácido L-glutámico>
Se midieron las concentraciones del ácido L-glutámico en las células de las cepas amplificadas por el gen yhfK. La concentración intracelular del ácido L-glutámico se midió 30 haciendo referencia al procedimiento que se da a conocer en A. Ishizaki et al., Biotech. Teqniq., vol 9, nº 6, página 409, 1995. El medio de cultivo en un volumen de 1 ml, se añadió a un tubo de ensayo de 1,5 ml, que contenía 500 µl de aceite de silicona, y se centrifugó inmediatamente durante 3 minutos a 15.000 rpm en un centrifugador. Entonces, el fondo del tubo de ensayo se seccionó, y las células se recuperaron. Las células se 35 situaron en un tubo de ensayo de 2 ml, que contenía 200 µl de 5N ácido perclórico y se almacenó a -80ºC antes de la medición. Esta solución de ácido perclórico que contenía las células se descongeló a temperatura ambiente, se suspendió y se neutralizó añadiendo 200 µl de 2,5 M de carbonato potásico. Los precipitados se eliminaron mediante centrifugación, y entonces se midió la concentración del ácido L glutámico en el
40 sobrenadante como una concentración intracelular de ácido L-glutámico.
Los resultados se muestran en la figura 4. El eje horizontal indica la concentración extracelular del ácido L-glutámico, y el eje vertical indica la concentración intracelular del
ácido L glutámico. Se reveló que, mientras que la concentración intracelular de ácido L-glutámico era más alta que la concentración extracelular de ácido L-glutámico en la cepa de control SC17sucA/RSFCPG+pSTV29, la concentración intracelular del ácido L-glutámico era más baja que la concentración extracelular del ácido L-glutámico en 5 SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK y SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK. Estos resultados indican que las cepas amplificadas por el gen yhfK tales como SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoyhfK y SC17sucA/RSFCPG+pSTV-yhfK llegaron a ser más parecidas para exportar el ácido L-glutámico intracelular al exterior de las células. Además, se encontró que el gen yhfK es un gen que codifica una proteína exportadora del
10 ácido L-glutámico que puede exportar ácido L-glutámico intracelular al exterior celular.
EJEMPLO 6
15 <Evaluación de la capacidad productora del ácido L-glutámico de Escherichia coli en la que el gen yhfK es amplificado>
Entonces, el gen yhfK derivado de Pantoea ananatis se introdujo en Escherichia coli, y se examinó el efecto de la amplificación del gen. 20
El vector mencionado anteriormente para la amplificación del gen yhfK derivado de Pantoea ananatis, pSTV-yhfK, y el plásmido de control pSTV29, se introdujeron cada uno en la cepa Escherichia coli de tipo salvaje, W3110, mediante electroporación y los transformantes que mostraban resistencia al cloranfenicol, se seleccionaron. La cepa
25 amplificada por yhfK, se denominó W3110/pSTV-yhfK, y la cepa de control pSTV29 introducida se denominó W3110/pSTV29.
Entonces, la cepa W3110/pSTV-yhfK y la cepa de control W3110/pSTV29 se cultivaron, y se examinó su capacidad para producir ácido L-glutámico. La cepa 30 W3110/pSTV-yhfK y la cepa control W3110/pSTV29 se precultivaron respectivamente en el medio L (medio que contenía 10 g de Bacto tryptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua pura, pH 7,0), se mezclaron con cloranfenicol, y un asa de inoculación de células se inoculó en 5 ml de medio que tenía la composición siguiente, utilizando un asa de inoculación de de un volumen de 1 µl proporcionado por
35 Nunc, y que se cultivó a un pH de 7,0 y a 34ºC durante 16 horas con agitación.
[Composición del medio mínimo]
Glucosa 40 g/l MgSO4·7 H2O 1,0 g/l (NH4)2SO4 20 g/l KH2PO4 1,0 g/l Extracto de levadura 1,0 g/l FeSO4·7H2O 0,01 g/l MnSO4·5 H2O 0,01 g/l Cloranfenicol 25 mg/l Carbonato cálcico (ajustar a pH 7,0) 30 g/l
Tabla 3 Efecto de la introducción del vector para la amplificación del gen yhfK derivado de la bacteria Pantoea en la bacteria Escherichia coli
Acumulación de ácido Azúcar
OD620 (*1/51) Rendimiento (%)
16 h L-glutámico (g/l) residual (g/l)
W3110 pSTV29 0,502 1,4 5,0 3,0
W3110 pSTV-yhfK 0,448 4,6 6,5 11,8
El rendimiento del ácido L-glutámico aumentó de forma notable en la cepa
W3110/pSTV-yhfK que tenía un gen yhfK amplificado de Pantoea ananatis, comparado
con la cepa de control W3110/pSTV29.
10
EJEMPLO 7
<Producción del ácido L-glutámico mediante la cepa ATCC13869 de las bacterias 15 corineformes, o mediante un derivado de ATCC13869 que se amplifica con el gen yhfK>
El gen yhfK puede clonarse a partir de un ADN cromosómico de la familia
Enterobacteriáceas tal como E. coli o P. ananatis. Basándose en la secuencia nucleótida
que se describe en SEC ID nº: 1 ó 3, y utilizando los cebadores que se muestran en SEC
20 ID nº:5 y nº:6, o SEC ID nº: 7 y nº:8, el gen yhfK puede amplificarse. El fragmento PCR obtenido que contiene el gen yhfK se trata con endonucleasa de restricción, y el ADN tratado se inserta en el vector lanzadera pVK7 de la Corineforme E. coli, que es un derivado de pCG1 (Patente US nº 4.617.267). Así, se obtiene el plásmido pVK7yhfK. La transformación de la cepa corineforme productora del ácido L-glutámico con el plásmido
25 pVK7yhfK puede llevarse a cabo mediante un procedimiento ordinario para obtener la cepa que contiene el gen yhfK amplificado. Por ejemplo, una cepa tal como el Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo salvaje, la cepa modificada para aumentar las actividades de la citrato sintasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa y glutamato deshidrogenasa, o para disminuir la actividad de la α cetoglutarato deshidrogenasa,
30 podrían utilizarse como productoras de L glutamato de las corinebacterias con un gen yhfK amplificado.
La cepa yhfK amplificada puede crecer durante 18-24 horas en placas CMDX (5g/l de glucosa 10 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de KH2PO4, 0,4 g/l de 35 MgSO4·H2O, 10 mg/l de FeSO4·H2O, 10 mg/l de MnSO4·4 5 H2O, 3 g/l de urea, 2 g/l (en términos de cantidad de N) de mameno, 20 g/l de agar, pH 7,5), y las células para 1/6 de cada placa pueden inocularse en 20 ml de medio (30 g/l de glucosa, 15 g/l de (NH4)2 SO4, 0,4 g/l de MgSO4·7H2O, 1 mg/l de FeSO4·7H2O, 1 mg/l de MnSO4·4 a 5 de H2O, 200 µg/l de vitamina B1, 200 µg/l de biotina, 0,48 g/l (en término de cantidad de N) de mameno, 1
40 g/matraz de CaCO3.pH 8,0) en un matraz y puede cultivarse a 31,5ºC durante 20 -40 horas con agitación. Entonces, pueden medirse las concentraciones de glucosa y ácido L-glutámico en el medio utilizando el Analizador Biotech (Sakura Seiki). Por tanto, se obtiene una cepa en la que el gen yhfK está amplificado y posee una capacidad productora de producción del ácido L-glutámico.
45
APLICABILIDAD INDUSTRIAL
Utilizando el microorganismo de la presente invención, el ácido L-glutámico puede producirse de forma eficiente. El ácido L-glutámico es útil como un material en bruto para condimentos, etc.
LISTADO DE SECUENCIAS
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<120> Microorganismo productor de ácido L-glutámico y procedimiento para la producción de ácido L-glutámico
<130> C434-C4329
<150> JP 2004-60542
<151> 2004-03-04
<160> 12
<170> PatentIn versión 3.1
<210> 1
<211> 3967
<212> ADN
<213> Pantoea ananatis
<220>
<221> CDS
<222> (1530).. (3620)
<223>
<400> 1
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<210> 2 5 <211> 697
<212> PRT
<213> Pantoea ananatis
<400> 2 10
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<210> 3
<211> 2375 5 <212> ADN
<213> Escherichia coli
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(2288)
<223>
<400> 3
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<210> 4
<211> 696
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
imagen3
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<210> 5 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 5
tcaaggcgat tttattgggt gagcttggc
29
<210> 6 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 6
ttattaatac gccagctgta ctgaatgggg
30
<210> 7 <211> 40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 7
gatcctgcag gtcaggaaat cggtcagatt gtcggctgtt
40
<210> 8 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Cebador
<400> 8
gatcgaattc aaggtggttg gggcgtaaat acgaagcatc
40
<210> 9 <211> 16214 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220> <223> Plásmido
<400> 9
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<212> PRT
<213> Artificial
<220> 10 <223> secuencia conservada
<220>
<221> MISC_FEATURE
imagen2
<222> (5), (10), (11), (27), (29) .. (31), (33), (35), (36), (62), (67), (72), (73), (76), (77), (79), (82 ) .. (85), (89), (90), (92), (93), (95), (97), (102), (104), (105), (110), (114), (115), (117), (126), (128), (131) .. (133), (135), (137), (139), (140), (147), (155), (157), (161),
(168), (174), (177), (186), (187), (198), (204), (208), (209), (220) .. (225), (228), (229),
(231), (234), (236), (258), (263), (270), (272), (273), (278), (287), (289), (290), (293),
(295), (298), (306), (310), (315), (318), (319), (332), (336), (340), (343), (347), (354),
(355), (357), (360), (362), (366), (370), (374) .. (377), (379), (386), (389), (396), (398),
5 (400), (402), (403), (405), (409), (412), (413), (415), (416), (419), (420), (423), (426) ..
(428), (430) .. (433), (436) .. (438), (440), (441), (444), (445), (447), (448), (451) .. (453),
(455), (456), (460), (461), (466), (472), (476), (480), (482) .. (484), (488), (491), (492),
(501), (502), (511), (515), (524), (526), (528), (530), (531), (533) .. (540), (543), (546),
(547), (554) .. (556), (557), (570), (571), (574), (577), (583), (595), (601), (602), (604), 10 (606), (610), (613), (614), (619), (630), (633), (635) .. (653), (659), (660), (662) .. (664),
(667), (668), (675), (678), (685), (688) .. (690), (693), (694), (696)
<223> Xaa = cualquier residuo aminoácido
15 <400> 10
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<210> 11
<211> 696
<212> PRT
<213> conservada
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10).. (696)
<223>
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10), (30), (33), (35), (72), (76), (83).. (85), (89), (80), (104), (105), (110), (117), (147), (155), (187), (198), (220), (223), (228), (231), (236), (293), (306), (310), (332), (340), (347), (355), (357), (370), (374), (382), (389), (398), (409), (412), (413), (419), (423), (428), (431), (432), (436), (437), (440), (444), (445), (453), (466), (472), (476), (482), (484), (491), (501), (524), (534), (538), (543), (556), (567), (570), (574), (601), (602), (604), (606), (610), (613), (630), (633), (637), (640), (641), (642), (644), (646), (648), (651).. (653), (662), (689), (690), (694), (696) <223> Xaa = cualquier residuo aminoácido
<400> 11
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<212> PRT
<213> conservada
<220> 10 <221> MISC_FEATURE
<222> (10), (30), (31), (33), (35), (36), (72), (76), (83), (84), (85), (89), (90), (104), (105), (110), (117), (147), (155), (187), (198), (220), (223), (228), (231), (236), (293), (306), (310), (332), (340), (347), (355), (357), (370), (374), (376), (382), (389), (398), (409), (412), (413), (419), (423), (428), (431), (432), (437), (440), (441), (444), (445), (453),
15 (466), (472), (476), (483), (484), (491), (501), (524), (534), (538), (543), (556), (567), (570), (574), (601), (602), (604), (606), (610), (613), (630), (633), (637), (640), (641), (644), (646), (648), (649), (662), (689), (690), (694), (696) <223> Xaa = cualquier residuo aminoácido
20 <400> 12
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Claims (6)

  1. Reivindicaciones
    1. Microorganismo que presenta una capacidad de producir ácido L-glutámico, en el que dicho microorganismo es modificado de manera que la expresión de un gen yhfK es potenciada aumentando el número de copias de dicho gen yhfK, o modificando una secuencia reguladora de la expresión de dicho gen yhfK, en el que dicho gen yhfK codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:
    (A)
    una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº: 2 ó 4; y
    (B)
    una proteína que comprende una secuencia aminoácida de SEC ID nº 2 ó 4, en la que dicha proteína incluye sustitución, deleción, inserción o adición de uno a 20 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico, y
    (C)
    una proteína que comprende una secuencia aminoácida que presenta el 90% o más de homología con respecto a la secuencia aminoácida total de SEC ID nº: 2 ó 4, y en el que dicha proteína presenta una capacidad para exportar ácido L-glutámico.
  2. 2. Microorganismo según la reivindicación 1, en el que dicho gen yhfK es seleccionado de entre el grupo constituido por:
    (a) un ADN que comprende una secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1 o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3; y
    b) un ADN que puede hibridizarse a la secuencia nucleótida desde el número 1530 al 3620 en SEC ID nº:1, o desde el número 201 al 2288 en SEC ID nº:3, bajo condiciones de astringencia que comprenden el lavado bajo 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 68ºC y en el que dicha secuencia codifica una proteína que presenta una capacidad para exportar el ácido L-glutámico.
  3. 3.
    Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo es una γ-proteobacteria.
  4. 4.
    Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho microorganismo es una enterobacteriácea, seleccionada de entre el grupo constituido por Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, y Serratia.
  5. 5.
    Microorganismo según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho microorganismo es una bacteria Corineforme.
  6. 6. Procedimiento para producir ácido L-glutámico que comprende el cultivo de un
    -55 microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio, y la recogida de dicho ácido L-glutámico a partir de dicho medio. 5 --
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