JPWO2008133161A1 - カルボキシル基を有する酸性物質の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
(2)ybjL遺伝子のコピー数を高めること又はybjL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変された(1)に記載の微生物。
(3)ybjL遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である(1)または(2)に記載の微生物:
(A)配列番号2、4または87に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号2、4または87に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、微生物内でその発現を増強することにより微生物のカルボキシル基を有する酸性物質生産能を向上させるを有するタンパク質。
(4)ybjL遺伝子が、配列番号5又は88に記載のタンパク質をコードする遺伝子である(1)〜(3)のいずれかに記載の微生物。
(5)前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌である、(1)〜(4)のいずれかに記載の微生物。
(6)前記微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、パントエア属細菌及びクレブシエラ属細菌からなる群より選択される、(5)に記載の微生物。
(7)前記微生物がルーメン細菌である、(1)〜(4)のいずれかに記載の微生物。
(8)前記微生物が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである(7)に記載の微生物。
(9)前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種又は2種以上の有機酸である(1)〜(8)のいずれかに記載の微生物。
(10)前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である(1)〜()のいずれかに記載の微生物。
(11)(1)〜(10)のいずれかに記載の微生物を培地中で培養し、該培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成・蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
(12)前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種又は2種以上の有機酸である、(11)に記載の方法。
(13)前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である、11に記載の方法。
(14)(1)〜(10)のいずれかに記載の微生物又は微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
(15)前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、α-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種又は2種以上の有機酸である、(14)に記載の方法。
(16)(12)又は(15)に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
本発明の微生物は、カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。「カルボキシル基を有する酸性物質の生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、カルボキシル基を持つ酸性物質を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成、蓄積する能力をいう。カルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有する微生物としては、本来的にカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有するものであってもよいが、以下に示すような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用してカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能を有するように改変したものや、本発明の遺伝子を導入することによってカルボキシル基を持つ酸性物質の生産能が付与又は増強された微生物であってもよい。
パントエア・アナナティスAJ13356株(FERM BP-6615)(欧州特許出願公開0952221号明細書)
尚、これらの菌株は、欧州特許出願公開0952221号明細書にはエンテロバクター・アグロメランスとして記載されているが、現在では、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株(FERM BP-6600)(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株(FERM BP-6617)(欧州特許出願公開955368号明細書)
ラウルテラ・プランティコーラ ATCC33531株
尚、AJ13399株及びAJ13410株は、寄託当時はクレブシエラ・プランティコーラとして分類されていたが、現在ではクレブシエラ・プランティコーラはラウルテラ・プランティコーラに分類されている(Drancourt, M. 2001. Int J Syst Evol Microbiol. 51:925-32)。
以下、細菌にカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を付与する方法、またはこれらの微生物のカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を増強する方法について述べる。
以下、具体的に微生物にアミノ酸又は有機酸生産能を付与する方法と、アミノ酸又は有機酸生産菌について例示する。
上述したような微生物にL−グルタミン酸生産能を付与するための改変の方法としては、例えば、L−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変する方法を挙げることができる。L−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(以下、「GDH」ともいう)(gdhA)、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニット酸ヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(以下、「CS」ともいう)(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ(以下「PRPC」ともいう)(prpC)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(以下、「PEPC」ともいう)(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ(pfkA,pfkB)、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などをが挙げられる。酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である。これらの酵素の中では、CS又はPRPC、PEPCおよびGDHのいずれか1種以上が好ましく、3種全てがより好ましい。
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624 (FERM BP-3853)
エシェリヒア・コリAJ12628 (FERM BP-3854)
エシェリヒア・コリAJ12949 (FERM BP-4881)
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr は、エシェリヒア・コリW3110の2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(sucA遺伝子)を破壊することにより得られた株である。この株は、2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
パントエア・アナナティスAJ13356(FERM BP-6615 米国特許6.331,419号)
パントエア・アナナティスSC17sucA(FERM BP-8646 国際公開パンフレットWO2005/085419号)
クレブシエラ・プランティコーラ AJ13410(FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム ΔS株 (国際公開95/34672号パンフレット参照)
SC17sucA株は、プライベートナンバーAJ417が付与され、平成16年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター(郵便番号305−8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
AJ13410株は、平成10年2月19日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所(現 産業技術総合研究所特許生物寄託センター、郵便番号305−8566 茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に、受託番号及びFERM P-16647として寄託され、平成11年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6617が付与されている。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573(FERM P-5492) 特開昭56-151495公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12210(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212(FERM P-8123) 特開昭61-202694公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12418(FERM-BP2205) 特開平2-186994公報参照
ブレビバクテリウム・フラバムDH18(FERM P-11116) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・メラセコラDH344(FERM P-11117) 特開平3-232497公報参照
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11574(FERM P-5493) 特開昭56-151495公報参照
エシェリヒア・コリAJ12628(FERMBP−3854)
エシェリヒア・コリAJ12624(FERMBP−3853)
前者は、2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、さらにL−グルタミン酸の分解活性が低下し、aceオペロンの発現が構成的になった性質を併せ持つ変異株であり、後者は、2−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下し、さらにL−グルタミン酸の分解活性が低下した変異株である(仏国特許2680178号明細書参照)。
コハク酸生産菌としては、酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株を使用することが出来、具体的には、エシェリヒア・コリSS373株(国際公開99/06532号パンフレット)が挙げられる。
酢酸、乳酸、エタノール、及び蟻酸の形成能を欠損した株は、最小培地で酢酸、及び乳酸を資化できない株を取得すること、または、以下の乳酸の生合成系遺伝子、及び酢酸の生合成系酵素の活性を低下することによって取得することが可能である。(国際公開2005/052135号パンフレット)。
また、上記のような株は、モノフルオロ酢酸耐性(US5,521,075)を付与することによっても取得することができる。
その他にコハク酸生成能が向上した株を取得する方法として、蟻酸リアーゼと乳酸デヒドロゲナーゼの両方を欠損し、ピルビン酸を資化できない株を、嫌気条件下でグルコース富化培地で培養し、ピルビン酸資化能を有する変異株を単離する方法が挙げられる(国際公開1997/16528号パンフレット)。
コハク酸生産能は、乳酸の生合成系酵素である、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH 以下カッコ内は酵素名)の酵素活性が低下するように改変することによっても付与することができる(国際公開2005/052135号パンフレット、国際公開2005/116227号パンフレット、米国特許5,770,435号公報、米国特許出願公開2007/0054387号公報、国際公開99/53035号公報、Alam, K. Y.and Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217)微生物によってはL型の乳酸デヒドロゲナーゼとD型の乳酸デヒドロゲナーゼを有するものがあるが、いずれか一方を低下させるように改変すればよいが、両方とも低下させることが好ましい。
コハク酸生産能は、ピルビン酸カルボキシラーゼ、マリックエンザイム、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を増強することによっても高めることが出来る(特開平11-196888号公報、国際公開第99/53035号パンフレット、Hong, S. H., and S. Y. Lee. 2001. Biotechnol. Bioeng. 74: 89-95、Millard, C. S. et al. 1996. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1808-1810、国際公開2005/021770号パンフレット特開2006-320208、Kim, P. et al. 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1238-1241)。これらの目的酵素の酵素活性増強は、前述したL−グルタミン酸生産菌について記載した目的遺伝子の発現の増強方法、及び下述するybjL遺伝子の発現の増強方法を参照にして行うことが出来る。
エシェリヒア・コリ SS373株(国際公開99/06532号パンフレット)
エシェリヒア・コリ AFP111株(国際公開9716528号パンフレット)
エシェリヒア・コリ NZN111株(米国特許6,159,738号公報)
エシェリヒア・コリ AFP184株(国際公開2005/116227号パンフレット)
エシェリヒア・コリ SBS100MG株、SBS110MG株、SBS440MG株、SBS550MG株、SBS660MG株(国際公開2006/031424号公報)
ブレビバクテリウム・フラバムAB−41株(特開平11−113588号公報)
ブレビバクテリウム・フラバムAB−41株/PC増幅株(特開平11−196888号公報)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ110655株(FERM BP-10951)
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh(国際公開第2005/021770号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)2256Δ(ldh, ach, pta, ack)(国際公開第2005/113744号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)(国際公開第2005/113745号パンフレット)
コリネバクテリウム・グルタミカムRldh-/pCRB-1 PC株(国際公開2005/010182号パンフレット)
マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス LPK,LPK7,LPK4(国際公開2005/052135号パンフレット)
アクチノバチルス・サクシノゲネス 130Z(米国特許5,504,004号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ10(米国特許5,521,075号公報)
アンアエロバイオスピリルム・サクシニシプロデューセンス FZ53(米国特許5,573,931号公報)
本発明の微生物は、上述したようなカルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有する微生物を、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にybjL遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、カルボキシル基を有する酸性物質生産能を付与してもよい。また、ybjL遺伝子の増幅により、カルボキシル基を有する酸性物質の生産能が付与又は増強された微生物でもよい。
ここで、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された」とは、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下していることをいう。乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、乳酸デヒドロゲナーゼ非改変株と比較して、菌体当たり10%以下に低下されていることが好ましい。また、乳酸デヒドロゲナーゼ活性は完全に欠損していてもよい。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下されたことは、公知の方法(Kanarek, L. and Hill, R.L. 1964. J. Biol. Chem. 239: 4202)により乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。エシェリヒア・コリの乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下した変異株の具体的な製造方法としては、Alam, K. Y., and Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217に記載されている方法等が挙げられる。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下され、かつ、ybjL遺伝子の発現が増強された微生物は、例えば後述の実施例1のようにして、LDH遺伝子が破壊された微生物を作製し、該微生物をybjL遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低下のための改変操作とybjLの発現増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。ここで、エシェリヒア・コリではLDHはldhA遺伝子、lldD遺伝子がコードしており、ldhA遺伝子のDNA配列を配列番号36、アミノ酸配列を配列番号37に、lldD遺伝子のDNA配列を配列番号38、アミノ酸配列を配列番号39に示す。
ヒト [Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)]
マウス[Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)]
ラット[GENE, 165, 331-332, (1995)]
酵母;サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)
[DDBJ Accession No.; D78170]
バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)
[GENE, 191, 47-50, (1997)]
リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)
[J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)]
なお、PC遺伝子発現の増強は、上述した前述したL−グルタミン酸生産菌について記載した目的遺伝子の発現の増強、及びybjL遺伝子の発現増強と同様にして行うことができる。
本発明の微生物を培地に培養し、培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することにより、カルボキシル基を有する酸性物質を製造することが出来る。また、本発明の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することによっても、カルボキシル基を有する酸性物質を製造することができる。前者の方法は、カルボキシル基を有する酸性物質が酸性アミノ酸である場合に好適である。また、後者の方法は、カルボキシル基を有する酸性物質が有機酸である場合に好適である。以下、カルボキシル基を有する酸性物質として、酸性アミノ酸及び有機酸の製造について、好適な態様を例示する。
本発明の微生物を培地に培養し、培地中に酸性アミノ酸を生成蓄積せしめ、酸性アミノ酸を該培地から採取することにより、酸性アミノ酸を製造することができる。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の培地を用いることができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株が利用可能であるものならばいずれの種類を用いてもよい。
本発明の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、有機酸を生成させ、該有機酸を採取することによって、有機酸を製造することができる。
前記第一の形態では、培地に添加する炭素源は、有機酸生成のための有機原料でもある。
前記第二の形態では、培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、有機酸生成反応に用いられる。
パントエア・アナナティスにおいてsdhA遺伝子破壊を行うために、「Red-driven integration」あるいは「Red-mediated integration」と呼ばれる方法(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645)を高効率で行うための受容菌を構築した。
ヘルパープラスミドRSF-Red-TERの構築スキームを図2に示す。
構築の最初の工程として、RSFsacBPlacMCSベクターをデザインした。そのために、pACYC184プラスミドのcat遺伝子、及びバチルス・サブチリスのsacB遺伝子の構造部分を含むDNA断片を、それぞれ配列番号43、44、45、46のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRにより増幅した。これらのオリゴヌクレオチドは各々、さらなるクローニングに必要な、都合のよいBglII、SacI、XbaI、及びBamHI制限酵素部位を5'末端に含んでいる。得られた1.5kbのsacB断片を、先に得たpMW119-PlaclacIベクターのXbaI-BamHI部位にクローニングした。このベクターは、pMW118-PlaclacIベクターについての記載(Skorokhodova, A.Y. et al. 2004. Biotekhnologiya (Rus) 5: 3-21)と同様にして構築した。但し、同ベクターは、pMW218プラスミドの代りにpMW219からのポリリンカー部位を含んでいる。
pMW118-(λattL-Kmr-λattR)プラスミドは、pMW118-attL-Tc-attR (WO2005/010175)プラスミドから、テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子をpUC4Kプラスミドのカナマイシン耐性遺伝子で置換することによって構築した。そのために、pMW118-attL-Tc-attRプラスミドのEcoRI-HindIII大断片を、pUC4KプラスミドのHindIII-PstI(676bp)及びEcoRI-HindIII(585bp)の2つの断片に連結した。基本となるpMW118-attL-Tc-attRは、以下の4つの断片を連結することによって得た。
・pMW118のAatII-EcoRI断片を持つ大断片(2359 bp)。この断片は、pMW118をEcoRIで消化し、DNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理し、次いでAatIIで消化することによって得た。
・アンピシリン耐性(ApR)の遺伝子blaを持つpUC19のAatII-BglII小断片(1194 bp)。この断片は、pUC19プラスミドの相当する領域をプライマーP5及びP6(配列番号59及び60)を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びAatII及びBglIIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・転写ターミネーターter_rrnBのBglII-PstI小断片(363bp)。この断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域をプライマーP7及びP8(配列番号61及び62)を用いてPCR増幅することにより得た。これらのプライマーは、PstI及びBglII及びPstIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-MCSプラスミド(Mashko, S.V. et al. 2001. Biotekhnologiya (in Russian) no.5, 3-20)をXbaI及びBamHIで消化し、次いで大断片(3342bp)を、ter_thrLターミネーターを含むXbaI-BamHI断片(68bp)と連結した。このter_thrLターミネーターを含む断片は、エシェリヒア・コリMG1655染色体の相当する領域を、プライマーP9及びP10(配列番号64及び65)を用いたPCRにより得た。こうしてpML-ter_thrLプラスミドを得た。これらのプライマーは、PstI及びXbaI及びBamHIのための副次的な認識部位を含んでいる。
・pML-ter_thrLプラスミドをKpnI及びXbaIで消化し、次いでDNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理し、テトラサイクリン耐性遺伝子を持つpBR322のEcoRI-Van91I小断片(1317bp)と連結して、pML-Tc-ter_thrLプラスミドを得た。尚、pBR322は、EcoRI及びVan91Iで消化し、次いでDNAポリメラーゼIクレノーフラグメントで処理した。
L−グルタミン酸排出遺伝子の探索は以下のようにして行った。L−グルタミン酸は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼによってトリカルボン酸サイクルの中間体である2−オキソグルタル酸に、1段階で変換されるため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやトリカルボン酸サイクルを持つ多くの微生物では、L−グルタミン酸は容易に代謝されることが予想される。しかし、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損させた株はグルタミン酸を分解できないため、高濃度のグルタミン酸存在下では生育が阻害される。ここでは、2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ欠損株としてパントエア・アナナティスSC17sucA株(特開平2001-333769号公報参照)から誘導した菌体外多糖生合成系欠損株SC17sucAamsを用い、高濃度のL−グルタミン酸耐性を指標にL−グルタミン酸排出系遺伝子の取得を試みた。
次に、この遺伝子がL−グルタミン酸生産に与える影響を検討するため、ybjL増幅用プラスミドpSTV-PanybjLを、配列番号10に示すL−グルタミン酸生産用プラスミドRSFCPGを有するL−グルタミン酸生産菌SC17sucA/RSFCPG(特開平2001-333769号公報参照)に導入して、L−グルタミン酸生産性を調べた。
〔培養培地組成〕
〔A区〕
シュークロース 30g/L
MgSO4・7H2O 0.5g/L
〔B区〕
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O 0.02g/L
MnSO4・5H2O 0.02g/L
L−リジン塩酸塩 0.2g/L
DL-メチオニン 0.2g/L
ジアミノピメリン酸 0.2g/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔C区〕
CaCO3 20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩・クロラムフェニコールをそれぞれ12.5mg/L 25mg/Lとなるように添加した。
次にエシェリヒア・コリのybjL遺伝子をパントエア・アナナティスSC17sucA/RSFCPG株に導入してGlu生産能に対する効果を調べた。
〔培養培地組成〕
〔A区〕
シュークロース 30g/L
MgSO4・7H2O 0.5g/L
〔B区〕
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O 0.02g/L
MnSO4・5H2O 0.02g/L
L−リジン塩酸塩 0.2g/L
DL-メチオニン 0.2g/L
ジアミノピメリン酸 0.2g/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔C区〕
CaCO3 20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩・クロラムフェニコールをそれぞれ12.5mg/L 25mg/Lとなるように添加した。
次にパントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子、エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子をエシェリヒア・コリに導入して増幅効果を検討した。
〔A区〕
グルコース 30g/L
MgSO4・7H2O 0.5g/L
〔B区〕
(NH4)2SO4 20g/L
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O 20mg/L
MnSO4・5H2O 20mg/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔C区〕
炭酸カルシウム 20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。
〔A区〕
グルコース 40g/L
MgSO4・7H2O 0.5g/L
〔B区〕
(NH4)2SO4 20g/L
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O 20mg/L
MnSO4・5H2O 20mg/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔C区〕炭酸カルシウム 30g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。
パントエア・アナナティス由来のybjL遺伝子をクレブシエラ・プランティコーラに導入して増幅効果を検討した。
〔A区〕
シュークロース 30g/L
MgSO4・7H2O 0.5g/L
〔B区〕
KH2PO4 2.0g/L
酵母エキス 2.0g/L
FeSO4・7H2O 0.02g/L
MnSO4・5H2O 0.02g/L
L−リジン塩酸塩 0.2g/L
DL-メチオニン 0.2g/L
ジアミノピメリン酸 0.2g/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔C区〕
CaCO3 20g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、クロラムフェニコールを25mg/Lとなるように添加した。
本遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法(Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645)とλファージ由来の切り出しシステム(Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203)によって実施した。本手法により目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5’側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を3’側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組み合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る。
WO2005/010175の記載に従って、ldhA遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。pMW118-attL-Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attL-cat-attRの順で挿入されている。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号13、14に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、ldhA遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号15,16に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。親株のPCR産物が約1.2kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められる。
ldhA遺伝子欠損株の構築と同様の方法にて構築した。lldD遺伝子の一部に対応するプライマーの5’末端に、λファージのattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3’末端に、それぞれ有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてプラスミドpMW118-attL-Cm-attRを鋳型としてPCRを行った。プライマーに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を配列番号17、18に示す。増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655ΔldhA株にエレクトロポレーションにより導入した。次に、プラスミドpKD46が脱落したアンピシリン感受性株を取得し、lldD遺伝子の欠失をPCRによって確認した。PCRは配列番号19,20に示した合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いて行った。親株のPCR産物が約1.4kbであるのに対し、欠損株は約1.9kbにバンドが認められる。
<6-1>遺伝子増幅用プラスミドの構築
ybjL遺伝子の増幅を行うためにプラスミドpMW219::Pthrを用いた。本プラスミドは、ベクターpMW219 (日本ジーン社製)のHindIIIサイトとBamHIサイトに配列番号21に示したエシェリヒア・コリのゲノム上のスレオニンオペロン(thrLABC)のプロモーター領域を有しており。このプロモーターの下流に遺伝子をクローニングすることによって遺伝子の増幅が可能なプラスミドである。
エシェリヒア・コリのゲノム配列のybjL遺伝子の塩基配列(GenBank Accession No.U00096)に基づいて、5’プライマーとしてBamHIサイトを有する配列番号22に示す合成オリゴヌクレオチド、配列番号23に示す3'側プライマーとしてBamHIサイトを有する合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、制限酵素BamHIにて処理し、ybjL遺伝子を含む遺伝子断片を得た。精製したPCR産物を、BamHIで処理したベクターpMW219::Pthrに連結してybjL増幅用プラスミドpMW219::Pthr::ybjLを構築した。
上記(6-2)で得られたpMW219::Pthr::ybjLおよびpMW219を用いて、エシェリヒア・コリMG1655ΔldhAΔlldD株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれMG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219と名づけた。また、エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637をpMW219::Pthr::ybjLおよびpMW219を用いて電気パルス法にて形質転換を行い、カナマイシン50μg/mlを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で約18時間培養した。出現したコロニーを純化し、定法によりプラスミドを抽出し、目的のプラスミドが導入されていることを確認した。得られた株をそれぞれAJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219と名づけた。
MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjL、MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219を25μg/ml のカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック(三菱ガス化学株式会社)を用いて嫌気条件下、37℃で、16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0(600nm)になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地(グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過)1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃で10時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H(Simazu)を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
10時間目のコハク酸蓄積を表6、コハク酸蓄積の経時変化を図4に示す。
ybjL遺伝子増幅株MG1655ΔldhAΔlldD/pMW219::Pthr::ybjLは対照のMG1655ΔldhAΔlldD/pMW219と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。
AJ110637/pMW219::Pthr::ybjL、AJ110637/pMW219を50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートに均一に塗布し、37℃にて16時間培養した。その後、該プレートをアネロパック(三菱ガス化学株式会社)を用いて嫌気条件下、37℃で、16時間培養を行った。得られたプレートの菌体を、0.8%の食塩水で洗浄後、51倍希釈でOD=1.0(600nm)になる様に調製した。この菌体懸濁液100μlと予め窒素ガスを吹込むことにより培地に溶解している気体を窒素ガスにて置換した生産培地(グルコース10g/l、リンゴ酸2Na 10g/l、TES 45.88g/l、Na2HPO4 6g/l、KH2PO4 3g/l、NH4Cl 1g/l、KOHでpH7.3に調整後フィルターろ過)1.3mlを1.5ml容のマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用攪拌機を用いて31.5℃で6時間培養した。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H(Simazu)を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
6時間目のコハク酸蓄積を表7、コハク酸蓄積の経時変化を図5に示す。
ybjL遺伝子増幅株AJ110637/pMW219::Pthr::ybjLは対照のAJ110637/pMW219と比べて、顕著にコハク酸蓄積が上昇した。
<9-1>エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637におけるadhE欠損株の構築
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637は、嫌気条件下において糖源を含む培地で生育させた場合、著量のエタノールを生成するため、アルコールデヒドロゲナーゼをコードするadhEを欠損させることにより、エタノールの生成を抑えることとした。
エンテロバクター・アエロゲネス AJ110637ΔadhE株において、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpycを増幅することにより、コハク酸の生成能を付与することとした。
上述と同様にエシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)のスレオニンオペロン(thrLABC)のプロモーター領域のPCR増幅を行った。5'プライマーとして配列番号81に示す合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして配列番82に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株(ATCC47076, ATCC700926)のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、スレオニンオペロンプロモーター断片(A)(配列番号83)を得た。
AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjL、AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218を、各々50μg/mlのカナマイシン、25μg/mlのテトラサイクリン、及び40μg/mlのクロラムフェニコールを含むLBプレートに均一に塗布し、31.5℃にて16時間培養した。その後、シード培地(バクトトリプトン 20g/l、イーストエキストラクト 10g/l NaCl 20g/L)3mlが分注された試験管に植菌し、31.5℃で16時間、振とう培養を行った。得られた培養液にコハク酸生産培地(グルコース100g/l、3時間以上、乾熱滅菌をした炭酸カルシウム50g/L)3mlを添加後、シリコン栓にて密閉し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。培養後、培地中に蓄積したコハク酸量を液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H(Simadzu)を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて50℃で溶出した。溶出液を5mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simadzu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸を測定した。
24時間目のコハク酸蓄積を表8に示す。
ybjL遺伝子増幅株AJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218::Pthr::Ent-ybjLでは、対照のAJ110637ΔadhE/pSTV28::Pthr::pyc/pMW218と比べて、顕著にコハク酸蓄積、及びコハク酸対消費糖収率が上昇した。
配列番号1:Pantoea ananatisのybjL遺伝子
配列番号2:Pantoea ananatisのYbjL
配列番号3:Esherichia coliのybjL遺伝子
配列番号4:Escherichia coliのYbjL
配列番号5:Pantoea ananatisとEscherichia coliのYbjLの共通配列
配列番号6:ams遺伝子破壊用プライマー
配列番号7:ams遺伝子破壊用プライマー
配列番号8:P. ananatisのybjL増幅用プライマー
配列番号9:P. ananatisのybjL増幅用プライマー
配列番号10:RSFCPGプラスミド配列
配列番号11:E. coli W3110のybjL増幅用プライマー
配列番号12:E. coli W3110のybjL増幅用プライマー
配列番号13:ldhA欠損用プライマー
配列番号14:ldhA欠損用プライマー
配列番号15:ldhA欠損確認用プライマー
配列番号16:ldhA欠損確認用プライマー
配列番号17:lldD欠損用プライマー
配列番号18:lldD欠損用プライマー
配列番号19:lldD欠損確認用プライマー
配列番号20:lldD欠損確認用プライマー
配列番号21:スレオニンプロモーター配列
配列番号22:E. coli MG1655のybjL増幅用プライマー
配列番号23: E. coli MG1655のybjL増幅用プライマー
配列番号24:Salmonella typhimuriumのybjL遺伝子
配列番号25:Salmonella typhimuriumのYbjL
配列番号26:Yersinia pestisのybjL遺伝子
配列番号27:Yersinia pestisのYbjL
配列番号28:Erwinia carotovoraのybjL遺伝子
配列番号29:Erwinia carotovoraのYbjL
配列番号30:Vibrio choleraeのybjL遺伝子
配列番号31:Vibrio choleraeのYbjL
配列番号32:Aeromonas hydrophiaのybjL遺伝子
配列番号33:Aeromonas hydrophiaのYbjL
配列番号34:Photobacterium profundumのybjL遺伝子
配列番号35:Photobacterium profundumのYbjL
配列番号36:Eshcerichia coliのldhA遺伝子
配列番号37:Eshcerichia coliのLdhA
配列番号38:Eshcerichia coliのlldD遺伝子
配列番号39:Eshcerichia coliのLldD
配列番号40:パントエア・アナナティスのhisD遺伝子の塩基配列
配列番号41:Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号42:Kmr遺伝子のhisD遺伝子への組込みのための断片の増幅用プライマー
配列番号43:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号44:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号45:sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号46:sacB遺伝子増幅用プライマー
配列番号47:PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号48:PlacUV5プロモーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号49:λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号50:λRedαβγ遺伝子及びtL3を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号51:PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号52:PlacUV5プロモーターおよびTrrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号53:attL増幅用プライマー
配列番号54:attL増幅用プライマー
配列番号55:attLの塩基配列
配列番号56:attR増幅用プライマー
配列番号57:attR増幅用プライマー
配列番号58:attRの塩基配列
配列番号59:bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号60:bla遺伝子を含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号61:ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号62:ter_rrnBを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号63:ter_thrLターミネーターを含むDNA断片の塩基配列
配列番号64:ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号65:ter_thrLターミネーターを含むDNA断片増幅用プライマー
配列番号66:Pantoea ananatisのamsオペロン
配列番号67:Pantoea ananatisのAmsH
配列番号68:Pantoea ananatisのAmsI
配列番号69:Pantoea ananatisのAmsA
配列番号70:Pantoea ananatisのAmsC
配列番号71:Pantoea ananatisのAmsB
配列番号72:adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号73:adhE欠損用プライマー塩基配列
配列番号74: Enterobacter aerogenes AJ110637 adhE塩基配列(部分配列)
配列番号75:スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号76:スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号77:スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号78 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増幅用プライマー
配列番号79 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子増幅用プライマー
配列番号80 :ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子断片
配列番号81:スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号82:スレオニンプロモーター増幅用プライマー
配列番号83:スレオニンプロモーター遺伝子断片
配列番号84:Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjL増幅用プライマー塩基配列
配列番号85:Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjL増幅用プライマー塩基配列
配列番号86:Enterobacter aerogenes AJ110637 ybjLの塩基配列
配列番号87:Enterobacter aerogenes AJ110637 YbjLのアミノ酸配列
配列番号88:EscherichiaとPantoeaとEnterobacterのYbjLの共通配列
Claims (16)
- カルボキシル基を有する酸性物質の生産能を有し、かつybjL遺伝子の発現が増強するように改変された微生物。
- ybjL遺伝子のコピー数を高めること、又はybjL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、ybjL遺伝子の発現が増強するように改変された、請求項1に記載の微生物。
- ybjL遺伝子が、下記(A)又は(B)に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項1または2に記載の微生物:
(A)配列番号2、4または87に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
(B)配列番号2、4または87に示すアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、微生物内でその発現を増強することにより微生物のカルボキシル基を有する酸性物質生産能を向上させるタンパク質。 - ybjL遺伝子が、配列番号5又は88に記載のタンパク質をコードする遺伝子である請求項1〜3のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物が、腸内細菌科に属する細菌である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物が、エシェリヒア属細菌、エンテロバクター属細菌、ラウルテラ属細菌、パントエア属細菌及びクレブシエラ属細菌からなる群より選択される、請求項5に記載の微生物。
- 前記微生物がルーメン細菌である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物が、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンスである請求項7に記載の微生物。
- 前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種または2種以上の有機酸である請求項1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である請求項1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の微生物を培地中で培養し、該培地中にカルボキシル基を有する酸性物質を生成・蓄積せしめ、カルボキシル基を有する酸性物質を該培地から採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
- 前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種又は2種以上の有機酸である、請求項11に記載の方法。
- 前記酸性物質がL-グルタミン酸及び/又はL-アスパラギン酸である、請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の微生物又は該微生物の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオン、または二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることによって、カルボキシル基を有する酸性物質を生成させ、該酸性物質を採取することを特徴とする、カルボキシル基を有する酸性物質の製造法。
- 前記酸性物質がコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、及びα-ケトグルタル酸からなる群より選択される1種又は2種以上の有機酸である、請求項14に記載の方法。
- 請求項12または15に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
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