CN101506347A - 产l-谷氨酸细菌和产生l-谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的产L－谷氨酸细菌，其中所述细菌已通过基因重组而被修饰，使得rpoS基因失活，将该细菌在培养基中培养以导致L－谷氨酸在培养基中积累，并从该培养基收集L－谷氨酸。

Description

产L-谷氨酸细菌和产生L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及产L-谷氨酸细菌和产生L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸广泛用作调味品等制造中的原料。

背景技术

通常利用所谓棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或它们的突变菌株通过发酵来产生L-氨基酸，所述棒状杆菌型细菌属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)(Kunihiko Akashi等，＂Amino acid fermentation＂，pP.195-215，1986，Japan Scientific Societies Press)。使用其它细菌菌株通过发酵产生L-谷氨酸的方法包括使用属于芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)或青霉属(Penicillium)等的微生物的方法(美国专利No.3,220,929)，使用属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)或假丝酵母属(Candida)等的微生物的方法(美国专利No.3,563,857)，使用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属或产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)(现在称为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes))等的微生物的方法(日本专利公告No.32-9393)，使用大肠杆菌(Escherichia coli)突变菌株的方法(日本专利申请公开No.5-244970)等等。此外，还已经公开了使用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantotea)或肠杆菌属(Enterobacter)的微生物产生L-谷氨酸的方法(日本专利申请公开Nos.2000-106869，2000-189169和2000-189175)。此外，已知通过缺失rpoS基因可以改善埃希氏菌属(Escherichia)细菌和棒状杆菌型细菌的产L-谷氨酸能力(WO 01/05939)。

由rpoS基因编码的RpoS蛋白(又称＂σS因子＂)不仅已知是一种稳定期特异性的(stationary phase-specific)σ因子，而且还知道它是对多种应激起响应而导致对多种基因表达的控制的σ因子。更具体地，σS因子在酸抗性的获得中起关键作用，有报道称rpoS基因缺陷菌株在酸性条件下的生存率急剧降低(Mol.Microbiol.，1995 Jul.，17(1)：155-67)。但是，大部分针对微生物中酸抗性的研究通常关注的是酸性条件下的生存率(survival rate)，而没有关于酸性条件下生长的报道。此外，迄今为止对rpoS缺陷菌株在酸性条件下的生长还没有研究。

本发明的公开

本发明的一个目的是提供能够有效地产生L-谷氨酸的细菌，和提供使用该细菌有效地产生L-谷氨酸的方法。

该目的是通过证明如下事实而实现的：当编码RNA聚合酶σS因子的rpoS基因被失活时，L-谷氨酸的发酵产率改善，并且产L-谷氨酸的细菌在酸性条件下的生长改善。由此完成了本发明。

本发明的一个目的是提供属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的产L-谷氨酸细菌，其中该细菌已通过基因重组而被修饰，使得rpoS基因失活。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中通过减少rpoS基因的表达或者破坏rpoS基因而使rpoS基因失活。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中rpoS基因编码选自下组的蛋白：

(A)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；和

(B)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但包括一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，并且具有RNA聚合酶的σS因子活性的蛋白。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中rpoS基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(b)能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补序列或者与能从该核苷酸序列制得的探针在严紧条件下杂交，并且编码具有RNA聚合酶的σS因子活性的蛋白的DNA。

本发明的一个进一步的目的是提供一种产生L-谷氨酸的方法，其包括在培养基中培养上述的细菌，并从该培养基收集L-谷氨酸。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的方法，其中在pH3至5培养所述细菌。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的方法，其中在培养过程中L-谷氨酸在培养基中积累并伴随着沉淀(accumulate accompanied withprecipitation)。

本发明的一个进一步的目的是提供一种改善产L-谷氨酸微生物在酸性条件下的生长的方法，包括通过基因重组使所述微生物的rpoS基因失活。

本发明的一个进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述微生物属于选自下组的属：泛菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和欧文氏菌属。

附图简要说明：

图1显示rpoS缺陷菌株在酸性条件下的生长。

图2显示rpoS缺陷菌株在酸性条件下达到的OD。

图3显示rpoS缺陷菌株在酸性条件下产生的L-谷氨酸量。

优选实施方案描述

下面详细描述本发明。

<1>本发明的产L-谷氨酸细菌

本发明的细菌属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属，具有产生L-谷氨酸的能力，并且已通过基因重组被修饰而使rpoS基因失活。

术语“产生L-谷氨酸的能力(产L-谷氨酸能力)”指本发明的细菌的如下所述的能力，在培养基中培养所述细菌时，该细菌能够产生L-谷氨酸并引起L-谷氨酸在培养基或所述本发明的细菌的细胞中积累到如此程度，以致能够从所述培养基或细胞收集L-谷氨酸。所述细菌中产生L-谷氨酸的能力可为天然能力，或者可通过诱变或重组DNA技术修饰该细菌而赋予。

本发明的细菌优选在低pH，特别是pH3至5生长。

具体地，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌被归类为γ-变形细菌(γ-proteobacteria)，并且它们在分类学上彼此非常相似(J.Gen.Appl.Microbiol.，Dec.1997，43(6)，355-361；International Journal of SystematicBacteriology，Oct.1997，pp.1061-1067)。近年来，根据DNA-DNA杂交实验等，某些属于肠杆菌属的细菌被重新归类为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、分散泛菌(Pantoea dispersa)等等(International Journal ofSystematic Bacteriology，July 1989，39(3).p.337-345)。此外，某些属于欧文氏菌属的细菌被重新归类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)或斯氏泛菌(Pantoeastewartii)(参见International Journal of Systematic Bacteriology，Jan.1993，43(1)，pp.162-173)。

肠杆菌属细菌的实例包括，但不限于，成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，等等。具体地，可以使用欧洲专利公开No.952221中例举的菌株。

肠杆菌属的典型菌株包括成团肠杆菌ATCC 12287。

泛菌属细菌的典型菌株包括但不限于Pantoea ananatis、斯氏泛菌、成团泛菌、和柠檬泛菌(Pantoea citrea)。具体实例包括下列菌株：Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614，欧洲专利公布No.0952221)Pantoea ananatis AJ13356(FERM BP-6615，欧洲专利公布No.0952221)Pantoea ananatis AJ 13601(FERM BP-7207，欧洲专利公布No.0952221)。

虽然在欧洲专利公布No.0952221中这些菌株被描述为成团肠杆菌，但如上文所述，现在根据16S rRNA的核苷酸序列分析等，将它们归类为Pantoea ananatis。

欧文氏菌属细菌的实例包括但不限于解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，克雷伯氏菌属细菌的例子包括植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。具体的实例包括下列菌株：

解淀粉欧文氏菌ATCC 15580

胡萝卜软腐欧文氏菌ATCC 15713

植生克雷伯氏菌AJ13399(FERM BP-6600，欧洲专利公布No.955368)

植生克雷伯氏菌AJ 13410(FERM BP-6617，欧洲专利公布No.955368)。

本发明的微生物当在酸性条件下培养时可具有导致液体培养基中L-谷氨酸积累量超过L-谷氨酸的饱和浓度的能力(以下也称为酸性条件下L-谷氨酸积累能力)。这种能力可以是藉由rpoS基因的失活而获得的，或者可以是该微生物固有的(native to the microorganism)。此外，导致L-谷氨酸积累量超过饱和浓度的能力可以是被赋予的，特别是通过使用如欧洲专利公布No.1078989中描述的在低pH对L-谷氨酸有抗性的菌株。

具有固有的在酸性条件下积累L-谷氨酸的能力的微生物的具体实例包括但不限于Pantoea ananatis AJ13356(FERM BP-6615)，AJ13601(FERMBP-7207)(这些参考欧洲专利公布No.0952221)等等。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日被保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，地址为Tsukuba Central 6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，给予的保藏号为FERMP-16645。后于1999年1月11日根据布达佩斯条约的规定将该保藏物转为国际保藏并且给予登录号FERM BP-6615。AJ13601菌株于1999年8月18日被保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心)，并给予保藏号FERMP-17516。后于2000年7月6日根据布达佩斯条约的规定将该保藏物转为国际保藏并且给予登录号FERM BP-7207。

为了赋予或增强如上所述的细菌产生L-谷氨酸的能力，可以修饰该细菌以增强编码L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表达。

L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脱氢酶(以下也称”GDH”)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(以下也称”CS”)、甲基柠檬酸合酶(methylcitrate synthase，以下也称”PRPC”)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下也称”PEPC”)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。在这些酶之中，CS或PRPC、PEPC及GDH之中的一种或多种是优选的。它们中的三种是更优选的。

以下，将说明修饰细菌以增强目标基因表达的方法。

第一种方法是通过增加目标基因的拷贝数。例如，可以将目标基因克隆到适当的质粒中，并使用该质粒转化宿主微生物。例如，当目标基因是编码CS的基因(gltA)、编码PRPC的基因(prpC)、编码PEPC的基因ppc)或编码GDH的基因(gdhA)时，来自埃希氏菌属细菌和棒状杆菌属细菌的这些基因的核苷酸序列已经有报道(Biochemistry，vol.22，pp.5243-5249，1983；J.Biochem.，vol.95，pp.909-916，1984；Gene，vol.27，pp.193-199，1984；Microbiology，vol.140，pp.1817-1828，1994；Mol.Gen.Genet，vol.218，pp.330-339，1989；Molecular Microbiology，vol.6，pp.317-326，1992)；因此，可以根据这些基因各自的核苷酸序列合成引物，并使用属于肠杆菌科(family Enterobacteriaceae)的细菌的染色体DNA作为模板进行PCR来获得这些基因。

可以转化的质粒的实例包括在属于肠杆菌科的细菌中能够自主复制的质粒，例如pUC19、pUC18、pBR322、RSF1010、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、pSTV28、pSTV29(pHSG和pSTV可获自Takara Bio)、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218(pMW系列的质粒可获自NipponGene)等等。也可以使用噬菌体DNA替代质粒作为载体。可用来同时增强CS或PRPC、PEPC和GDH的活性的质粒包括：RSFCPG，其含有gltA、ppc和gdhA基因(参见欧洲专利公布No.0952221)；和RSFPPG，其通过将RSFCPG中的gltA基因替换为prpC基因而得到(参见实施例)。

转化方法的实例包括：用氯化钙处理受体细胞以增加DNA的通透性，该方法已有用于大肠杆菌K-12的报道(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；从处于生长期的细胞制备感受态细胞然后将DNA导入其中，该方法已有用于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的报道(Duncan，C.H.，Wilson，GA和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))，等等。除这些方法之外，一种替代方法是将DNA受体细菌细胞制成能够容易地摄取重组DNA的原生质体或原生质球，然后将重组DNA导入该DNA受体细胞中，这种方法已知适用于枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomycetes)和酵母(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci，USA，75，1929(1978))。此外，也可通过电脉冲法进行微生物的转化(日本专利申请公开No.2-207791)。

目标基因拷贝数的增加也可以通过将该基因的多个拷贝导入微生物染色体DNA来实现。为了将基因的多个拷贝导入微生物的染色体DNA，可以将染色体DNA上以多个拷贝存在的序列作为靶标来进行同源重组(Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))。染色体DNA上以多个拷贝存在的序列包括重复DNA和存在于转座元件末端的反向重复序列。或者，如日本专利申请公开No.2-109985所公开的，还可以将目标基因掺入转座子并转移该转座子，导致该基因的多个拷贝导入染色体DNA。此外，还可以使用Mu噬菌体来将目标基因掺入宿主染色体(日本专利申请公开No.2-109985)。

第二种方法是通过将目标基因的表达控制序列，如染色体DNA或质粒上的启动子，替换为更强的表达控制序列，来增强目标基因的表达。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、PR启动子、lacUV启动子等等是已知的强启动子。此外，还可以替换基因启动子区域中的数个核苷酸而使得启动子增强，如国际专利公布WO00/18935中公开的。表达控制序列的替换可以例如通过与基因替换中相同的方式利用温度敏感型质粒来进行。具有在本发明的属于肠杆菌科的细菌中有效的温度敏感性复制起点的载体的一个实例是国际专利公布WO99/03988中描述的质粒pMAN997，等等。此外，基因替换的菌株可以使用喹哪啶酸(quinaldic acid)来容易地加以选择，这在下文描述。

表达控制序列的修饰可以结合如上所述的基因拷贝数的增加来进行。

通过上述方法被修饰从而增强了柠檬酸合酶基因、甲基柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因表达的微生物的实例包括下列文献中公开的微生物：欧洲专利公布Nos.EP 1078989、0955368、0952221和1078989，日本专利申请公开No.2006-129840，国际专利公布No 2006/051660等等。

此外，也可以通过增强6-磷酸葡糖酸脱水酶活性、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性或它们二者来赋予产L-谷氨酸能力。具有增加的6-磷酸葡糖酸脱水酶活性和2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性的微生物的实例包括欧洲专利公布EP 1352966中公开的微生物。

可以通过降低或消除如下所述的酶的活性来赋予产L-谷氨酸能力：所述酶催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应，并导致非L-谷氨酸化合物的生成。这样的酶的实例包括2-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶，等等。特别优选的是降低或消除2-酮戊二酸脱氢酶的活性。

为了降低或消除上述酶的活性，可以通过通常的诱变或基因工程技术向上述酶的基因中导入突变。诱变处理包括，例如，用X射线或紫外线照射，或用诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍加以处理，等等。可以将突变导入编码所述酶蛋白的基因的编码区，或者导入负责调节表达的区域，如启动子。基因工程技术包括基因重组、转导、细胞融合，等等。

目标酶细胞内活性的减少及减少的程度可以通过下述方式予以确认：测量获自候选菌株的细胞提取物或其纯化级分中的酶活性，并将其与野生型菌株的酶活性进行比较。例如，2-酮戊二酸脱氢酶的活性可以通过Reed等的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，Methods in Enzymology，13，pp.55-61(1969))进行测量。

具体地，减少或消除了2-酮戊二酸脱氢酶活性的细菌的实例包括下列：

Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207，EP1078989A)

Pantoea ananatis AJ13356(FERM BP-7207，USP 6,331,419)

Pantoea ananatis SC 17sucA(FERM BP-8646，WO2005/085419)

植生克雷伯氏菌AJ13410菌株(FERM BP-6617，USP 6,197，559)。

SC17sucA菌株是从SC17菌株通过破坏2-酮戊二酸脱氢酶基因而获得的。SC17菌株是从AJ13355选择低粘液(phlegm)产生突变株而获得的。AJ13355菌株是由于其在含有L-谷氨酸和碳源的培养基中于低pH条件下增殖的能力而从自然界分离的。AJ13601菌株是通过将源自大肠杆菌的gltA、ppc和gdhA基因以及源自乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的gltA基因导入SC17sucA而获得的。然后，选择在低pH高浓度L-谷氨酸抗性菌株，并最终选择具有高增殖程度和高的L-谷氨酸产生能力的菌株。对SC17sucA菌株给予自定编号AJ417，并于2004年2月26日将其保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现称独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，给予保藏号FERM BP-08646。

本发明的细菌具有上文所述的产L-谷氨酸能力，属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属，并且已经通过基因重组被修饰而使rpoS基因失活。

可以通过修饰具有产L-谷氨酸能力的，并且属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的细菌，使得rpoS基因通过基因重组而失活，来获得本发明的细菌。在属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的本发明的细菌的培育中，可以先赋予产L-谷氨酸能力或者先使rpoS基因失活。

短语“细菌已经被修饰而使rpoS基因失活”意味着该细菌已经被修饰，使得与未修饰菌株，如亲本菌株或野生型菌株相比，RpoS蛋白不正常发挥功能。通过基因重组修饰rpoS基因的结果包括，例如，与亲本菌株或野生型菌株相比，每个细胞的RpoS分子数的减少、无RpoS蛋白产生、每个分子的RpoS蛋白活性的降低，或者该活性的消失，等等。可以通过降低rpoS基因的表达来减少RpoS分子数。rpoS基因表达的减少包括rpoS mRNA的转录或翻译的减少。此外，可以通过破坏rpoS基因实现RpoS蛋白产生的消除、每分子的RpoS蛋白活性的降低，或者该活性的消除。可以用于比较的野生型菌株的实例包括Pantoea ananatis AJ13355菌株、植生克雷伯氏菌AJ 13399菌株，等等。

具体地，可通过下述方式修饰rpoS基因：缺失染色体上rpoS基因编码区的部分或全部、修饰表达控制序列如启动子或Shine-Dargarno(SD)序列，等等。此外，也可以通过修饰表达控制序列之外的非翻译区来降低所述基因的表达。此外，可以缺失整个rpoS基因，包括染色体上位于rpoS基因上游和下游的序列。另外，可以向染色体上编码rpoS的区域中导入氨基酸替换(错义突变)、终止密码子(无义突变)或导致一个或两个核苷酸添加或缺失的移码突变(Journal of Biological Chemistry，272：8611-8617(1997)；Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 95 5511-5515(1998)；Journal of Biological Chemistry，266，20833-20839(1991))。

在本发明中，短语“通过基因重组被修饰”意思是缺失染色体上rpoS基因的部分或全部表达控制序列，如启动子区域，或缺失染色体上rpoS基因的编码区或非编码区。它还可以表示利用同源重组将其它序列插入前述区域以降低胞内rpoS活性，而不是利用X射线或紫外照射或诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍通过常规诱变来加以修饰。在本发明中，优选通过修饰rpoS基因使rpoS基因失活达到这样的程度，以致rpoS基因的功能不通过自发突变而恢复。

当修饰表达控制序列时，优选一个或更多个核苷酸被改变，更优选两个或更多个核苷酸被改变，特别优选3个或更多个核苷酸被改变。当在编码区内进行缺失时，待缺失的区域可以包括N末端、内部区域、C末端，或者整个编码区，只要RpoS蛋白的功能降低或消失即可。一般而言，缺失较长的区域能较可靠地导致rpoS基因的失活。此外，优选的是，位于被缺失区域上游和下游的阅读框相互不一致(do not conform to each other)。

当将序列插入编码区时，插入点可以在rpoS基因的任何区域内。插入较长的区域能较可靠地导致rpoS基因的失活。优选的是，位于插入位点上游和下游的阅读框相互不一致。对要插入的序列没有特别限制，只要它能降低或消除RpoS蛋白的功能，实例包括，例如，携带对L-谷氨酸产生有用的基因的转座子和抗生素抗性基因。

可以如上文所述修饰染色体上的rpoS基因，例如通过缺失rpoS基因的部分序列来制备缺失型rpoS基因，用含有该缺失型基因的DNA转化细菌，导致该基因和染色体上的rpoS基因发生同源重组，从而用该缺失型基因替换染色体上的rpoS基因。即使从该缺失型rpoS基因产生了蛋白质，该蛋白质的三维结构将不同于野生型RpoS蛋白，因而其功能将会降低或消失。利用上述同源重组的基因替换所导致的基因破坏已经有报道，其实例包括使用含有温度敏感型复制起点的质粒，或者能够进行接合转移的质粒，使用不含能在所选宿主中起作用的复制起点的自杀载体，等等(美国专利No.6,303,383或日本专利公开No.05-007491)。

此外，也可以使用喹哪啶酸通过基因破坏来使rpoS基因失活，从而产生双交换重组菌株。

喹哪啶酸是一种四环素类似物，是通过由Tn10编码的一种四环素分泌蛋白分泌到细胞外的。喹哪啶酸是一种弱酸性物质，在弱酸性条件下失去其电荷，形成不带电的形式。因此，它能够容易地穿越细胞膜。在弱酸性条件下，四环素分泌系统分泌喹哪啶酸，然后被分泌的喹哪啶酸在细胞外的弱酸性环境中转化成不带电形式(the free form)，并再次流入细胞，结果，细胞外和细胞内之间的质子浓度梯度(proton concentration gradient)消失。也就是说，含有来源于Tn10的四环素分泌基因(四环素抗性基因)的菌株在弱酸性条件下变成对喹哪啶酸敏感(J.Bacteriol.，Aug 1980，143(2)，p.926-33)。如果四环素抗性基因(Tn10)携带在载体上，该载体通过单交换整合到染色体中，则可以用四环素显性选择该菌株，而通过双交换消除了载体部分的菌株可以在含喹哪啶酸的培养基中显性选择。这样就简化了操作。

因此，若将四环素抗性基因插入用于基因重组的载体，分离双重组菌株而不使用标志基因是简单的。

rpoS基因转录的减少可以通过比较rpoS mRNA的量和野生型菌株或未修饰菌株的rpoS mRNA量来予以确认。mRNA的量可以通过Northern杂交、RT-PCR等等(Molecular Cloning，Cold spring Harbor Laboratory Press，Coldspring Harbor(USA)，2001)来评估。虽然转录的减少可以是任何程度的减少，只要与野生型菌株或未修饰菌株相比转录有所减少即可，但理想的是减少到例如野生型菌株或未修饰菌株中转录的至少75％或更少，50％或更少，25％或更少，或10％或更少，特别优选的是rpoS基因根本不表达。

rpoS基因编码蛋白的量的减少可以使用抗体通过Western印迹(Molecular cloning，Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001)来予以确认。虽然蛋白量的减少可以是任何程度的减少，只要与野生型菌株或未修饰菌株相比蛋白量有所减少即可，但理想的是减少例如野生型菌株或未修饰菌株中的量的至少75％或更少，至少50％或更少，25％或更少，特别优选的是根本不产生该蛋白质(活性已完全消失)。

根据本发明，rpoS基因编码的蛋白，即RpoS蛋白，是RNA聚合酶的σS因子。RNA聚合酶由α、β、β’和σ亚基组成。σ因子结合包括α、β和β’亚基的核心酶，并识别由RNA聚合酶转录的基因的启动子。在本发明中，“RpoS蛋白的功能”是指对于RNA聚合酶所转录基因的启动子的识别。如果RpoS不正常发挥功能，则RpoS正常发挥功能时(如野生型菌株)表达的基因的表达将降低或消失。细胞中RpoS功能的降低可以通过用Northern杂交或RT-PCR方法检测通常由rpoS转录的基因(如bolA基因)的表达(JBacteriol.，1991 JuI，173(14)：4474-81)来加以确认。

来自肠杆菌科的RpoS蛋白的实例包括SEQ ID NO：2的蛋白。这种蛋白由来自Pantoea ananatis的rpoS基因(SEQ ID NO：1)所编码。此外，由于rpoS基因的核苷酸序列可能根据属于肠杆菌科的细菌物种或菌株而不同，rpoS基因可能是SEQ ID NO：1的核苷酸序列的变体。可以利用SEQ ID NO：1的核苷酸序列在BLAST检索(http://blast.genome.jp/)等等中来找到rpoS基因的变体。此外，rpoS基因的变体包括能够使用rpoS基因同源物，如来自肠杆菌科细菌的染色体作为模板，和合成寡核苷酸如SEQ ID NO：7和10的那些作为引物通过PCR而扩增的基因。

RpoS蛋白的一个实例是具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白。此外，由于取决于细菌的物种或菌株rpoS基因密码子选择和核苷酸序列可能有不同，所述基因可编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但该序列包括一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，只要维持RpoS蛋白的功能。这些氨基酸差异的数目可以是，例如，1至20，优选1至10，更优选1至5。这些差异通常是容许正常产生RpoS蛋白的保守突变。保守突变是这样的突变，其中，如果取代位置是芳族氨基酸，则取代相互发生在Phe、Trp、Tyr之间；如果取代位置是疏水氨基酸，则在Leu、Ile、Val之间；如果是极性氨基酸，则在Gln、Asn之间；如果是碱性氨基酸，则在Lys、Arg、His之间；如果是酸性氨基酸，则在Asp、Glu之间；并且如果是具有羟基的氨基酸，则在Ser、Thr之间。典型的保守突变是保守取代。认为是保守的取代的具体实例包括：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。

此外，除了具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因之外，rpoS基因可以是在严紧条件下与SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，或者与能够从该核苷酸序列制备的探针杂交的变体。“严紧条件”包括如下所述的这些条件：在所述条件下形成特异性杂合体，例如具有不少于80％，优选不少于90％，更优选不少于95％，更优选不少于97％，最优选不少于99％的同源性的杂合体，而不形成同源性低于上述的杂合体。或者，严紧条件的示例是在相应于在60℃、1x SSC、0.1％SDS，优选在60℃，0.1x SSC、0.1％SDS，更优选68℃、0.1x SSC、0.1％SDS进行一次、二次或三次的盐浓度洗涤一次，优选2-3次。探针长度可以根据杂交条件合适地选择，通常是100bp到1kbp。

<2>能产生L-谷氨酸的微生物在酸性条件下生长的改善

可以通过如上所述进行基因重组使微生物中的rpoS基因失活来改善该微生物的L-谷氨酸产生能力。具体地，可以改善该微生物在酸性条件下的生长。酸性条件通过，例如，pH 3至5，更优选pH4至5来指示。

所述微生物的实例包括属于泛菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的细菌。

具体地，优选在酸性条件下培养所述微生物，导致L-谷氨酸的产生和积累，并伴随着L-谷氨酸的沉淀。

当所述微生物能够在酸性条件下积累L-谷氨酸时，特别地，可以通过改善该微生物在酸性条件下的生长来改善L-谷氨酸的产生。

<3>本发明的产生L-谷氨酸的方法

可以通过在培养基中培养本发明的微生物以产生L-谷氨酸并导致其在培养基中积累，并从该培养基收集L-谷氨酸，来产生L-谷氨酸。

所选的培养基可以是含有碳源、氮源和无机盐，以及根据需要的痕量有机营养物(如氨基酸和维生素)的典型培养基。合成培养基或天然培养基均可使用。培养基中使用的碳源和氮源可以是任何类型，只要所选的菌株能够利用所选的物质。

作为碳源，可以使用糖，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，此外，可以单独使用或者与其它碳源组合使用有机酸，如乙酸和柠檬酸，或者醇，如乙醇。作为氮源，可以使用：氨，铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、硝酸盐等等。作为有机营养物，可以使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，以及包含这些物质的化合物如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解物。在使用需要氨基酸等用于生长的营养缺陷型突变菌株时，优选补充需要的营养物。作为无机盐，可以使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

优选在通气条件下进行培养，同时发酵温度优选控制在20至45℃，pH为3至9。当培养过程中pH下降时，通过添加例如碳酸钙或碱例如氨气来中和培养基。在如上所述的条件下培养10至120小时后，在培养液中产生显著(substantial)量的L-谷氨酸。

此外，通过使用经过调节使得L-谷氨酸沉淀的液体培养基，可以在培养过程中使L-谷氨酸沉淀到培养基中。L-谷氨酸在例如pH5.0至4.0沉淀，优选在pH4.5至4.0，更优选在pH4.3至4.0，特别优选在pH4.0沉淀。为了改善酸性条件下的细菌生长，并且使L-谷氨酸有效沉淀，理想的是pH优选为5.0至4.0，更优选4.5至4.0，更优选4.3至4.0。可以在培养期间的一部分或整个培养期间于所述范围内的pH进行培养。

培养完成后，可以通过已知方法从培养液收集L-谷氨酸。例如，从培养液中移除细胞后，可以通过浓缩-结晶、离子交换层析等收集L-谷氨酸。当在有利于将L-谷氨酸沉淀在培养基中的条件下进行培养时，可以通过离心、过滤等收集沉淀到培养基中的L-谷氨酸。在此情况下，还可以使任何已溶解于培养基中的L-谷氨酸结晶，然后将结晶的L-谷氨酸与已经沉淀的L-谷氨酸一起收集。

实施例

下面将参考非限制性的实施例对本发明进行更具体的说明。

<1>rpoS基因破坏菌株的制备

(1)用于基因破坏的质粒pUT-Tn10的构建

为了破坏rpoS基因，构建了一种具有四环素抗性基因的载体，以供在利用喹哪啶酸和四环素抗性基因进行的基因破坏中使用。首先，将来自Tn10的四环素抗性基因插入该载体。使用引物Tn10-750Xho(SEQ ID NO：3)和Tn10-3020Xho(SEQ ID NO：4)，并使用来自大肠杆菌K-12 ME8424菌株(Hfr，P045，thi，relA1，tyrA::Tn10，ung-1，和nadB，由National Institute ofGenetics，Japan提供)的染色体作为模板，通过PCR扩增四环素抗性基因。此外，使用引物pUT-3710Xho(SEQ ID NO：5)和pUT-3020Xho(SEQ ID NO：6)和pUT399作为模板进行PCR。其结果产生具有XhoI位点的pUT399的片段。将两种扩增片段均用XhoI处理，然后连接得到质粒pUT-Tn10。pUT399具有R6K复制起点，并包含接合转移需要的mob区，且其无法在不含pir基因的细菌菌株(可获自Biomedal，参见R.Simon等，BIO/TECHNOLOGYNOVEMBER 1983，784-791(1983))中复制。

(2)rpoS基因破坏菌株的制备

使用Pantoea ananatis SC17sucA菌株(FERM BP-8646)的染色体作为模板，并使用引物rpoS-F1(SEQ ID NO：7)/rpoS-FR(SEQ ID NO：8)或rpoS-RF(SEQ ID NO：9)/rpoS-R1(SEQ ID NO：10)，进行PCR。结果，扩增了rpoS基因上游和下游的约2.1kb。然后，将这些扩增片段作为模板，使用引物KpnI-rpoS-F2(SEQ ID NO：11)/KpnI-rpoS-R2(SEQ ID NO：12)的组合扩增约4.1kb的片段，并将该片段克隆到pGEM-T Easy(Promega)中。

将所得的质粒用KpnI处理，将片段(约4.1kb)连接于pUT-Tn10的KpnI位点，获得pUT/Tn10/ΔrpoS。将该质粒导入具有λ-pir的大肠杆菌S17-1λ-pir菌株(可获自Biomedal，R.Simon等，BIO/TECHNOLOGY NOVEMBER 1983，784-791(1983))，并通过接合将该质粒从所得的菌株转移到SC17sucA菌株。

通过在含有25mg/L氯霉素、100mg/L L-赖氨酸、100mg/L L-甲硫氨酸、100mg/L二氨基庚二酸和5g/L蔗糖的M9基本培养基(5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵和6g磷酸氢二钠，溶于1L纯水)中进行选择，得到了pUT-Tn10/ΔrpoS掺入染色体上rpoS基因位点的SC17sucA菌株(FERM BP-8646)。

在亦含基本培养基组分(0.5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵和6g磷酸氢二钠，溶于1L纯水)、25mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素的L培养基(10g细菌胰蛋白胨(bacto tryptone)、5g酵母提取物、5g NaCl和15g琼脂，溶于1L纯水，pH 7.0)上纯化该菌株。还在不含所述抗生素的相同培养基上培养细胞。挑取数个菌落，在组成相同的液体培养基中培养过夜。将培养物用去离子水稀释100至10,000倍，施加于喹哪啶酸平板(培养基如下获得：将5g细菌胰蛋白胨、5g酵母提取物、40g NaCl、0.05g四环素和10g NaH₂PO₄溶于900mL纯化水中，用KOH将溶液调节到pH 5.2，将20g琼脂与该溶液混合，将混合物在120℃高压灭菌(autoclave)20分钟，并向经过高压灭菌的混合物中添加溶于100mL纯化水并经过滤除菌的0.2g喹哪啶酸、13.6mg ZnCl₂和5g葡萄糖)。使用引物进行PCR确认出现的菌落中rpoS基因的结构。将rpoS基因被破坏的菌株命名为SC17sucArpoS。

构建了质粒RSFPPG。该质粒含有L-谷氨酸生物合成基因，其包括prpC(国际专利公布WO2006/051660)、ppc和gdh(欧洲专利公布No.0999282)。

设计了引物1(SEQ ID NO：13)和引物2(SEQ ID NO：14)来扩增RSFCPG(欧洲专利公布No.1233068)中除gltA基因ORF之外(other than)的部分。使用这些引物并以RSFCPG作为模板进行PCR，获得了大约14.9kb的片段。对于prpC，使用引物3(SEQ ID NO：15)和引物4(SEQ ID NO：16)，并以大肠杆菌W3110菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，获得了大约1.2kb的片段。将这两种PCR产物均用BglII和KpnI处理，连接，然后用来转化大肠杆菌JM109菌株。收集所有出现的菌落，并从这些菌落提取作为混合物的质粒。用该质粒混合物转化大肠杆菌CS缺陷菌株ME8330，并将细胞悬液涂布到含有50mg/L尿嘧啶和5mg/L盐酸硫胺素的M9基本培养基(5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵和6g磷酸氢二钠，溶于1L纯水)。从出现的菌落中提取了质粒，并命名为RSFPPG。将该Glu产生质粒RSFPPG导入SC17sucArpoS菌株，以构建rpoS缺陷的Glu产生细菌SC17sucArpoS/RSFPPG。

<2>rpoS基因破坏菌株在酸性条件下的生长

在多种pH条件下研究了SC17sucArpoS/RSFPPG的生长。将SC17sucArpoS/RSFPPG菌株和SC17sucA/RSFPCPG菌株(rpoS野生型)在通过将基本培养基成分添加到L培养基中而制备的固体培养基上培养过夜，并用无菌水洗涤细胞两次。将细胞以OD660nm 0.05接种到5ml基本培养基(5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵、6g磷酸氢二钠，100mg赖氨酸盐酸盐、100mg L-甲硫氨酸和100mg二氨基庚二酸，和30g L-谷氨酸，溶于1L纯化水，用氨调节到不同pH水平)中，并使用ADVANTEC产的自动OD测量装置TN1506随时间(over time)测量OD。结果示于图1和2。

在pH5.1或更高的pH，SC17sucA/RSFPPG对照菌株和SC17sucArpoS/RSFPPG菌株之间没有差别。但是，当pH为4.9或更低时，rpoS基因破坏菌株倾向于显示更有利的生长。此外，随着培养基的pH被降低，这种效应倾向于变得更加显著。因此，rpoS基因的破坏有效改善了酸性条件下的生长。

<3>rpoS基因破坏菌株在酸性条件下的L-谷氨酸产生

然后在酸性条件下评估了SC17sucArpoS/RSFPPG菌株产生L-谷氨酸的能力。

将SC17sucA/RSFPPG菌株和SC17sucArpoS/RSFPPG菌株在培养基中培养过夜，所述培养基是将基本培养基的成分(5g葡萄糖、2mM硫酸镁、3g磷酸二氢钾、0.5g氯化钠、1g氯化铵和6g磷酸氢二钠，溶于1L纯水)和12.5mg/L四环素添加到L培养基(10g细菌胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和15g琼脂，溶于1L纯水，pH 7.0)中制备的。使细胞在每个平板上生长，然后分别接种到小型发酵罐(jar fermenter)中的300mL培养基(如下所列)中，并在1/1vvm的通气、34℃、氨气调节pH4.7的条件下培养。当糖耗尽时，添加额外的糖以继续培养。对于SC17sucArpoS/RSFPPG菌株，当L-谷氨酸浓度达到饱和溶解度时，以1g/L的浓度添加果胶。

培养基组成(所有浓度为终浓度)：

A组：100g/L蔗糖、1.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.2mL/L GD113(消泡剂)

B组：5g/L(NH₄)₂SO₄、6g/L KH₂PO₄、6g/L酵母提取物(Difco)、1.5g/LNaCl、60mg/L MnSO₄·5H₂O、0.8g/L L-赖氨酸、0.6g/L DL-甲硫氨酸、0.6g/LDL-二氨基庚二酸、4g/L甜菜碱

C组：60mg/L FeSO₄·7H₂O

对于每个组，将组分在120℃灭菌20分钟，然后混合并以每个300mL的体积分装到1L体积的小型发酵罐中。

补料培养基：700g/L蔗糖、0.2mL/L GD113，120℃灭菌20分钟

上述每个培养物的结果示于图3。SC17sucA/RSFPPG对照菌株倾向于在培养当中停止生长。另一方面，SC17sucArpoS/RSFPPG菌株的生长没有停止，该菌株显示的L-谷氨酸积累明显超过了SC17sucA/RSFPPG所得的L-谷氨酸积累。

工业实用性

使用本发明的微生物，可以通过发酵有效地产生L-谷氨酸。此外，通过使rpoS基因失活，可以改善产L-谷氨酸细菌在酸性条件下的生长。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>产L-谷氨酸细菌和产生L-谷氨酸的方法

<130>C729-C7132

<150>JP2006-223288

<151>2006-08-18

<150>US60/823921

<151>2006-08-30

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>Pantoea ananatis

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(993)

<400>1

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>2

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物Tn10-750Xho

<400>3

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物Tn10-3020Xho

<400>4

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物pUT-3710Xho

<400>5

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物pUT-3020Xho

<400>6

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物rpoS-F1

<400>7

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物rpoS-FR

<400>8

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物rpoS-RF

<400>9

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物rpoS-R1

<400>10

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物KpnI-rpoS-F2

<400>11

<210>12

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物KpnI-rpoS-R2

<400>12

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物1

<400>13

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物2

<400>14

<210>15

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物3

<400>15

<210>16

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物4

<400>16

Claims (9)

1.一种属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属或欧文氏菌属的产L-谷氨酸细菌，其中所述细菌已通过基因重组而被修饰，使得rpoS基因失活。

2.根据权利要求1的细菌，其中所述rpoS基因是通过降低rpoS基因表达或者破坏rpoS基因而失活的。

3.根据权利要求1的细菌，其中所述rpoS基因编码选自下组的蛋白：

(A)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；和

(B)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但包括一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加，并且具有RNA聚合酶的σS因子活性的蛋白。

4.根据权利要求1的细菌，其中所述rpoS基因选自下组：

(a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA；和

(b)能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列的互补序列或者与能从该核苷酸序列制得的探针在严紧条件下杂交的DNA，并且其中所述DNA编码具有RNA聚合酶的σS因子活性的蛋白。

5.一种产生L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养根据权利要求1-4中任一项的细菌，并从该培养基收集L-谷氨酸。

6.根据权利要求5的方法，其中在pH3至5培养所述细菌。

7.根据权利要求5或6的方法，其中在培养过程中L-谷氨酸在培养基中积累并伴随着沉淀。

8.一种改善产L-谷氨酸微生物在酸性条件下的生长的方法，其包括通过基因重组使所述微生物的rpoS基因失活。

9.根据权利要求8的方法，其中所述微生物属于选自下组的属：泛菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和欧文氏菌属。

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