BRPI0715711B1 - métodos para produzir ácido l-glutâmico, e para melhorar o crescimento de um micro-organismo produtor de ácido l-glutâmico sob condições ácidas - Google Patents

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO, E PARA MELHORAR O CRESCIMENTO DE UM MICRO-ORGANISMO PRODUTOR DE ÁCIDO L-GLUTÂMICO SOB CONDIÇÕES ÁCIDAS” Campo Técnico A presente invenção diz respeito a uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico e a um método para produzir ácido L-glutâmico. O ácido L-glutâmico é amplamente usado como um material bruto na produção de condimentos e assim por diante.

Fundamentos da Técnica O ácido L-glutâmico é tipicamente produzido por fermentação, utilizando-se as assim chamadas bactérias corineformes, as quais pertencem aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium, ou suas cepas mutantes (Kunihiko Akashi et al., “Amino acid fermentation”, pp. 195-215, 1986, Japan Scientific Societies Press). Os métodos para produzir ácido L-glutâmico mediante fermentação com o uso de outras cepas bacterianas incluem métodos que usam um microorganismo pertencente aos gêneros Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou coisa parecida (Patente U.S. n-3.220.929), métodos que usam um microorganismo pertencente aos gêneros Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida ou coisa parecida (Patente U.S. n- 3.563.857), métodos que usam um microorganismo pertencente aos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (correntemente referido como Enterobacter aerogenes) ou coisa parecida (Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) n2 32-9393), métodos que usam uma cepa mutante de Escherichia coli (Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI) n2 5-244970), e assim por diante. Além disso, os métodos para produzir ácido L-glutâmico com o uso de um microorganismo pertencente aos gêneros Klebsiella, Erwinia, Pantoea ou Enterobacter foram também apresentados (Patentes Japonesas Abertas ao Público n— 2000-106869, 2000- 189169 e 2000-189175). Além disso, é conhecido o fato de que a capacidade de produzir ácido L-glutâmico das bactérias Escherichia e das bactérias corineformes, pode ser melhorada mediante extinção do gene rpoS (WO 01/05939). A proteína RpoS (também conhecida como “fator sigma S”) codificada pelo gene rpoS é não apenas conhecida como um fator sigma específica da fase estacionária, mas também como um fator sigma que responde a várias espécies de estresse resultante no controle de várias expressões genéticas. Mais especificamente, o fator sigma S desempenha um papel central na aquisição de resistência a ácido, e é relatado que o índice de sobrevivência das cepas deficientes do gene rpoS dramaticamente decresce sob condições ácidas (Mol. Microbiol., julho de 1995, 17(1): 155-167). Entretanto, a maioria das pesquisas sobre a resistência a ácido nos microorganismos tipicamente se focaliza sobre o índice de sobrevivência sob condições ácidas, e não existem relatos acerca do crescimento sob condições ácidas. Além disso, o crescimento das cepas deficientes de rpoS sob condições ácidas não foi pesquisado até a presente data.

Descrição da Invenção Um objeto da presente invenção é fornecer uma bactéria que possa eficientemente produzir ácido L-glutâmico, e fornecer um método para produzir eficientemente o ácido L-glutâmico mediante o uso da bactéria.

Este objeto foi alcançado pela demonstração de que a produção da fermentação do ácido L-glutâmico foi melhorada, e o crescimento de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico sob condições ácidas foi melhorado, quando o gene rpoS, que codifica o fator sigma S da RNA polimerase, foi inativado. Assim, a presente invenção ficou completa. É um objeto da presente invenção fornecer uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico que pertença aos gêneros Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia, em que a bactéria tenha sido modificada por recombinação de genes para inativar o gene rpoS. É um outro objeto da presente invenção fornecer a bactéria como descrito acima, em que o gene rpoS é inativado pela redução da expressão do gene rpoS, ou pelo rompimento do gene rpoS. É um outro objeto da presente invenção fornecer a bactéria como descrito acima, em que o gene rpoS codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo de: (A) a proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (B) a proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, mas que inclua substituições, deleções, inserções ou adições de um ou de vários resíduos de aminoácidos e que tenha atividade do fator sigma S da RNA polimerase. É um outro objeto da presente invenção fornecer a bactéria como descrito acima, em que o gene rpoS seja selecionado do grupo consistindo de: (a) o DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: l,e (b) um DNA que seja capaz de hibridizar com uma sequência complementar à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, ou uma sonda que possa ser preparada da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes, e codifique uma proteína tendo a atividade do fator sigma S da RNA polimerase. f E um outro objeto da presente invenção fornecer um método para produzir ácido L-glutâmico, compreendendo cultivar a bactéria acima mencionada em um meio, e colher o ácido L-glutâmico do meio. É um outro objeto da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que a bactéria é cultivada em pH 3 a 5. É um outro objeto da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o ácido L-glutâmico se acumula acompanhado de precipitação no meio durante a cultura. É um outro objeto da presente invenção fornecer um método para melhorar o crescimento de um microorganismo produtor de ácido L-glutâmico sob condições ácidas, compreendendo inativar o gene rpoS do microorganismo mediante recombinação de genes. É um outro objeto da presente invenção fornecer o método como descrito acima, em que o microorganismos pertence ao gênero selecionado do grupo consistindo de Pantoea, Enterobacter, Serratia, Klebsiella ou Erwinia.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra o crescimento da cepa deficiente de rpoS sob condições ácidas. A Figura 2 mostra a OD alcançada pela cepa deficiente de rpoS sob condições ácidas. A Figura 3 mostra a quantidade de ácido L-glutâmico produzida pela cepa deficiente de rpoS sob condições ácidas.

Descrição das Formas de Realização Preferidas A presente invenção é descrita em detalhes abaixo: <1> Bactéria produtora de ácido L-glutâmico da presente invenção A bactéria da presente invenção pertence ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia, tem a capacidade de produzir ácido L-glutâmico, e foi modificada por recombinação de genes para inativar o gene spoS. A expressão “capacidade de produzir ácido L-glutâmico” refere-se à capacidade de produzir ácido L-glutâmico e causar o acúmulo do ácido L-glutâmico em um meio ou células da bactéria da presente invenção, a um grau tal que o ácido L-glutâmico possa ser coletado do meio ou das células quando a bactéria seja cultivada no meio. A capacidade de produzir ácido L-glutâmico na bactéria pode ser uma capacidade nativa, ou pode ser comunicada pela modificação da bactéria com o uso de técnicas de mutagênese ou de DNA recombinante. A bactéria da presente invenção preferivelmente cresce em um pH baixo, especialmente pH de 3 a 5.

Em particular, as bactérias Pantoea, as bactérias Erwinia e as bactérias Enterobacter são classificadas como γ-proteobactéria, e elas se situam taxonomicamente muito próximas uma da outra (J. Gen. Appl. Microbiol., dezembro de 1997, 43(6), 355-361; International Journal of Systematic Bacteriology, outubro de 1997, pp. 1061-1067). Nos anos recentes, algumas bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou coisa parecida, com base nas experiências de hibridização de DNA-DNA, etc. (International Journal of Systematic Bacteriology, julho de 1989, 39(3), pp. 337-345). Além disso, algumas bactérias pertencentes ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (referir-se ao International Journal of Systematic Bacteriology, janeiro de 1993, 43(1), pp. 162-173).

Exemplos das bactérias Enterobacter incluem, porém sem limitar, a Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Especificamente, as cepas exemplificadas na Publicação da Patente Européia n° 952221 podem ser usadas.

Uma cepa típica do gênero Enterobacter inclui a Enterobacter agglomeranses ATCC 12287.

Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem, porém sem limitar, a Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans e Pantoea citrea. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, Publicação da Patente Européia n° 0952221) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Publicação da Patente Européia n2 0952221) Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Publicação da Patente Européia n2 0952221) Embora estas cepas sejam descritas como Enterobacter agglomerans na Publicação da Patente Européia n2 0952221, elas são correntemente classificadas como Pantoea ananatis com base na análise da sequência de nucleotídeos de rRNA 16S etc., como descrito acima.

Exemplos das bactérias Erwinia incluem, porém sem limitar, a Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, e exemplos das bactérias Klebsiella incluem a Klebsiella planticola. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Erwinia amylovora ATCC 15580 Erwinia carotovora ATCC 15713 Klebsiella planticola AJ13399 (FERM BP-6600, Publicação da Patente Européia n2 955368) Klebsiella planticola AJ 13410 (FERM BP-6617, Publicação da Patente Européia n2 955368). O microorganismo da presente invenção pode ter uma capacidade de causar o acúmulo do ácido L-glutâmico em um meio líquido em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico quando cultivado sob condições ácidas (daqui por diante também referida como uma capacidade de acúmulo do ácido L-glutâmico sob condições ácidas). Esta capacidade pode ser adquirida através da inativação do gene rpoS, ou pode ser natural ao microorganismo. Além disso, a capacidade de causar acúmulo do ácido L-glutâmico em uma quantidade de exceda a concentração de saturação, pode ser comunicada, particularmente, pelo emprego de uma cepa que seja resistência ao ácido L-glutâmico em um pH baixo, como descrito na Publicação da Patente Européia n2 1078989.

Exemplos específicos de um microorganismo que tenha a capacidade de acumular ácido L-glutâmico natural sob condições ácidas incluem, porém sem limitar, a Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601 (FERM BP-7207) (quanto a estas, referir-se à Publicação da Patente Européia nâ 0952221), e assim por diante. A Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (presentemente o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Endereço: Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998, e lhe foi dado o número de acesso de FERM P-16645. O depósito foi então convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999, e lhe foi dado um número de acesso de FERM BP-6615. A cepa AJO601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) em 18 de agosto de 1999, e lhe foi dado o número de acesso de FERM P-17516. O depósito foi então convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 6 de julho de 2000, e lhe foi dado o número de acesso de FERM BP-7207.

Para comunicar ou intensificar a capacidade de produzir o ácido L-glutâmico a uma bactéria como descrito acima, a bactéria pode ser modificada para intensificar a expressão de um gene codificando uma enzima envolvida na biossíntese do ácido L-glutâmico.

As enzimas que se acham envolvidas na biossíntese do ácido L-glutâmico incluem a glutamato desidrogenase (daqui por diante também referida como “GDH”), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (daqui por diante também referida como “CS”), metilcitrato sintase (daqui por diante também referida como “PRPC”), a fosfoenolpiruvato carboxilase (daqui por diante também referida como “PEPC), piruvato desidrogenase, piruvato quinase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato quinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triosefosfato isomerase, biofosfato de frutose aldolase, fosfofructoquinase, fosfato de glicose isomerase, e assim por diante. Entre estas enzimas, uma ou mais das CS ou PRPC, PEPC e GDH são preferidas. Três destas são mais preferidas.

Daqui por diante, os métodos para modificar bactérias para intensificar a expressão de um gene alvo serão explanados. O primeiro método é mediante o aumento do número de cópias de um gene alvo. Por exemplo, o gene alvo pode ser clonado em um plasmídeo apropriado, e o plasmídeo usado para transformar uma bactéria hospedeira. Por exemplo, quando o gene codificando CS (gltA), o gene codificando PRPC iprpC), o gene codificando PEPC (ppc), ou o gene codificando GDH (gdhA) forem o gene alvo, as sequências de nucleotídeos destes genes da bactéria Escherichia e da bactéria Corynebacterium foram relatadas (Biochemistry, volume 22, pp. 5243-5249, 1983; J. Biochem., volume 95, pp. 909-916, 1984; Gene, volume 27, pp. 193-199, 1984; Microbiology, vol. 140, pp. 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet, volume 218, pp. 330-339, 1989; Molecular Microbiology, volume 6, pp. 317-326, 1992); e, portanto, estes genes podem ser obtidos por iniciadores de sintetização com base em suas respectivas sequências de nucleotídeos, e realizando a PCR com o uso do DNA cromossômico das bactérias pertencentes à família das Enterobacteriaceae como um gabarito.

Exemplos dos plasmídeos que podem ser transformados incluem os plasmídeos que são autonomamente replicáveis nas bactérias pertencentes à família da Enterobacteriaceae, por exemplo pUC 19, pUC 18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG e pSTV podem ser obtidos da Takara Bio), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (os plasmídeos da série pMW podem ser obtidos da Nippon Gene), e assim por diante. O DNA de fago pode também ser usado como um vetor, ao invés de um plasmídeo. Exemplos de plasmídeos que podem ser usados para simultaneamente reforçar as atividades de CS ou PRPC, PEPC e GDH incluem RSFCPG, que contém os genes gltA, ppc e gdhA (referir-se à Publicação da Patente Européia ns 0952221), e RSFPPG, que é obtido pela substituição do gene gltA em RSFCPG pelo gene prpC (referir-se aos exemplos).

Exemplos do método de transformação incluem tratar as células receptoras com cloreto de cálcio, de modo a aumentar a permeabilidade do DNA, o que foi relatado quanto a Escherichia coli K-12 [Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], preparar as células competentes a partir das células que estejam na fase de crescimento, seguido pela introdução do DNA nelas, o que foi relatado quanto a Bacillus subtilis [Duncan, C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)], e assim por diante. Além destes métodos, tomar as células bacterianas receptoras do DNA em protoplastos ou esferoplastos que podem facilmente absorver o DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante nas células receptoras do DNA, é um método alternativo, e que é conhecido como sendo aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras [Chang, S. e Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J. M. e Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R., Proc. Natl. Sei., USA, 75, 1929 (1978)]. Além disso, a transformação dos microorganismos pode também ser realizada pelo método do pulso elétrico (Patente Japonesa Aberta ao Público ns 2-207791).

O aumento do número de cópias de um gene alvo também pode ser obtido pela introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico de um microorganismo. De modo a introduzir cópias múltiplas de um gene no DNA cromossômico de um microorganismo, a recombinação homóloga [Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)] pode ser realizada pelo alvejamento de uma sequência que exista em múltiplas cópias no DNA cromossômico. As sequências que existem em múltiplas cópias no DNA cromossômico incluem o DNA repetitivo e as repetições invertidas que se acham presentes na extremidade de um elemento transponível. Altemativamente, como apresentado na Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985, é também possível incorporar um gene alvo em um transpóson, e transferi-lo, resultando na introdução de múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico. Além disso, o gene alvo pode também ser incorporado em um cromossoma hospedeiro com o uso do fago Um (Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2-109985). O segundo método é mediante a intensificação da expressão de um gene objetivo por substituição de uma sequência de controle de expressão do gene objetivo, tal como um promotor no DNA cromossômico ou plasmídeo, por aquele mais forte. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor PR, o promotor lacUV, e assim por diante, são conhecidos como promotores fortes. Além disso, é também possível substituir vários nucleotídeos em uma região promotora de um gene, de modo que o promotor seja fortalecido, como apresentado na Publicação da Patente Internacional WO 00/18935. A substituição da sequência de controle da expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira como na substituição do gene com o uso de um plasmídeo sensível à temperatura. Um exemplo de um vetor tendo uma origem de replicação sensível à temperatura eficaz nas bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae da presente invenção é o plasmídeo pMAN997, descrito na Publicação da Patente Internacional WO 99/03988, e assim por diante. Além disso, as cepas substituídas pelos genes podem ser facilmente selecionadas pelo uso de ácido quináldico, que é descrito mais abaixo. A modificação de uma sequência de controle da expressão pode ser feita em combinação com o aumento do número de cópias do gene, como descrito acima.

Exemplos de microorganismos que tenham sido modificados pelo método descrito acima, de modo que a expressão do gene da citrato sintase, do gene da citrato de metila sintase, do gene da fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou do gene da glutamato desidrogenase, seja intensificada, incluem os microorganismos apresentados nas publicações de Patentes Européias n25 EP 1078989, 0955368, 0952221 e 1078989, na Patente Japonesa Aberta ao Público n2 2006-129840, na Publicação da Patente Internacional n2 2006/051660 e assim por diante.

Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico também pode ser comunicada pela intensificação da atividade da 6-fosfogliconato desidratase, da atividade da 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogluconato aldolase, ou de ambas. Exemplos de microorganismos com atividades aumentadas de 6-fosfogliconato desidratase e 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogluconato aldolase, incluem os microorganismos apresentados na publicação da patente européia EP 1352966. A capacidade de produção do ácido L-glutâmico pode ser comunicada pela redução ou eliminação da atividade de uma enzima que catalise uma reação de ramificação da via da biossíntese do ácido L-glutâmico, e resulta na produção de um composto diferente do ácido L-glutâmico. Exemplos de uma tal enzima incluem as 2-oxoglutarato desidrogenase, isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato quinase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, l-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase, e assim por diante. É particularmente preferível reduzir ou eliminar a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase.

De modo a reduzir ou eliminar as atividades das enzimas acima mencionadas, as mutações podem ser introduzidas nos genes das enzimas acima mencionadas mediante técnicas típicas de mutagênese ou de engenharia genética. Os tratamentos de mutagênese incluem, por exemplo, irradiação com raios-X ou raios ultravioletas, ou tratamento com um agente de mutagênese tal como a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, e assim por diante. A mutação pode ser introduzida na região codificadora do gene que codifica a proteína enzimática, ou na região responsável pela expressão de regulação, tal como um promotor. As técnicas de engenharia genética incluem a recombinação genética, a transdução, a fusão celular, e assim por diante.

Uma redução na atividade intracelular da enzima objetivo, e o seu grau, podem ser confirmados pela medição da atividade enzimática em um extrato celular ou uma sua fração purificada obtida da capa candidata, e comparando-as com aquela de uma cepa do tipo selvagem. Por exemplo, a atividade da 2-oxoglutarato desidrogenase pode ser medida pelo método de Reed et al. [Reed, L. J. e Mukherjee, B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61 (1969)].

Especificamente, exemplos de bactéria com atividade reduzida ou eliminada de 2-oxoglutarato desidrogenase, incluem as seguintes: Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, EP1078989A) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-7207, USP 6.331.419) Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP8646, WO 2005/085419) Klebsiella planticola cepa AJ13410 (FERM BP-6617, USP 6.197.559). A cepa SC17sucA foi obtida da cepa SC 17 pelo rompimento do gene de 2-oxoglutarato desidrogenase. A cepa SC 17 foi obtida pela seleção de uma cepa mutante de baixa produção de flegma de AJ13355. A cepa AJ 13355 foi isolada da natureza por causa de sua capacidade de proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono na condição de baixo pH. A cepa AJ13601 foi obtida pela introdução na cepa SC17sucA dos genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli e do gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum. Depois, uma cepa resistente ao ácido L-glutâmico em alta concentração, em baixo pH, foi selecionada, e a cepa tendo um grau de alta proliferação e uma alta capacidade de produzir ácido L-glutâmico, foi finalmente selecionada. À cepa SC17sucA foi atribuído um número particular de AJ417, e ela foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (presentemente o International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566) em 26 de fevereiro de 2004, e lhe foi dado um número de acesso de FERM BP-08646. A bactéria da presente invenção tem a capacidade mencionada acima de produzir ácido L-glutâmico, pertence ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia, e foi modificada para inativar o gene rpoS mediante recombinação dos genes. A bactéria da presente invenção pode ser obtida mediante modificação de uma bactéria tendo a capacidade de produzir ácido L-glutâmico e pertencente ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia, de modo que o gene rpoS seja inativado por recombinação de genes. Na reprodução da bactéria da presente invenção pertencente ao gênero Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia, ou a comunicação da capacidade de produzir ácido L-glutâmico ou a inativação do gene rpoS, pode ser realizada primeiro. A expressão “a bactéria foi modificada para inativar o gene ropS' significa que a bactéria foi modificada de modo que a proteína RpoS não funcione normalmente em comparação com aquela em uma cepa não modificada, tal como uma cepa precursora ou uma cepa do tipo selvagem. Os resultados da modificação do gene rpoS pela recombinação de genes incluem, por exemplo, um decréscimo no número de moléculas RpoS por célula em comparação com aquelas da cepa precursora ou de uma cepa do tipo selvagem, nenhuma produção da proteína RpoS, redução da atividade da proteína RpoS por molécula, ou o desaparecimento da atividade, e assim por diante. O número de moléculas RpoS pode ser reduzido reduzindo-se a expressão do gene rpoS. O decréscimo na expressão do gene rpoS inclui ou um decréscimo na transcrição ou na translação do mRNA de rpoS. Além disso, eliminando-se a produção da proteína RpoS, a redução da atividade da proteína RpoS por molécula, ou a eliminação da atividade, podem ser alcançadas pelo rompimento do gene rpoS. Exemplos da cepa do tipo selvagem que podem ser usados para comparação incluem a capa Pantoea ananatis AJ13355, a cepa Klebsiellaplanticola AJ13399, e assim por diante.

Especificamente, o gene rpoS pode ser modificado deletando-se uma parte da região codificadora inteira do gene rpoS no cromossoma, modificando uma sequência de controle da expressão, tal como os promotores ou uma sequência de Shine-Dargamo (SD), ou coisa parecida. Além disso, a expressão do gene pode também ser reduzida pela modificação de uma região não translada, outra que não as sequências de controle da expressão. Além disso, o gene rpoS inteiro, incluindo as sequências de montante e de jusante do gene rpoS sobre o cromossoma, pode ser deletado. Além do mais, as substituições dos aminoácidos (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de deslocamento resultando na adição ou deleção de um ou dois nucleotídeos, podem ser introduzidas na região codificando rpoS no cromossoma [.Journal of Biological Chemistry, 272: 8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 266, 20833-20839(1991)].

Na presente invenção, a expressão “modificado pela recombinação de genes” significa uma deleção de uma parte ou a sequência de controle da expressão inteira, tal como a região promotora, ou uma deleção de uma região codificadora ou região não codificadora do gene rpoS sobre o cromossoma. Pode também significar a inserção de outras sequências nas regiões precedentes com o uso de recombinação homóloga para reduzir a atividade intracelular do rpoS, mas não modificadas pela mutagênese usual com o uso de raios-X ou de irradiação ultravioleta ou um mutageno tal como a N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina. Na presente invenção, o gene rpoS é preferivelmente inativado pela modificação do gene rpoS a um grau tal que a função do gene rpoS não seja restaurada por uma mutação espontânea.

Quando da modificação de uma sequência de controle de expressão, preferivelmente um ou mais nucleotídeos são alterados, mais preferível dois ou mais nucleotídeos são alterados, particularmente preferível três ou mais nucleotídeos são alterados. Quando da deleção dentro da região codificadora, a região a ser deletada pode incluir o término N, uma região interna, o término C, ou a região codificadora inteira, contando que a função da proteína RpoS seja reduzida ou eliminada. Em geral, deletar regiões mais longas mais confiavelmente resulta na inativação do gene rpoS. Além disso, é preferível que as matrizes de leitura de montante e de jusante da região deletada não se conformem uma com a outra.

Quando da inserção de uma sequência na região codificadora, o ponto de inserção pode estar dentro de qualquer região no gene rpoS. A inserção de uma região mais longa resulta mais confiavelmente na inativação do gene rpoS. É preferível que as matrizes de leitura de montante e jusante do sítio de inserção não de conformem uma com a outra. A sequência a ser inserida não é particularmente limitada, contanto que ela reduza ou elimine a função da proteína RpoS, e exemplos incluem, por exemplo, os genes de resistência a antibióticos e os transpósons carregando um gene útil para a produção do ácido L-glutâmico. O gene rpoS no cromossoma pode ser modificado como descrito acima mediante, por exemplo, o preparo de um gene rpoS do tipo deleção mediante deleção de uma sequência parcial do gene rpoS, transformando uma bactéria com um DNA contendo o gene do tipo deleção resultante na recombinação homóloga do gene e do gene rpoS no cromossoma, e dessa forma substituindo o gene rpoS pelo gene do tipo deleção no cromossoma. Mesmo que a proteína seja produzida do gene rpoS do tipo deleção, sua estrutura tridimensional será diferente daquela da proteína rpoS do tipo selvagem, e assim a sua função será reduzida ou eliminada. O rompimento dos genes resultante da substituição de genes usando recombinação homóloga como descrito acima, já foi relatado, e exemplos deste incluem o uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura, ou um plasmídeo capaz de transferência conjugacional, utilizando um vetor suicida que não tenha uma origem de replicação capaz de funcionar no hospedeiro escolhido, e assim por diante (Patente U.S. n~ 6.303.383 ou Patente Japonesa Aberta ao Público ns 05-007491.

Além disso, o gene rpoS também pode ser inativado através do rompimento do gene com o uso do ácido quináldico, resultando em uma cepa recombinante de cruzamento duplo. O ácido quináldico é um análogo da tetraciclina, e é excretado das células por uma proteína de excreção da tetraciclina codificada por TnlO. O ácido quináldico é uma substância ffacamente ácida, e ele perde sua carga elétrica e toma uma forma eletricamente livre sob condições ffacamente ácidas. Portanto, ele pode facilmente passar através das membranas celulares. Sobre as condições ffacamente ácidas, o ácido quináldico é excretado pelo sistema de excreção da tetraciclina e então o ácido quináldico excretado se converte na forma livre no ambiente ffacamente acídico fora da célula, e flui para a célula novamente e, como resultado, o gradiente de concentração protônica entre o exterior e o interior da célula desaparece. Isto é, uma cepa contendo o gene de excreção da tetraciclina (gene de resistência à tetraciclina) derivada de TnlO, se toma sensível ao ácido quináldico sob condições fracamente ácidas (J. Bacteriol., agosto de 1980, 143(2), pp. 926-933). Se o gene de resistência à tetraciclina (TnlO) for carregado em um vetor, que seja incorporado no cromossoma por cruzamento único, a cepa pode ser de preponderantemente selecionada com a tetraciclina, e uma cepa em que o componente vetor seja eliminada por cruzamento duplo pode ser preponderantemente selecionada em um meio que contenha o ácido quináldico. Assim, a operação se toma simples.

Portanto, quando o gene de resistência à tetraciclina for introduzido no vetor para a recombinação de genes, o isolamento de uma cepa recombinante dupla, sem o uso de um gene marcador, é simples. O decréscimo na transcrição do gene rpoS pode ser confirmado pela comparação da quantidade de mRNA de rpoS com aquela cepa de um tipo selvagem ou uma cepa não modificada, a quantidade de mRNA pode ser avaliada por hibridização de Northern, RT-PCR, e assim por diante [.Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001]. Não obstante o decréscimo na transcrição posse ser de qualquer grau, contanto que a transcrição seja reduzida em comparação com aquela de uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada, ela é desejavelmente reduzida para, por exemplo, pelo menos 75 % ou menos, 50 % ou menos, 25 % ou menos, ou 10 % ou menos, da transcrição em uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada, e é particularmente preferível que o gene rpoS não seja expresso sob qualquer condição. O decréscimo da quantidade da proteína codificada pelo gene rpoS pode ser confirmado por Western blotting com o uso de anticorpos [.Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001]. Não obstante o decréscimo da quantidade da proteína possa ser de qualquer grau contanto que a quantidade seja reduzida em comparação com aquela de uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada, ela é desejavelmente reduzida em, por exemplo, pelo menos 75 % ou menos, 50 % ou menos, 25 % ou menos, ou 10 % ou menos, da quantidade em uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa não modificada, e é particularmente preferível que a proteína não seja produzida de modo algum (que a atividade tenha desaparecido completamente). A proteína codificada pelo gene rpoS, isto é, a proteína RpoS, de acordo com a presente invenção, é o fator sigma S da RNA polimerase. A RNA polimerase consiste nas subunidades α, β, β’ e sigma (σ). O fator sigma se liga à enzima núcleo que inclui as subunidades α, β e β’, e reconhece o promotor para o gene transcrito pela RNA polimerase. Na presente invenção, a “função da proteína RpoS” refere-se ao reconhecimento do promotor do gene transcrito pela RNA polimerase. Se a RpoS não funcionar normalmente, a expressão dos genes, que são expressos quando a RpoS funciona normalmente, tal como uma cepa do tipo selvagem, é reduzida ou eliminada. A redução da função da RpoS nas células pode ser confirmada pela detecção da expressão de um gene que seja tipicamente transcrito pelo rpoS, tal como o gene boi A, por hibridização de Northern ou o método de RT-PCR [J. Bacteriol., julho de 1991,173 (14): 4474-4481].

Exemplos da proteína RpoS da Enterobacteriaceae incluem a proteína da SEQ ID NO: 2. Esta proteína é codificada pelo gene rpoS da Pantoea ananatis (SEQ ID NO: 1). Além disso, tendo em vista que a sequência de nucleotídeos do gene rpoS pode variar dependendo da espécie ou da cepa das bactérias pertencentes à família da Enterobacteriaceae, o gene rpoS pode ser uma variante da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1. As variantes do gene rpoS podem ser encontradas pelo uso da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 em uma pesquisa de BLAST (http://blast.genome.jp/), ou coisa parecida. Além disso, as variantes do gene rpoS incluem um gene que pode ser amplificado por PCR com o uso de um homólogo do gene rpoS, tal como o cromossoma de uma bactéria de Enterobacteriaceae como um gabarito, e oligonucleotídeos sintéticos tais como aquelas das SEQID NOS: 7 e 10, como iniciadores.

Um exemplo da proteína RpoS é a proteína que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2. Além disso, tendo em vista que diferenças podem existir na utilização do códon e as sequências de nucleotídeos do gene rpoS dependendo das espécies ou das cepas das bactérias, o gene pode codificar a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, mas que inclua substituições, deleções, inserções ou adições de um ou vários resíduos de aminoácido, contanto que a função da proteína RpoS seja mantida. A quantidade destas diferenças de aminoácidos pode ser, por exemplo, de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10, mais preferível de 1 a 5. Estas diferenças são mutações tipicamente conservativas que possibilitam a produção normal da proteína RpoS. Uma mutação conservativa é uma mutação em que a substituição tem lugar mutuamente entre Phe, Trp, Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile, vai, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gin, Asn, se ele for um aminoácido polar; entre Lys, Arg, His, se ele for um aminoácido básico; entre Asp, Glu, se ele for um aminoácido acídico; e entre Ser, Thr, se ele for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Mutações conservativas típicas são substituições conservativas. Exemplos específicos de substituições que são consideradas como sendo conservativas incluem: substituição de Ala por Ser ou Thr, substituição de Arg por Gin, His ou Lys, substituição de Asn por Glu, Gin, Lys, His ou Asp, substituição de Asp por Asn, Glu ou Gin, substituição de Cys por Ser ou Ala, substituição de Gin por Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg, substituição de Glu por Asn, Gin, Lys ou Asp, substituição de Gly por Pro, substituição de His por Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr, substituição de Ile por Leu, Met, Vai ou Phe, substituição de Leu por Ile, Met, Vai ou Phe, substituição de Lys por Asn, Glu, Gin, His ou Arg, substituição de Met por Ile, Leu, Vai ou Phe, substituição de Phe por Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu, substituição de Ser por Thr ou Ala, substituição de Thr por Ser ou Ala, substituição de Trp por Phe ou Tyr, substituição de Tyr por His, Phe ou Trp, e substituição de Vai por Met, Ile ou Leu.

Além disso, além do gene tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1, o gene rpoS pode ser uma variante que hibridize com a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1, ou uma sonda que possa ser preparada da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes. “Condições estringentes” incluem aquelas sob as quais um híbrido específico, por exemplo um híbrido tendo homologia de não menos do que 80 %, preferivelmente de não menos do que 90 %, mais preferível de não menos do que 95 %, e ainda mais preferível de não menos do que 97 %, e o mais preferível de não menos do que 99 %, é formado, e um híbrido tendo homologia menor do que a acima não é formado. Altemativamente, as condições estringentes são exemplificadas pela lavagem por uma vez, de preferência duas ou três vezes, em uma concentração de sal correspondente a 60 °C, 1 x SSC, 0,1 % de SDS, preferivelmente 60 °C, 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS em 60 °C, mais preferível 68 °C, 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS conduzidos por uma, duas ou três vezes. O comprimento da sonda pode ser selecionado adequadamente, dependendo das condições de hibridização, e é usualmente de 100 pares de base a 1000 pares de base. <2> Melhoramento do crescimento de um microorganismo capaz de produzir ácido L-glutâmico sob condições ácidas A produtividade do ácido L-glutâmico de um microorganismo pode ser melhorada pela inativação do gene rpoS no microorganismo, por recombinação de gene, como descrito acima. Especificamente, o crescimento do microorganismo sob condições ácidas pode ser melhorado. As condições ácidas são indicadas, por exemplo, por um pH de 3 a 5, mais preferível um pH de 4 a 5.

Exemplos do microorganismo incluem as bactérias pertencentes aos gêneros Pantoea, Enterobacter, Serratia, Klebsiella ou Erwinia.

Especificamente, o microorganismo é de preferência cultivado sob condições ácidas, as quais resultam na produção e acúmulo do ácido L-glutâmico acompanhado pela precipitação do ácido L-glutâmico.

Quando o microorganismo seja capaz de acumular ácido L-glutâmico sob condições ácidas, em particular a produção do ácido L-glutâmico pode ser melhorada pela melhora do crescimento do microorganismo sob condições ácidas. <3> Método para produzir ácido L-glutâmico da presente invenção O ácido L-glutâmico pode ser produzido pelo cultivo da bactéria da presente invenção em um meio, para produzir e causar o acúmulo do ácido L-glutâmico no meio, e coleta do ácido L-glutâmico do meio. O meio de cultura escolhido pode ser um meio típico contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais inorgânicos, assim como quantidades de traço de nutrientes orgânicos quando necessário, tais como aminoácidos e vitaminas. Ou um meio sintético ou natural pode ser usado. As fontes de carbono e de nitrogênio usadas no meio podem ser de qualquer tipo, contanto que as substâncias escolhidas possam ser utilizadas pela cepa escolhida.

Como a fonte de carbono, os sacarídeos tais como a glicose, o glicerol, a frutose, a sacarose, a maltose, a manose, a galactose, o hidrolisado de amido, e melaços podem ser usados. Além disso, ácidos orgânicos, tais como o ácido acético e o ácido cítrico, ou álcoois, tais como o etanol, podem ser usados isoladamente ou em combinação com outras fontes de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, a amônia, os sais de amônio tais como o sulfato de amônio, o carbonato de amônio, o cloreto de amônio, o fosfato de amônio e o acetato de amônio, nitratos, e assim por diante, podem ser usados. Como os nutrientes orgânicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléico, e compostos contendo estas substâncias tais como a peptona, casaminoácidos, extrato de levedura, e hidrolisado de proteína de soja, podem ser usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica, que requeira um aminoácido, ou coisa parecida, para o crescimento, seja usada, o nutriente requerido preferivelmente é suplementado. Como sais minerais, os fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês, e assim por diante, podem ser usados. A cultura é preferivelmente realizada com aeração, ao passo que a temperatura de fermentação é preferivelmente controlada como sendo de 20 a 45 °C, e o pH como sendo de 3 a 9. Quando o pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado pela adição de, por exemplo, carbonato de cálcio ou um álcali, tal como o gás de amônia. Uma quantidade substancial de ácido L-glutâmico é produzida no caldo de cultura após 10 a 120 horas de cultura sob condições tais conforme descritas acima.

Além disso, o ácido L-glutâmico pode ser precipitado durante a cultura no meio, mediante o uso de um meio líquido, o qual seja ajustado de modo que o ácido L-glutâmico se precipite. O ácido L-glutâmico se precipita, por exemplo, em um pH de 5,0 a 4,0, preferivelmente um pH de 4,5 a 4,0, mais preferível um pH de 4,3 a 4,0, particularmente preferível um pH de 4,0. De modo a melhorar o crescimento bacteriano sob condições ácidas, bem como levar em conta a precipitação eficiente do ácido L-glutâmico, é desejável que o pH seja preferivelmente de 5,0 a 4,0, mais preferível de 4,5 a 4,0, mais preferível de 4,3 a 4,0. A cultura pode ser realizada em um pH dentro das faixas acima mencionadas por um período parcial ou total da cultura.

Após a conclusão da cultura, o ácido L-glutâmico pode ser coletado do caldo de cultura por métodos conhecidos. Por exemplo, após as células terem sido removidas do caldo de cultura, o ácido L-glutâmico pode ser coletado por concentração-cristalização, cromatografía de troca de íons, ou coisa parecida. Quando a cultura seja realizada sob condições favoráveis para precipitar o ácido L-glutâmico no meio, o ácido L-glutâmico que se precipita no meio pode ser coletado por centrifugação, filtração ou coisa parecida. Neste caso, é também possível cristalizar qualquer ácido L-glutâmico que se tenha dissolvido no meio, e depois coletar o ácido L-glutâmico cristalizado juntamente com o ácido L-glutâmico que já se tenha precipitado.

Exemplos A presente invenção será explanada mais especificamente abaixo com referência aos seguintes Exemplos não limitativos.

<1> Preparação da cepa rompida do gene rpoS (1) Construção do plasmídeo pUT-TnlO para rompimento dos genes Para romper o gene rpoS, um vetor tendo o gene de resistência à tetraciclina para uso no rompimento de genes usando o ácido quináldico e o gene de resistência à tetraciclina, foi construído. Primeiro, o gene de resistência à tetraciclina foi amplificado por PCR com o uso dos iniciadores Tnl0-750Xho (SEQ ID NO: 3) e Tnl0-3020Xho (SEQ ID NO: 4) e o cromossoma da cepa de Escherichia coli K-12 ME8424 (Hfr, P045, thi, relAl, tyrA::TnlO, ung-1 e nadB, fornecidos pelo National Institute of Genetics, Japão) como um gabarito. Além disso, a PCR foi realizada com o uso dos iniciadores pUT-3710Xho (SEQ ID NO: 5) e pUT-3020Xho (SEQ ID NO: 6) e pUT399 como um gabarito. Isto resultou em um fragmento de pUT399 com o sítio Xhol. Ambos os fragmentos amplificados foram tratados com Xhol, e depois ligados para se obter o plasmídeo pUT-TnlO. O pUT399 tem uma origem de replicação de R6K e contém a região mob necessária para a transferência conjugacional, e não pode ser replicado em uma cepa bacteriana que não tenha o gene pir [disponível da Biomedal, referência a R. Simon etal., BIO/TECHNOLOGYnovembro de 1983, 784-791 (1983)].

(2) Preparação da cepa rompida do gene rpoS A PCR foi realizada mediante o uso do cromossoma da cepa SC17sucA de Pantoea ananatis (FERM BP-8646) como um gabarito e dos iniciadores rpoS-Fl (SEQ ID NO: 7)/rpoS-FR (SEQ ID NO: 8), ou rpoS-RF (SEQ ID NO: 9)/rpoS-Rl (SEQ ID NO: 10). Como um resultado, cerca de 2,1 kb tanto a montante quanto a jusante do gene rpoS foram amplificados. Depois, estes fragmentos amplificados foram usados como gabaritos com a combinação dos iniciadores KpnI-rpoS-F2 (SEQ ID NO: ll)/KpnI-rpoS-R2 (SEQ ID NO: 12) para amplificar um fragmento de cerca de 4,1 kb, e este fragmento foi clonado em pGEM-T Easy (Promega). O plasmídeo resultante foi tratado com Kpnl, e o fragmento (cerca de 4,1 kb) foi ligado ao sítio de Kpn\ de pUT-TnlO para se obter pUT-TnlO/ArpoS. Este plasmídeo foi introduzido na cepa de Escherichia coli SI 7-Ιλ-pir tendo λ-pir [disponível da Biomedal, R. Simon et al., BIO/TECHNOLOGY novembro de 1983, 784-791 (1983)], e este plasmídeo foi transferido da cepa resultante para a cepa SC17sucA por conjugação.

Mediante seleção em meio mínimo M9 (5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico em 1 litro de água pura) contendo 25 mg/litro de cloranfenicol, 100 mg/litro de lisina-L, 100 mg/litro de metionina-L, 100 mg/litro de ácido diaminopimélico, e 5 g/litro de sacarose, a cepa SC17sucA (FERM BP-8646) com pUT-TnlO/ArpoS incorporado no sítio do gene rpoS no cromossoma, foi obtida.

Esta cepa foi purificada no meio L (10 g de triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 litro de água pura, pH de 7,0) também contendo componentes de meio mínimo (0,5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água pura), 25 mg/litro de cloranfenicol, e 12,5 mg/litro de tetraciclina. As células foram também cultivadas no mesmo meio, porém sem os antibióticos. Várias colônias foram colhidas e cultivadas durante a noite em um meio líquido tendo a mesma composição. A cultura foi diluída por 100 a 10.000 vezes com água esterilizada, e aplicada a uma placa de ácido quináldico (meio obtido pela dissolução de 5 g de triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 40 g de NaCl, 0,05 g de tetraciclina e 10 g de NaH2P04 em 900 ml de água purificada, ajustando-se a solução a pH 5,2 com KOH, misturando-se 20 g de ágar com a solução, autoclavando-se a mistura em 120 °C por 20 minutos, e adicionando-se 0,2 g de ácido quináldico, 13,6 mg de ZnCl2 e 5 g de glicose dissolvida em 100 ml de água purificada e submetida a esterilização de filtragem para a mistura autoclavada). A estrutura do gene rpoS nas colônias que apareceram, foi confirmada por PCR com o uso de iniciadores. A cepa tendo o gene rpoS rompido foi designada SC17sucArpoS. O plasmídeo RSFPPG foi construído. Este plasmídeo contém os genes da biossíntese do ácido L-glutâmico, incluindo prpC (Publicação da Patente Internacional WO 2006/051660), ppc e gdh (Publicação da Patente Européia n° 0999282). O iniciador 1 (SEQ ID NO: 13) e o iniciador 2 (SEQ ID NO: 14) foram projetados para amplificar um componente de RSFCPG (Publicação da Patente Européia n2 1233068) outro que não o ORF do gene gltA. Mediante o uso destes iniciadores e RSFCPG como gabarito, a PCR foi realizada para se obter um fragmento de cerca de 14,9 kb. No que diz respeito ao prpC, a PCR foi realizada mediante o uso do iniciador 3 (SEQ ID NO: 15) e do iniciador 4 (SEQ ID NO: 16), e o DNA cromossômico da cepa W3110 de E. coli como um gabarito para se obter um fragmento de cerca de 1,2 kb.

Ambos estes produtos da PCR foram tratados com BglW e Kpnl, ligados e, depois, usados para transformar a cepa JM109 de E. coli. Todas as colônias que apareceram foram coletadas, e os plasmídeos foram extraídos das colônias como uma mistura. A cepa deficiente de CS de E. coli, a ME8330, foi transformada com a mistura de plasmídeos, e a suspensão celular foi aplicada ao meio mínimo M9 (5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico, em 1 litro de água pura) contendo 50 mg/litro de uracila e 5 mg/litro de HC1 de tiamina. Das colônias que apareceram, um plasmídeo foi extraído e designado RSFPPG. O plasmídeo da produção de Glu RSFPPG foi introduzido na cepa SC17sucArpoS para construir uma bactéria produtora de Glu deficiente de rpoS, a SC17sucArpoS/RSFPPG. <2> Crescimento da cepa rompida do gene rpoS sob condições ácidas O crescimento de SC17sucArpoS/RSFPPG foi pesquisado sob várias condições de pH. A cepa SC17sucArpoS/RSFPPG e a cepa SC17sucA/RSFPCPG (tipo selvagem do rpoS) foram cultivadas durante a noite sobre um meio sólido, que foi preparado pela adição de ingredientes do meio mínimo ao meio L, e as células foram lavadas duas vezes com água esterilizada. As células foram inoculadas em 5 ml do meio mínimo (5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio, 6 g de fosfato dissódico, 100 mg de cloridreto de lisina, 100 mg de metionina L e 100 mg de ácido diaminopimélico, e 30 g de ácido L-glutâmico em 1 litro de água purificada, ajustados a vários níveis de pH com amônia) em OD 660 nm de 0,05, e a OD foi medida no decorrer do tempo mediante o uso do aparelho automático medidor de OD TN1506, produzido pela ADVANTEC. Os resultados são apresentados nas Figuras 1 e 2.

No pH de 5,1 ou mais elevado, não houve nenhuma diferença entre a cepa de controle SC17sucA/RSFPPG e a cepa SC17sucArpoS/RSFPPG. Entretanto, quando o pH foi de 4,9 ou mais baixo, a cepa rompida do gene rpoS tendeu a apresentar crescimento mais favorável. Além disso, este efeito tendeu a tomar-se mais significativo quando o pH do meio foi reduzido. Portanto, o rompimento do gene rpoS foi eficaz para melhorar o crescimento sob condições ácidas. <3> Produção do ácido 1-glutâmico pela cepa rompida do gene rpoS sob condições ácidas Em seguida, a capacidade da cepa SC 17sucArpoS/RSFPPG de produzir ácido L-glutâmico foi avaliada sob condições ácidas. A cepa SC 17sucA/RSFPPG e a cepa SC17sucArpoS/RSFPPG foram cultivadas durante a noite em um meio, o qual foi preparado pela adição de ingredientes do meio mínimo (5 g de glicose, sulfato de magnésio 2 mM, 3 g de fosfato monopotássico, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amônio e 6 g de fosfato dissódico em 1 litro de água pura) e 12,5 mg/litro de tetraciclina ao meio L (10 g de triptona Bacto, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 litro de água pura, pH de 7,0). As células foram cultivadas sobre cada placa, e depois cada uma foi inoculada em meios de cultura de 300 ml (listados abaixo) em fermentadores de jarro e cultivada com aeração de 1/1 wm em 34 °C e pH 4,7 ajustado com gás amoníaco. Quando o açúcar foi exaurido, açúcar adicional foi acrescentado para continuar a cultura. No que diz respeito à cepa SC17sucArpoS/RSFPPG, quando a concentração do ácido L-glutâmico havia alcançado a solubilidade de saturação, pectina foi adicionada em uma concentração de 1 g/litro.

Composições dos meios (todas as concentrações são concentrações finais): grupo A: 100 g/litro de sacarose, 1,2 g/litro de MgS04-7H20, 0,2 ml/litro de GDI 13 (agente anti-espuma) grupo B: 5 g/litro de (NH4)2S04, 6 g/litro de KH2P04, 6 g/litro de extrato de levedura (Difco), 1,5 g/litro de NaCl, 60 mg/litro de MnSCV5H2C), 0,8 g/litro de lisina-L, 0,6 g/litro de metionina-DL, 0,6 g/litro de ácido DL-diaminopimélico, 4 g/litro de betaína grupo C: 60 mg/litro de FeS04-7H20 Para cada grupo, os ingredientes foram esterilizados em 120 °C por 20 minutos, depois misturados e dispensados em um volume de 300 ml cada em fermentadores de jarro de volume de 1 litro.

Meio de alimentação: 700 g/litro de sacarose, 0,2 ml/litro de GDI 13, esterilizado em 120 °C por 20 minutos.

Os resultados para cada uma das culturas acima mencionadas são apresentados na Figura 3. A cepa de controle SC17sucA/RSFPPG tendeu a interromper o crescimento no meio da cultura. Por outro lado, o crescimento da cepa SC17sucArpoS/RSFPPG não foi interrompido, e esta cepa apresentou acúmulo de ácido L-glutâmico marcadamente excedendo aquele obtido com a SC 17sucA/RSFPPG.

Aplicabilidade industrial Mediante o uso do microorganismo da presente invenção, o ácido L-glutâmico pode ser eficientemente produzido por fermentação. Além do mais, pela inativação do gene rpoS, o crescimento das bactérias produtoras do ácido L-glutâmico sob condições ácidas pode ser melhorado.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Método para produzir ácido L-glutâmico, caracterizado por compreender: cultivar uma bactéria produtora de ácido L-glulâmico que pertence aos gêneros Pantoea, Emerobacier, Kíebsiella ou Erwinici, em um meio em pH 3 a 5; e coletar ácido L-glutâmico do meio, em que a bactéria foi modificada por recombinaçáo gênica para inativar o gene rpoS.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene rpoS é in ativado por redução da expressão do gene rpoS ou pelo rompimento do gene rpoS.

3. Método de acordo com a reivindicação I ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o gene rpoS codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo na proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene rpoS é selecionado do grupo consistindo no DNA compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo falo de que a bactéria é Pantoea ananatis.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ácido L-glutâmico se acumula acompanhado por precipitação no meio, durante a cultura,

8. Método para melhorar o crescimento de um microorganismo produtor de ácido L-glutâmico sob condições ácidas, o método caracterizado pelo fato de que compreende inativar o gene rpoS do microorganismo mediante recombinação gênica, em que o micro-organismo pertence aos gêneros Pantoea, Enterobacter, Klebsiella ou Erwinia.