BRPI0810011B1

BRPI0810011B1 - Método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila

Info

Publication number: BRPI0810011B1
Application number: BRPI0810011-0A
Authority: BR
Inventors: Yoshihiko Hara; Keita Fukui; Kazue Kawamura; Yoshihiro Usuda; Kazuhiko Matsui; Yoshinori Tajima
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2007-04-17
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2021-11-30
Also published as: JPWO2008133161A1; CN101688176A; CN101688176B; US20100112647A1; US9822385B2; US20150259717A1; BRPI0810011A2; EP2147970A4; WO2008133161A1; JP5218400B2; US20180044703A1; EP2147970B1; EP2147970A1

Abstract

microorganismo, e, métodos para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, e para produzir um polímero contendo ácido succínico uma substância ácida tendo um grupo carboxila é produzida por cultura de um microorganismo que tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila e foi modificado de modo que a expressão de gene ybjl é otimizada em um meio para produzir e acumular a substância ácida tendo um grupo carboxila no meio, e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila a partir do meio.

Description

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila. Ácido L-glutâmico e ácido L- aspártico são amplamente usados como matérias primas de condimentos e semelhantes. Ácido succínico é amplamente usado como uma matéria prima de condimentos e plásticos biodegradáveis.

Técnica Antecedente

Ácido L-glutâmico é produzido principalmente por fermentação utilizando bactérias produzindo ácido L-glutâmico das assim chamadas bactérias corineformes pertencentes ao gênero Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou cepas mutantes das mesmas (ver, por exemplo, documento não patente 1). Como métodos para produzir ácido L- glutâmico por fermentação usando outras cepas bacterianas, métodos usando um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou outros (ver, por exemplo, documento de patente 1), métodos usando um microorganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida ou outros (ver, por exemplo, documento de patente 2), métodos usando um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (atualmente referido como Enterobacter aerogenes) ou outros métodos (ver, por exemplo, documento de patente 3), usando uma cepa mutante de Escherichia coli (ver, por exemplo, documento de patente 4), e outros, são conhecidos. Além disso, métodos para produzir ácido L-glutâmico usando um microorganismo pertencente ao gênero Klebsiella, Erwinia, Pantoea ou Enterobacter também foram descritos (ver, por exemplo, documentos de patente 5 a 7).

Além disso, foram descritas várias técnicas para aumentar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico por melhora das enzimas biossintéticas de ácido L-glutâmico usando técnicas de DNA recombinantes. Por exemplo, foi relatado para bactérias Corynebacterium ou Brevibacterium que a introdução de um gene codificando para citrato sintase derivado de Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum foi eficaz para a otimização da capacidade de produção de ácido L-glutâmico das bactérias corineformes (ver, por exemplo, documento de patente 8). Além disso, também foi relatado que a introdução de um derivado do gene citrato sintase de uma bactéria corineforme em enterobactérias pertencentes ao gênero Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia ou Escherichia foi eficaz para a otimização da capacidade de produção de ácido L-glutâmico das mesmas (ver, por exemplo, documento de patente 7).

Como métodos para otimizar a capacidade de produzir substâncias alvos como aminoácidos, são conhecidos métodos de modificar os sistemas de absorção ou de excreção de substâncias. Como métodos para modificar um sistema de absorção para uma substância, por exemplo, são conhecidos métodos de deletar ou atenuar um sistema para absorção de uma substância alvo em células de modo a aumentar a capacidade de produzir a substância alvo. Especificamente, métodos para otimizar a capacidade para produzir ácido L-glutâmico por deleção do operon gluABCD ou uma parte do mesmo de modo a eliminar ou atenuar a absorção de ácido L-glutâmico em células (ver, por exemplo, documento de patente 9), são conhecidos métodos para aumentar a capacidade de produzir nucleotídeos purina atenuando a absorção nucleotídeos purina em células (ver, por exemplo, documento de patente 10), e outros.

Além disso, como métodos para modificar um sistema de excreção, são conhecidos métodos para otimizar um sistema de excreção para uma substância alvo e métodos de deletar ou atenuar um sistema de excreção para um intermediário ou substrato em um sistema de biossíntese de uma substância alvo. Como os métodos de otimizar um sistema de excreção de uma substância alvo, são conhecidos, por exemplo, métodos para produzir L- lisina por utilização de uma cepa bacteriana Corynebacterium em que o gene de excreção de L-lisina (lysE) é otimizado (ver, por exemplo, documento de patente 11), e métodos para produzir ácido L-glutâmico por uso de uma enterobactéria em que o gene do sistema de excreção de ácido L-glutâmico (yhfK) é otimizado (ver, por exemplo, documento de patente 18). Além disso, também foram relatados métodos para produzir um L-aminoácido usando os genes rhtA, B, C, que são sugeridos como estando envolvidos na excreção de L-aminoácidos, (ver, por exemplo, documento de patente 12). Como o método para, por exemplo, deletar um sistema de excreção para um intermediário ou substrato em um sistema de biossíntese de uma substância alvo, em cujo caso a substância alvo é ácido L-glutâmico, são conhecidos os métodos de mutação ou ruptura do gene 2-oxoglutarato permease para atenuar a excreção de 2-oxoglutarato, que é um intermediário de uma substância alvo (ver, por exemplo, documento de patente 13).

Além disso, foi sugerido uso de um gene codificando para a superfamília de cassete de ligação de ATP (transportador ABC) envolvida no transporte de substâncias através das membranas celulares na criação de microorganismos em que o transporte transmembrana de aminoácidos é modificado (ver, por exemplo, documento de patente 14).

Além disso, foi relatado que a eficiência da produção de ácido L-glutâmico foi otimizada em bactérias Escherichia por melhora da expressão de genes que se espera participem em excreção de L-aminoácidos como yfiK (ver, por exemplo, documento de patente 15). Além disso, foi também relatado que a capacidade de produção de ácido L-glutâmico pode ser otimizada através de uma expressão do gene yhfK (ver, por exemplo, documento de patente 18).

Além disso, são conhecidos, como métodos para produzir ácido L-glutâmico, métodos de cultura de um microorganismo sob condições ácidas para produzir ácido L-glutâmico por fermentação com precipitação do ácido L-glutâmico (ver, por exemplo, documento de patente 16). Sob uma condição de pH baixo onde ácido L-glutâmico é precipitado, aumenta a relação de existência de ácido L-glutâmico na forma livre não tendo carga elétrica, e o ácido L-glutâmico penetra facilmente nas membranas celulares. Quando ácido L-glutâmico é absorvido em células, ele é convertido em um intermediário do ciclo TCA, ácido 2-oxoglutárico, em uma etapa por glutamato desidrogenase, e deste modo, considera-se geralmente que o ácido L-glutâmico absorvido pelas células é facilmente metabolizado. No entanto, uma bactéria Enterobacter ou bactéria Escherichia em que a atividade de 2- oxoglutarato desidrogenase é deletada ou atenuada ou semelhantes, é usada na produção fermentativa de ácido L-glutâmico (por exemplo, documentos de patente 16 e 17), mas este microorganismo não pode degradar ácido 2- oxoglutárico, deste modo a concentração intracelular de ácido 2-oxoglutárico aumenta como um resultado para inibir o crescimento do microorganismo, e assim a cultura não pode ser realizada. Deste modo, no documento de patente 16 descrito acima, uma cepa que é deficiente na atividade 2-oxoglutarato desidrogenase e pode produzir ácido L-glutâmico com precipitação ácido L- glutâmico foi criada por um tratamento de mutação e usada para a produção de ácido L-glutâmico.

Para a produção de aminoácidos não orgânicos incluindo ácido succínico por fermentação, bactérias aeróbicas incluindo aquelas pertencentes ao gênero Anaerobiospirillum ou Actinobacillus são geralmente usadas (documentos de patente 19 e 20, documento não patente 2). Apesar do uso destas bactérias aeróbicas proporcionar rendimentos elevados de produtos, muitos nutrientes são necessários para a sua proliferação, sendo assim necessário adicionar uma quantidade grande de fontes de nitrogênio orgânico como licor de infusão de milho (CSL) em meio de cultura. Adição de quantidades grandes de fontes de nitrogênio orgânico resulta não somente em aumento no custo da cultura, mas também em aumento do custo de purificação para isolar o produto e, portanto, não é econômico.

Além disso, também são conhecidos os métodos conhecidos em que bactérias aeróbicas como bactérias corineformes são cultivadas uma vez sob condições aeróbicas para a proliferação de células bacterianas, então revestidas, lavadas, e deixadas repousar como células para produzir um aminoácido não orgânico sem suprimento de oxigênio (documento de patentes 21 e 22). Estes métodos são econômicos, desde que o nitrogênio orgânico possa ser adicionado em uma quantidade menor para a proliferação das células bacterianas, e as bactérias possam crescer suficientemente em um meio de cultura simples. No entanto, ainda existe espaço para o aperfeiçoamento em termos de quantidade de produção, concentração, e taxa de produção por célula dos ácidos orgânicos alvo assim como simplificação de processo de produção, e semelhantes. Além disso, também foi relatada a produção de aminoácidos não orgânicos por fermentação usando uma bactéria em que a atividade fosfoenolpiruvato carboxilase é otimizada (por exemplo, documento de patente 23), e semelhantes.

Além disso, como para Escherichia coli, que é uma bactéria gram negativa anaeróbica facultativa, são conhecidos métodos para produzir um aminoácido não orgânico por cultivo do mesmo uma vez sob uma condição aeróbica para permitir o crescimento de células, e então cultivando o mesmo como células repousando sem suprimento de oxigênio para produzir anaerobicamente os aminoácidos não orgânicos (documento não patente 3), como os métodos usando bactérias corineformes, ou aerobicamente cultivando o mesmo de modo a produzir aerobicamente os aminoácidos não orgânicos (documento de patente 24). No entanto, porque Escherichia coli é uma bactéria gram negativa, sendo vulnerável à pressão osmótica, ainda se nota espaço para o aperfeiçoamento na produtividade por célula etc.

O gene ybjL é um gene localizado no genoma de Escherichia coli (ver, por exemplo, documento não patente 4), e também é considerado para codificar um determinado transportador com base em motivos, topologia etc. da sequência de aminoácido deduzida. No entanto, clonagem do gene assim como expressão do gene e análise do produto de expressão não foram relatadas, e as funções reais do gene ainda permanecem desconhecidas.

Documento de patente 1: Patente U.S. No. 3.220.929

Documento de patente 2: Patente U.S. No. 3.563.857

Documento de patente 3: Publicação de patente japonesa (KOKOKU) No. 32-9393

Documento de patente 4: Patente japonesa acessível ao público (KOKAI) No. 5-244970

Documento de patente 5: Patente japonesa acessível ao público No. 2000-106869 (patente U.S. No. 6.682.912)

Documento de patente 6: Patente japonesa acessível ao público No. 2000-189169 (pedido publicado de patente U.S. No. 2001009836)

Documento de patente 7: Patente japonesa acessível ao público No. 2000-189175 (patente U.S. No. 7.247.459)

Documento de patente 8: Publicação de patente japonesa No. 7-121228

Documento de patente 9: Pedido de patente européia acessível ao público No. 1038970

Documento de patente 10: Pedido de patente européia acessível ao público No. 1004663

Documento de patente 11: Publicação de patente internacional WO97/23597

Documento de patente 12: Patente japonesa acessível ao público No. 2000-189177 (pedido publicado de patente U.S. No. 2005239177)

Documento de patente 13: Publicação de patente internacional WO 97/23597

Documento de patente 14: Publicação de patente internacional WO 00/37647

Documento de patente 15: Patente japonesa acessível ao público No. 2000-189180 (patente U.S. No. 6.979.560).

Documento de patente 16: Patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769 (pedido publicado de patente U.S. No. 2007134773)

Documento de patente 17: Patente japonesa acessível ao público No. 7-203980 (patente U.S. No. 5.573.945)

Documento de patente 18: Patente japonesa acessível ao público No. 2005-278643 (pedido publicado de patente U.S. No. 2005196846)

Documento de patente 19: Patente U.S. No. 5.142.834

Documento de patente 20: Patente U.S. No. 5.504.004

Documento de patente 21: Patente japonesa acessível ao público No. 11-113588

Documento de patente 22: Patente japonesa acessível ao público No. 11-196888

Documento de patente 23: Patente japonesa acessível ao público No. 11-196887

Documento de patente 24: Pedido publicado de patente U.S. No. 20050170482

Documento não patente 1: Kunihiko Akashi et al., Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press (Gakkai Shuppan Center), pp. 195-215, 1986

Documento não patente 2: Guettler, M.V. et al., 1999, International Journal of Systematic Bacteriology, 49: 207-216

Documento não patente 3: Vemuri G.N. et al., 2002, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28(6): 325-332

Documento não patente 4: Blattner, F.R. et al., 1997, Science, 277(5331): 1453-74

Descrição da invenção Objeto a ser alcançado pela invenção

Um objeto da presente invenção consiste em prover uma cepa bacteriana que pode eficientemente produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, especialmente ácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, e ácido succínico, e prover um método para eficientemente produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila por uso de uma tal cepa.

Meios para alcançar o objeto

Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas a fim de alcançar o objeto acima mencionado e, como um resultado, isolaram ybjL como um gene envolvido em resistência de ácido L-glutâmico e descobriram que, em uma cepa em que a expressão do gene ybjL tinha sido otimizada, o rendimento de fertilização de ácido L-glutâmico tinha sido otimizado. Eles também descobriram que em uma cepa em que a expressão do gene ybjL tinha otimizado, a taxa de produção ou rendimento de ácido succínico é otimizada e, assim, realizaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê o seguinte. (1) Um microorganismo que tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila e foi modificado de modo que a expressão de gene ybjL é otimizada. (2) O microorganismo de acordo com (1), que foi modificado de modo que a expressão do gene ybjL é otimizada por aumento do número de cópias do gene ybjL ou modificação de uma sequência de controle de expressão do gene ybjL . (3) O microorganismo de acordo com (1) ou (2), em que o gene ybjL é um gene codificando para uma proteína definida no seguinte (A) ou (B): (1) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4 ou 87; (8) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4 ou 87, em que um ou vários resíduos de aminoácido são substituídos, deletados, inseridos ou adicionados, e a proteína melhora uma capacidade do microorganismo de produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila quando a expressão do mesmo é otimizada no microorganismo. (9) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (3), em que o gene ybjL é um gene codificando para a proteína de SEQ ID NO: 5 ou 88. (10) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que o microorganismo é uma bactéria pertencente à família Enter obacteriaceae. (11) O microorganismo de acordo com (5), em que o microorganismo é selecionado dentre o grupo consistindo de bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Raoultella, Pantoea, e Klebsiella. (12) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que o microorganismo é uma bactéria do rumem. (13) O microorganismo de acordo com (7), em que o microorganismo é Mannheimia succiniciproducens. (14) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (8), em que a substância ácida consiste de um ou mais tipos de ácidos orgânicos selecionados dentre o grupo consistindo de ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxalacético, ácido cítrico, ácido isocítrico, e ácido a-cetoglutárico. (15) O microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (), em que a substância ácida consiste de ácido L-glutâmico e/ou ácido L- aspártico. (16) Um método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, que compreende cultivar o microorganismo de acordo com qualquer um dentre (1) a (10) em um meio para produzir e acumular a substância ácida tendo um grupo carboxila no meio de cultura, e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila a partir do meio. (17) O método de acordo com (11), em que a substância ácida consiste de um ou mais tipos de ácidos orgânicos selecionados dentre o grupo consistindo de ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxalacético, ácido cítrico, ácido isocítrico, e a-cetoglutárico. (18) O método de acordo com (11), em que a substância ácida consiste de ácido L-glutâmico e/ou ácido L-aspártico. (19) Um método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, que compreende deixar o microorganismo de acordo com qualquer uma de (1) a (10) ou um produto obtido por processamento do microorganismo atuar em uma matéria prima orgânica em uma mistura de reação contendo ions carbonato, ions bicarbonato, ou gás dióxido de carbono de modo a produzir a substância ácida tendo um grupo carboxila, e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila. (20) O método de acordo com (14), em que a substância ácida consiste de um ou mais tipos de ácidos orgânicos selecionados dentre o grupo consistindo de ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxalacético, ácido cítrico, ácido isocítrico, e a-cetoglutárico. (21) Um método para produzir um polímero contendo ácido succínico, que compreende a etapa de produção de ácido succínico pelo método de acordo com (12) ou (15), e a etapa de polimerização do ácido succínico obtido.

Breve Explicação dos Desenhos

Fig. 1 mostra a estrutura de plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER.

Fig. 2 mostra a construção de plasmídeo auxiliar RSF-Red- TER.

Fig. 3 mostra o crescimento de cepa amplificada em ybjL na presença de ácido L-glutâmico de concentração elevada.

Fig. 4 mostra acúmulo de ácido succínico obtido com cepa amplificada em ybjL de bactéria Escherichia.

Fig. 5 mostra acúmulo de ácido succínico obtido com cepa amplificada em ybjL de bactéria Enterobacter.

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO

A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

<1> Microorganismo da presente invenção tendo capacidade para produzir substância ácida tendo um grupo carboxila

O microorganismo da presente invenção é um microorganismo que tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila e foi modificado de modo que a expressão do gene ybjL é otimizada. O termo “capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila” usado aqui significa uma capacidade do microorganismo da presente invenção para produzir e acumular uma substância ácida tendo um grupo carboxila em um meio ou células do microorganismo da presente invenção em tal grau que a substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser coletada a partir das células ou meio quando o microorganismo da presente invenção é cultivado no meio. O microorganismo tendo uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser um microorganismo originalmente tendo a capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, ou pode ser um microorganismo obtido por modificação de um microorganismo como o descrito abaixo usando técnicas de mutação ou técnicas de DNA recombinante de modo que o microorganismo tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, ou um microorganismo concedido com ou uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila ou microorganismo em que a capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila é otimizada por introdução do gene da presente invenção.

Na presente invenção, "substância ácida tendo um grupo carboxila" significa um composto orgânico tendo grupo (s) carboxila e apresentando acidez quando a substância é isenta de composto não formando um sal. Especificamente, exemplos incluem ácidos orgânicos e L- aminoácidos tendo dois grupos carboxila, isto é, aminoácidos ácidos. Exemplos dos L-aminoácidos incluem ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico, e exemplos dos ácidos orgânicos incluem ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido oxalacético, ácido cítrico, ácido isocítrico, ácido a- cetoglutárico, e semelhantes.

Apesar da cepa parental do microorganismo que pode ser usada na presente invenção não ser particularmente limitada, bactérias são preferidas. Como as bactérias, bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, bactérias classificadas em bactérias de rúmen, e bactérias corineformes são preferidas.

A família Enterobacteriaceae engloba bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Raoultella, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, e semelhantes. Em particular, são preferidas as bactérias classificadas em uma família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada pelo banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=9134). Dentre estas, bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, Enterobacter, Raoultella, Pantoea, Klebsiella, ou Serratia são especialmente preferidas.

Uma “bactéria pertencente ao gênero Escherichia” significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida do versado na técnica de microbiologia, apesar da bactéria não ser particularmente limitada. Exemplos de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia usado na presente invenção incluem, mas não são limitadas a Escherichia coli (E. coli).

A bactéria pertencente ao gênero Escherichia que pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada. No entanto, exemplos incluem, por exemplo, as bactérias dos grupos de filos descritos no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt F.C. Ed., 1996, Escherichia coli and Salmonella-. Cellular and Molecular Biology/segunda edição, pp. 2477-2483, tabela 1, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Exemplos específicos incluem Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076) e semelhantes derivados da cepa do tipo selvagem protótipo, cepa Kl 2.

Estas cepas são disponíveis, por exemplo, do American Type Culture Collection (Address: 12301 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108, United States of America). Isto é, números de registro são dados a cada uma das cepas, e as cepas podem ser ordenadas por uso destes números. Os números de registro das cepas são listados no catálogo de American Type Culture Collection. Bactérias Pantoea, bactérias Erwinia, e bactérias Enterobacter são bactérias classificadas como y-proteobactérias, e elas são taxonomicamente muito relacionadas entre si (J. Gen. Appl. Microbiol., 1997, 43, 355-361; Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 43, 1061-1067). Nos últimos anos, algumas bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter foram reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa, ou semelhantes, com base nos experimentos de hibridização de DNA-DNA etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 1989, 39: 337-345). Além disso, algumas bactérias pertencentes ao gênero Erwinia foram reclassificadas como Pantoea ananas ou Pantoea stewartii (fazer referência a Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 162-173).

Exemplos de bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e semelhantes. Especificamente, as cepas exemplificadas no pedido de patente européia acessível ao público No. 952221 podem ser usadas. Cepas típicas do gênero Enterobacter incluem cepa de Enterobacter agglomerans ATCC 12287, cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048, cepa de Enterobacter aerogenes NBRC 12010 (Biotechnol Bioeng., 2007, Mar. 27;98(2): 340-348), e cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637 (FERM ABP-10955), e semelhantes. A cepa AJ110637 foi obtida do solo da Costa de Susuki Kaigan, Makinohara-shi, Shizuoka-ken em Março de 2006 pela cultura líquida acumulada usada glicerol como a fonte de carbono. A sequência de 16S rDNA de comprimento total foi então determinada, e uma homologia de 99,9% com a da cepa de Enterobacter aerogenes NCTC 10006 foi obtida. Além disso, também em um teste fisiológico usando um kit API, a cepa mostrou resultados similares para a espécie de protótipo de Enterobacter aerogenes, e deste modo ela foi identificada como Enterobacter aerogenes. Esta cepa foi depositada junto ao International Patent Organism Depository, Agency of Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305- 8566, Japan) em 22 de agosto de 2007, e recebeu um número de acesso de FERM P-21348. Então o depósito foi convertido em um depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 13 de março de 2008, e recebeu o número de acesso de FERM ABP-10955. Cepas típicas das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis, Pantoea stewartii, Pantoea agglomerans, e Pantoea citrea. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, patente européia acessível ao público No. 0952221) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, patente européia acessível ao público No. 0952221)

Apesar destas cepas serem descritas como Enterobacter agglomerans na patente européia acessível ao público No. 0952221, elas são atualmente classificadas como Pantoea ananatis com base na análise da sequência de nucleotídeo do 16S rRNA etc., como descrito acima.

Exemplos das bactérias Erwinia incluem Erwinia amylovora e Erwinia carotovora, exemplos das bactérias Klebsiella incluem Klebsiella planticola, e exemplos das bactérias Raoultella incluem Raoultella planticola. Exemplos específicos incluem as seguintes cepas: Cepa de Erwinia amylovora ATCC 15580 Cepa de Erwinia carotovora ATCC 15713 Cepa de Klebsiella planticola AJ13399 (FERM BP-6600, patente européia acessível ao público No. 955368) Cepa de Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, patente européia acessível ao público No. 955368). Cepa de Raoultellaplanticola ATCC 33531

Apesar da cepa AJ13399 e da cepa AJ13410 serem classificadas como Klebsiella planticola no momento do depósito, Klebsiella planticola está atualmente classificada como Raoultella planticola (Drancourt, M., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 51: 925-32).

Exemplos das bactérias de rúmen incluem bactérias Mannheimia, bactérias Actinobacillus, bactérias Anaerobiospirillum, bactérias Pyrobacterium, e bactérias Selenomonas. Bactérias incluindo Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Selenomonas ruminantium, Veillonella parvula, Wolnella succinogenes, Anaerobiospirillum succiniciproducens, e semelhantes e podem ser usadas, sendo particularmente desejável usar Mannheimia succiniciproducens. Cepas específicas incluem cepa Mannheimia sp. 55E (KCTC0769BP, pedido publicado de patente U.S. No. 20030113885, publicação de patente internacional W02005/052135).

<1-1> Conferir capacidade para produzir substância ácida tendo um grupo carboxila

A seguir, métodos para conferir uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila para as bactérias ou métodos para otimizar uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila para as bactérias são descritos.

Para conferir uma capacidade de produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, métodos convencionalmente empregados na criação de bactérias para produzir substâncias por fermentação (ver "Amino Acid Fermentation", Japan Scientific Societies Press, primeira edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp. 77-100) podem ser aplicados. Tais métodos incluem a aquisição de um mutante auxotrófico, uma cepa resistente a análogo, ou um mutante da regulação metabólica, ou construção de uma cepa recombinante tendo expressão otimizada de uma enzima envolvida na biossíntese de substância ácida tendo um grupo carboxila. Na criação de bactérias que produzem uma substância ácida tendo um grupo carboxila, uma ou duas ou mais propriedades, como mutação auxotrófica, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica, podem ser conferidas. A expressão de uma ou duas ou mais enzimas envolvidas na biossíntese de substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser otimizada. Além disso, conferir as propriedades como mutação auxotrófica, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica pode ser combinado com a otimização das enzimas biossintéticas.

Uma cepa mutante auxotrófica para uma substância ácida tendo um grupo carboxila, uma cepa resistente para um análogo de uma substância ácida tendo um grupo carboxila, ou uma cepa mutante de regulação metabólica podem ser obtidas submetendo-se a cepa parental ou cepa de tipo selvagem a uma mutagênese convencional, como exposição aos raios X ou irradiação UV, ou tratamento com um mutagene como N-metil-N'- nitro-N-nitrosoguanidina, e então selecionando as que demonstram um autotrofia, resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica e que também tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila.

Métodos para conferir uma capacidade de produzir um aminoácido ou ácido orgânico para os microorganismos, e bactérias produzindo aminoácidos ou ácidos orgânicos serão especificamente exemplificados abaixo.

<Bactérias produzindo ácido L-glutâmico>

Exemplos do método de modificar um microorganismo para conferir a capacidade de produção de ácido L-glutâmico para o microorganismo incluem, por exemplo, modificar um microorganismo de modo que a expressão de um gene codificando para uma enzima envolvida na biossíntese de ácido L-glutâmico é otimizada. Exemplos da enzima envolvida em biossíntese de ácido L-glutâmico incluem glutamato desidrogenase (a seguir também referido como “GDH”) (gdh), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (a seguir também referido como “CS”)(gZM), metilcitrato sintase (a seguir também referido como "PRPC" (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (a seguir também referido como “PEPC”) (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase {end), fosfogliceromutase {pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase {pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase {gapA), triose fosfato isomerase {tpiA), frutose bisfosfato aldolase {fbp), fosfofrutoquinase {pfkA, pfkB), e glicose fosfato isomerase {pgi), e semelhantes. As abreviações em parêntese após os nomes da enzima são os nomes do gene correspondendo às enzimas. Dentre estas enzimas, uma ou mais dentre CS ou PRPC, PEPC e GDH são preferidas, e três enzimas são as mais preferidas.

Métodos para modificar um microorganismo para aumentar a expressão de um gene alvo será explicado abaixo.

O primeiro método consiste em aumentar o número de cópias de um gene alvo por clonagem do gene alvo em um plasmídeo apropriado e transformação de uma bactéria hospedeira com o plasmídeo obtido. Por exemplo, quando o gene alvo é o gene codificando para CS (gene gltÁ), o gene codificando para PEPC (gene ppc) ou o gene codificando para GDH (gene gdhA), as sequências de nucleotídeos destes genes de bactérias Escherichia e bactérias Corynebacterium já foram elucidados (Ner, S. et al., 1983, Biochemistry, 22: 5243-5249; Fujita, N. et al., 1984, J. Biochem., 95: 909-916; Valle, F. et al., 1984, Gene, 27:193-199; Microbiology, 140: 1817- 1828, 1994; Eikmanns, B.J. et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 218: 330-339; Bormann, E.R. et al., 1992, Molecular Microbiology, 6: 317-326), e deste modo eles podem ser obtidos por síntese dos iniciadores com base em sua respectiva sequência de nucleotídeos, e realizando PCR usando DNA cromossômico como o gabarito.

Exemplos dos plasmídeos usados para transformação incluem um plasmídeo que replica autonomamente na bactéria hospedeira pertencente à família Enterobacteriaceae, como pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG e pSTV são disponíveis de Takara Bio), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (vetores pMW são disponíveis de Nippon Gene), e semelhantes. Além disso, um DNA de fago também pode ser usado como o vetor em vez de um plasmídeo. Exemplos de plasmídeo para atividades simultaneamente otimizando CS ou PRPC, PEPC e GDH como descrito acima incluem RSFCPG que foi incorporado com o gene gltA, gene ppc e gene gdhA (fazer referência à patente européia acessível ao público No. 0952221), e RSFPPG correspondente a RSFCPG em que o gene gltA é substituído com o gene prpC.

Exemplos de métodos de transformação incluem tratar as células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade para DNA, o que foi relatado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53: 159-162), e preparar as células competentes dentre as células que estão na fase de crescimento, seguido por transformação com DNA, o que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., et al., 1977, Gene, 1: 153-167). Altemativamente, um método de tomar as células recipientes a DNA em protoplastos ou esferoplastos, que facilmente podem absorver DNA recombinante, seguido por introdução do DNA recombinante nas células, que é conhecido como sendo aplicável para Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., 1979, Molec. Gen. Genet., 168: 111-115; Bibb, M.J. et al., 1978, Nature, 274: 398- 400; Hinnen, A., et al., 1978, Proc. Natl. Sei., USA, 75: 1929-1933) também pode ser empregado. Além disso, microorganismos também podem ser transformados pelo método de pulso elétrico (patente japonesa acessível ao público No. 2-207791).

O número de cópias de um gene alvo também pode ser otimizado por introdução de cópias múltiplas do gene no DNA cromossômico do microorganismo. Cópias múltiplas de um gene podem ser introduzidas no DNA cromossômico por recombinação homóloga (Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) usando cópias múltiplas de uma sequência como alvos no DNA cromossômico. Como a presente sequência em cópias múltiplas no DNA cromossômico, DNAs repetitivos, e repetições invertidas presentes no final de um elemento transponível podem ser usados. Também, como descrito na patente japonesa acessível ao público No. 2-109985, é possível incorporar um gene alvo em um transposon, e permitir que ele seja transferido para introduzir cópias múltiplas do gene dentro do DNA cromossômico. O gene alvo também pode ser introduzido no cromossomo bacteriano por uso de fago Mu (patente japonesa acessível ao público No. 2-109985).

O segundo método consiste em aumentar a expressão do gene alvo substituindo uma sequência de expressão regulamentar do gene alvo, como promotor, no DNA cromossômico ou plasmídeo com um promotor mais forte. Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, etc. são conhecidos como promotores fortes. Além disso, também é possível introduzir a substituição de nucleotídeo para vários nucleotídeos em uma região promotora de um gene, de modo que o promotor é modificado para ser mais forte, ou modificar a sequência SD como descrito na publicação de patente internacional WOOO/18935. Exemplos de métodos para avaliar a potência de promotores e promotores fortes são descritos em um artigo de Goldstein et al. (Goldstein, M.A., e Doi, R.H., 1995, Biotechnol. Annu. Rev., 1: 105-128), etc.

Substituição de uma sequência de expressão regulatória pode ser realizada, por exemplo, no mesmo modo como em substituição do gene usando um plasmídeo sensível à temperatura. Exemplos de vetores tendo uma origem de replicação sensível à temperatura e utilizáveis para Escherichia coli e Pantoea ananatis incluem, por exemplo, o plasmídeo pMAN997 descrito na publicação internacional WO99/03988, e semelhantes. Além disso, substituição de uma sequência de expressão regulamentar também pode ser realizada pelo método chamado “Red-driven integration” usando recombinase de fago Red À, (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97: 6640-6645), o método combinando o método de "Red driven- integration" e o sistema excisivo de fago X, (Cho, E.H., et al., 2002, J. Bacteriol., 184: 5200-5203) (W02005/010175), e semelhantes. Modificação de uma sequência de expressão regulamentar pode ser combinada com aumento do número de cópias do gene.

Como mostrado no exemplo de referência 1, a cepa resistente a um produto de gene Red À,, por exemplo, a cepa de Pantoea ananatis SC17(0), pode ser preferivelmente usada para a "Red driven-integration". A cepa SC 17(0) foi depositada junto a Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Russia, 117545 Moscow 1, Dorozhny proezd. 1) em 21 de setembro de 2005 sob um número de acesso de VKPM B-9246.

Exemplos de microorganismos modificados pelo método descrito acima, de modo que a expressão de gene de citrato sintase, gene de metilcitrato sintase, gene de fosfoenolgene piruvato carboxilase e/ou glutamato desidrogenase é otimizada, incluem os microorganismos descritos na patente japonesa acessível ao público Nos. 2001-333769, 2000-106869, 2000-189169, 2000-333769, 2006-129840, W02006/051660, e semelhantes.

Além disso, a capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser melhorada por otimização da atividade de 6-fosfogluconato desidratase, atividade de 2-ceto-3-deóxi-6-fosfogluconato aldolase, ou ambas as atividades. Exemplos do microorganismo dos quais a atividade de 6- fosfogluconato desidratase e atividade de 2-ceto-3-deóxi-6-fosfogluconato aldolase são aumentadas, incluem o microorganismo descrito na patente japonesa acessível ao público No. 2003-274988.

A modificação para conferir a capacidade de produção de ácido L-glutâmico também pode ser atingida diminuindo-se ou eliminando-se a atividade de uma enzima que catalisa uma reação de ramificação de uma via biossintética de ácido L-glutâmico e produzindo um composto diferente de ácido L-glutâmico. Exemplos desta enzima catalisando uma reação de ramificação de uma via biossintética de ácido L-glutâmico e produzindo um composto diferente de ácido L-glutâmico incluem 2-oxoglutarato desidrogenase (sucA\ isocitrato liase (aceÁ), fosfato acetiltransferase (pta), acetato quinase (ack\ acetohidróxi ácido sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvl), formato acetiltransferase (pfl\ lactato desidrogenase (Idh), glutamato decarboxilase (gadAB), l-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase (putA), e semelhantes. Nomes de genes são indicados nos parênteses depois dos nomes das enzimas. É particularmente preferível diminuir ou eliminar a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase dentre estas enzimas.

A fim de diminuir ou eliminar as atividades das enzimas acima mencionadas, métodos semelhantes aos métodos para diminuir ou eliminar a atividade de lactato desidrogenase (LDH) descritos abaixo podem ser usados.

Diminuição ou deficiência de atividade intracelular da enzima de marcação e o grau em que a atividade é diminuído pode ser confirmada por medição da atividade da enzima de um extrato celular ou uma fração purificada dos mesmos obtida a partir de uma cepa candidata e comparando a mesma com a de uma cepa de tipo selvagem. Por exemplo, a atividade 2- oxoglutarato desidrogenase pode ser medida pelo método de Reed et al. (Reed L.J. e Mukherjee B.B., 1969, Methods in Enzymology, 13, pp. 55-61).

Métodos de eliminar ou diminuir a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase nas bactérias Escherichia são descritos na patente japonesa acessível ao público Nos. 5-244970, 7-203980 e semelhantes. Um método de eliminar ou diminuir a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase em bactérias corineformes é descrito na publicação de patente internacional WO95/34672. Além disso, tal método para bactérias Enterobacter é descrito na patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769.

Exemplos específicos de bactérias Escherichia que são deficientes na atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase ou em que a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase é diminuída incluem as seguintes cepas (patente U.S. Nos. 5.378.616 e 5.573.945). E. coli W3110sucA::Kmr. E. coli AJ12624 (FERM BP-3853). E. coli AJ12628 (FERM BP-3854). E. coli AJ12949 (FERM BP-4881). E. coli W3110sucA::Kmr é obtido por ruptura do gene 2- oxoglutarato desidrogenase (gene sue A) de Escherichia coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em 2-oxoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos específicos de bactérias em que uma atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase é deletada ou diminuída incluem as seguintes cepas: Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, patente européia acessível ao público No. 1078989). Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente US No. 6.331.419). Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646, W02005/085419). Cepa Klebsiella planticola AJ13410 (FERM BP-6617, Patente USNo. 6.197.559).

Cepa Brevibacterium lactofermentum ΔS (fazer referência a publicação de patente internacional WO95/34672).

A cepa SC17sucA é obtida por obtenção de uma cepa mutante de produção de flegma deficiente (SC 17) da cepa AJ13355, que foi isolada da natureza como uma cepa que podería proliferar em um meio contendo acido L-glutâmico e a fonte de carbono a pH baixo, e rompendo o gene de 2- oxoglutarato desidrogenase (sueA) da cepa mutante. A cepa AJ13601 é uma cepa obtida por introdução do plasmídeo RSFCPG contendo os genes gltA, ppc e gdhA derivados de Escherichia coli e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum na cepa SC17sucA para obter a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, e selecionar uma cepa resistente de ácido L-glutâmico de concentração elevada em um pH baixo, e uma cepa mostrando um grau de proliferação elevado e uma capacidade de produção elevada de ácido L-glutâmico da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB (patente européia acessível ao público No. 0952221). A cepa AJ13356 foi obtida por deleção do gene subunidade aKGDH-El (sucA) da cepa AJ13355.

A cepa SC17sucA recebeu um número privado de AJ417, depositada junto ao International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, código postal: 305-8566) em 26 de fevereiro de 2004, e recebeu um número de acesso de FERM BP- 08646.

A cepa AJ13410 foi depositada junto ao International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, código postal: 305-8566) em 19 de fevereiro de 1998, e recebeu um número de acesso de FERM P-16647. O depósito foi então convertido em uma depósito international sob as provisões de Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6617.

A cepas de Pantoea ananatis AJ13355, AJ13356, eAJ13601 e a cepa de Klebsiella planticola AJ13399 têm uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma concentração que excede a concentração de saturação de ácido L-glutâmico em um meio líquido quando ele é cultivado sob um condição ácida.

Além disso, a fim de otimizar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico das bactérias Enterobacteriaceae, o método de deletar o gene arcA (patente U.S. No. 7.090.998), e o método de amplificar o gene yhfK, que é um gene de excreção de ácido glutâmico (W02005/085419) também podem ser usados.

Diferente do acima, exemplos de bactérias corineformes tendo capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem as seguintes cepas.

Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 56-151495).

Brevibacterium flavum AJ12210 (FERM P-8123, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 61-202694).

Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 61-202694).

Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM-BP2205, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 2-186994).

Brevibacterium flavum DH18 (FERM P-11116, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 3-232497).

Corynebacterium melassecola DH344 (FERM P-11117, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 3-232497).

Corynebacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. No. 56-151495).

Microorganismos tendo capacidade de produção de ácido L- glutâmico incluem a cepa de Brevibacterium lactofermentum AJ13029 (FERM BP-5189, fazer referência a W096/06180), que foi produzida para ser capaz de produzir ácido L-glutâmico em um meio contendo quantidade excessiva de biotina na ausência de inibidor da ação de biotina por introdução de uma mutação para transmitir a sensibilidade à temperatura a um inibidor da ação de biotina como tensoativos. Exemplos ainda incluem microorganismos pertencentes ao gênero Alicyclobacillus e resistantes a um antimetabólito de ácido L-glutâmico (patente japonesa acessível ao público No. 11-262398).

Além disso, o microorganismo tendo a capacidade de produzir acido L-glutâmico pode ser um microorganismo tendo a propriedade de propriedade de degradação de ácido L-glutâmico diminuída, ou uma propriedade em que a expressão de operon maleato sintase (<2ceB)«isocitrato liase (αcβ^)’isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (aceK) (doravante abreviado como “operon ace”) se tomou constitutiva Exemplos de microorganismos tendo tal propriedade incluem, por exemplo, os seguintes.

Escherichia coli AJ12628 (FERM BP-3854) Escherichia coli AJ12624 (FERM BP-3853) A primeira é uma cepa mutante tendo tanto uma propriedade em que a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase é diminuída como uma propriedade em que a expressão do operon ace se tomou constitutiva e a última r é uma cepa mutante em que a atividade de 2-oxoglutarato desidrogenase é diminuída e a atividade de decomposição de ácido L- glutâmico é diminuída (fazer referência uma patente francesa No. 2680178).

Quando uma bactéria Pantoea é usada, ela preferivelmente tem tal mutação que ela produz extracelularmente produz menos flegma como comparado a uma cepa de tipo selvagem quando ela é cultivada em um meio contendo um sacarídeo. A fim de introduzir uma mutação proporcionando uma menor produção extracelular de flegma como comparado a uma cepa de tipo selvagem, qualquer um dentre o método de triagem para uma cepa não produzindo materiais viscosos no meio sólido, descrito na patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769, e um método de romper o operon ams envolvido na síntese de polissacarídeo pode ser usado. A sequência de nucleotídeo do operon ams envolvido na síntese de polissacarídeo é mostrada em SEQ ID NO: 66, e a sequência de aminoácidos de AmsH, I, A, C e B codificados por este operon são mostradas em SEQ ID NOS: 67, 68, 69, 70 e 71, respectivamente.

<Bactérias produzindo ácido succínico>

Como bactérias produzindo ácido succínico, cepas deficientes em capacidades para formar ácido acético, ácido láctico, etanol e ácido fórmico podem ser usadas, e exemplos específicos incluem a cepa de Escherichia coli SS373 (publicação de patente internacional WO99/06532).

Cepas deficientes em capacidades para formar ácido acético, ácido láctico, etanol e ácido fórmico podem ser obtidas por obtenção de uma cepa que não pode assimilar ácido acético e ácido láctico em um meio mínimo, ou por diminuição das atividades do gene de biossíntese de ácido láctico e enzimas de biossíntese de ácido acético descritas abaixo (publicação de patente internacional W02005/052135).

Além disso, tais cepas como descrito acima também podem ser obtidas conferindo resistência a ácido monofluoro acético (patente U.S. No. 5.521.075).

Outros exemplos do método para obter uma cepa em que a capacidade de produzir ácido succínico é otimizada incluem cultivar uma cepa que é deficiente em ambos formato liase e lactato desidrogenase e não pode assimilar ácido pirúvico em um meio enriquecido com glicose sob condições anaeróbicas, e isolar uma cepa mutante tendo uma capacidade para assimilar ácido pirúvico (publicação de patente internacional WO97/16528).

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser conferida por amplificação de um gene de enzima que está envolvido no sistema de biossíntese de ácido succínico descrito abaixo, ou deleção de um gene de enzima que catalisa uma reação de ramificação do sistema de biossíntese de ácido succínico para produzir outro composto.

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser conferida por modificação de um microorganismo de modo que a atividade enzimática de lactato desidrogenase (LDH, a seguir abreviações de nomes de enzima são indicados em parêntese), que é uma enzima de sistema de biossíntese de ácido láctico, diminui (publicação de patente internacionais W02005/052135, W02005/116227, patente U.S. No. 5.770.435, pedido publicado de patente U.S. No. 20070054387, publicação de patente internacional WO99/53035, Alam, K.Y. e Clark, D.P., 1989, J. Bacteriol., 171: 6213-6217). Alguns microorganismos podem ter L-lactato desidrogenase e D-lactato desidrogenase, e este microorganismo pode ser modificado de modo que as atividades de cada uma das enzimas, preferivelmente atividades de ambas as enzimas, são diminuída.

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser conferida por modificar um microorganismo de modo que a atividade enzimática da enzima do sistema de biossíntese de ácido fórmico, piruvato- formato liase (PFL), é diminuída (pedido publicado de patente U.S. No. 20070054387, publicação de patente internacional W02005/116227, WO2005/52135, Donnelly, M.I. et al., 1998, Appl. Biochem. Biotechnol., 70- 72: 187-198).

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser conferida por modificação de um microorganismo de modo que as atividades enzimáticas de fosfato acetiltransferase (PTA), acetato quinase (ACK), piruvato oxidase (POXB), acetil-CoA sintetase (ACS) e acetil-CoA hidrolase (ACH), que são enzimas de sistema de biossíntese de ácido acético, são diminuídas (pedido publicado de patente U.S. No. 20070054387, publicação de patente internacional W02005/052135, WO99/53035, W02006/031424, W02005/113745, e W02005/113744).

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser otimizada por modificação de um microorganismo de modo que a atividade enzimática de álcool desidrogenase (ADH), que é uma enzima de sistema de biossíntese de etanol, é diminuída (fazer referência à publicação de patente internacional WO 2006/031424).

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser otimizada por diminuição das atividades de piruvato quinase, glicose PTS (ptsG), proteína ArcA, proteína IclR (iclR), glutamato desidrogenase (gdJi) e/ou glutamina sintetase (ginA), e glutamato sintase (gltBD) (publicação de patente internacional WO 2006/107127, W02007007933, patente japonesa acessível ao público No. 2005-168401). Aqui indicado em parênteses seguindo os nomes da enzima são os nomes do gene.

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser conferida por otimização de uma enzima de sistema de biossíntese envolvida na produção de ácido succínico.

Uma capacidade para produzir ácido succínico também pode ser otimizada por melhora das atividades enzimáticas de piruvato carboxilase, enzima málica, fosfoenolpiruvato carboxilase, fumarase, fumarato redutase, malato desidrogenase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase (patente japonesa acessível ao público No. 11-196888, publicação de patente internacional WO 99/53035, Hong, S.H., e S.Y. Lee, 2001, Biotechnol. Bioeng., 74: 89-95, Millard, C.S. et al., 1996, Appl. Environ. Microbiol., 62: 1808-1810, publicação de patente internacional WO 2005/021770, patente japonesa acessível ao público No. 2006-320208, Kim, P. et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol., 70: 1238-1241). A otimização das atividades enzimáticas destas enzimas alvo pode ser realizada por referência aos métodos para otimizar a expressão de um gene alvo descrito, e os métodos para otimizar a expressão de gene ybjL descrito depois.

Exemplos específicos de bactérias produzindo ácido succínico pertencentes à família Enterobacteriaceae incluem as seguintes cepas.

Cepa de Escherichia coli SS373 (publicação de patente internacional WO 99/06532).

Cepa de Escherichia coli AFP111 (publicação de patente internacional WO 97/16528).

Cepa de Escherichia coli NZN111 (patente U.S. No. 6.159.738).

Cepa de Escherichia coli AFP184 (publicação de patente internacional WO 2005/116227).

Cepa de Escherichia coli SBS100MG, cepa SBS110MG, cepa SBS440MG, cepa SBS550MG, e cepa SBS660MG (publicação de patente internacional WO 2006/031424).

Exemplos de bactérias produzindo ácido succínico pertencentes às bactérias corineformes incluem as seguintes cepas.

Cepa de Brevibacterium flavum AB-41 (patente japonesa acessível ao público No. 11-113588).

Cepa de Brevibacterium flavum AB-41 (cepa amplificada por PC, patente japonesa acessível ao público No. 11-196888).

Cepa de Corynebacterium glutamicum AJ110655 (FERM BP- 10951).

Cepa de Brevibacterium flavum MJ233Δldh (publicação de patente internacional WO 2005/021770).

Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) 2256Δ (Idh, ach, pta, ack) (publicação de patente internacional W02005/113744).

Brevibacterium lactofermentum 2256Δ(ldh, pta, ack, poxB) (publicação de patente internacional W02005/113745)

Cepa de Corynebacterium glutamicum Rldh-/pCRB-l PC (publicação de patente internacional W02005/010182)

Exemplos de bactérias produzindo ácido succínico pertencente às bactérias de rúmen incluem as seguintes cepas.

Mannheimia succiniciproducens LPK, LPK7 e LPK4 (publicação de patente internacional WO 2005/052135).

Actinobacillus succinogenes 130Z (patente U.S. No. 5.504.004).

Anaerobiospirillum succiniciproducens FZ10 (patente U.S. No. 5.521.075).

Anaerobiospirillum succiniciproducens FZ53 (patente U.S. No. 5.573.931).

<l-2> Otimização da expressão de gene ybjL

O microorganismo da presente invenção pode ser obtido por modificação de um microorganismo que tem uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila como o descrito acima de modo que a expressão do gene ybjL é otimizada. No entanto, esta modificação em que a expressão do gene ybjL é otimizada é realizada primeiro, e então uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser conferida. Além disso, o microorganismo da presente invenção pode ser um microorganismo ao qual foi conferida a capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila ou microorganismo em que a capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila é otimizada por amplificação do gene ybjL .

O gene “ybjL” usado na presente invenção refere-se ao gene ybjL de Escherichia coli ou um homólogo do mesmo, o gene ybjL de Pantoea ananatis ou um homólogo do mesmo, ou o gene ybjL de Enterobacter aerogenes ou um homólogo do mesmo. Exemplos do gene ybjL de Escherichia coli incluem um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, preferivelmente um gene tendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 101 a 1783 em SEQ ID NO: 3. Além disso, exemplos do gene ybjL derivado de Pantoea ananatis incluem um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, preferivelmente um gene tendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 298 a 1986 em SEQ ID NO: 1. Além disso, exemplos do gene ybjL derivado da cepa de Enterobacter aerogenes AJ110673 incluem um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 87, preferivelmente um gene tendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 19 a 1704 em SEQ ID NO: 86. Além disso, exemplos do gene ybjL incluem um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 25 (SEQ ID NO: 24) como o gene ybjL derivado de Salmonella typhimurium, um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 27 (SEQ ID NO: 26) como o gene ybjL derivado de Yersinia pestis, um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 29 (SEQ ID NO: 28) como o gene ybjL derivado de Erwinia carotovora, um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31 (SEQ ID NO: 30) como o gene ybjL derivado de Vibrio cholerae, um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33 (SEQ ID NO: 32) como o gene ybjL derivado de Aeromonas hydrophila, um gene codificando para uma proteína tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 35 (SEQ ID NO: 34) como o gene ybjL derivado de Photobacterium profundum, e semelhantes. Além disso, o gene ybjL pode ser um clonado a partir de uma bactéria corineforme como Corynebacterium glutamicum e Brevibacterium lactofermentum, bactéria Pseudomonas como Pseudomonas aeruginosa, bactéria Mycobacterium como Mycobacterium tuberculosis ou outros, com base na homologia para os genes exemplificados acima. As sequências de aminoácidos das proteínas codificadas pelo gene ybjLs de Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Erwinia carotovora, Vibrio cholerae, Aeromonas hydrophila e Photobacterium profundum descrito acima são 96%, 90%, 88%, 64%, 60% e 68% homólogas para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4, respectivamente, e 86%, 90%, 84%, 63%, 60% e 67% homólogas para uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, respectivamente. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e 4 mostrou uma homologia de 86%. A sequência de consenso de SEQ ID NOS: 2 e 4 é mostrada em SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 4 e 87 mostrou uma homologia de 92%, e uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e 87 mostrou uma homologia de 83%. A sequência do gene ybjL da cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637 (SEQ ID NO: 86) e uma sequência de aminoácido codificado assim (SEQ ID NO: 87) foram recentemente encontradas pelos inventores da presente invenção. A seqüência de consenso da sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4 e 87 é mostrada em SEQ ID NO: 88.

O gene ybjL homólogo refere-se a um gene derivado de um microorganismo diferente de Escherichia coli, Pantoea ananatis e Enterobacter aerogenes, demonstrando uma elevada similaridade estrutural ara o gene ybjL de Escherichia coli, Pantoea ananatis ou Enterobacter aerogenes e codificando para uma proteína que melhora uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila de um microorganismo quando a expressão dos mesmos está otimizando o microorganismo. Exemplos de gene ybjL homólogo incluem genes codificando para uma proteína mostrando uma homologia de 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente preferivelmente 97% ou mais, em toda a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4 ou 87 ou uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4 ou 87, e melhorando uma capacidade para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila de um microorganismo quando a expressão da mesma é otimizada no microorganismo. O gene ybjL homólogo codificando para uma proteína mostrando uma homologia de 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente preferivelmente 97% ou mais, para qualquer uma dentre as sequências de aminoácidos acima mencionadas, pode ter uma seqüência de consenso de SEQ ID NOS: 5 ou 88, preferivelmente SEQ ID NO: 5. Homologia de sequência de aminoácidos e sequência de nucleotídeos pode ser determinada por uso, por exemplo, do algoritmo BLAST de Karlin e Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) ou FASTA (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Programas chamados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos com base neste algoritmo BLAST (fazer referência a www.ncbi.nlm.nih.gov). Neste Relatório, o termo "homologia" pode ser usado para fazer referência a "identidade".

O gene ybjL pode ser um gene tendo uma mutação conservativa como genes artificialmente modificados, desde que a otimização da expressão dos mesmos proporcione uma melhora na capacidade para produzir uma substância alvo de um microorganismo. Isto é, o gene ybjL pode ser um gene codificando para uma sequência de aminoácido de uma proteína existente, por exemplo, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 4, 25, 27, 29, 31, 33, 35 ou 87 incluindo uma mutação conservativa, especificamente, substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições. Apesar do número significado pelo termo “vários” usado aqui poder diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional da proteína ou tipos de resíduos de aminoácido, ele pode ser preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, particularmente preferivelmente 1 a 5. Além disso, o gene ybjL pode ser um gene codificando para uma proteína mostrando uma homologia de 70% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, particularmente preferivelmente 97% ou mais, na sequência completa de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 25, 27, 29, 31, 33, 35 ou 87, o que melhora a capacidade para produzir uma substância alvo de um microorganismo quando a expressão do mesmo é otimizada no microorganismo.

A substituição acima mencionada é preferivelmente uma substituição conservativa que é uma substituição neutra não proporcionando mudança funcional. A mutação conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente dentre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição for um aminoácido aromático; dentre Leu, Ile e Vai, se o sítio de substituição for um aminoácido hidrofóbico; dentre Gin e Asn, se ele for um aminoácido polar; dentre Lys, Arg e His, se ele for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se ele for um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se ele for um aminoácido tendo grupo hidroxila. Exemplos específicos de substituição considerados como substituição conservativa incluem: substituição de Ser ou Thr com Ala; substituição de Gin, His ou Lys com Arg; substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp com Asn; substituição de Asn, Glu ou Gin com Asp; substituição de Ser ou Ala com Cys; substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg com Gin; substituição de Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp com Glu; substituição de Pro com Gly; substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr com His; substituição de Leu, Met, Vai ou Phe com He; substituição de He, Met, Vai ou Phe com Leu; substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg com Lys; substituição de lie, Leu, Vai ou Phe com Met; substituição de Trp, Tyr, Met, He ou Leu com Phe; substituição de Thr ou Ala com Ser; substituição de Ser ou Ala com Thr; substituição de Phe ou Tyr com Trp; substituição de His, Phe ou Trp com Tyr; e substituição de Met, lie ou Leu com Vai.

Este gene pode ser obtido por modificação da sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 298 a 1986 em SEQ ID NO: 1, a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 101 a 1783 em SEQ ID NO: 3, a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 19 a 1704 em SEQ ID NO: 86, ou uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32 ou 34 por, por exemplo, mutagênese sítio específica, de modo que substituição, deleção, inserção ou adição de um resíduo de aminoácido ou resíduos está incluída em um sítio específico da proteína codificada. Além disso, este gene também pode ser obtido por um tratamento de mutação convencionalmente conhecido. Exemplos do tratamento de mutação incluem tratar um gene tendo uma dentre a sequência de nucleotídeos descrita acima com hidroxilamina ou outros in vitro, e tratar um microorganismo, por exemplo, uma bactéria Escherichia, contendo o gene com irradiação de raio ultravioleta ou um mutagene usado em um tratamento de mutação comum, como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou EMS (metanossulfonato de etila). A mutação para as substituições, deleções, inserções, adições, inserções ou outros de resíduos de aminoácido descritos acima também incluem uma mutação de ocorrência natural com base em diferença individual, diferença em espécie de microorganismos que contém o gene ybjL (mutante ou variante) e semelhantes.

O gene ybjL também pode ser um DNA hibridizável com um filamento complementar de DNA tendo a sequência de nucleotídeo de uma sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 298 a 1986 em SEQ ID NO: 1, DNA tendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 101a 1783 em SEQ ID NO: 3, DNA tendo a sequência de nucleotídeo de nucleotídeos números 19 a 1704 em SEQ ID NO: 86, ou DNA tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, 3, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ou 86, ou uma sonda que pode ser preparada de DNAs tendo estas sequências sob condições estringentes e codificando para uma proteína que melhora uma capacidade para produzir uma substância de um microorganismo quando a expressão dos mesmos é otimizada no microorganismo.

As “condições estringentes” referidas aqui incluem uma condição sob a qual um assim chamado híbrido específico é formado, e híbrido não específico não é formado. E difícil expressar claramente esta condição por uso de qualquer valor numérico. No entanto, as condições estringentes incluem, por exemplo, condições onde DNAs mostrando homologia elevada em cada outro, por exemplo, DNAs mostrando uma homologia de, por exemplo, não menos do que 80%, preferivelmente não menos do que 90%, mais preferivelmente não menos do que 95%, particularmente preferivelmente não menos do que 97%, hibridizam um com cada outro, e DNAs tendo homologia menor do que o nível acima não hibridizam um com cada outro, e condições de lavagem em hibridização Southern comum, isto é, condições de lavagem uma vez, preferivelmente duas vezes ou três vezes, em concentração de sal e temperatura de 1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65°C, ainda mais preferivelmente 0,1 xSSC, 0,1% SDS a 68°C.

A sonda pode ser uma sonda tendo a sequência parcial do gene ybjL. Esta sonda pode ser produzida por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base na sequência de nucleotídeo do gene e um fragmento de DNA incluindo o gene como o gabarito e realizado em um modo bem conhecido do versado. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como uma sonda, a condição de lavagem após hibridização sob a condição acima mencionada pode ser exemplificada por 2 x SSC, 0,1% SDS a 50°C.

As descrições acima mencionadas com referência ao homólogo de gene e mutação conservativa são similarmente aplicadas aos outros genes de enzimas descritos neste relatório.

A otimização de uma expressão do gene ybjL pode ser atingida aumentando o número de cópias do gene ybjL, modificando uma sequência de controle de expressão do gene ybjL, amplificando um regulador que aumenta a expressão do gene ybjL, ou deletando ou atenuando um regulador que diminui a expressão do gene ybjL, usando transformação ou recombinação homóloga realizada no mesmo modo como os métodos para otimizar a expressão de um gene alvo descrito acima para bactérias produzindo ácido L- glutâmico.

No microorganismo da presente invenção, atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila é preferivelmente otimizada por melhora de uma expressão do gene ybjL . Se "a atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila for otimizada” ela pode ser confirmada por comparação da quantidade de uma substância ácida tendo um grupo carboxila excretado em um meio em que o microorganismo da presente invenção é cultivado com a quantidade do mesmo obtido por cultivo de um microorganismo de controle em que o gene ybjL não é introduzido. Isto é, a “melhora em uma atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila” é observada como aumento da concentração de uma substância ácida tendo um grupo carboxila acumulada no meio em que o microorganismo da presente invenção é cultivado como comparado com a concentração obtida com um microorganismo de controle. Além disso, a "melhora em uma atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila” também é observada como uma diminuição na concentração intracelular de uma substância ácida tendo um grupo carboxila no microorganismo da presente invenção. Com relação à melhora da “atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila”, a concentração intracelular de uma substância ácida tendo um grupo carboxila preferivelmente diminui por 10% ou mais, mais preferivelmente 20% ou mais, particularmente preferivelmente 30% ou mais, como comparado com a concentração de uma cepa em que a expressão do gene ybjL não é otimizada. A “atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila” absoluta de um microorganismo pode ser detectada por medição de uma diferença de concentrações intracelular e extracelular de uma substância ácida tendo um grupo carboxila. Além disso, a “atividade para excretar uma substância ácida tendo um grupo carboxila” também pode ser detectada por medição da atividade para absorver aminoácidos em células usando vesículas de membrana revertidas com um radioisótopo (J. Biol. Chem., 2002, vol. 277, No. 51, pp. 49841-49849). Por exemplo, a atividade pode ser medida por preparação das vesículas de membrana revertidas de células em que o gene ybjL é expressado, adição de um substrato servindo como uma força de direção como ATP, e medição da atividade para ácido glutâmico rotulado RI. Além disso, a atividade também pode ser medida por detecção de uma mudança da taxa de reação de substância ácida rotulada tendo um grupo carboxila e substância ácida não rotulada tendo um grupo carboxila em bactérias vivas.

O microorganismo da presente invenção pode ser um microorganismo tendo uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em um meio líquido em uma quantidade maior do que a quantidade provendo a concentração de saturação de ácido L-glutâmico quando ele é cultivado sob condições ácidas (esta capacidade também é referida como a capacidade de acúmulo de “ácido L-glutâmico sob condições ácidas” a seguir). Este microorganismo pode ser um microorganismo que acabou tendo uma capacidade de acúmulo de ácido L-glutâmico sob condições ácidas por otimização de uma expressão do gene ybjL, ou um microorganismo que originalmente tinha a capacidade de acúmulo de ácido L-glutâmico sob condições ácidas.

Exemplos específicos de microorganismos tendo a capacidade de acúmulo de ácido L-glutâmico sob condições ácidas incluem a cepa de Pantoea ananatis AJ13355 acima mencionada (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) (para estes, fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769), e semelhantes. As cepas de Pantoea ananatis AJ13355 e AJ13356 foram depositadas junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, National Institute of Bioscience and Human- Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Address: Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japan) em 19 de fevereiro de 1998 e receberam os números de acesso de FERM P-16644 e FERM P-16645. Os depósitos foram então convertidos em depósito international sob as provisões de Tratado de Budapeste em 11 de Janeiro de 1999 e receberam os números de acesso de FERM BP-6614 e FERM BP-6615. A cepa AJ13601 foi depositada junto ao National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) em 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM P-17516. O depósito foi convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 06 de julho de 2000 e recebeu um número de acesso de FERM BP-7207. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando elas foram isoladas e depositadas como cepas de Enterobacter agglomerans AJ13355, AJ13356 e AJ13601. No entanto, elas foram recentemente re-classificadas como Pantoea ananatis com base na sequência de nucleotídeos de 16S rRNA e semelhantes.

Quando um ácido orgânico, especialmente ácido succínico, é produzido pelo método da presente invenção, uso de um microorganismo é modificado de modo que as atividades de uma ou mais enzimas dentre lactato desidrogenase (LDH), álcool desidrogenase (ADH), e piruvato formato liase (PFL) são diminuídas. Além disso, quando a expressão do gene ybjL é aumentada, este se toma mais eficaz.

A expressão "modificada de modo que a atividade de lactato desidrogenase é diminuída" usada aqui significa que a atividade de lactato desidrogenase é diminuída como comparado com a de uma cepa não modificada de lactato desidrogenase. A atividade de lactato desidrogenase é preferivelmente diminuída a 10% por célula ou inferior como comparado à de uma cepa não modificada de lactato desidrogenase. A atividade de lactato desidrogenase pode ser completamente deletada. A diminuição da atividade de lactato desidrogenase pode ser confirmada por medição da atividade de lactato desidrogenase por um método conhecido (Kanarek, L. and Hill, R.L., 1964, J. Biol. Chem., 239: 4202). Exemplos específicos do método para produzir uma cepa mutante de Escherichia coli em que a atividade de lactato desidrogenase é diminuída incluem o método descrito em Alam, K.Y., e Clark, D.P., 1989, J. Bacteriol., 171: 6213-6217, e semelhantes. O microorganismo da presente invenção em que a atividade de lactato desidrogenase é diminuída e expressão do gene ybjL é otimizada pode ser obtido por, por exemplo, preparação de um microorganismo em que o gene LDH é rompido, e transformando este microorganismo com um vetor recombinante contendo o gene ybjL, como descrito no exemplo 1 descrito depois. No entanto, uma dentre a modificação para diminuir a atividade de LDH e uma dentre a modificação para otimizar a expressão do gene ybjL pode ser realizada primeiro. Em Escherichia coli, LDH é codificado pelos genes IdhA e UdD. A sequência de DNA do gene IdhA é mostrada em SEQ ID NO: 36, a sequência de aminoácido assim codificada é mostrada em SEQ ID NO: 37, a sequência de DNA do gene UdD é mostrada em SEQ ID NO: 38, e a sequência de aminoácido assim codificada é mostrada em SEQ ID NO: 39.

A fim de diminuir ou deletar a atividade de LDH, uma mutação que diminui ou deleta a atividade intracelular de LDH pode ser introduzida no gene LDH em um cromossomo por um método de mutagênese comum. Por exemplo, isto pode ser atingido por deleção do gene codificando para LDH em um cromossomo, ou modificação de uma sequência de controle de expressão como um promotor e a sequência Shine-Dalgamo (SD) por recombinação de gene. Além disso, também pode ser atingido introduzindo uma mutação para substituição de aminoácido (mutação sentido errado), ou um códon de parada (mutação não sentido), ou uma mutação de deslocamento de quadro que aumenta ou deleta um ou dois nucleotídeos em uma região codificando para LDH em um cromossomo, ou deletando o gene parcialmente ou completamente (Qiu Z. e Goodman M.F., 1997, J. Biol. Chem., TT2:. 8611- 8617). Além disso, a atividade de LDH também pode ser diminuída ou deletada por ruptura do gene, por exemplo, por construção de um gene codificando para um mutante LDH do qual a região de codificação é deletada, e substituindo o gene construído para o gene LDH normal em um cromossomo por recombinação homóloga ou outros, ou por introdução de um transposon ou fator IS no gene.

A fim de introduzir uma mutação para diminuir ou deletar a atividade de LDH por recombinação genética, por exemplo, os seguintes métodos são usados. O gene LDH em um cromossomo pode ser substituído com um gene mutante por preparação de um gene LDH mutante em que a sequência parcial do gene LDH é modificada de modo que ele não produz uma enzima que pode funcionar normalmente, e transformar uma bactéria com um DNA contendo o gene mutante para causar recombinação homóloga entre o gene mutante e o gene em um cromossomo. Tal mutagênese sítio específica com base em substituição de gene utilizando recombinação homóloga já foi estabelecida, e inclui um método chamado "Red driven integration" desenvolvido por Datsenko e Wanner (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6640-6645), um método de usar um DNA linear como um método utilizando o método "Red driven integration" em combinação com um sistema de excisão derivado de fago X (Cho, E.H., et al., 2002, J. Bacteriol., 184: 5200-5203), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (patente U.S. No. 6.303.383, patente japonesa acessível ao público No. 05- 007491, W02005/010175), e semelhantes. Esta mutagênese sítio específica baseada na substituição de genes, usando recombinação homóloga como descrito acima, também pode ser realizada usando um plasmídeo não tendo a capacidade para replicar em um hospedeiro.

A expressão "modificada de modo que a atividade de álcool desidrogenase é diminuída" usada aqui significa que a atividade de álcool desidrogenase é diminuída como comparado com a de uma cepa não modificada de álcool desidrogenase. A atividade de álcool desidrogenase é preferivelmente diminuída a 10% por célula ou menor, como comparado a uma cepa não modificada de álcool desidrogenase. A atividade de álcool desidrogenase pode ser completamente deletada. A diminuição da atividade de álcool desidrogenase pode ser confirmada medindo a atividade de álcool desidrogenase por um método conhecido (Lutstorf, U.M. et al., 1970, Eur. J. Biochem., 17: 497-508). Exemplos específicos do método para produzir uma cepa mutante de Escherichia coli em que a atividade de álcool desidrogenase é diminuída incluem o método descrito em Sanchez A.M. et al., 2005, Biotechnol. Prog., 21: 358-365, e semelhantes. O microorganismo da presente invenção em que a atividade de álcool desidrogenase é diminuída e expressão 5 do gene ybjL é otimizada pode ser obtido por, por exemplo, preparação de um microorganismo em que um gene codificando para álcool desidrogenase (ADH) é rompido, e transformação deste microorganismo com um vetor recombinante contendo o gene ybjL. No entanto, uma dentre modificação para diminuir a atividade de ADH e uma dentre modificação para otimizar a 10 expressão do gene ybjL pode ser realizada primeiro. A atividade de álcool desidrogenase pode ser diminuída por um método similar ao método para diminuir a atividade de lactato desidrogenase descrito acima. Como o gene ADH (adhEj Enterobacter aerogenes, a sequência de nucleotídeo (sequência parcial) do gene ADH da cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637 (FERM 15 ABP-10955) é mostrada em SEQ ID NO: 74. A sequência de nucleotídeo completa deste gene pode ser determinada por, por exemplo, isolamento do gene ADH ÇadhE) a partir do DNA cromossômico de Enterobacter aerogenes com base em tal sequência parcial.

A expressão "modificada de modo que a atividade de piruvato 20 formato liase é diminuída" usada aqui significa que a atividade de piruvato formato liase é diminuída como comparado com a de uma cepa não modificada de piruvato formato liase. A atividade de piruvato formato liase é preferivelmente diminuída a 10% por célula ou inferior como comparado a uma cepa não modificada de piruvato formato liase. A atividade de piruvato 25 formato liase pode ser completamente deletada. A diminuição da atividade de piruvato formato liase pode ser confirmada por medida da atividade de piruvato formato liase por um método conhecido (Knappe, J. e Blaschkowski, H.P., 1975, Meth. Enzymol., 41: 508-518). O microorganismo da presente invenção em que a atividade de piruvato formato liase é diminuída e expressão do gene ybjL é otimizada pode ser obtido por, por exemplo, preparação de um microorganismo em que o gene PFL é rompido, e transformação deste microorganismo com um vetor recombinante contendo o gene ybjL. No entanto, uma dentre modificação para diminuir a atividade de PFL e uma modificação para otimizar a expressão de ybjL pode ser realizada primeiro. A atividade de piruvato formato liase pode ser diminuída por um método similar ao método para diminuir a atividade de lactato desidrogenase descrito acima.

Quando um ácido orgânico, especialmente ácido succínico, é produzido pelo método da presente invenção, uma bactéria é modificada de modo que a atividade de piruvato carboxilase (PC) é otimizada. Além disso, de modo que a expressão do gene ybjL seja otimizada, ela também pode ser usada. A otimização da atividade de piruvato carboxilase pode ser combinada com diminuição da atividade de lactato desidrogenase, atividade de álcool desidrogenase, e/ou atividade de piruvato formato liase. A expressão "modificada de modo que a atividade de piruvato carboxilase é otimizada" significa que a atividade de piruvato carboxilase é aumentada como comparada com a de uma cepa não modificada como uma cepa de tipo selvagem ou cepa parental. A atividade de piruvato carboxilase pode ser medida por, por exemplo, um método de medição da diminuição de NADH como descrito depois.

Como o gene PC usado no método da presente invenção, usa- se um gene tendo uma sequência de nucleotídeo já determinada ou um gene obtido isolando um fragmento de DNA codificando uma proteína tendo a atividade de PC de um cromossomo de um microorganismo, animal, planta, ou outros e determinando a sequência de nucleotídeo. Depois da sequência de nucleotídeo ser determinada, um gene sintetizado com base nesta sequência pode ser usado.

Como o gene PC, um gene PC derivado de uma bactéria corineforme como Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch, P.G. et al., 1998, Microbiology, vol. 144: 915-927) pode ser usado. Além disso, desde que as funções de PC codificado, isto é, as propriedades de estar envolvido na fixação de dióxido de carbono, não sejam substancialmente degradadas, uma parte de nucleotídeos em uma sequência de nucleotídeo do gene PC pode ser substituída com outros nucleotídeos, deletada, ou inserida com outro ou outros nucleotídeos. Altemativamente, uma parte de uma sequência de nucleotídeo pode ser transferida.

Os genes PC obtidos a partir de bactérias diferentes de Corynebacterium glutamicum, outros microorganismos, animais e plantas também podem ser usados. Em particular, sequências dos genes PC derivados de microorganismos, animais e plantas descritas abaixo são conhecidas (referências são indicadas abaixo), e elas podem ser obtidas por hibridização ou amplificação por PCR das porções ORF realizadas do mesmo modo como descrito acima. Humano [Biochem. Biophys. Res. Comm., 202, 1009-1014, (1994)] Camundongo [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 1766-1779, (1993)] Rato [GENE, 165, 331-332, (1995)] Levedura: Saccharomyces cerevisiae [Mol. Gen. Genet., 229, 307-315, (1991)], Schizosaccharomycespombe [DDBJ acesso No.; D78170] Bacillus stearothermophilus [GENE, 191, 47-50, (1997)] Rhizobium etli [J. Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)]

O gene PC pode ser otimizado no mesmo modo como os usados para otimizar a expressão de um gene alvo descrito acima para bactérias produzindo ácido L-glutâmico e otimizar a expressão do gene ybjL

<2> Método para produzir substância ácida tendo um grupo carboxila da presente invenção

Uma substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser produzida por cultivo do microorganismo da presente invenção em um meio para produzir e acumular uma substância ácida tendo um grupo carboxila no meio e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila a partir do meio. Além disso, uma substância ácida tendo um grupo carboxila também pode ser produzida deixando-se o microorganismo da presente invenção, ou um produto obtido por processamento do microorganismo, atuar em uma matéria prima orgânica em uma mistura de reação contendo íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono de modo a produzir a substância ácida tendo um grupo carboxila, e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila. O primeiro método é preferido quando a substância ácida tendo um grupo carboxila é um aminoácido ácido. O último método é preferido quando a substância ácida tendo um grupo carboxila é um ácido orgânico. A seguir, as formas de realização preferidas de produção de um aminoácido ácido e um ácido orgânico como substância ácida tendo um grupo carboxila serão exemplificadas.

<2-1> Produção de aminoácido ácido

Um aminoácido ácido pode ser produzido por cultivo de um microorganismo da presente invenção em um meio para produzir e acumular um aminoácido ácido no meio e coletar um aminoácido ácido a partir do meio.

Como o meio usado para a cultura, um meio comum contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais inorgânicos assim como quantidades de traço de nutrientes orgânicos como aminoácidos e vitaminas como requerido pode ser usado. Ou um meio sintético ou meio natural pode ser usado. A fonte de carbono e fonte de nitrogênio usada no meio pode ser de qualquer tipo desde que as substâncias que podem ser utilizadas por uma cepa a ser cultivada sejam escolhidas.

Como uma fonte de carbono, sacarídeos como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, mannose, galactose, hidrolisado de amido e melaços podem ser usados. Além disso, álcoois como etanol podem ser usados independentemente ou em combinação com outra fonte de carbono. Além disso, ácidos orgânicos como ácido acético e ácido cítrico diferente de uma substância alvo também podem ser usados como uma fonte de carbono. Como uma fonte de nitrogênio, amónia, sais de amónio como sulfato de amónio, carbonato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio e acetato de amónio, nitratos e semelhantes podem ser usados. Como a quantidade de traço, nutrientes orgânicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléicos, os contendo as substâncias como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produtos de decomposição de proteína de soja podem ser usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido ou outros para crescimento é usada, o nutriente requerido é preferivelmente suplementado. Como sais minerais, fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e semelhantes podem ser usados.

A cultura é preferivelmente realizada como cultura de aeração, enquanto a temperatura de fermentação é controlada para ser de 20 a 45°C, e pH para ser de 3 a 9. Quando pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado pela adição de, por exemplo, carbonato de cálcio, ou com um alcalino como gás de amónia. Um aminoácido ácido é acumulado no caldo de cultura preferivelmente após 10 a 120 horas de cultura sob tais condições como descrito acima.

Quando o aminoácido ácido é ácido L-glutâmico, a cultura pode ser realizada com precipitação de ácido L-glutâmico no meio por uso de um meio líquido ajustado para ter uma condição sob a qual o ácido L- glutâmico é precipitado. A condição sob a qual o ácido L-glutâmico é precipitado é, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente pH 4,0.

Após completar a cultura, ácido L-glutâmico pode ser coletado do meio de cultura por métodos de coleta conhecidos. Por exemplo, ácido L- glutâmico pode ser coletado por, após as células serem removidas do meio de cultura, concentrando o meio de cultura para cristalizar, ou por cromatografia de troca iônica ou outros. Quando a cultura é realizada sob condições para precipitar ácido L-glutâmico, ácido L-glutâmico precipitado no meio pode ser coletado por centrifugação, filtração ou outros. Neste caso, também é possível cristalizar ácido L-glutâmico dissolvido no meio e então coletar o ácido L- glutâmico precipitado no caldo de cultura junto com o ácido L-glutâmico cristalizado.

<2-2> Produção de ácido orgânico

Um ácido orgânico pode ser produzido deixando o microorganismo da presente invenção ou um produto obtido por processamento do microorganismo atuar em uma matéria prima orgânica em uma mistura de reação contendo íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono para produzir o ácido orgânico, e coletar um ácido orgânico.

Na primeira forma de realização, por cultivo d o microorganismo em um meio contendo íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono, e uma matéria prima orgânica, proliferação do microorganismo e produção do ácido orgânico são simultaneamente atingidos. Nesta forma de realização, o meio corresponde à mistura de reação. Proliferação do microorganismo e produção do ácido orgânico podem ser simultaneamente atingidas, ou pode-se ter um período de cultura em que a proliferação do microorganismo é principalmente atingida, e um período de cultura em que a produção do ácido orgânico é principalmente atingida.

Na segunda forma de realização, ao deixar as células proliferarem por cultura em um meio para coexistir com uma mistura de reação contendo íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono, e uma matéria prima orgânica, e assim deixar o microorganismo atuar na matéria prima orgânica na mistura de reação, um ácido orgânico é produzido. Nesta forma de realização, um produto obtido por processamento das células do microorganismo também pode ser usado. Exemplos do produto obtido por processamento das células incluem, por exemplo, células imobilizadas obtidas por imobilização das células com acrilamida, carragenano, ou outros, produto rompido, obtido por ruptura das células, sobrenadante de centrifugação do produto rompido, fração obtida por purificação parcial do sobrenadante por tratamento com sulfato de amónio ou outros, e semelhantes.

Apesar das bactérias usadas para a cultura poderem ser as obtidas em um meio sólido como meio ágar por cultura inclinada, as cultivadas antes em um meio líquido (cultura de semente) são preferidas. Como o meio usado para a cultura, um meio geralmente usado para cultura de microorganismos pode ser usado. Por exemplo, um meio geralmente usado obtido por adição de nutrientes naturais como extrato de carne, extrato de levedura e peptona, para uma composição compreendendo sais inorgânicos como sulfato de amónio, fosfato de potássio e sulfato de magnésio pode ser usado.

Na primeira forma de realização acima mencionada, a fonte de carbono adicionada no meio também serve como a matéria prima orgânica para a produção do ácido orgânico.

Na segunda forma de realização acima mencionada, as células após a cultura são coletadas por centrifugação, separação de membrana, ou outros, e usadas na reação de produção de ácido orgânico.

A matéria prima orgânica usada no método da presente invenção não é particularmente limitada, desde que uma fonte de carbono cujo microorganismo da presente invenção pode assimilar para produzir ácido succínico seja usada. No entanto, carboidratos fermentáveis incluindo carboidratos como galactose, lactose, glicose, frutose, glicerol, sacarose, sacarose, amido e celulose, poliálcoois como glicerina, manitol, xilitol e ribitol, e semelhantes são geralmente usados. Dentre estes, glicose, frutose e glicerol são preferidos, e glicose é particularmente preferida. Quando o ácido orgânico é ácido succínico, ácido fumárico ou outros podem ser adicionados a fim de eficientemente produzir ácido succínico como descrito na patente japonesa acessível ao público No. 5-68576, e ácido málico pode ser adicionado em vez de ácido fumárico.

Além disso, uma solução de amido sacarificada, melaços, ou outros contendo os carboidratos fermentáveis acima mencionados também podem ser usados. Os carboidratos fermentáveis podem ser usados independentemente ou em combinação. Apesar da concentração da matéria prima orgânica acima mencionada não ser particularmente limitada, é mais vantajoso que a concentração seja tão elevada quanto possível dentro de uma faixa em que a cultura do microorganismo e a produção do ácido orgânico não sejam inibidas. Na primeira forma de realização acima mencionada, a concentração da matéria prima orgânica no meio está geralmente na- faixa de 5 a 30% (p/v), preferivelmente 10 a 20% (p/v). Além disso, na segunda forma de realização acima mencionada, a concentração da matéria prima orgânica na mistura de reação está geralmente na faixa de 5 a 30% (p/v), preferivelmente 10 a 20% (p/v). Além disso, a matéria prima orgânica pode ser suplementada junto com diminuição da matéria prima orgânica com o progresso da cultura ou reação.

A mistura de reação acima mencionada contendo íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono e uma matéria prima orgânica não é particularmente limitada, e pode ser, por exemplo, um meio para cultivar microorganismos, ou pode ser um tampão como tampão fosfato. A mistura de reação é preferivelmente uma solução aquosa contendo a fonte de nitrogênio, sais inorgânicos, e semelhantes. A fonte de nitrogênio não é particularmente limitada desde que uma fonte de nitrogênio que o microorganismo da presente invenção pode assimilar para produzir um ácido orgânico seja escolhida, e exemplos específicos incluem vários compostos de nitrogênio orgânico ou inorgânico como sais de amónio, nitratos, uréia, hidrolisado de soja, produtos de degradação de caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de carne e licor de infusão de milho. Exemplos dos sais inorgânicos incluem vários fosfatos, sulfatos, e sais metálicos como os de magnésio, potássio, manganês, ferro, e zinco. Se necessário, fatores promotores do crescimento incluindo vitaminas como biotina, ácido pantotênico, inositol, e ácido nicotínico, nucleotídeos, aminoácidos e semelhantes são adicionados. A fim de suprimir a espumação no momento da reação, é desejável adicionar uma quantidade apropriada de um antiespumante comercialmente disponível no meio. pH de uma mistura de reação pode ser ajustado por adição de carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de potássio, carbonato de magnésio, hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, ou outros. Porque o pH para a reação é geralmente 5 a 10, preferivelmente 6 a 9,5, o pH de uma mistura de reação é ajustado para estar dentro da faixa acima mencionada com uma substância alcalina, carbonato, uréia, ou outros mesmo durante a reação, se necessário.

Como uma mistura de reação usada na presente invenção, água, tampão, meio ou outros é usada, mas um meio é o mais preferido. O meio pode ser feito para conter, por exemplo, a matéria prima orgânica acima mencionada, e íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono, e a reação pode ser realizada sob condições anaeróbicas. Os íons carbonato ou bicarbonato são supridos a partir do carbonato de magnésio, carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, carbonato de potássio, ou bicarbonato de potássio, que também pode ser usado como um agente neutralizante. No entanto, se necessário, íons carbonato ou bicarbonato também podem ser supridos a partir do ácido carbônico ou ácido bicarbônico ou sais dos mesmos ou gás dióxido de carbono. Exemplos específicos dos sais de ácido carbônico ou ácido bicarbônico incluem, por exemplo, carbonato de magnésio, carbonato de amónio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de amónio, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, e semelhantes. Ions carbonato ou ions bicarbonato podem ser adicionados em uma concentração de 0,001 a 5 M, preferivelmente 0,1 a 3 M, mais preferivelmente 1 a 2 M. Quando gás de dióxido de carbono está contido, gás dióxido de carbono está contido em uma quantidade de 50 mg a 25 g, preferivelmente 100 mg a 15 g, mais preferivelmente 150 mg a 10 g, por litro da solução.

A temperatura de crescimento ótimo do microorganismo usada para a reação está geralmente na faixa de 25 a 40°C. A temperatura de reação está geralmente na faixa de 25 a 40°C, preferivelmente na faixa de 30 a 37°C. Quantidade de células bacterianas na mistura de reação é, apesar de não ser particularmente limitada, 1 a 700 g/L, preferivelmente 10 a 500 g/L, mais preferivelmente 20 a 400 g/L. Um tempo de reação é preferivelmente 1 a 168 horas, mais preferivelmente 3 a 72 horas. A reação pode ser realizada em batelada ou na coluna.

Cultura de bactérias é preferivelmente realizada sob condições aeróbicas. Por outro lado, a reação de produção de ácido orgânico pode ser realizada sob condições aeróbicas, condições microaeróbicas ou condições anaeróbicas. Para uma reação sob condições microaeróbicas ou condições anaeróbicas, um método de realizar a reação em um vaso de reação vedado sem aeração, um método de realizar a reação com suprimento de um gás inerte como gás de nitrogênio na mistura de reação, um método de realizar a reação suprindo um gás inerte contendo dióxido de carbono como uma mistura de reação, e semelhantes podem ser usados.

O ácido orgânico acumulado na mistura de reação (meio de cultura) pode ser separado e purificado a partir de uma mistura de reação em um modo convencional. Especificamente, sólidos como células bacterianas podem ser removidos por centrifugação, filtração, ou outros, então a solução resultante pode ser dessalinizada com uma resina de troca iônica, ou semelhantes, e o ácido orgânico pode ser separado e purificado a partir da solução por cristalização ou cromatografia de coluna.

Além disso, na presente invenção, quando o ácido orgânico de marcação é ácido succínico, depois do ácido succínico ser produzido pelo método da presente invenção descrito acima, uma reação de polimerização pode ser realizada por uso do ácido succínico obtido como uma matéria prima para produzir um polímero contendo ácido succínico. Nos últimos anos, com o aumento de produtos industriais ambientalmente amigáveis, polímeros preparados a partir de matérias primas de origem de plantas vêm atraindo atenções. Acido succínico produzido na presente invenção pode ser convertido em polímeros como poliésteres e poliamidas e usados (patente japonesa acessível ao público No. 4-189822). Exemplos específicos de polímeros contendo ácido succínico incluem ácido succínico poliésteres obteníveis por polimerização de um diol como butanodiol e etileno glicol e ácido succínico, poliamidas de ácido succínico obteníveis por polimerização de uma diamina como hexametilenodiamina e ácido succínico, e semelhantes. Além disso, polímeros contendo ácido succínico e ácido succínico obtidos pelo método de produção da presente invenção, e composições contendo os mesmos podem ser usadas como aditivos de alimentos, agentes farmacêuticos, cosméticos, e semelhantes.

Exemplos

A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos exemplos.

Exemplo de referência 1: Construção de cepa de Pantoea ananatis resistente a um produto de gene Red de λ

A fim de realizar a ruptura de gene sdhA em Pantoea ananatis, foi construída uma cepa recipiente para realizar de modo eficiente o método chamado "Red-driven integration" ou "Red-mediated integration" (Datsenko, KA. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640-6645). Primeiro, o plasmídeo auxiliar novo RSF-Red-TER que expressa os genes gam, bet e exo de X (doravante referido como "genes Red X ") foi construído (fig. 1). Os detalhes dos mesmos serão descritos no exemplo de referência 2.

Este plasmídeo pode ser usado em uma faixa ampla de hospedeiros tendo antecedentes genéticos diferentes. Isto é porque: 1) este plasmídeo tem o replicon do plasmídeo de espectro de hospedeiro amplo RSF1010 (Scholz, et al., 1989, Gene, 75: 271-288; Buchanan-Wollaston et al., 1987, Nature, 328: 172-175), que é estavelmente mantido por vários tipos de bactérias gram negativa e gram positiva, e mesmo em células de planta, 2) os genes X Red, genes gam, bet e exo, estão sob o controle do promotor PlacUV5, que é reconhecido pelas RNA polimerases de vários tipos de bactérias (por exemplo, Brunschwig, E. e Darzins, A., 1992, Gene, 111, 1, 35- 41; Dehio, M. et al, 1998, Gene, 215, 2, 223-229), e 3) o fator de autorregulação PlacUV5-lacI e o terminador de transcrição não dependente de p (TrmB) do operon rrnB de Escherichia coli inferior ao nível de expressão basal dos genes X Red (Skorokhodova, A.Y. et al, 2004, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21). Além disso, o plasmídeo RSF-Red-TER contém o gene levansucrase (sacB), e por uso deste gene, o plasmídeo pode ser coletado das células em um meio contendo sacarose.

Em Escherichia coli, a frequência de integração de um fragmento PCR gerado de DNA junto com a região de flanco curto provida pelo plasmídeo RSF-Red-TER é tal elevada como a de uma frequência obtida quando usando o plasmídeo auxiliar pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645). No entanto, a expressão dos genes X Red é tóxica para Pantoea ananatis. Células transformadas com o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER crescem extremamente lentamente em meio LB contendo IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo, 1 mM) e um antibiótico apropriado (25 μg/ml de cloranfenicol ou 40 μg/ml de canamicina), e a eficiência de recombinação mediada por X Red é extremamente baixa (10‘8), se observada de todo.

Uma cepa variante de Pantoea ananatis que é resistente a expressão de todos os três genes X Red foi selecionada. Para este propósito, o plasmídeo RSF-Red-TER foi introduzido na cepa de Pantoea ananatis SC 17 (patente U.S. No. 6.596.517) por eletroporação. Após uma cultura de 18 horas, cerca de 106 transformantes foram obtidos, e dentre estes, 10 clones formaram colônias de um tamanho grande, e todos os restantes formaram colônias extremamente pequenas. Após uma cultura de 18 horas, as colônias grandes foram de cerca de 2 mm, e as colônias pequenas foram de cerca de 0,2 mm. Apesar das colônias pequenas não crescerem ainda mais mesmo quando a cultura foi estendida até 24 horas, as colônias grandes continuaram a crescer. Uma dentre a colônia grande de cepas mutantes de Pantoea ananatis que era resistente para expressão de todos os três dos genes X Red (gam, bet, e exo) foi usada para posterior análise.

O DNA de plasmídeo RSF-Red-TER foi isolado a partir de um clone dentre os clones da colônia grande, e dentre vários clones dos clones de colônia pequena, e transformado outra vez em Escherichia coli MG1655 para examinar a capacidade do plasmídeo para sintetizar um produto de gene Red ativo. Por um experimento de controle para "Red-dependent integration" nos transformantes obtidos, foi demonstrado que somente o plasmídeo isolado a partir do clone de colônia grande induziu a expressão dos genes X Red requeridos para a "Red-dependent integration". A fim de investigar se a "Red- mediated integration" ocorre no clone de colônia grande selecionado, a eletroporação foi realizada usando um fragmento linear de DNA produzido por PCR. Este fragmento foi designado de modo que ele contém um marcador KmR e uma região de flanco de 40 bp homólogos para o gene hisD, e é integrado no gene hisD de Pantoea ananatis no sítio de reconhecimento

SmaL Dois clones de colônia pequenos foram usados como controle. A sequência de nucleotídeo do gene hisD de Pantoea ananatis é mostrada em SEQ ID NO: 40. Para PCR, os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 41 e 42 foram usados como iniciadores, e o plasmídeo pMW 118-(Àatt-Kmr-Xatt) foi usado como o gabarito. Os dois clones de colônia pequena que não eram resistentes para os genes X Red foram usados como um controle. Construção do plasmídeo pMWl 18-(XattL-Kmr-ÀattR) será explicada em detalhes no exemplo de referência 3.

O plasmídeo RSF-Red-TER pode induzir a expressão dos genes Red pelo gene lacl realizado no plasmídeo. Dois tipos de condições de indução foram investigados. No primeiro grupo, IPTG (1 mM) foi adicionado 1 hora antes da eletroporação, e no segundo grupo, IPTG foi adicionado no início da cultura para preparar as células em que a eletroporação é possível. A taxa de crescimento da progénie da cepa SC 17 abrigando o derivado do clone RSF-Red-TER de colônia grande não foi significantemente inferior à de uma cepa não tendo o plasmídeo RSF-Red-TER. A adição de IPTG somente levemente diminuiu a taxa de crescimento destas culturas. Por outro lado, a cepa RSF-Red-TER introduziu SC 17 derivado da progénie dos clones de colônia pequena cresceu extremamente lentamente mesmo sem a adição de IPTG, e após indução, o crescimento foi substancialmente parado. Após eletroporação de RSF-Red-TER isolado das células da progénie do clone de colônia grande, muitos clones KmR cresceram (18 clones após um tempo de indução curto, e cerca de 100 clones após um tempo de indução prolongado). Todos dentre os 100 clones que foram investigados tem um fenótipo His', e cerca de 20 clones foram confirmados por PCR como tendo a estrutura esperada do cromossomo nas células. Por outro lado, mesmo quando a eletroporação foi realizada com RSF-Red-TER isolado das células da progénie dos clones de colônia pequena, não foi obtida qualquer cepa integrada.

O clone de colônia grande obtido foi cultivado em uma placa contendo 7% de sacarose para eliminar o plasmídeo, e transformado outra vez com RSF-Red-TER. A cepa sem o plasmídeo foi designada SC 17(0). Esta cepa foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetica (Address: 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) em 21 de setembro de 2005, e recebeu um número de acesso de VKPM B-9246.

Todos os clones que cresceram após a re-transformação acima mencionada tem um tamanho grande como o clone de cepa parental SC 17(0). O experimento de "Red-mediated integration" foi realizado na cepa SC 17(0) re-transformada com o plasmídeo RSF-Red-TER. Três dos transformantes independentes obtidos foram investigados usando o mesmo fragmento de DNA como o usado para o experimento anterior. O tempo de indução curto (1 hora antes da eletroporação) foi empregado. Clones KmR excedendo dez clones cresceram em cada experimento. Todos os clones examinados têm o fenótipo His’. Deste modo, uma cepa mutante designada SC 17(0) que é resistente a expressão dos genes λ Red foi selecionada. Esta cepa pode ser usada como uma cepa recipiente apropriada para a "Red-dependent integration" no cromossomo de Pantoea ananatis.

Exemplo de referência 2: Construção de plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER

O esquema para construir o plasmídeo auxiliar RSF-Red-TER é mostrado na fig. 2.

Como a primeira etapa na construção, um vetor RSFsacBPlacMCS foi projetado. Para este propósito, fragmentos de DNA contendo o gene cat do plasmídeo pACYC184 e a região estrutural do gene sacB de Bacillus subtilis foram amplificados por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 43 e 44, e 45 e 46, respectivamente. Oligonucleotídeos continham os sítios de enzima de restrição BgBI, Saci, Xbal e .ZtamHI, que são requeridos e convenientes para posterior clonagem, nas regiões de extremidade 5’, respectivamente. O fragmento sacB obtido de 1,5 kb foi clonado no vetor previamente obtido pMWl 19-Piaclad no sítio Xbal-BamHI. Este vetor foi construído no mesmo modo como que descrito para o vetor pMWl 18-Piaclad (Skorokhodova, A.Y. et al, 2004, Biotekhnologiya (Rus), 5: 3-21). No entanto, este vetor continha uma porção de poliligador derivado de pMW219 em vez do plasmídeo pMW218.

Então o fragmento cat acima mencionado de 1,0 kb foi tratado com BgHl e Saci, e clonado no plasmídeo RSF-PiacladsacB obtido na etapa prévia no sítio BamHI-SacI. O plasmídeo pMW-PiacladsacBcat obtido continha o fragmento de PlacUVS-lacI-sacB-cat. A fim de subclonar este fragmento no vetor RSF1010, pMW-PiacladsacBcat foi digerido com BgBI, terminado de modo cego com fragmento Klenow de DNA polimerase I, e sucessivamente digerido com Saci. Um fragmento de 3,8 kb BglII-SacI do plasmídeo pMWPiacladsacBcat foi eluído a partir de 1% agarose gel, e ligado com o vetor RSF1010 que foi tratado com PstI e Sad. TGI de Escherichia coli foi transformado com a mistura de ligação, e colocado na placa de meio LB contendo cloranfenicol (50 mg/L). Os plasmídeos isolados dos clones cultivados foram analisados com as enzimas de restrição para obter um plasmídeo RSFsacB. A fim de construir um vetor de RSFsacBPlacMCS, um fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 47 e 48 como iniciadores e o plasmídeo pMWl 19-Piaclad como um gabarito. O fragmento obtido de 146 bp foi digerido com Saci e Notl, e ligado com o fragmento grande de Sacl- Notl do plasmídeo RSFsacB. Então por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 49 e 50 como iniciadores, e o plasmídeo pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645) como um gabarito, um fragmento de DNA de 2,3 kb contendo os genes XRedαβy e o terminador de transcrição tL3 foi amplificado. O fragmento obtido foi clonado no vetor RSFsacBPlacMCS no sítio Pvul-Notl. Deste modo, o plasmídeo RSFRed foi projetado.

A fim de eliminar a leitura através da transcrição dos genes Red, um terminador de transcrição dependente de p do operon rmB de Escherichia coli foi inserido na posição entre o gene cat e o promotor PlacUV5. Para este fim, um fragmento de DNA contendo o promotor PlacUV5 e o terminador TrmB foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 51 e 48 como iniciadores e o cromossomo de Escherichia coli BW3350 como um gabarito. Estes fragmentos obtidos foram tratados com Kpnl e ligados. Então o fragmento 0,5 kb contendo ambos PlacUV5 e TrmB foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 48 e 52 como iniciadores. O fragmento obtido de DNA foi digerido com EcoRI, terminado de modo cego por um tratamento com fragmento Klenow de DNA polimerase I, digerido com BamHI, e ligado com o fragmento grande Ecll36II-BamHI do vetor RSFsacBPlacMCS. O plasmídeo obtido foi designado RSF-Red-TER.

Exemplo de referência 3: Construção de plasmídeo pMWl 18-(λ,attL-Kmr- λattR).

O plasmídeo pMWl 18-(λattL-Kmr-λattR) foi construído a partir do plasmídeo pMWl18-attL-Tc-attR (WO 2005/010175) por substituição do gene marcador de resistência a tetraciclina com o gene de resistência a canamicina do plasmídeo pUC4K. Para este fim, o fragmento grande de EcoRI-HindIII do plasmídeo pMWl 18-attL-Tc-attR foi ligado em dois fragmentos do plasmídeo pUC4K: fragmento HindIII-PstI (676 bp) e fragmento EcoRI-HindIII (585 bp). pMWl 18-attL-Tc-attR básico foi obtido por ligação dos seguintes quatro fragmentos. 1)0 fragmento Bg/II-LcoRI (114 bp) incluindo attL (SEQ ID NO: 55) que foi obtido por amplificação PCR da região correspondente a attL de cromossomo W3350 de Escherichia coli (contendo profago X) usando os iniciadores PI e P2 (SEQ ID NOS: 53 e 54) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para BgHI e EcoRI). 2) O fragmento de Psd-EzndlII (182 bp) incluindo attR (SEQ ID NO: 58) que foi obtido por amplificação PCR da região correspondente para attR do cromossomo W3350 de Escherichia coli (contendo profago À,) usando os iniciadores P3 e P4 (SEQ ID NOS: 56 e 57) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para PstI e //indlll). 3) O fragmento grande BgllI-HindIII (3916 bp) de pMW118- ter_rmB. O plasmídeo pMW 118-ter_rmB foi obtido por ligação dos seguintes três fragmentos de DNAs: - O fragmento grande de DNA (2359 bp) incluindo o fragmento AatlI-EcoRI de pMW 118 que foi obtido por digestão de pMW 118 com EcoRI, tratar com fragmento DNA polimerase I Klenow, e então digerir com Aatll; - O fragmento pequeno de AatlI-BgHI (1194 bp) de pUC19 incluindo o gene bla para resistência a ampicilina (ApR), que foi obtido por amplificação PCR da região correspondente do plasmídeo pUC19 usando os iniciadores P5 e P6 (SEQ ID NOS: 59 e 60) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para PstI, Aatll e BgHI); - O fragmento pequeno de BgHI-PstI (363 bp) do terminador de transcrição ter_rmB, que foi obtido por amplificação PCR da região correspondente do cromossomo MG1655 de Escherichia coli usando os iniciadores P7 e P8 (SEQ ID NOS: 61 e 62) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para PstI, BgHI e PstI). 4) O fragmento pequeno EcoBA-PstI (1388 bp) (SEQ ID NO: 63) de pML-Tc-ter_thrL incluindo o gene de resistência a tetraciclina e o terminador de transcrição ter_thrL; o plasmídeo pML-Tc-ter_thrL foi obtido pelas seguintes duas etapas: - o plasmídeo pML-ter_thrL foi obtido por digestão do plasmídeo pML-MCS (Mashko, S.V. et al., 2001, Biotekhnologiya (in Russian), no. 5, 3-20) com Xbal e RízmHI, seguido por ligação do fragmento grande (3342 bp) com o fragmento Xbal-BamHI (68 bp) transportando o terminador ter thrL obtido por amplificação PCR da região correspondente do cromossomo MG 1655 de Escherichia coli usando os iniciadores P9 e P10 (SEQ ID NOS: 64 e 65) (estes iniciadores continham os sítios de reconhecimento subsidiários para Pstl, Xbal e Ra/wHI); - o plasmídeo pML-Tc-ter_thrL foi obtido por digestão do plasmídeo pML-ter_thrL com Kpríl e Xbál seguido por tratamento com fragmento Klenow de DNA polimerase I e ligado com o fragmento pequeno EcoRI-Van91I (1317 bp) de pBR322 incluindo o gene de resistência a tetraciclina (pBR322 foi digerido com EcoRI e Van91I e então tratado com fragmento Klenow de DNA polimerase I).

Exemplo 1: Busca de gene de excreção de ácido L-glutâmico

A busca de gene de excreção de ácido L-glutâmico foi realizada como a seguir. Porque o ácido L-glutâmico é convertido em um intermediário do ciclo de ácido tricarboxílico, 2-oxoglutarato, em uma etapa por glutamato desidrogenase, espera-se que o ácido L-glutâmico seja facilmente metabolizado em muitos microorganismos tendo glutamato desidrogenase ou o ciclo de ácido tricarboxílico. No entanto, porque uma cepa em que 2-oxoglutarato desidrogenase é deletada não pode degradar ácido L- glutâmico, o crescimento dos mesmos é inibido na presença de ácido glutâmico de uma concentração elevada. Neste exemplo, por uso de uma cepa deficiente em biossíntese de polissacarídeo extracelular SC17sucAams derivada da cepa SC17sucA de Pantoea ananatis (fazer referência uma patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769) como uma cepa 2- oxoglutarato desidrogenase deficiente, foi tentado obter um gene de excreção de ácido L-glutâmico utilizando resistência ao ácido L-glutâmico de uma concentração elevada como um marcador. Porque a cepa SC17sucA produziu uma quantidade marcada de polissacarídeos extracelulares quando ela cresceu em um meio de ágar contendo uma fonte de açúcar, a manipulação da mesma foi extremamente difícil. Deste modo, ao deletar o operon ams codificando para genes do sistema de biossíntese de polissacarídeo extracelular, a produção de polissacarídeos extracelular foi suprimida. PCR foi realizado usando pMW 118-ÀattL-Kmr-XattR como um gabarito e os iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 para amplificar um fragmento do gene contendo um gene de resistência a canamicina, sequências attL e attR de fago X, em ambas as extremidades do gene de resistência, e sequência 50 bp a montante de amsl e sequência 50 bp a jusante do gene amsC adicionadas nas extremidades externas das seqüências de fago X. Este fragmento foi purificado por uso do sistema de purificação de DNA Wizard PCR Prep DNA (Promega).

Então a cepa SC 17(0) foi transformada com RSF-Red-TER para obter uma cepa SC17(0)/RSF-Red-TER. Esta cepa foi cultivada durante a noite no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura e 5 g de NaCl em 1 L de água pura, pH 7,0) contendo 25 mg/L de cloranfenicol, o meio de cultura depois da cultura noturna foi inoculado em volume 1/100 em 100 mL do meio L contendo 25 mg/L de cloranfenicol e 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo, e a cultura foi realizada a 34°C durante 3 horas. As células preparadas como descrito acima foram coletadas, lavadas três vezes com 10% de glicerol resfriado com gelo, e finalmente colocadas em suspensão em 0,5 mL de 10% de glicerol. As células colocadas em suspensão foram usadas como células competentes, e 100 ng do fragmento PCR preparado na seção acima foram introduzidos nas células usando GENE PULSER II (BioRad) sob as condições de um campo de força de 18 kV/cm, capacidade do capacitor de 25 μF e resistência de 200 Í1 Meio SOC resfriado com gelo (20 g/L de Bacto triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 0,5 g/L de NaCl, e 10 g/L de glicose ) foi adicionado na suspensão de célula, e a cultura foi realizada a 34°C durante 2 horas com agitação. A cultura foi aplicada em um meio preparado adicionando ingredientes de meio mínimo (meio contendo 5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L) e 40 mg/L de canamicina no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0). As colônias que apareceram foram purificadas com o mesmo meio, e então foi confirmado por PCR que o gene ams foi substituído com o gene de resistência a canamicina.

Cromossomo foi extraído da cepa deficiente em gene ams usando o kit de purificação de DNA genômico bacteriano produzido por Edge Biosystems. Separadamente, a cepa SC17sucA foi cultivada durante a noite em um meio ágar obtido por adicionar os ingredientes do meio mínimo descrito acima no meio L. As células foram raspadas com um loop, lavadas três vezes com 10% de glicerol resfriado com gelo, e finalmente colocadas em suspensão em 10% de glicerol de modo a ter um volume final de 500 μL. As células colocadas em suspensão foram usadas como células competentes, e 600 ng do cromossomo de DNA acima mencionado foram introduzidos nas células competentes usando GENE PULSER II (BioRad) sob as condições de um campo de força de 17,5 kV/cm, capacidade do capacitor de 25 μF e resistência de 200 Í2. O meio SOC resfriado com gelo foi adicionado na suspensão de célula, e a cultura foi realizada a 34°C durante 2 horas com agitação. Então a cultura foi aplicada em um meio ágar preparado por adição dos ingredientes do meio mínimo descrito acima e 40 mg/L de canamicina no meio L. As colônias que apareceram foram purificadas com o mesmo meio, e então foi confirmado por PCR que o gene ams foi substituído com o gene de resistência a canamicina. Uma cepa assim confirmada foi designada como cepa SC17sucAams.

DNA cromossômico extraído da cepa de Pantoea ananatis AJ13355 foi parcialmente digerido com uma enzima de restrição SαiβAL Então fragmentos de cerca de 10 kb foram coletados e introduzidos no sítio BamYG. de pSTV28 (Takara Bio) para preparar uma biblioteca de plasmídeo. Esta biblioteca de plasmídeos foi introduzido nas células competentes da cepa SC17sucAams preparada em um modo convencional por eletroporação.

Seleção foi realizada para a cepa SC17sucAams introduzida com a biblioteca de plasmídeos em uma placa do meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0) adicionado com ingredientes de meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L de água pura) usando resistência a cloranfenicol como um marcador para obter transformantes. Estes transformantes foram colocados em uma placa em um meio mínimo de glicose contendo ácido L- glutâmico em uma concentração elevada (meio compreendendo o meio mínimo de glicose misturado com 0,2 M de ácido L-glutâmico, 100 mg/L cada de lisina, metionina e ácido diaminopimélico como concentração final), em que SC17sucAams não pode formar colônias.

Os transformantes foram cultivados a 34°C durante 3 dias, e 64 clones das colônias que apareceram foram deixando formar novamente colônias únicas na mesma placa. Como um resultado, verificou-se que 11 clones dentre os mesmos formaram colônias após 48 horas, e os restantes formaram colônias após 72 horas.

Então os genes inseridos nos vetores abrigados pelos transformantes foram analisados. Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes, e sequências de nucleotídeos foram determinadas. Verificou- se que dentre os 11 clones que formaram colônias em 48 horas, 10 clones tinham o mesmo loci, e todos os genes contidos mostraram homologia para ybjL, que era um gene de Escherichia coli cuja função era desconhecida.

Além disso, este gene ybjL não poderia ser obtido sob as condições em que o gene de sistema de excreção de ácido glutâmico descrito em WO 2005/085419, yhfK, tinha sido obtido e, inversamente, o gene yhfK não poderia ser obtido sob a condição da seleção usado neste exemplo.

A fim de confirmar que o fator que confere resistência a ácido glutâmico é ybjL, o gene ybjL foi clonado. PCR foi realizado usando o DNA cromossômico de cepa AJ13355 como o gabarito e oligonucleotídeos ybjL-Fl e ybjL-R2 mostrados em SEQ ID NOS: 8 e 9 para amplificar o fragmento de cerca de 1,8 kb contendo o gene ybjL de P. ananatis. Este fragmento foi purificado usando o sistema de purificação de DNA Wizard PCR Prep (Promega), e então tratado com as enzimas de restrição Kpnl e óp/zl, e o produto foi ligado com pSTV28 (Takara Shuzo) tratado com as mesmas enzimas para obter pSTV-PanybjL. A cepa SC17sucA foi transformada com este plasmídeo pSTV-PanybjL e o plasmídeo pSTV28 como um controle para comparação (Takara Shuzo) para construir a cepa SC17sucA/pSTV-PanybjL e a cepa SC17sucA/pSTV28.

A cepa SC17sucA/pSTV-ybjL foi colocada em um meio mínimo contendo ácido glutâmico (meio contendo 0,5 g de glicose ou sacarose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio, 6 g de fosfato dissódico, 0,2 M de L-glutamato de sódio, 100 mg/L cada de lisina, metionina e ácido diaminopimélico e 15 g de ágar em 1 L de água pura). A cultura foi realizada a 34°C durante 2 dias. Como um resultado, confirmou-se que onde a cepa introduzida no vetor de controle, cepa SC17sucA/pSTV28, não pode formar colônias, SC17sucA/pSTV-ybjL pode formar colônias no meio mínimo.

Então a cepa SC17sucA/pSTV-PanybjL foi cultivada em um meio mínimo líquido contendo ácido glutâmico (meio contendo 0,5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio, 6 g de fosfato dissódico, 0,2 M de L-glutamato de sódio, 100 mg/L cada de lisina, metionina e ácido diaminopimélico em 1 L de água pura) para examinar crescimento da cepa na presença de ácido L-glutâmico em concentração elevada.

Os resultados são mostrados na fig. 3. Verificou-se que o crescimento de SC17sucA/pSTV-PanybjL em que o gene ybjL foi otimizado foi marcadamente otimizado na presença de ácido L-glutâmico em concentração elevada, como comparado com a cepa SC17sucA/pSTV28 usada como uma cepa de controle. Consequentemente, confirmou-se que ybjL é um fator que confere resistência a ácido L-glutâmico.

Exemplo 2: Efeito de amplificação de gene ybjL na produção de ácido L- glutâmico em pH neutro.

Então, a fim de examinar o efeito deste gene na produção de ácido L-glutâmico, o plasmídeo para amplificação ybjL, pSTV-PanybjL, foi introduzido na bactéria produzindo ácido L-glutâmico SC17sucA/RSFCPG tendo o plasmídeo para produção de ácido L-glutâmico, RSFCPG, mostrado em SEQ ID NO: 10 (fazer referência à patente japonesa acessível ao público No. 2001-333769), e a produtividade de ácido L-glutâmico dos mesmos foi examinada. pSTV-PanybjL e o plasmídeo de controle para comparação, pSTV28 (Takara Shuzo), foram cada introduzidos em SC17sucA/RSFCPG por eletroporação, e transformantes foram obtidos usando resistência a cloranfenicol como um marcador. Após a confirmação dos plasmídeos, a cepa introduzida com o plasmídeo para amplificação ybjL foi designada SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL, e a cepa pSTV29-introduzida foi designada SC17sucA/RSFCPG+pSTV28.

Então SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL e a cepa de controle SC17sucA/RSFCPG+pSTV28 foram cultivadas para examinar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico das cepas. O meio tem a seguinte composição. [Composição de meio de cultura] [seção A] Sacarose 30 g/L MgSO4□7H2O 0,5 g/L [Grupo B] KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4□7H2O 0,02 g/L MnSO4□5H2O 0,02 g/L cloridrato de L-lisina 0,2 g/L DL-Metionina 0,2 g/L Acido diaminopimélico 0,2 g/L (ajustado a pH 7,0 com KOH) [Grupo C] CaCO3 20 g/L

Os ingredientes dos grupos A e B foram esterilizados a 115°C durante 10 minutos por autoclave, e o ingrediente do grupo C foi esterilizado a 180°C durante 3 horas com calor seco. Então os ingredientes dos três grupos foram misturados, e 12,5 mg/L de cloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol foram adicionados na mistura. SC17sucA/RSFCPG+pSTV29 e SC17sucA/RSFCPG+pSTV- PanybjL foram, cada, pré-cultivados em um meio obtido por adição dos ingredientes ao meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L de água pura), 25 mg/L de cloranfenicol e 12,5 mg/L de tetraciclina no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0), e inoculado em uma quantidade apropriada a 5 ml do meio acima mencionado contido em um tubo de teste.

As células foram cultivadas durante 17,5 horas, e então a densidade celular, concentração de ácido L-glutâmico e quantidade residual de sacarídeo no meio de cultura foram medidos. A densidade celular foi examinada por medida da turvação a 620 nm do meio diluído 51 vezes usando um espectrofotômetro (U-2000A, Hitachi). A concentração de ácido L- glutâmico foi medida na cultura do sobrenadante apropriadamente diluído com água por uso de Biotech Analyzer (AS-210, Sakera SI). Os resultados são mostrados na tabela 1. Acúmulo de ácido L-glutâmico foi aumentado em cerca de 3 g/L, e o rendimento com base em sacarídeo aumentou em cerca de 9% na cepa amplificada por ybjL, SC17sucA/RSFCPG+pSTV-PanybjL, como comparado com a cepa de controle, SC17sucA/RSFCPG+pSTV28. Tabela 1

Exemplo 3: Efeito de amplificação de gene ybjL derivado de Escherichia coli

Então o gene ybjL de Escherichia coli foi introduzido na cepa de Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG, e o efeito dos mesmos na produção de ácido glutâmico foi examinado.

PCR foi realizado usando os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOS: 11 e 12 preparados com base na sequência de ybjL de Escherichia coli registrada junto ao GeneBank como AP009048 (SEQ ID NO: 3) e cromossomo de cepa de Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) como o gabarito para obter um fragmento de cerca de 1,7 kb contendo o gene ybjL. Este fragmento foi tratado com Sphl e Kpnl, e ligado com pSTV28 (Takara Shuzo) no sítio correspondente. O plasmídeo obtido para amplificação de ybjL de Escherichia coli foi designado como plasmídeo pSTV-EcoybjL para amplificação do ybjL.

O plasmídeo obtido pSTV-EcoybjL para amplificação de ybjL foi introduzido na cepa SC17sucA/RSFCPG acima mencionada por eletroporação, e um transformante foi obtido usando resistência a cloranfenicol como um marcador. A cepa amplificada por gene ybjL de Escherichia coli obtida foi designada como SC17sucA/RSFCPG+pSTV- EcoybjL.

Então SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL e a cepa de controle, SC17sucA/RSFCPG+pSTV28, foram cultivados para examinar a capacidade de produção de ácido L-glutâmico das cepas. O meio tem a seguinte composição. [Composição de meio de cultura] [Grupo A] Sacarose 30 g/L MgSO4□7H2O 0,5 g/L [Grupo B] KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4L□7H2O 0,02 g/L MnSO4□5H2O 0,02 g/L Cloridrato de L-Lisina 0,2 g/L DL-Metionina 0,2 g/L Ácido diaminopimélico 0,2 g/L (ajustado para pH 7,0 com KOH) [Grupo C] CaCO3 20 g/L

Os ingredientes dos grupos A e B foram esterilizados a 115°C durante 10 minutos por autoclave, e o ingrediente do grupo C foi esterilizado a 180°C durante 3 horas com calor seco. Então os ingredientes dos três grupos foram misturados, e 12,5 mg/L de cloridrato de tetraciclina e 25 mg/L de cloranfenicol foram adicionados na mistura.

SC17sucA/RSFCPG+pSTV28 e SC17sucA/RSFCPG+pSTV- EcoybjL foram cada pré-cultivados em um meio obtido por adição dos ingredientes do meio mínimo (meio contendo 0,5 g de glicose, 2 mM de sulfato de magnésio, 3 g de monofosfato de potássio, 0,5 g de cloreto de sódio, 1 g de cloreto de amónio e 6 g de fosfato dissódico em 1 L de água pura), 25 mg/L de cloranfenicol e 12,5 mg/L de tetraciclina para o meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0), e inoculados em uma quantidade apropriada a 5 ml do meio acima mencionado contido em um tubo de teste.

As células foram cultivadas durante 17,5 horas, e então a densidade celular e a concentração de ácido L-glutâmico no meio de cultura foram medidos no mesmo modo como no exemplo 2. Os resultados são mostrados na tabela 2. Acúmulo de ácido L-glutâmico foi aumentado em cerca de 2 g/L, e o rendimento com base em sacarídeo aumentou por cerca de 7% na cepa amplificada por ybjL, SC17sucA/RSFCPG+pSTV-EcoybjL, como comparado com a cepa de controle, SC17sucA/RSFCPG+pSTV28. Tabela 2

Exemplo 4: Efeito de amplificação de gene ybjL na produção de L- aminoácidos em Escherichia coli

Então o gene ybjL derivado de Pantoea ananatis e o gene ybjL derivado de Escherichia coli foram cada introduzidos em Escherichia coli, e o efeito da amplificação dos mesmos foi examinado.

O vetor acima mencionado para amplificação de gene ybjL derivado de Pantoea ananatis, pSTV-PanybjL, vetor para amplificação de gene ybjL derivado de Escherichia coli, pSTV-EcoybjL, e o plasmídeo de controle pSTV28 foram cada introduzidos em uma cepa de Escherichia coli de tipo selvagem, cepa W3110, por eletroporação para obter transformantes demonstrando resistência a cloranfenicol. A cepa em que ybjL derivado de Pantoea ananatis foi amplificado foi designada W3110/pSTV-PanybjL, a cepa em que ybjL derivado de Escherichia coli foi amplificado foi designada W3110/pSTV-EcoybjL, e a cepa pSTV28 introduzida como um controle foi designada W3110/pSTV28.

Então as capacidades de produção de ácido L-glutâmico das cepas de ybjL amplificadas, W3110/pSTV-PanybjL e W3110/pSTV-EcoybjL, e W3110/pSTV28 como um controle foram examinadas. W3110/pSTV- PanybjL, W3110/pSTV-EcoybjL e W3110/pSTV28 como um controle foram cada pré-cultivados no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0) adicionado com cloranfenicol, e um loop de células foi inoculado por uso de lmL de volume produzido por Nunc a 5 mL de um meio tendo a seguinte composição contida em um tubo de teste, e cultivado a 37°C durante 11,5 horas com agitação. Densidade celular e concentração de ácido L-glutâmico no meio de cultura foram medidas no mesmo modo como no exemplo 2. Os resultados são mostrados na tabela 3. [Composição de meio de cultura] [Grupo A] Glicose 30 g/L MgSO4□7H2O 0,5 g/L [Grupo B] (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4□7H2O 20 mg/L MnSO4□5H2O 20 mg/L (ajustado a pH 7,0 com KOH) [Grupo C] Carbonato de cálcio 20 g/L

Os ingredientes dos grupos A e B foram esterilizados a 115°C durante 10 minutos por autoclave, e o ingrediente do grupo C foi esterilizado a 180°C durante 3 horas com calor seco. Então os ingredientes dos três grupos foram misturados, e 25 mg/L de cloranfenicol foi adicionado na mistura. Tabela 3

Revelou-se que a capacidade de produção de ácido L- glutâmico foi marcadamente otimizada na cepa de Escherichia coli W3110/pSTV-ybjL, que é uma cepa amplificada com gene ybjL de Pantoea ananatis, como comparado à cepa introduzida no vetor, cepa W3110/pSTV28 como um controle.

Então capacidades para produzir outros aminoácidos da cepa amplificada em ybjL foram examinados. W3110/pSTV-PanybjL, e W3110/pSTV28 como um controle foram pré-cultivados no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0) adicionado com cloranfenicol, e um loop de células foi inoculado por uso de um loop de volume de 5 mL produzido por Nunc a 5 mL de um meio tendo a seguinte composição contida em um tubo de teste, e cultivado a 37°C durante 7 horas com agitação. A densidade celular e concentração de L-aminoácido no meio de cultura foram medidos no mesmo modo no exemplo 2. Os resultados são mostrados na tabela 4. [Composição de meio de cultura] [Grupo A] Glicose 40 g/L MgSO4□7H2O 0,5 g/L [Grupo B] (NH4)2SO4 20 g/L KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4-7H2O 20 mg/L MnSO4-5H2O 20 mg/L (ajustado a pH 7,0 com KOH) [Grupo C] Carbonato de cálcio 30 g/L

Os ingredientes dos grupos A e B foram esterilizados a 115°C durante 10 minutos por autoclave, e o ingrediente do grupo C foi esterilizado a 180°C durante 3 horas com calor seco. Então os ingredientes dos três grupos foram misturados, e 25 mg/L de cloranfenicol foi adicionado na mistura. Tabela 4

*: O branco não foi inoculado com células

Revelou-se que não apenas o acúmulo de quantidade ácido L- glutâmico, mas também o acúmulo da quantidade de ácido L-aspártico foram otimizados em W3110/pSTV-PanybjL de Escherichia coli, que é uma cepa amplificada no gene ybjL, como comparado à cepa de controle introduzida no vetor, cepa W3110/pSTV28.

Exemplo 5: Efeito de amplificação de gene ybjL na produção de ácido L- glutâmico em Klebsiella planticola

O gene ybjL derivado de Pantoea ananatis foi introduzido em Klebsiella planticola, e o efeito da amplificação dos mesmos foi examinado.

O vetor acima mencionado para amplificação de gene ybjL derivado de Pantoea ananatis, pSTV-PanybjL, e o plasmídeo de controle pSTV28 foram cada introduzidos em uma cepa produzindo ácido L-glutâmico d Klebsiella planticola, cepa AJ13410 (pedido de patente japonesa No. 11- 68324), por eletroporação para obter transformantes demonstrando resistência a cloranfenicol. A cepa em que ybjL derivado de Pantoea ananatis foi amplificado foi designada como AJ13410/pSTV-PanybjL, e a cepa introduzida em pSTV28 como um controle foi designada como AJ13410/pSTV28.

Então as capacidades de produção de ácido L-glutâmico- da cepa amplificada por ybjL, AJ13410/pSTV-PanybjL, e AJ13410/pSTV28 como um controle, foram examinadas. AJ13410/pSTV-PanybjL e AJ13410/pSTV28 foram pré-cultivados no meio L (meio contendo 10 g de Bacto triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de ágar em 1 L de água pura, pH 7,0) adicionado com cloranfenicol, e um loop de células foram inoculado por uso de um loop de 1 mL de volume produzido por Nunc a 5 mL de um meio tendo a seguinte composição contida em um tubo de teste, e cultivado a 37°C durante 17 horas com agitação. Densidade celular e concentração de ácido L-glutâmico no meio de cultura foram medidas no mesmo modo como no exemplo 2. Os resultados são mostrados na tabela 5. [Composição de meio de cultura] [Grupo A] Sacarose 30 g/L MgSO4-7H2O 0,5 g/L [Grupo B] KH2PO4 2,0 g/L Extrato de levedura 2,0 g/L FeSO4-7H2O 0,02 g/L MnSO4-5H2O 0,02 g/L cloridrato de L-Lisina 0,2 g/L DL-Metionina 0,2 g/L Acido diaminopimélico 0.2 g/L (ajustado a pH 7,0 com KOH) [Grupo C] CaCO3 20 g/L

Os ingredientes dos grupos A e B foram esterilizados a 115°C durante 10 minutos por autoclave, e o ingrediente do grupo C foi esterilizado a 180°C durante 3 horas com calor seco. Então os ingredientes dos três grupos foram misturados, e 25 mg/L de cloranfenicol foram adicionados na mistura. Tabela 5

Revelou-se que a capacidade de produção de ácido L- glutâmico foi marcadamente otimizada em AJ13410/pSTV-PanybjL de Klebsiella planticola, que é uma cepa amplificada no gene ybjL de Pantoea ananatis, como comparado a cepa introduzida no vetor, cepa AJ13410/pSTV28, como um controle.

Exemplo de referência 4: Construção de cepa de Escherichia coli deficiente em gene L, D - lactato desidrogenase

Este gene foi deletado por uso do método chamado "Red- driven integration" desenvolvido por Datsenko e Wanner (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 97, No. 12, pp. 6640- 6645), e o sistema de excisão de fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., e Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184 (18): 5200-5203). De acordo com este método, é possível construir uma cepa rompida no gene em uma etapa única por uso de um produto PCR obtido com iniciadores de oligonucleotídeos sintéticos em que uma parte do gene alvo é projetada na extremidade 5' da sequência e uma parte de um gene de resistência a antibiótico é projetada na extremidade 3' da sequência. Além disso, por uso do sistema de excisão de fago X em combinação, o gene de resistência a antibiótico que é integrado na cepa rompida em gene pode ser removido.

<1-1> Construção de cepa deficiente em gene IdhA codificando para D- lactato desidrogenase

De acordo com a descrição de WO 2005/010175, PCR foi realizado por uso de oligonucleotídeo sintético tendo sequências correspondentes para partes do gene IdhA na extremidade 5' da sequências e sequências correspondentes a ambas as extremidades attL e attR de fago À, na extremidade 3' da sequência como iniciadores e plasmídeo pMW118-attL- Cm-attR como o gabarito. pMWl 18-attL-Cm-attR é um plasmídeo obtido por inserção dos genes attL e attR, que são os sítios de fixação de fago X, e o gene cat, que é um gene de resistência a antibiótico, em pMWl 18 (Takara Bio), e os genes são inseridos na ordem de attL-cat-attR. As sequências dos oligonucleotídeo sintéticos usados como os iniciadores são mostradas em SEQ ID NOs. 13 e 14. O produto PCR amplificado foi purificado em um agarose gel e introduzido na cepa MG 1655 de Escherichia coli contendo o plasmídeo pKD46 capaz de replicação sensível a temperatura por eletroporação. Então uma cepa sensível a ampicilina não abrigando pKD46 foi obtida, e a deleção do gene IdhA foi confirmada por PCR. PCR foi realizado por uso de um oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores. Apesar do produto PCR obtido para a cepa parental ter um tamanho de cerca de 1,2 kb, a cepa deficiente mostrou uma banda para um tamanho de cerca de 1,9 kb.

Para eliminar o gene att-cat introduzido no gene IdhA, a cepa foi transformada com um plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts, e uma cepa resistente a ampicilina foi selecionada. O pMW-intxis-ts contém o gene integrase de fago À, (Int) e gene excisionase (Xis) e permite uma replicação sensível à temperatura. Então a cepa da qual att-cat e pMW-intxis-ts foram eliminados foi confirmada por PCR com base na sensibilidade a ampicilina e a sensibilidade a cloranfenicol. PCR foi realizado por uso dos oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 15 e 16 como iniciadores. Apesar do produto PCR obtido para a cepa em que att-cat permaneceu ter um tamanho de cerca de 1,9 kb, a banda de cerca de 0,3 kb foi observada para a cepa em que att-cat foi eliminado. A cepa deficiente IdhA obtida como descrito acima foi designada como cepa MG1655AldhA.

<l-2> Construção de cepa deficiente em gene UdD codificando para L-lactato desidrogenase

Uma cepa foi construída no mesmo modo como o da construção da cepa deficiente em gene IdhA. PCR foi realizado usando oligonucleotídeos sintéticos tendo sequências correspondentes para partes do gene UdD na extremidade 5' das sequências e sequências correspondentes a ambas as extremidades de attL e attR de fago À, na extremidade 3' das sequências como iniciadores e plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR como o gabarito. As sequências dos oligonucleotídeos sintéticos usados como os iniciadores são mostradas em SEQ ID NOs. 17 e 18. O produto PCR amplificado foi purificado em um agarose gel e introduzido na cepa de Escherichia coli MG1655AldhA contendo plasmídeo pKD46 capaz de replicação sensível à temperatura por eletroporação. Então uma cepa sensível a ampicilina não abrigando pKD46 foi obtida, e a deleção do gene UdD foi confirmada por PCR. PCR foi realizado por uso dos oligonucleotídeos sintéticos mostrados em SEQ ID NOS: 19 e 20 como iniciadores. Apesar do produto PCR obtido para a cepa parental ter um tamanho de cerca de 1,4 kb, a banda de cerca de 1,9 kb foi observada para a cepa deficiente.

Para eliminar o gene att-cat introduzido no gene UdD, a cepa foi transformada com um plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts, e uma cepa de resistência a ampicilina foi selecionada. Então a cepa da qual att-cat e pMW- intxis-ts tinham sido eliminados foi obtida and confirmada por PCR com base na sensibilidade a ampicilina e sensibilidade a cloranfenicol. PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NOS: 19 e 20 como iniciadores. Apesar do produto PCR obtido para a cepa em que att-cat permaneceu ter um tamanho de cerca de 1,9 kb, a banda de cerca de 0,3 kb foi observada para a cepa em que att-cat foi eliminado. A cepa deficiente em UdD obtida como descrito acima foi designada como a cepa MG1655ΔldhAΔlldD.

Exemplo 6: Construção de cepa otimizada em gene ybjL de bactérias produzindo ácido succínico <6-l> Construção de plasmídeo para a amplificação do gene

A fim de amplificar o gene ybjL, plasmídeo pMW219::Pthr foi usado. Este plasmídeo corresponde ao vetor pMW219 (Nippon Gene) tendo a região promotora do operon treonina (thrLABC) no genoma de Escherichia coli mostrado em SEQ ID NO: 21 no sítio HindIII e sítio BamHI, e permite a amplificação de um gene por clonagem do gene em uma posição no plasmídeo a jusante da do promotor.

<6-2> Construção de plasmídeo para melhorar ybjL

PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético tendo um sítio de BamHI mostrado em SEQ ID NO: 22 como um iniciador 5', o oligonucleotídeo sintético tendo um sítio BamHI mostrado em SEQ ID NO: 23 como um iniciador 3', que foram preparados com base na sequência de nucleotídeo do gene ybjL na sequência do genoma de Escherichia coli (acesso Genbank No. U00096), e o DNA genômico de cepa de Escherichia coli MG1655 como o gabarito, e o produto foi tratado com a enzima de restrição TtazwHI para obter um fragmento do gene contendo o gene ybjL. O produto PCR foi purificado e ligado com o vetor pMW219::Pthr tratado com /Lz/wHI para a construção do plasmídeo pMW219::Pthr::ybjL para amplificação ybjL.

<6-3 > Produção de cepa amplificada em ybjL

pMW219::Pthr::ybjL obtido em <6-2> descrito acima e pMW219 foram usados para transformar a cepa de Escherichia coli MG1655ΔldhAΔlldD pelo método de pulso elétrico, e os transformantes foram aplicados no meio ágar LB contendo 25 μg/ml de canamicina, e cultivados a 37°C durante cerca de 18 horas. As colônias que apareceram foram purificadas, e os plasmídeos foram extraídos das mesmas em um modo convencional para confirmar a introdução do plasmídeo de marcação. As cepas obtidas foram designadas como MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219: :Pthr: :ybjL e MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219, respectivamente. A cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637 também foi transformada com pMW219::Pthr::ybjL e pMW219 pelo método de pulso elétrico, e os transformantes foram aplicados no meio ágar LB contendo 50 μg/ml de canamicina, e cultivados a 37°C durante cerca de 18 horas. As colônias que apareceram foram purificadas, e os plasmídeos foram extraídos das mesmas em um modo convencional para confirmar a introdução do plasmídeo de marcação. As cepas obtidas foram designadas como AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL e AJ110637/pMW219, respectivamente.

Exemplo 7: Efeito de amplificação de ybjL em cepa produzindo ácido succínico de bactérias Escherichia

MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219: :Pthr: :ybjL e MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219 foram cada uniformemente aplicados em uma placa LB contendo 25 μg/ml de canamicina, e cultivados a 37°C durante 16 horas. Então cada placa foi incubada a 37°C durante 16 horas sob uma condição anaeróbica por uso de Anaeropack (Mitsubishi Gas Chemical). As células obtidas na placa foram lavadas com 0,8% de salmoura, e então diluídas 51 vezes, e assim a suspensão de célula tendo OD = 1,0 (600 nm) foi preparada. Esta suspensão de célula em um volume de 100 μl e um meio de produção (10 g/l de glicose, 10 g/l de 2Na de malato, 45,88 g/l de TES, 6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 1 g/l de NH4CI, ajustado para pH 7,3 com KOH e filtrado) em um volume de 1,3 ml em que os gases dissolvendo no meio foram substituídos com gás nitrogênio por borbulhamento de gás nitrogênio antes, e colocados em microtubos de 1,5 ml de volume, e as células foram cultivadas a 31,5°C durante 10 horas por uso de um agitador para microtubos. Após a cultura, a quantidade de ácido succínico acumulada no meio foi analisada por cromatografia líquida. Dois dos recheios tipo Shim SCR-102H (Shimadzu) conectados em série foram usados como a coluna, e uma amostra foi eluída a 50°C com 5 mM de ácido p-toluenossulfônico. O eluado foi neutralizado com 20 mM de uma solução aquosa de Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-toluenossulfônico e 100 μM de EDTA, e ácido succínico foi quantificado por medição da condutividade elétrica com CDD- 10AD (Shimadzu).

As quantidades de ácido succínico acumuladas após 10 horas são mostradas na tabela 6, e a mudança do acúmulo de ácido succínico é mostrada na fig. 4.

Acúmulo de ácido succínico foi marcadamente aumentado na cepa amplificada em gene ybjL MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjL como comparado a MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219 como o controle. Tabela 6: Efeito de ybjL amplificação em cepa produzindo ácido succínico, MG1655ΔldhAΔlldD

Exemplo 8: Efeito de amplificação de ybjL em cepa produzindo ácido succínico de bactéria Enterobacter

AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL e AJ110637/pMW219 foram cada uniformemente aplicados em uma placa de LB contendo 50 μg/ml de canamicina, e cultivados a 37°C durante 16 horas. Então cada placa foi incubada a 37°C durante 16 horas sob uma condição anaeróbica por uso de Anaeropack (Mitsubishi Gas Chemical). As células obtidas na placa foram lavadas com 0,8% de salmoura, e então diluídas 51 vezes, e assim a suspensão de célula tendo OD = 1,0 (600 nm) foi preparado. Esta suspensão de célula em um volume de 100 μl e um meio de produção (10 g/1 de glicose, 10 g/1 2Na de malato, 45,88 g/1 de TES, 6 g/1 de Na2HPO4, 3 g/1 de KH2PO4, 1 g/1 de NEfiCl, ajustado para pH 7,3 com KOH e filtrado) em um volume de 1,3 ml em que os gases dissolvendo no meio foram substituídos com gás nitrogênio por borbulhamento de gás de nitrogênio antes e colocados em microtubos de 1,5 ml de volume, e as células foram cultivadas a 31,5°C durante 6 horas por uso de um agitador para os microtubos. Após a cultura, a quantidade de ácido succínico acumulada no meio foi analisada por cromatografia líquida. Dois dos recheios tipo Shim SCR-102H (Shimadzu) conectados em série foram usados como a coluna, e uma amostra foi eluída a 50°C com 5 mM de ácido p-toluenossulfônico. O eluado foi neutralizado com 20 mM de uma solução aquosa de Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-toluenossulfônico e 100 μM de EDTA, e ácido succínico foi quantificado por medir condutividade elétrica com CDD-10AD (Shimadzu).

As quantidades de ácido succínico acumuladas após 6 horas são mostradas na tabela 7, e a mudança de acúmulo de ácido succínico é mostrada na fig. 5.

Acúmulo de ácido succínico foi marcadamente aumentado na cepa amplificada com o gene ybjL AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL como comparado a AJ110637/pMW219 como o controle. Tabela 7: Efeito de amplificação de ybjL em cepa AJ110637

Exemplo 9 <9-l> Construção de cepa deficiente em adhE de Enterobacter aerogenes AJ110637

Quando Enterobacter aerogenes AJ110637 é cultivado em um meio contendo uma fonte de açúcar sob condições anaeróbicas, ele produz uma quantidade de etanol marcada. Deste modo, adhE codificando para álcool desidrogenase foi deletado para suprimir a geração de etanol.

Um fragmento do gene para deletar adhE foi preparado por PCR usando um plasmídeo pMW-attL-Tc-attR descrito em WO 2005/010175 como o gabarito e oligonucleotídeos de SEQ ID NOS: 72 e 73 como iniciadores. pMWl 18-attL-Tc-attR é um plasmídeo obtido por inserção dos genes attL e attR, que são os sítios de fixação de fago À,, e o gene Tc, que é um gene de resistência a antibiótico, em pMW118 (Takara Bio), e os genes são inseridos na ordem de attL-Tc-attR. Por PCR descrito acima, um fragmento do gene contendo um gene de resistência a tetraciclina, sequências attL e attR de fago X em ambas as extremidades do gene de resistência, e sequência de 60 bp a montante e sequência de 59 bp a jusante do gene adhE adicionado às extremidades externas das seqüências do fago X foi amplificado. Este fragmento foi purificado por uso de sistema de purificação de DNA Wizard PCR Prep (Promega).

Então a cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637 foi transformada com RSF-Red-TER para obter cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637/RSF-Red-TER. Esta cepa foi cultivada durante a noite no meio LB contendo 40 μg/L de cloranfenicol, o meio de cultura foi inoculado em um volume de 1/100 a 50 mL do meio LB contendo 40 μg/L de cloranfenicol e 0,4 mM de isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo, e a cultura foi realizada a 31 °C durante 4 horas. As células foram coletadas, lavadas três vezes com 10% de glicerol resfriado com gelo e finalmente colocadas em suspensão em 0,5 mL de 10% de glicerol. As células colocadas em suspensão foram usadas como células competentes, e o fragmento PCR preparado na seção acima foi introduzido nas células por uso de GENE PULSER II (BioRad) sob as condições de um campo de força de 20 kV/cm, capacidade do capacitor de 25 μF e resistência de 200 Q. Meio LB resfriado com gelo foi adicionado na suspensão de célula, e a cultura foi realizada a 31 °C durante 2 horas com agitação. Então a cultura foi aplicada em um meio preparado por adição de 25 μg/L de tetraciclina no meio LB. As colônias que apareceram foram purificadas com o mesmo meio, e então foi confirmado por PCR que o gene adhE foi substituído com o gene de resistência a tetraciclina.

<9-2> Construção de cepa otimizada de gene piruvato carboxilase de cepa AJ110637AadhE

Uma capacidade para produzir ácido succínico foi dada para a cepa Enterobacter aerogenes AJ110637AadhE por amplificação de pyc codificando para piruvato carboxilase derivado de Corynebacterium glutamicum nesta cepa.

A fim de expressar pyc derivado de Corynebacterium glutamicum na cepa AJ110637AadhE, foi tentado obter um fragmento de promotor operon treonina da cepa Escherichia coli MG 165 5. A sequência de Escherichia coli genômica total (cepa Escherichia coli K-12) já tinha sido elucidada (acesso Genbank No.U00096, Science, 277, 1453-1474 (1997)). Com base nesta sequência, amplificação PCR da região promotora do operon treonina (thrLABC) foi realizada. PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético tendo um sítio Saci mostrado em SEQ ID NO: 75 como um iniciador 5', o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 76 como um iniciador 3', e o DNA genômico de cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076, ATCC 700926) como um gabarito para obter um fragmento de promotor operon treonina (A) (SEQ ID NO: 77).

Além disso, um fragmento do gene pyc derivado da cepa Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) foi obtido. PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 78 como um iniciador 5', o oligonucleotídeo sintético tendo um sítio Saci mostrado em SEQ ID NO: 79 como um iniciador 3', e o DNA genômico da cepa Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) como um gabarito para obter um fragmento do genepyc (B) (SEQ ID NO: 80).

PCR foi realizado por uso dos fragmentos (A) e (B) como gabaritos, os iniciadores de SEQ ID NOS: 75 e 79 para obter um fragmento do gene (C) consistindo dos fragmentos (A) e (B) ligados uns aos outros. Este fragmento do gene (C) foi tratado com a enzima de restrição Saci, e purificado, e o produto foi ligado com o vetor de plasmídeo pSTV28 (Takara Bio) digerido com uma enzima de restrição Saci para a construção de um plasmídeo pSTV28::Pthr::pyc para amplificação de pyc.

O plasmídeo pSTV28::Pthr::pyc para amplificação pyc foi introduzido na cepa Enterobacter aerogenes AJ110637AadhE acima mencionado por eletroporação para obter um transformante exibindo resistência a tetraciclina e cloranfenicol. Esta cepa amplificada em pyc de Enterobacter aerogenes AJ110637AadhE foi designada como AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc.

<9-3> Construção de cepa otimizada em gene ybjL de Enterobacter aerogenes de AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc

Do mesmo modo como descrito acima, a amplificação PCR da região promotora do operon treonina (thrLABC) de Escherichia coli (cepa Escherichia coli K-12) foi realizada. PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 81 como um iniciador 5', o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 82 como um iniciador 3', e o DNA genômico de cepa Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076, ATCC 700926) como um gabarito para obter um fragmento de promotor operon treonina (A) (SEQ ID NO: 83).

Além disso, a fim de clonar o gene ybjL da cepa Enterobacter aerogenes AJ110637, PCR foi realizado por uso do oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 84 como um iniciador 5', o oligonucleotídeo sintético mostrado em SEQ ID NO: 85 como um iniciador 3', e o DNA genômico da cepa Enterobacter aerogenes AJ 110637 como um gabarito para obter um fragmento de gene ybjL (B) (SEQ ID NO: 86).

PCR foi realizado por uso dos fragmentos (A) e (B) como gabaritos, e os iniciadores de SEQ ID NOS: 81 e 85 para obter um fragmento de gene (C) consistindo dos fragmentos (A) e (B) ligados em cada outro. Este fragmento de gene (C) foi terminado de modo cego por uso de kit TaKaRa BKL (Takara Bio), e a extremidade 5' foi fosforilada. Então o fragmente foi digerido com a enzima de restrição Smal, e o produto foi ligado com o vetor de plasmídeo pMW218 desfosforilado com fosfatase alcalina para construir um plasmídeo pMW218::Pthr::Ent-ybjL para amplificação de ybjL.

O vetor pMW218::Pthr::Ent-ybjL acima mencionado para amplificação do gene ybjL derivado da cepa Enterobacter aerogenes AJ 110637, e o plasmídeo pMW218 para controle foram cada introduzidos na cepa de Enterobacter aerogenes AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc por eletroporação para obter transformantes exibindo resistência a tetraciclina, cloranfenicol e canamicina. A cepa amplificada em ybjL derivada da cepa Enterobacter aerogenes AJ110637AadhE/pSTV28::Pthr::pyc foi designada como AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL, e a cepa pMW218 introduzida como um controle foi designada como AJ 11063 7AadhE/pSTV28: :Pthr: :pyc/pMW218.

<9-4> Efeito de amplificação de ybjL derivado de Enterobacter aerogenes em bactéria Enterobacter

AJ11063 7ΔadhE/pSTV28: :Pthr: :pyc/pMW218: :Pthr: :Ent- ybjL, e AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218 foram cada uniformemente aplicados em uma placa LB contendo 50 μg/ml de canamicina, 25 g/ml de tetraciclina, e 40 μg/ml de cloranfenicol, e cultivados a 31,5°C durante 16 horas. Então as células foram inoculadas em 3 ml de um meio de semente (20 g/l de Bacto triptona, 10 g/l de extrato de levedura, 20 g/L de NaCl) contido em um tubo de teste, e cultivados a 31,5°C durante 16 horas com agitação. Um meio de produção de ácido succínico (100 g/l de glicose, 50 g/L de carbonato de cálcio submetido à esterilização com ar quente durante 3 horas ou mais) em um volume de 3 ml foi adicionado ao meio obtido acima, então o tubo foi vedado com uma tampa de silicone, e a cultura foi realizada a 31,5°C durante 24 horas com agitação. Após a cultura, a quantidade de ácido succínico acumulada no meio foi analisada por cromatografia líquida. Dois dentre os recheios tipo Shim SCR-102H (Shimadzu) conectados em séries foram usados como a coluna, e uma amostra foi eluída a 50°C com 5 mM de ácido p-toluenossulfônico. O eluído foi neutralizado com 20 mM de solução aquosa de Bis-Tris contendo 5 mM de ácido p-toluenossulfônico e 100 μM de EDTA, e ácido succínico foi quantificado por medição da condutividade elétrica com CDD-10AD (Shimadzu).

As quantidades de ácido succínico acumuladas após 24 horas são mostradas na tabela 8.

O acúmulo de ácido succínico e o rendimento de ácido succínico com base em sacarídeo consumido foram aumentados de modo marcante na cepa amplificada por gene ybjL AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL como comparado a AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218 como o controle Tabela 8

Explicação da listagem de sequência SEQ ID NO: 1: gene vójL de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 2: YbjL de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 3: gene ybjL de Escherichia coli SEQ ID NO: 4: YbjL de Escherichia coli SEQ ID NO: 5: Sequência consenso de YbjL de Pantoea ananatis e Escherichia coli SEQ ID NO: 6: Iniciador para ruptura do gene ams SEQ ID NO: 7: Iniciador para ruptura do gene ams SEQ ID NO: 8: Iniciador para amplificação de ybjL de P. ananatis SEQ ID NO: 9: Iniciador para amplificação de ybjL de P. ananatis SEQ ID NO: 10: Sequência de plasmídeo RSFCPG SEQ ID NO: 11: Iniciador para amplificação de ybjL de E. coli W3110 SEQ ID NO: 12: Iniciador para amplificação áeybjL de E. coli W3110 SEQ ID NO: 13: Iniciador para deleção de IdhA SEQ ID NO: 14: Iniciador para deleção de IdhA SEQ ID NO: 15: Iniciador para confirmar deleção de IdhA SEQ ID NO: 16: Iniciador para confirmar deleção de IdhA SEQ ID NO: 17: Iniciador para deleção de UdD SEQ ID NO: 18: Iniciador para deleção de UdD SEQ ID NO: 19: Iniciador para confirmar deleção de UdD SEQ ID NO: 20: Iniciador para confirmar deleção de UdD SEQ ID NO: 21: Promotor de sequência de treonina SEQ ID NO: 22: Iniciador para amplificação de ybjL de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 23: Iniciador para amplificação àeybjL de E. coli MG1655 SEQ ID NO: 24: genejVyZ de Salmonella typhimurium SEQ ID NO: 25: YbjL de Salmonella typhimurium SEQ ID NO: 26: geneyójL de Yersiniapestis SEQ ID NO: 27: YbjL de Yersiniapestis SEQ ID NO: 28: gene_yó/'£ de Erwinia carotovora SEQ ID NO: 29: YbjL de Erwinia carotovora SEQ ID NO: 30: gencyb/L de Vibrio cholerae SEQ ID NO: 31: YbjL de Vibrio cholerae SEQ ID NO: 32: gene J-TJ/L de Aeromonas hydrophia SEQ ID NO: 33: YbjL de Aeromonas hydrophia SEQ ID NO: 34: geneyZyL de Photobacteriumprofundum SEQ ID NO: 35: YbjL de Photobacteriumprofundum SEQ ID NO: 36: gene IdhA de Escherichia coli SEQ ID NO: 37: LdhA de Escherichia coli SEQ ID NO: 38: UdD gene de Escherichia coli SEQ ID NO: 39: LldD de Escherichia coli SEQ ID NO: 40: Sequência de nucleotídeo de gene hisD de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 41: Iniciador para amplificação de fragmento para incorporação de gene Kmr em gene hisD SEQ ID NO: 42: Iniciador para amplificação de fragmento para incorporação de gene Kmr em gene hisD SEQ ID NO: 43: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO: 44: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO: 45: Iniciador para amplificação de gene sacB SEQ ID NO: 46: Iniciador para amplificação de gene sacB SEQ ID NO: 47: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor PlacUV5 SEQ ID NO: 48: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor PlacUV5 SEQ ID NO: 49: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene XRedαβy e tL3 SEQ ID NO: 50: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene XRedαβy e tL3 SEQ ID NO: 51: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor PlacUV5 e TrmB SEQ ID NO: 52: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo promotor PlacUV5 e TrmB SEQ ID NO: 53: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 54: Iniciador para amplificação de attL SEQ ID NO: 55: Sequência de nucleotídeo de attL SEQ ID NO: 56: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 57: Iniciador para amplificação de attR SEQ ID NO: 58: Sequência de nucleotídeo de attR SEQ ID NO: 59: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene bla SEQ ID NO: 60: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo gene bla SEQ ID NO: 61: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rrnB SEQ ID NO: 62: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo ter_rrnB SEQ ID NO: 63: Sequência de nucleotídeo do fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL SEQ ID NO: 64: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL SEQ ID NO: 65: Iniciador para amplificação de fragmento de DNA contendo terminador ter_thrL SEQ ID NO: 66: operon ams de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 67: ArnsH de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 68: Amsl de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 69: AmsA de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 70: AmsC de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 71: AmsB de Pantoea ananatis SEQ ID NO: 72: Sequência de nucleotídeo de iniciador para deleção de adhE SEQ ID NO: 73: Sequência de nucleotídeo de iniciador para deleção de adhE SEQ ID NO: 74: Sequência de nucleotídeo de adhE de Enterobacter aerogenes AJ110637 (sequência parcial) SEQ ID NO: 75: Iniciador para amplificação de promotor de treonina SEQ ID NO: 76: Iniciador para amplificação de promotor de treonina SEQ ID NO: 77: Fragmento do gene promotor de treonina SEQ ID NO: 78: Iniciador para amplificação do gene piruvato carboxilase SEQ ID NO: 79: Iniciador para amplificação do gene piruvato carboxilase SEQ ID NO: 80: Fragmento do gene piruvato carboxilase SEQ ID NO: 81: Iniciador para amplificação de promotor de treonina SEQ ID NO: 82: Iniciador para amplificação de promotor de treonina SEQ ID NO: 83: Fragmento do gene promotor de treonina SEQ ID NO: 84: Sequência de nucleotídeo de iniciador para amplificação de ybjL de Enterobacter aerogenes AJ110637 SEQ ID NO: 85: Sequência de nucleotídeo de iniciador para amplificação de ybjL de Enterobacter aerogenes AJ110637 SEQ ID NO: 86: Sequência de nucleotídeo de ybjL de Enterobacter aerogenes AJ110637 SEQ ID NO: 87: Sequência de aminoácido de YbjL de Enterobacter aerogenes AJ110637 SEQ ID NO: 88: Sequência consenso de YbjL de Escherichia, Pantoea e Enterobacter

Aplicabilidade industrial

A eficiência da produção de uma substância ácida tendo um grupo carboxila pode ser otimizada por uso do microorganismo da presente invenção.

Claims

1. Método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar um microrganismo em um meio para produzir e acumular a substância ácida tendo um grupo carboxila no meio; e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila a partir do meio, em que o microrganismo tem uma capacidade de produzir a substância ácida tendo um grupo carboxila, em que o microrganismo foi modificado de modo que a expressão do gene ybjL é otimizada por aumento do número de cópias do gene ybjL, em que o microrganismo é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, e em que o gene ybjL é um gene compreendendo a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 298 a 1986 na SEQ ID NO: 1, a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 101 a 1783 na SEQ ID NO: 3, ou a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 19 a 1704 na SEQ ID NO: 86, e em que a substância ácida consiste em um ou mais tipos de substâncias selecionadas do grupo consistindo em ácido L-glutâmico e ácido succínico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a substância ácida consiste de ácido L-glutâmico.

3. Método para produzir uma substância ácida tendo um grupo carboxila, caracterizado pelo fato de que compreende: colocar um microrganismo ou produto processado do mesmo em uma mistura de reação contendo uma matéria-prima orgânica em combinação com íons carbonato, íons bicarbonato, ou gás dióxido de carbono de modo a produzir a substância ácida tendo um grupo carboxila; e coletar a substância ácida tendo um grupo carboxila, em que o microrganismo tem uma capacidade de produzir a substância ácida tendo um grupo carboxila, em que o microrganismo foi modificado de modo que a expressão do gene ybjL é otimizada por aumento do número de cópias do gene ybjL, em que o microrganismo é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, em que o gene ybjL é um gene compreendendo a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 298 a 1986 na SEQ ID NO: 1, a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 101 a 1783 na SEQ ID NO: 3, ou a sequência nucleotídica dos nucleotídeos de número 19 a 1704 na SEQ ID NO: 86, em que a substância ácida consiste em um ou mais tipos de substâncias selecionadas do grupo consistindo em ácido L-glutâmico e ácido succínico, e em que o produto processado é selecionado do grupo consistindo de células imobilizadas, células rompidas, sobrenadante de centrifugação de células rompidas, fração obtida por purificação parcial do sobrenadante.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a substância ácida é ácido succínico.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é selecionado a partir do grupo consistindo em bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, Enterobacter, Raoultella, Pantoea e Klebsiella.