PL206590B1 - Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu - Google Patents

Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu

Info

Publication number
PL206590B1
PL206590B1 PL348448A PL34844801A PL206590B1 PL 206590 B1 PL206590 B1 PL 206590B1 PL 348448 A PL348448 A PL 348448A PL 34844801 A PL34844801 A PL 34844801A PL 206590 B1 PL206590 B1 PL 206590B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ndh
gene
microorganism
strain
oxidase
Prior art date
Application number
PL348448A
Other languages
English (en)
Other versions
PL348448A1 (en
Inventor
Yuta Nakai
Yoshio Kawahara
Osamu Kurahashi
Original Assignee
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18701548&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL206590(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Kk
Publication of PL348448A1 publication Critical patent/PL348448A1/xx
Publication of PL206590B1 publication Critical patent/PL206590B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206590 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 348448 (51) Int.Cl.
C12P 13/04 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 9/02 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 04.07.2001
Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu
(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo: AJINOMOTO CO, INC., Tokyo, JP
05.07.2000, JP, 2000-204252 (72) Twórca(y) wynalazku:
YUTA NAKAI, Kawasaki, JP
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 14.01.2002 BUP 02/02 YOSHIO KAWAHARA, Kawasaki, JP OSAMU KURAHASHI, Kawasaki, JP NAKANISHI,Kazuo, Kawasaki, JP ITO,Hisao, Kawasaki, JP
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2010 WUP 08/10 (74) Pełnomocnik:
rzecz. pat. Mirosława Ważyńska
PL 206 590 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem mikroorganizmu wybranego z grupy składającej się z Escherichia coli i bakterii coryneform. Wynalazek przedstawia sposób zwiększenia wydajności otrzymywania substancji końcowych w sposobach wytwarzania z wykorzystaniem mikroorganizmów.
Wiele organizmów zdobywa energię wymaganą do aktywności życiowej poprzez oddychanie. W oddychaniu mikroorganizmów uczestniczą różne kompleksy enzymatyczne, zależnie od gatunku mikroorganizmu lub środowiska wzrostu, znacząco różna jest też wydajność uzyskiwania energii. Węglowodany, białka i kwasy alifatyczne są przekształcane w acetylo-CoA w glikolizie, β-utlenianiu itd. I rozkładane w cyklu kwasu cytrynowego. Energia zmagazynowana w wyniku tych procesów w postaci NADH zużywana jest do transportu protonów na zewnątrz komórki drobnoustroju z udziałem dehydrogenazy NADH (NDH) i układu przenoszenia elektronów składającego się z oksydoreduktaz. Dzięki temu tworzy się gradient stężenia protonów pomiędzy wewnętrzną a zewnętrzną błoną cytoplazmatyczną. Ten gradient stężenia protonów wykorzystywany jest do syntezy adenozynotrifosforanu (ATP). Jednocześnie, zależnie od kombinacji NDH i oksydoreduktaz, wśród szlaków przenoszenia elektronów występują szlaki o wysokiej zdolności transportu protonów oraz szlaki o niskiej zdolności transportu protonów na zewnątrz komórki. Uważa się, że szlak o wysokiej zdolności transportu protonów wskazuje na wysoką wydajność energetyczną a szlak o niskiej zdolności transportu protonów na zewnątrz komórki wskazuje na niską wydajność energetyczną. Tak więc, u jednego rodzaju mikroorganizmu jednocześnie występuje wiele równoległych szlaków łańcuchów oddechowych przenoszenia elektronów i szlaki te obejmują zarówno te o wysokiej jak i te o niskiej wydajności energetycznej.
U Escherichia coli obecne są dwa rodzaje NDH i dwa rodzaje końcowych oksydaz łańcucha oddechowego dla warunków tlenowych. Są to NDH: NDH-I (NDH-1, kodowany przez operon nuo) zapewniający dużą wydajność energetyczną oraz NDH-II (kodowany przez ndh) zapewniający niską wydajność energetyczną. Ponadto w przypadku oksydazy końcowej znane są: oksydaza cytochromu typu bo (kodowana przez operon cyoABCD), sklasyfikowana jako typ SoxM (Castresana, J, i Saraste, M., Trends In Biochem. Sci., 20, 443-448 (1995)) i charakteryzująca się wysoką wydajnością energetyczną oraz oksydaza cytochromu typu bd (kodowana przez cydAB) charakteryzująca się niską wydajnością energetyczną. Chociaż wiadomo, że poziom ekspresji tych enzymów łańcucha oddechowego zmienia się w zależności od warunków środowiska wzrostu (Minagawa i in., The Journal of Biological Chemistry, 265:11198-11203 (1990); Tseng i in., Journal of Bacteriology, 178:1094-1098 (1996); Green i in., Molecular Microbiology, 12:433-444 (1994); Bongaerts i in., Molecular Microbiology, 16:521-534 (1995)), wciąż niewiele wiadomo jakie jest fizjologiczne znaczenie poziomów ekspresji tych oksydaz.
Ponadto, u Corynebacterium glutamicum, występuje kompleks cytochromu bc1 oraz potwierdzono obecność co najmniej dwóch rodzajów oksydaz końcowych: oksydazy typu SoxM i oksydazy cytochromu typu bd (The Second Symposium Concerning Metabolic Engineering, Lecture Abstracts, 1999). Wskazuje to, że szlak przenoszenia elektronów z chinonu na cząsteczkę tlenu obejmuje dwa rodzaje szlaków, szlak wykorzystujący kompleks cytochromu bc1 i oksydazy typu SoxM oraz szlak wykorzystujący tylko oksydazę cytochromu typu bd. Uważa się, że pierwszy szlak jest szlakiem przenoszenia elektronów o wysokiej wydajności energetycznej, w którym wartość przeniesienia protonu w odniesieniu do przeniesienia jednego elektronu jest wysoka a drugi szlak jest szlakiem przenoszenia elektronów o niskiej wydajności energetycznej, w którym wartość przeniesienia protonu w odniesieniu do przeniesienia jednego elektronu jest niska.
W przypadku oksydazy końcowej z E. coli, jeśli porównuje się w hodowli tlenowej wzrost zmutowanego szczepu posiadającego tylko oksydazę cytochromu typu bo, ze zmutowanym szczepem mającym tylko oksydazę cytochromu typu bd i dziki szczep mający obie oksydazy, to najniższy wzrost obserwuje się dla zmutowanego szczepu mającego tylko oksydazę cytochromu typu bd i zależy on od rodzaju i wydajności energetycznej oksydazy końcowej (Annual Meeting of the Society for Fermentation i Bioengineering Japan, 1995, Lecture Abstracts, No. 357).
Obserwowano również szczep, który był pozbawiony NDH-I lub oksydazy cytochromowej typu bo związanych z wysoką wydajnością a wykazywał obniżoną wydajność energetyczną (Calhoun i in., Journal of Bacteriology, 175:3020-3925 (1993)).
Jednakże brak jest doniesień, że w wyniku amplifikacji genu kodującego enzymy łańcucha oddechowego zapewniającego wysoką wydajność, takie jak gen kodujący NDH-I i gen kodujący oksydaPL 206 590 B1 zę typu SoxM następowałaby zmiana wydajności energetycznej, co więcej nie jest nawet znana próba wykorzystania tego faktu w produkcji L-aminokwasu. Ponadto, nie przeprowadzono żadnych prób polegających na usunięciu enzymu łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej takiego jak NDH-II i oksydazy cytochromu typu bd, w celu wytworzenia L-aminokwasu.
Do biosyntezy substancji, takich jak L-aminokwasy i kwasy nukleinowe, żywe organizmy potrzebują energii. Na większość używanej energii składa się siła redukująca NADH, NADPH itd. oraz energia gromadzona w postaci ATP. Współtwórcy wynalazku stwierdzili, że zwiększenie dopływu energii zużywanej przy produkcji substancji docelowych sposobami wytwarzania określonych substancji z wykorzystaniem mikroorganizmów, poprawi zdolność wytwarzania tych substancji. Na podstawie tego pomysłu, opracowano wynalazek polegający na skonstruowaniu mikroorganizmu o lepszej wydajności energetycznej i opisano sposób produkowania określonej substancji, L-aminokwasu, z wykorzystaniem tego mikroorganizmu.
Współtwórcy wynalazku stwierdzili, że mikroorganizm o wyższym poziomie wytwarzania energii można skonstruować przez wzmocnienie szlaku łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej lub upośledzenie szlaku łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej. W szczególności, dla E. coli, szczepy, które uważa się za posiadające lepszą wydajność energetyczną wytworzono przez amplifikację genu kodującego oksydazę cytochromu typu bo jako enzymu łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej lub usunięcie genu kodującego NDH-II jako enzymu łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej. Następnie, przy ich pomocy wytworzono L-aminokwas i stwierdzono, że wydajność produkcji L-aminokwasu była większa w szczepach, w których ulepszono wydajność energetyczną.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-aminokwasu, w którym wykorzystuje się mikroorganizm wybrany z grupy składającej się z Escherichia coli i bakterii coryneform, obejmujący etapy, w których mikroorganizm hoduje się w pożywce w celu wytworzenia i nagromadzenia L-aminokwasu w pożywce i zbiera się L-aminokwas, charakteryzujący się tym, że mikroorganizm jest szczepem zmutowanym lub szczepem genetycznie zrekombinowanym, w którym aktywność oksydazy cytochromu typu bo, należącej do oksydaz typu SoxM, jest zwiększona w porównaniu ze szczepem niezmodyfikowanym poprzez zwiększenie liczby kopii genu kodującego oksydazę cytochromu typu bo i/lub zamianę promotora genu na silniejszy promotor.
L-aminokwas wybrany jest korzystnie z grupy obejmującej L-lizynę, L-treoninę i L-fenyloalaninę.
Korzystnie oksydaza cytochromu typu bo jest kodowana przez operon cyo.
Korzystnie przez wprowadzenie mutacji w genie kodującym NDH-II lub przez unieczynnienie tego genu pozbawia się funkcji NDH-II w mikroorganizmie.
Jako wybrany mikroorganizm hoduje się E. coli.
Sposób wytwarzania substancji docelowej obejmuje rozwiązanie, w którym dodatkowo szlak łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej jest upośledzony przez mutację lub uszkodzenie genu kodującego enzym wchodzący w skład łańcucha oddechowego. Enzymy łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej obejmują oksydazy cytochromu typu bd, NDH-II lub oba z nich.
Sposób według wynalazku objaśniono na rysunku, na którym:
Fig. 1 przedstawia konstrukcję plazmidu pTS^ndh do wytwarzania szczepu z uszkodzonym genem kodującym NDH-II.
Fig. 2 - konstrukcję pMAN997.
Oprócz L-aminokwasu, który jest otrzymywany zgodnie z wynalazkiem, rozwiązanie to może być stosowane do wytwarzania innej substancji, o ile jest to substancja wytwarzana przez mikroorganizm. Przykłady takich substancji obejmują np. oprócz L-aminokwasów takich jak L-treonina, L-lizyna, kwas L-glutaminowy, L-leucyna, L-izoleucyna, L-walina i L-fenyloalanina również kwasy nukleinowe takie jak kwas guanylowy i kwas inozynowy, witaminy, antybiotyki, czynniki wzrostu, substancje aktywne fizjologicznie itp.
Mikroorganizmem według wynalazku jest mikroorganizm wykazujący zdolność do wytwarzania substancji docelowej, skonstruowany z rodzicielskiego szczepu mikroorganizmu posiadającego jako szlaki łańcucha oddechowego szlak o wysokiej wydajności energetycznej i szlak o niskiej wydajności energetycznej, przy czym zwiększona jest wydajność szlaku łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej oraz ewentualnie obniżona jest wydajność szlaku łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej.
Na ogół, mikroorganizmy takie jak E. coli i maczugowce (coryneform) mogą wykorzystywać jednocześnie kilka równoległych szlaków łańcucha oddechowego transportujących elektrony i szlaki te
PL 206 590 B1 wykazują bądź wysokie wartości przenoszenia protonów, bądź niskie wartości przenoszenia protonów w przeliczeniu na elektron. Np. u E. coli, w odniesieniu do donora elektronów NADH, obecne są NDH-I i NDH-II jako dehydrogenazy NADH, które katalizują przeniesienie protonu z NADH na pierścień chinonu. NDH-I wykazuje wysoką wydajność energetyczną a NDH-II - niską wydajność energetyczną. To oznacza, że dla NDH-II liczba protonów transportowanych na zewnątrz komórki z jednym elektronem (wartość przeniesienia protonu) wynosi 0, podczas gdy uważa się, że dla NDHI wynosi 2.
Ogólnie, wydajność energetyczna szlaku o wysokiej wartości przeniesienia protonu w przeliczeniu na elektron, jak opisano powyżej, np. szlaku łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej jest zwiększona a wydajność szlaku łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej jest obniżona. Zwiększenie wydajności szlaku łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej może być uzyskane poprzez wzmocnienie aktywności enzymu uczestniczącego w szlaku ł a ń cucha oddechowego. Podczas gdy wydajność szlaku ł a ńcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej może być obniżona przez zmniejszenie lub wyeliminowanie aktywności enzymu łańcucha oddechowego.
Dobór odpowiedniego enzymu łańcucha oddechowego nie podlega szczególnym ograniczeniom, o ile jest to enzym łańcucha oddechowego.
W szczególności, przykłady takich enzymów obejmują dehydrogenazy katalizujące przeniesienie elektronu z donora elektronu na pierścień chinonu, jak ubichinon, dimetylomenachinon i menachinon oraz oksydazy katalizujące przeniesienie elektronu z pierścienia chinonu na donora elektronu.
Oksydazy katalizujące reakcję wytwarzania cząsteczki wody przez przeniesienie elektronu z pierścienia chinonu klasyfikuje się jako enzymy typu SoxM (typ bo) albo typu bd. Wartość przeniesienia protonu przez enzymy typu bo wynosi 2, podczas gdy dla typu bd wynosi 1. Typ bo wykazuje więc większą wydajność energetyczną.
Terminy „wysoka wydajność energetyczna i „niska wydajność energetyczna nie są tu stosowane w znaczeniu bezwzględnym ale rozpatrywane są jako terminy względne.
Poniżej wyjaśniono sposoby zwiększenia aktywności enzymu łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej oraz sposoby ograniczenia lub wyeliminowania aktywności enzymu łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej.
W celu zwię kszenia aktywności enzymu ł a ńcucha oddechowego o wysokiej wydajnoś ci energetycznej, na przykład tworzy się zrekombinowany DNA przez ligację fragmentu genu kodującego enzym z wektorem działającym w komórce mikroorganizmu, korzystnie z wektorem wielokopijnym i wprowadza się ten wektor do mikroorganizmu transformują c komórki. Dzię ki temu ulega zwi ę kszeniu liczba kopii genu kodującego enzym w komórkach stransformowanego szczepu i w rezultacie, zwiększa się też aktywność enzymatyczna. Ta procedura zostanie wyjaśniona na przykładzie operonu cyo (cyoABCDE), kodującego oksydazę cytochromu typu bo, jako genu kodującego enzym łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej.
Sekwencja operonu cyo z E. coli została już opublikowana (Chepuri i in., The Journal of Biological Chemistry, 265:11185-11192 (1990)), można więc na jej podstawie sklonować operon. Można też zastosować gen pochodzący z bakterii należącej do rodzaju Escherichia lub gen pochodzący od innego mikroorganizmu, np. operon cyo z maczugowca.
Jako wektor do klonowania genu i wprowadzenia genu do mikroorganizmu, stosuje się np. wektor autonomicznie replikujący się w komórkach E. coli. W szczególności, przykłady wektorów obejmują pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pSTV29 itd. Do wprowadzenia genu do maczugowca stosuje się wektor wahadłowy korzystnie autonomicznie replikujący się w komórkach maczugowców i E. coli.
Przykłady plazmidów autonomicznie replikujących się w komórkach maczugowców są następujące: pAM 330 (niebadana publikacja patentu japońskiego (Kokai) No. 58-67699) pHM 1519 (niebadana publikacja patentu japońskiego No. 58-77895) pAJ 655 (niebadana publikacja patentu japońskiego No. 58-192900) pAJ 611 (niebadana publikacja patentu japońskiego No. 58-192900) pAJ 1844 (niebadana publikacja patentu japońskiego No. 58-192900) pCG 1 (niebadana publikacja patentu japońskiego No. 57-134500) pCG 2 (niebadana publikacja patentu japońskiego Nr 58-35197) pCG 4 (niebadana publikacja patentu japońskiego Nr 57-183799) pCG 11 (niebadana publikacja patentu japońskiego Nr 57-183799) pHK4 (niebadana publikacja patentu japońskiego Nr 5-7491)
PL 206 590 B1
W celu zligowania fragmentu DNA zawierającego operon cyo z wektorem z wytworzeniem zrekombinowanego DNA, wektor jest wstępnie trawiony enzymem restrykcyjnym dającym końce odpowiadające końcom operonu cyo. Ligację zazwyczaj przeprowadza się stosując ligazę, np. ligazę DNA T4.
Wprowadzenie zrekombinowanego DNA, wytworzonego opisaną metodą, do mikroorganizmu, przeprowadza się dowolnymi znanymi metodami transformacji. Na przykład, stosuje się metodę traktowania komórek biorcy chlorkiem wapnia w celu zwiększenia przepuszczalności dla DNA, co opisano dla E. coli K-12 (Mandel, M, i Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)); metoda przygotowania komórek kompetentnych z komórek znajdujących się w fazie wzrostu a następnie wprowadzenie do nich DNA, opisana dla Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. i Young, F. E., Gene, 1, 153 (1977)). Oprócz tej metody, stosuje się także metody przeprowadzenia komórek biorcy DNA w protoplasty lub sferoplasty, które łatwo pobierają zrekombinowany DNA, po czym tak przygotowany zrekombinowany DNA wprowadza się do komórek, przy czym metoda ta jest odpowiednia dla Bacillus subtilis, Actinomycetes i drożdży (Chang, S. i Choen, S. N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J., Ward, J.M. i Hopwood, O. A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J. B. i Fink, G. R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)). Transformację maczugowców można przeprowadzić metodą impulsu elektrycznego (publikacja niepoddanego badaniu patentu japońskiego 2-207791).
Zwiększenie aktywności oksydazy cytochromu typu bo przeprowadza się przez uzyskanie obecności w chromosomalnym DNA gospodarza wielu kopii operonu cyo. W celu wprowadzenia wielu kopii operonu cyo do chromosomalnego DNA mikroorganizmu, takiego jak bakterie należące do rodzaju Escherichia i maczugowce, przeprowadza się rekombinację homologiczną stosując sekwencję, której wielokrotne kopie występują w chromosomalnym DNA jako sekwencje docelowe. Jako sekwencje, których wielokrotne kopie występują w chromosomalnym DNA, można stosować repetytywny DNA lub odwrócone powtórzenia znajdujące się na końcach elementów transpozonowych. Można również jak ujawniono w niebadanej publikacji patentu japońskiego No. 2-109985, wprowadzać operon cyo do transpozonu, który po przeniesieniu umożliwia wprowadzenie wielokrotnych kopii operonu cyo do chromosomalnego DNA. Każda z tych metod prowadzi do zwiększenia liczby kopii operonu cyo w komórkach stransformowanego szczepu, a w rezultacie uzyskuje się zwiększenie aktywności oksydazy cytochromu typu bo.
Poza wymienioną amplifikacją genu, zwiększenie aktywności oksydazy cytochromu typu bo osiąga się przez zastąpienie sekwencji regulatorowej operonu cyo, np. promotora, silniejszym promotorem (patrz publikacja niebadanego patentu japońskiego No. 1-215280). Jako silne promotory znane są np. promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor PR i promotor PL faga lambda, promotor tet, promotor amyE itd.. Wprowadzenie tych promotorów zwiększa poziom ekspresji operonu cyo a zatem zwiększeniu ulega aktywność oksydazy cytochromu typu bo. Zwiększenie poziomu ekspresji sekwencji regulatorowej może być połączone ze zwiększeniem liczby kopii operonu cyo.
Zwiększenie aktywności enzymu łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej można też osiągnąć przez wprowadzenie mutacji, zwiększającej wewnątrzkomórkową aktywność enzymu poprzez poddanie procesom mutagennym mikroorganizmu. Przykłady mutacji obejmują mutacje w rejonie kodującym zwiększające specyficzną aktywność enzymu, mutacje w sekwencji regulatorowej zwiększające poziom ekspresji genu itd. Procesy mutagenne obejmują między innymi mutagenizowanie, można wymienić metody wykorzystujące naświetlanie promieniami ultrafioletowymi, traktowanie środkiem mutagennym, zazwyczaj używanym do mutagenezy, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (NTG) i kwas azotawy.
W celu ograniczenia lub zniesienia aktywnoś ci enzymu w ł a ń cuchu oddechowym o niskiej wydajności energetycznej, do genu kodującego enzym wprowadza się mutację tak, aby wewnątrzkomórkowa aktywność eksprymowanego enzymu uległa obniżeniu lub zniesieniu lub gen w obrębie chromosomu mikroorganizmu uszkadza się tak aby zaburzyć jego prawidłowe funkcjonowanie.
Poniżej wyjaśniono sposób uszkadzania genu na przykładzie genu ndh kodującego NDH-II jako genu enzymu łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej.
Gen ndh klonuje się na podstawie znanej sekwencji ndh z E. coli (Young i in., European Journal of Biochemistry, 116:165-170 (1981)). Można również zastosować gen z innej bakterii z rodzaju Escherichia lub gen pochodzący z innych mikroorganizmów, taki jak gen ndh maczugowców.
Gen ndh w obrębie chromosomu uszkodza się przez transformację mikroorganizmu DNA zawierającym zmodyfikowany gen ndh z delecją w sekwencji kodującej, w celu uzyskania unieczynnionego genu NDH-II (delecja genu typu ndh) i umożliwienie rekombinacji genu typu ndh z delecją z genem ndh na chromosomie. Znany jest sposób unieczynnienia genu przez rekombinację homologiczną
PL 206 590 B1 i istnieją sposoby oparte na liniowym DNA, plazmidzie zawierającym wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację itd.
Według wynalazku korzystna jest metoda wykorzystująca plazmid zawierający wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację.
Gen ndh w obrębie chromosomu gospodarza może być zastąpiony w następujący sposób genem typu ndh z delecją. Zrekombinowany DNA wytwarza się przez insercję wrażliwego na temperaturę regionu kontrolującego replikację, genu typu ndh z delecją i genu markerowego niosącego oporność na lek a następnie tak zrekombinowanym DNA transformuje się komórki maczugowca. Następnie, uzyskany szczep transformanta hoduje się w temperaturze, w której wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację nie funkcjonuje, po czym szczep transformanta można hodować w pożywce zawierającej lek w celu otrzymania szczepu transformanta, w którym zrekombinowany DNA jest włączony do chromosomalnego DNA.
W takim szczepie transformanta, w którym zrekombinowany DNA jest włączony do chromosomalnego DNA, gen typu ndh z delecją ulega rekombinacji z genem ndh pierwotnie obecnym w chromosomie i dwa fuzyjne geny: chromosomalny gen ndh i gen typu ndh z delecją są wbudowane do chromosomu tak, aby pozostałe fragmenty zrekombinowanego DNA (część wektora, wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację i marker oporności na lek) występowały pomiędzy dwoma genami fuzyjnymi. Zatem, transformant eksprymuje NDH-II, ponieważ prawidłowy gen ndh jest w tym układzie dominujący.
Następnie, w celu pozostawienia w chromosomalnym DNA tylko genu typu ndh z delecją, jedną kopię genu ndh usuwa się razem z częścią wektora (obejmującą wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację i marker oporności na lek) z chromosomalnego DNA przez rekombinację dwóch genów ndh. W takim przypadku, prawidłowy gen ndh pozostaje na chromosomalnym DNA, a gen typu ndh z delecją ulega wycięciu z chromosomalnego DNA, lub na odwrót, gen typu ndh z delecją pozostaje na chromosomalnym DNA a prawidłowy gen ndh ulega wycięciu z chromosomalnego DNA. W obu przypadkach, wycięty DNA może być zatrzymany w komórce jako plazmid gdy komórkę hoduje się w temperaturze, w jakiej funkcjonuje wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację. Po czym komórkę hoduje się w temperaturze, w której nie funkcjonuje wrażliwy na temperaturę region kontrolujący replikację. Komórka nie może namnażać się w hodowli, gdy na chromosomalnym DNA pozostał gen typu ndh z delecją, ponieważ plazmid zawierający normalny gen ndh uległ usunięciu z komórki. Z drugiej strony komórka może się namnażać, gdy w obrębie chromosomalnego DNA pozostał normalny gen ndh. Zatem poprzez wybranie takiego szczepu, który może namnażać się w temperaturze, w której funkcjonuje region kontrolujący replikację wrażliwy na temperaturę lecz nie może namnażać się w temperaturze, w której nie funkcjonuje region kontrolujący replikację wrażliwy na temperaturę, może być otrzymany szczep, w którym w obrębie chromosomalnego DNA jest unieczynniony gen hdh, a normalny gen ndh jest przenoszony na plazmidzie.
Gdy szczep z unieczynnionym genem ndh otrzymany jak opisano powyżej hoduje się w temperaturze, w której funkcjonuje region kontrolujący replikację wrażliwy na temperaturę (na przykład w niskiej temperaturze), gen ndh pozostaje w komórce, natomiast gdy szczep ten hoduje się w temperaturze, w której nie funkcjonuje region kontrolujący replikację wrażliwy na temperaturę (na przykład w wysokiej temperaturze), następuje utrata genu ndh.
Otrzymany szczep recA-, z unieczynnionym genem ndh w obrębie chromosomowego DNA, podczas gdy normalny gen ndh jest wbudowany w plazmid, jest korzystnie stosowany jako mikroorganizm według wynalazku, ponieważ podczas hodowli w niskiej temperaturze w szczepie tym nie dojdzie do wbudowania genu ndh obecnego na plazmidzie do chromosomu, a zatem zapewnione jest pominięcie tego genu.
Przykłady wektorów posiadających wrażliwy na temperaturę region inicjacji replikacji u E. coli to np. plazmid pMAN997 opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 99/03988 itd., a przykłady wektorów posiadających wraż liwy na temperaturę region inicjacji replikacji u maczugowców obejmują np. plazmid pHSC4 opisany w publikacji niebadanego patentu japońskiego No. 5-7491 itd. Jednakże, jako plazmidy można stosować również inne wektory.
Specyficzne przykłady mikroorganizmów jakie otrzymano opisanym sposobem obejmują mikroorganizmy, których oksydaza typu SoxM lub NDH-I lub obie razem są wzmocnione, mikroorganizmy, których aktywność oksydazy cytochromu typu bd lub NDH-II lub aktywności obu są obniżone lub zniesione oraz mikroorganizmy, których aktywność oksydazy typu SoxM lub NDH-I lub obie są zwiększone i aktywno ść oksydazy cytochromu typu bd lub NDH-II lub aktywnoś ci obu są obniż one lub zniesione.
PL 206 590 B1
Bardziej szczegółowo, przykładem może być E. coli, u której aktywność oksydazy typu SoxM jest zwiększona a NDH-II jest zniesiona. Przykładem oksydaz typu SoxM jest oksydaza cytochromu typu bo.
Nie ma szczególnych ograniczeń jakie mikroorganizmy zostaną użyte według wynalazku, o ile posiadają one wymienione właściwości i przykładem takich bakterii są należące do rodzaju Escherichia, takie jak E. coli, maczugowce takie jak Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum), Bacillus, np. Bacillus subtilis, Serratia, np. Serratia marcescens, jak również drożdże np. Saccharomyces cerevisae itd.
W szczególności, jeś li produktem fermentacji jest L-treonina, jako odpowiednie mikroorganizmy można wymienić E. coli VKPM B-3996 (RIA 1867) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,175,107), Corynebacterium acetoacidophilum AJ12318 (FERM BP-1172) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,188,949) itd., dla L-lizyny: E. coli AJ11442 (NRRL B-12185, FERM BP-1543) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 4,346,170), E. coli W3110 (tyrA) (ten szczep otrzymuje się usuwając plazmid pHATerm z E. coli W3110 (tyrA)/pHATerm (FERM BP-3653), jak opisano w publikacji zgłoszenia mię dzynarodowego WO 95/16042), Brevibacterium lactofermentum AJ12435 (FERM BP-2294) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,304,476), Brevibacterium lactofermentum AJ3990 (ATCC31269) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 4,066,501) itp.; dla kwasu L-glutaminowego: E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) (jak w publikacji niebadanego patentu francuskiego FR 2,680,178), Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172) (publikacja niebadanego patentu japońskiego nr 5-26811, publikacja niebadanego patentu francuskiego FR 2701489), Brevibacterium lactofermentum AJ12475 (FERM BP-2922) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,272,067), Brevibacterium lactofermentum AJ13029 (jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym JP95/01586) itd., dla L-leucyny, można wymienić E. coli AJ11478 (FERM P-5274) (jak opisano w publikacji japońskiego zgłoszenia patentowego (Kokoku) nr 62-34397), Brevibacterium lactofermentum AJ3718 (FERM P-2516) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 3,970,519) itp., dla L-izoleucyny: E. coli KX141 (VKPM B-4781) (jak opisano w publikacji niebadanego patentu europejskiego EP 519,113), Brevibacterium flavum AJ12149 (FERM BP-759) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 4,656,135) itp.; dla L-waliny: E. coli VL1970 (VKPM B-4411) (jak opisano w publikacji niebadanego patentu europejskiego EP 519,113), Brevibacterium lactofermentum AJ12341 (FERM BP-1763) (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,188,948) itp. i dla L-fenyloalaniny można wymienić: E. coli AJ12604 (FERM BP-3579) (jak opisano w publikacji niebadanego patentu japońskiego No. 5-236947, w publikacji niebadanego patentu europejskiego EP 488,424), Brevibacterium lactofermentum AJ12637 (FERM BP-4160) (jak opisano w publikacji niebadanego patentu francuskiego FR 2686898) itd.
W mikroorganizmie zastosowanym wedł ug wynalazku, zależ nie od produkowanego L-aminokwasu, możliwe jest zwiększenie aktywności enzymu uczestniczącego w biosyntezie tej substancji. Co więcej, aktywność enzymu niekorzystna dla wytwarzania substancji docelowej może być zmniejszona lub zniesiona.
Jako pożywkę do wytwarzania L-aminokwasu typowo stosuje się dobrze znaną pożywkę, dobraną do stosowanego mikroorganizmu. Znaczy to, że pożywka może być zwykłą pożywką zawierającą źródło węgla, źródło azotu, jony nieorganiczne, jak również inne składniki organiczne, jeśli to konieczne. Do realizacji wynalazku nie jest potrzebna specjalna pożywka.
Jako źródło węgla można zastosować cukier, na przykład taki jak glukoza, laktoza, galaktoza, fruktoza lub hydrolizat skrobi, alkohol, np. glicerol lub sorbitol, kwasy organiczne, np. kwas fumarowy, kwas cytrynowy lub kwas bursztynowy itd.
Jako źródło azotu, stosuje się nieorganiczne sole amonowe, takie jak siarczan amonu, chlorek amonu lub fosforan amonu, organiczny azot taki jak hydrolizat sojowy, gazowy amoniak, wodny roztwór amoniaku itd.
Pożądane jest zastosowanie dodatkowych substancji, takich jak witamina B1, L-homoseryna i L-tyrozyna lub ekstrakt drożdżowy, w odpowiednich ilościach, jako śladowych organicznych składników pokarmowych, jak w mikronawozach organicznych. Inne związki niż wymienione, takie jak, fosforan potasu, siarczan magnezu, jony żelaza, jony manganu itd. dodaje się w małych ilościach, jeśli to konieczne.
Hodowlę można prowadzić w typowych, dobrze znanych warunkach wybranych zależnie od stosowanego mikroorganizmu. Np. hodowlę korzystnie prowadzi się w warunkach tlenowych przez 16-120 godzin. Temperaturę hodowli korzystnie kontroluje się tak, aby była w przedziale od 25°C do 45°C a pH podczas hodowli utrzymuje się w przedziale od 5-8. Substancje nieorganiczne lub orga8
PL 206 590 B1 niczne, kwasowe lub alkaliczne, jak również gazowy amoniak można stosować w celu uzyskania stosownych wartości pH.
Według wynalazku, do wyodrębnienia wytworzonych produktów z pożywki hodowlanej nie są wymagane żadne specjalne metody. Wynalazek realizuje się łącząc typowe, dobrze znane techniki jonowymienne, techniki wytrącania i inne.
Wynalazek wyjaśniono w następujących przykładach jego wykonania.
P r z y k ł a d 1:
Klonowanie genu kodującego oksydazę cytochromu typu bo
Operon sklonowano na podstawie opisanej w literaturze sekwencji operonu cyo (cyoABCDE) kodującej oksydazę cytochromu typu bo z E. coli (Chepuri i in., The Journal of Biological Chemistry, 265:11185-11192 (1990)).
W szczególności, operon genu cyo otrzymano z biblioteki fagowej Kohary (Kohara i in., Cell, 50:495-508 (1987)) zawierającej operon cyo. Fagowy DNA otrzymano z klonu faga 147[2H5] Kohary zawierającego operon stosując zestaw Wizard lambda prep (Promega). Otrzymany DNA faga 147[2H5] trawiono PshBl i otrzymany fragment o 5,5 kb, zawierający operon cyo po uzyskaniu tępych końców wstawiono w miejsce Smal pMW119 (Nippon Gene) aby sklonować operon cyo zawierający obszar promotora. W otrzymanym plazmidzie operon cyo wstawiono w odwrotnym kierunku w stosunku do promotora operonu laktozowego obecnego w pMW119. Uzyskany plazmid nazwano pMW(CYO)B.
Plazmid pMW(CYO)B wprowadzono do szczepu E. coli W3110 (otrzymanego z National Institute of Genetics/ Mishima, Shizuoka, Japan) tworząc W3110/pMW(CYO)B. Stosując znane metody zmierzono aktywność oksydazy ubichinolu w ekstraktach komórek szczepów W3110 i W3110/pMW(CYO)B jako aktywność oksydazy końcowej (Kita i in., The Journal of Biological Chemistry, 259:3368-3374 (1984)).
Wyniki przedstawiono w Tablicy 1.
T a b l i c a 1: Aktywność oksydazy ubichinolu
Szczep Aktywność oksydazy ubichinolu (mmol/min/mg białka)
W3110/pMW119 0,28
W3110/pMW(CYO)B 0,56
Stwierdzono, że aktywność końcowej oksydazy była wyższa w szczepie z wprowadzonym pMW(CYO)B, jak pokazano w Tablicy 1. Uzyskane zwiększenie aktywności oksydazy uważa się za spowodowane zwiększoną aktywnością oksydazy cytochromu typu bo poprzez zwiększenie aktywności operonu cyo.
P r z y k ł a d 2:
Uzyskanie szczepu pozbawionego NDH-II
W celu wytworzenia szczepu pozbawionego aktywności NDH-II skonstruowano wewnętrznie trawioną częściową sekwencję genu kodującego NDH-II (unieczynniony gen NDH-II). Częściową sekwencję kodującą NDH-II sklonowano korzystając ze znanej sekwencji genu ndh kodującego NDH-II z E. coli (Young i in., European Journal of Biochemistry, 116, 165-170 (1981)).
Szczegółowo, unieczynniony gen kodujący NDH-II wytworzono następująco (Fig. 1): fragment DNA o około 2,4 kb, zawierający częściową sekwencję NDH-II z E. coli zamplifikowano techniką PCR na matrycy chromosomalnego DNA stosując jako startery ndh-1 (SEQ ID NO: 1) i ndh-2 (SEQ ID NO; 2). Ten fragment wklonowano potem do wektora pGEM-T (Promega), tworząc pGEM-ndh. pGEM-ndh trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Stul i otrzymany fragment DNA długości 0,5 kb zebrano i ligowano z pTWV229 (Takara Shuzo) trawionego EcoRI i Smal, tworząc pTWV-ndh.
Następnie pGEM-ndh trawiono enzymem restrykcyjnym Stul, i otrzymany fragment DNA o długości 0,9 kb wbudowano w miejsce HincII pTWV-ndh. Tak otrzymano pTWVΔndh zawierający część polilinkera pTWV229 w częściowej sekwencji ndh. Plazmid pTWVΔndh zawiera sekwencję ndh wbudowaną wraz z sekwencją o 17 bp pochodzącą z pTWV229 w miejscu Stul sekwencji ndh. Następnie fragment o długości 1,5 kb otrzymany w wyniku trawienia pTWVΔndh Hindlll i EcoRI wstawiono pomiędzy Hindlll i EcoRI plazmidu niosącego wrażliwość na temperatury pMAN997 (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 99/03988), tworząc pTS^ndh. Przeprowadzono rekombinację homologiczną plazmidu pTS^ndh i genomu szczepu W3110 jak dla ndh zwykłymi technikami rekombinacji homologicznej, wykorzystując zależność od temperatury nadaną przez pTS^ndh (Matuyama i in.,
PL 206 590 B1
Journal of Bacteriology, 162:1196 (1985)), tworząc szczep W3110(ndh), nie eksprymujący prawidłowego białka NDH-II, ponieważ do obszaru kodującego ndh w genomie wstawiono sekwencję o 17 bp pochodzącą z pTWV229. Do szczepu W3110(ndh) wprowadzono unieczynniony tyrA z W3110(tyrA), przez transdukcję P1, stosując jako marker oporność na tetracyklinę, tworząc w ten sposób szczep W3110(ndh, tyrA).
Wymieniony pMAN997 otrzymano wymieniając fragment Vspl-Hindlll z pMAN031 (J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) z fragmentem VspI-HindIII z pUC19 (Takara Shuzo) (Fig. 2).
Następnie, ponieważ otrzymywanie szczepu W3110(tyrA) omówiono szczegółowo w publikacji niebadanego europejskiego zgłoszenia patentowego EP 488,424/1992, sposób jego otrzymywania krótko wyjaśniono poniżej.
Szczep E. coli W3110 otrzymano z National Institute of Genetics (Mishima, Shizuoka). Komórki wysiano na szalce z LB uzupełnionym streptomycyną i wybrano szczep tworzący kolonię, otrzymując szczep oporny na streptomycynę. Wybrany oporny na streptomycynę szczep mieszano ze szczepem E. coli K-12 ME8424 i aby indukować koniugację hodowano w pełnej pożywce (pożywka L; 1% Bactotrypton, 0,5% ekstraktu z drożdży, 0,5% NaCl) w temperaturze 37°C przez 15 minut hodowli stacjonarnej. Szczep E. coli K-12 ME8424 ma następujące cechy genetyczne (HfrP045, thi, relA1, tyrA::Tn10, ung-1, nadB) i może być uzyskany z National Institute of Genetics. Następnie hodowlę wysiewano na pożywce pełnej (pożywka L; 1% Bactotrypton, 0,5% ekstraktu z drożdży, 0,5% NaCl, 1,5% agar) zawierającej streptomycynę, tetracyklinę i L-tyrozynę, po czym wybierano szczep tworzący kolonie. Ten szczep określono jako szczep E. coli W3110(tyrA).
W publikacji niebadanego europejskiego zgł oszenia patentowego EP 488,424/1992 ujawniono liczne szczepy otrzymane przez wprowadzenie plazmidu do powyższego szczepu. Przykładowo, szczep otrzymany przez wprowadzenie plazmidu pHATerm, określony jako E. coli W3110 (tyrA) /pHATerm, złożono 16 listopada 1991, w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Baraki-ken, Japan, postal code: 305) (obecnie, niezależna jednostka, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Sukuba-shi, Baraki-ken, Japan, postal code: 305-5466) jako depozyt międzynarodowy zgodny z Traktatem Budapesztańskim i otrzymał numer FERM BP-3653. Szczep E. coli W3110(tyrA) otrzymano typowo eliminując plazmid pHATerm z powyższego szczepu.
P r z y k ł a d 3:
Wytwarzanie L-lizyny
Plazmid pMW(CYO)B otrzymany według przykładu 1 wprowadzono do szczepu W3110(tyrA) i szczepu w3110(ndh, tyrA), otrzymanego w przykładzie 2, tworząc odpowiednio W3110(tyrA)/pMW (CYO)B i W3110(ndA, tyrA)/pMW(CYO)B. Podobnie, pMW119 wprowadzono do W3110(tyrA) tworząc szczep W3110(tyrA)/pMW119. Wytwarzanie L-lizyny przez szczepy W3110(tyrA)/pMW(CYO)B, W3110(ndA, tyrA)/pMW(CYO)3 i W3110 (tyrA)/pMW119 stanowiący kontrolę, oszacowano dla hodowli w kolbie. Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C przez 24 do 48 godzin z wytrząsaniem stosując pożywkę o poniżej podanym składzie. Wyniki przedstawiono w Tablicy 2.
(Skład pożywki)
Glukoza 40 g/l
MgSO4*7H2O 1 g/l
KH2PO4 1 g/l
MgSO4*7H2O 0,01 g/l
MgSO4*5H2O 0,01 g/l
ekstrakt drożdżowy (Difco) 2 g/l
L-tyrozyna 0,1 g/l lub 0,05 g/l
pH pożywki doprowadzono do 7,0 stosując KOH i pożywkę autoklawowano w temperaturze
115°C przez 10 minut. Glukozę i MgSO4*7H2O sterylizowano oddzielnie. Następnie, przed założeniem hodowli, zgodnie z Farmakopeą Japońską do pożywki dodano 30 g/l CaCO3 poddanego uprzednio suchej sterylizacji w 180°C, i 100 μg/l antybiotyku ampicyliny.
PL 206 590 B1
T a b l i c a 2: Ilość wytworzonej L-lizyny
Szczep L-Lys (g/l)
W3110(tyrA)/pMW119 0,29
W3110(tyrA)/pMW(CYO) B 0,48
W3110(ndA, tyrA)/pMW(CYO) 0,53
Stwierdzono, że nastąpiło zwiększenie wydajności produkcji L-lizyny w E. coli w wyniku zwiększenia aktywności oksydazy cytochromu typu bo. Uważa się, że jest to wynik skuteczniejszego uzyskiwania energii przez zwiększenie produktywności łańcucha oddechowego o wysokiej wydajności energetycznej a uzyskana energia została użyta do wytworzenia L-lizyny.
Stwierdzono także, że nastąpił wzrost wydajności wytwarzania L-lizyny w E. coli z unieczynnionym NDH-II. Sądzi się, że jest to wynik skuteczniejszego uzyskiwania energii wskutek unieczynnienia szlaku łańcucha oddechowego o niskiej wydajności energetycznej a uzyskana energia została użyta do wytworzenia L-lizyny.
P r z y k ł a d 4:
Wytwarzanie L-treoniny
Otrzymany wcześniej opisaną metodą plazmid pMW(CYO)B wprowadzono do bakterii E. coli VKPM B-3996 (RIA 1867) wytwarzającej L-treoninę (jak w amerykańskim opisie patentowym US 5,175,107, dalej opisywany tu jako „szczep B-3996), tworząc szczep B-3996/pMW(CYO)B. Szczep B3996 niósł plazmid pVIC40 (publikacja patentowego zgłoszenia międzynarodowego W090/04636) otrzymany przez wstawienie operonu treoninowego do wektora plazmidowego pAYC32 o szerokim zakresie gospodarzy, zawierającego marker oporności na streptomycynę (jak opisali Chistorerdov, A. Y., Tsygankov, Y. D., Plasmid, 1986, 16, 161-167). Szczep B-3996 zdeponowano w Instytucie Badań Antybiotyków USSR (VNIIA), pod numerem rejestracyjnym RIA1867.
Jako kontrolę otrzymano B-3996/pMW119 wprowadzając pMW119 do B-3996. Wytwarzanie L-treoniny przez B-3996/pMW(CYO) B i B-3996/pMW115 oszacowano dla hodowli prowadzonej w kolbie. Hodowlę prowadzono w temperaturze 37°C przez 38 godzin z mieszaniem przy 114-116 obrotach na minutę w pożywce o składzie wymienionym w Tablicy 3. Przygotowano składniki A, B i C, według Tablicy 3 i sterylizowano oddzielnie, następnie schłodzono i wymieszano w stosunku 16/20 objętości składnika A, 4/20 objętości składnika B i 30 g/l składnika C. Wyniki przedstawiono w Tablicy 4.
T a b l i c a 3: pożywka do produkcji treoniny
A (NH4)2SO4 16 g/l KH2PO4 1 g/l FeSO4*7H2O 0,01 mg/l MnOSO4*4H2O 0,01 mg/l Ekstrakt drożdżowy (Difco) 2 mg/l L-izoleucyna 50 mg/l Kwas nikotynowy 10 mg/l pH doprowadzono KOH do 7,0 i autoklawowano w 115°C przez 10 minut (16/20 objętości)
B 20% glukoza autoklawowana w 115°C przez 10 minut (4/20 objętości) MgSO4*7H2O 1 mg/l
C CaCO3 według Farmakopei Japońskiej, poddane suchej sterylizacji w 180°C (30 g/l) Antybiotyki (100 μg/l streptomycyny i 5 μg/l kanamycyny)
T a b l i c a 4: ilość wytworzonej L-treoniny
Szczep L-Thr (g/l)
B-3996/pMW119 13,1
B-3996/pMW(CYO)B 14,3
Stwierdzono, że wydajność produkcji L-treoniny przez E. coli można podnieść zwiększając aktywność oksydazy cytochromu typ bo.
PL 206 590 B1
P r z y k ł a d 5:
Wytwarzanie L-fenyloalaniny
Plazmid pACMAB wyodrębniono ze szczepu E. coli W3110 (tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 standardowymi metodami oczyszczania plazmidu. Plazmid ten powstał przez wstawienie fragmentu DNA zawierającego uniewrażliwiony gen kodujący mutazę choryzmianu/dehydratazę prefenianu(CM-PDH) głównego szlaku biosyntezy L-fenyloalaniny, w miejsca BamHI i Hindlll wektora plazmiowego pACYC184 (Apr) (jak w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 97/08333). Szczep W3110(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 (oznaczony AJ12604) zdeponowano 28 stycznia 1991 w National Institute of Bioscience and Human Technology Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, postal code: 305) i otrzymał on numer dostępu FERM P-11975. Następnie został zdeponowany w depozycie międzynarodowym, zgodnie z ustaleniami Traktatu Budapesztańskiego, 26 września 1991, gdzie otrzymał numer dostępu FERM BP-3579.
Plazmid pACMAB cięto Sall uzyskując tępe końce. Następnie wklonowano weń tępo zakończony fragment DNA zawierający operon cyo o długości 5,5 kb, otrzymany z wymienionego wcześniej DNA faga 147[2H5] Kohary przez trawienie PshBI. Powstały plazmid pACMAB-cyo wprowadzono do w3110(tyrA)/pBR-aroG4. Otrzymany szczep transformanta hodowano w pożywce do wytwarzania L-fenyloalaniny (zawierającej 20 g glukozy, 29,4 g wodorofosforanu disodu, 6 g diwodorofosforanu potasu, 1 g chlorku sodu, 2 g chlorku amonu, 10 g cytrynianu sodu, 0,4 g glutaminianu sodu, 3 g siedmiowodnego siarczanu magnezu, 0,23 g chlorku wapnia, 2 mg chlorowodorku tiaminy, i 100 mg L-tyrozyny w 1 l wody, pH 7,0) w 37°C przez 40 godzin. Zawartość L-fenyloalaniny w pożywce określano metodą HPLC.
Wyniki przedstawiono w Tablicy 5.
T a b l i c a 5: Ilość wytwarzanej L-fenyloalaniny
Szczep L-Phe (g/l)
W3110(fy/A)/pACMAB, pBR-aroG4 3,9
W3110(tyrA)/pACKAB-cyo, pBR-aroG4 4,2
Stwierdzono, że produktywność L-fenyloalaniny przez E. coli ulegała zwiększeniu po zwiększeniu aktywności oksydazy cytochromu typu bo.
Lista sekwencji <110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu <130> OP1186 <141> 2000-07-05 <150> JP 2000-204252 <151> 2001-07<160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter do amplifikacji genu NDH-II (ndh-1) <400> 1 cgatggaagc ttccgcgatt atggg <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter do amplifikacji genu NDH-II genu (ndh-2) <400> 2 aagcgcggaa ttcgtccttc aatcatc
PL 206 590 B1

Claims (5)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania L-aminokwasu, w którym wykorzystuje się mikroorganizm wybrany z grupy skł adają cej się z Escherichia coli i bakterii coryneform, obejmują cy etapy, w których mikroorganizm hoduje się w pożywce w celu wytworzenia i nagromadzenia L-aminokwasu w pożywce i zbiera się L-aminokwas, znamienny tym, że mikroorganizm jest szczepem zmutowanym lub szczepem genetycznie zrekombinowanym, w którym aktywność oksydazy cytochromu typu bo, należącej do oksydaz typu SoxM, jest zwiększona w porównaniu ze szczepem niezmodyfikowanym poprzez zwiększenie liczby kopii genu kodującego oksydazę cytochromu typu bo i/lub zamianę promotora genu na silniejszy promotor.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oksydaza cytochromu typu bo jest kodowana przez operon cyo.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że pozbawia się funkcji NDH-II w mikroorganizmie przez wprowadzenie mutacji w genie kodującym NDH-II lub przez unieczynnienie tego genu.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że L-aminokwas wybrany jest z grupy obejmującej L-lizynę, L-treoninę i L-fenyloalaninę.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że E. coli hoduje się jako wybrany mikroorganizm.
    PL 206 590 B1
    Rysunki pGEM-ndh pTWV-Andh
    Fig. i
    H/msll ffinai defosforylacja ligacja
    Η!ηά\II wrażliwy na temperaturę plazmid pMAN997
    Hindll, EcoR I
    F«)R!. ///radli ligacja wrażliwy na temperaturę plazmid pTSAndh zastosowany do rozerwania ndh fragment PCR zamplifikowany ndh-1 i ndh-2 wklonowany do pGEM-T
    Stu
    0.9 Kb
    Stu I
    Stu I i Eco Rł
    Eco Rl, Stu I
    OS Kb pTWV229 i
    ▼ Ec
    Eco Rl, Sme I
    Eco Rl
    PL 206 590 B1
    Hin d III, trawienie Vsp I Hin d IH, trawienie Vsp I ligacja i [ Amp pMAN997 | ' SacI
PL348448A 2000-07-05 2001-07-04 Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu PL206590B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000204252A JP4380029B2 (ja) 2000-07-05 2000-07-05 微生物を利用した物質の製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL348448A1 PL348448A1 (en) 2002-01-14
PL206590B1 true PL206590B1 (pl) 2010-08-31

Family

ID=18701548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL348448A PL206590B1 (pl) 2000-07-05 2001-07-04 Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu

Country Status (16)

Country Link
US (2) US8586334B2 (pl)
EP (2) EP1170376B1 (pl)
JP (1) JP4380029B2 (pl)
KR (1) KR100805644B1 (pl)
CN (1) CN1280419C (pl)
AT (2) ATE442453T1 (pl)
AU (1) AU782560B2 (pl)
BR (1) BRPI0102666B1 (pl)
DE (2) DE60144205D1 (pl)
DK (2) DK2067864T3 (pl)
ES (2) ES2331601T3 (pl)
MY (1) MY127434A (pl)
PE (1) PE20020172A1 (pl)
PL (1) PL206590B1 (pl)
RU (1) RU2238325C2 (pl)
TW (1) TWI238192B (pl)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
JP2001046067A (ja) * 1999-08-04 2001-02-20 Ajinomoto Co Inc 好熱性バチルス属細菌由来のｌ−リジン生合成系遺伝子
PL341895A1 (en) * 1999-08-12 2001-02-26 Ajinomoto Kk Plasmide autonomously replicable in corynebacter bacteria
MXPA02007154A (es) * 2000-01-21 2004-09-06 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-lisina.
US7344855B2 (en) 2002-02-27 2008-03-18 Dsm Ip Assets B.V. Fermentation process
CA2501574C (en) 2002-10-04 2013-12-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the biological production of 1,3-propanediol with high yield
AU2003277276A1 (en) 2002-10-04 2004-05-04 Genencor International, Inc. Improved production of bacterial strains cross reference to related applications
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
DE10254074A1 (de) * 2002-11-19 2004-06-17 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten
JP2006517796A (ja) * 2003-02-18 2006-08-03 メタボリック エクスプローラー 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法
US7335496B2 (en) * 2003-06-05 2008-02-26 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
KR101073370B1 (ko) 2003-07-29 2011-10-17 아지노모토 가부시키가이샤 물질 생산에 영향을 미치는 대사 흐름을 결정하는 방법
FR2862068B1 (fr) * 2003-11-06 2007-10-12 Metabolic Explorer Sa Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph
JP4380305B2 (ja) * 2003-11-21 2009-12-09 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
EP1664318B1 (en) 2004-01-30 2009-09-23 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing microorganism and method for producing l-amino acid
JP4780783B2 (ja) * 2004-02-27 2011-09-28 協和発酵バイオ株式会社 アミノ酸の製造法
US7344874B2 (en) * 2004-03-04 2008-03-18 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7300776B2 (en) 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
US7482140B2 (en) * 2004-06-15 2009-01-27 Ajinomoto Co., Inc. L-tyrosine-producing bacterium and a method for producing L-tyrosine
US7205132B2 (en) * 2004-09-10 2007-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7794989B2 (en) * 2004-12-28 2010-09-14 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing L-glutamic acid
US7547531B2 (en) 2005-01-18 2009-06-16 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing microorganism which has been modified to inactive the fimH gene, and a method for producing I-amino acid
WO2006129835A1 (en) * 2005-05-30 2006-12-07 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING POLY-gamma-GLUTAMIC ACID AND MICROORGANISM USED IN THE PRODUCTION METHOD
US20070004014A1 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 Yuichiro Tsuji Method for producing l-threonine
JP2008283863A (ja) 2005-08-26 2008-11-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
JP2007185184A (ja) * 2005-12-16 2007-07-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007086618A1 (en) 2006-01-30 2007-08-02 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009095237A (ja) 2006-02-02 2009-05-07 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2009118740A (ja) * 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2007119574A2 (en) 2006-03-23 2007-10-25 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009060791A (ja) 2006-03-30 2009-03-26 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
CN101437949B (zh) * 2006-05-09 2012-08-22 三井化学株式会社 利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法
EP2025759B1 (en) * 2006-05-09 2017-06-07 Mitsui Chemicals, Inc. Method for production of glycolic acid by enhancing the synthesis of coenzyme
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
EP2046949B1 (en) * 2006-07-19 2014-01-15 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
WO2008013996A2 (en) * 2006-07-27 2008-01-31 Gevo Inc. Engineered microorganisms for increasing product yield in biotransformations, related methods and systems
US9562224B2 (en) * 2006-09-07 2017-02-07 William Marsh Rice University Reduced activity of ubiCA in E. coli
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
WO2008072761A2 (en) * 2006-12-11 2008-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing an l-amino acid
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2006145712A (ru) * 2006-12-22 2008-06-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной способностью к утилизации глицерина
WO2008090770A1 (ja) 2007-01-22 2008-07-31 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
JP2010088301A (ja) * 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2010263790A (ja) * 2007-09-04 2010-11-25 Ajinomoto Co Inc アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
RU2395579C2 (ru) * 2007-12-21 2010-07-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
EP2248906A4 (en) 2008-01-23 2012-07-11 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
JP2011167071A (ja) * 2008-05-22 2011-09-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
BRPI0918299B1 (pt) 2008-09-08 2018-08-14 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
KR101123213B1 (ko) * 2008-09-11 2012-03-19 부산대학교 산학협력단 미생물 전자전달계 및 탄소원 대사경로가 재설계된 재조합 대장균 생촉매
JP2012029565A (ja) 2008-11-27 2012-02-16 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
EP2382320B1 (en) 2009-01-23 2018-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
JP5521347B2 (ja) 2009-02-16 2014-06-11 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
RU2010101135A (ru) 2010-01-15 2011-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Бактерия семейства enterobacteriaceae - продуцент l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата, и способ получения l-аспартата или метаболитов, производных l-аспартата
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2471870C2 (ru) 2010-06-03 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА И L-ЦИТРУЛЛИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА pepA
RU2010122646A (ru) 2010-06-03 2011-12-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия генов, кодирующих транспортер лизина/аргинина/орнитина
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
JP2015013812A (ja) 2011-11-01 2015-01-22 味の素株式会社 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
WO2014185430A1 (ja) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
EP3027777A1 (en) * 2013-07-31 2016-06-08 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the recombinant production of a polypeptide in prokaryotic cells
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
RU2628696C1 (ru) 2013-10-02 2017-08-21 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения основной аминокислоты (варианты)
JP6459962B2 (ja) 2013-10-21 2019-01-30 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
EP3061828A4 (en) 2013-10-23 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
CN109121422B (zh) 2016-02-25 2021-12-21 味之素株式会社 使用过表达编码铁输出蛋白基因的肠杆菌科的细菌生产l-氨基酸的方法
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2020071538A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
BR112021011882A2 (pt) 2018-12-27 2021-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido básico
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
CN111909917B (zh) * 2019-05-10 2022-10-14 中国科学院微生物研究所 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用
JP2022550084A (ja) 2019-09-25 2022-11-30 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
EP4083064A4 (en) * 2019-12-23 2024-06-05 CJ CheilJedang Corporation MICROORGANISM FOR PRODUCING L-AMINO ACID HAVING INCREASED CYTOCHROME C ACTIVITY, AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING SAME
CN113106075B (zh) * 2021-02-25 2022-06-14 齐鲁工业大学 一种细胞色素氧化酶突变体及其应用
JP2024003706A (ja) * 2022-06-27 2024-01-15 花王株式会社 芳香族化合物の製造方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4104124A (en) * 1976-08-30 1978-08-01 Louisiana State University Foundation Process for the production of single cell protein and amino acids
DE4027453A1 (de) * 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
JP2817400B2 (ja) * 1993-10-28 1998-10-30 味の素株式会社 物質の製造法
FI980551A (fi) * 1998-03-11 1999-09-12 Valtion Teknillinen Transformoidut mikro-organismit, joilla on parannettuja ominaisuuksia
US6074830A (en) * 1998-06-09 2000-06-13 E. I. Du Pont De Nemours & Company 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase
JPH11346776A (ja) * 1998-06-11 1999-12-21 Ajinomoto Co Inc ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのシトクロムｂｄ型キノールオキシダーゼ遺伝子
US7220571B2 (en) * 2000-09-28 2007-05-22 Archer-Daniels-Midland Company Escherichia coli strains which over-produce L-threonine and processes for the production of L-threonine by fermentation
DE602004031444D1 (de) * 2003-10-21 2011-03-31 Cargill Inc Herstellung von monatin und monatinvorstufen

Also Published As

Publication number Publication date
DE60139838D1 (de) 2009-10-22
BRPI0102666B1 (pt) 2017-05-02
DE60144205D1 (de) 2011-04-21
AU782560B2 (en) 2005-08-11
ATE442453T1 (de) 2009-09-15
ES2331601T3 (es) 2010-01-11
PE20020172A1 (es) 2002-03-22
EP1170376B1 (en) 2009-09-09
US20020160461A1 (en) 2002-10-31
RU2238325C2 (ru) 2004-10-20
CN1335401A (zh) 2002-02-13
EP2067864B1 (en) 2011-03-09
US8586334B2 (en) 2013-11-19
EP2067864A1 (en) 2009-06-10
JP4380029B2 (ja) 2009-12-09
DK2067864T3 (da) 2011-06-27
PL348448A1 (en) 2002-01-14
AU5416901A (en) 2002-01-10
BR0102666A (pt) 2002-02-26
KR20020005441A (ko) 2002-01-17
DK1170376T3 (da) 2009-12-14
JP2002017363A (ja) 2002-01-22
ES2360174T3 (es) 2011-06-01
ATE501265T1 (de) 2011-03-15
TWI238192B (en) 2005-08-21
CN1280419C (zh) 2006-10-18
US20140045219A1 (en) 2014-02-13
KR100805644B1 (ko) 2008-02-26
MY127434A (en) 2006-12-29
EP1170376A1 (en) 2002-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL206590B1 (pl) Sposób wytwarzania L-aminokwasu z wykorzystaniem wybranego mikroorganizmu
JP3106501B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JP4207426B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JP4380305B2 (ja) 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
EP0811682A2 (en) Method of producing L-lysine
JP3861290B2 (ja) ストレス耐性微生物及び発酵生産物の製造法
JP2002051787A (ja) スレオニン及びイソロイシンの製造法
EP1484410A1 (en) Fermentation methods and genetically modified bacteria with increased substrate and byproduct uptake.
EP0834559B1 (en) Process for producing l-lysine by fermentation
US7163810B2 (en) Method for producing target substance
US20050106688A1 (en) Method for producing L-amino acid
WO2001005959A1 (fr) Obtention d&#39;une substance cible par un procede de fermentation
JP2000050894A (ja) 発酵生産物の製造法及びストレス耐性微生物
WO2001005979A1 (fr) Methode d&#39;elaboration d&#39;une substance cible par fermentation
BamHI S kkkk I

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
RECP Rectifications of patent specification