TWI238192B - Method for producing substance utilizing microorganism - Google Patents

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1238192 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（1 ) 本發明的背景 本發明的領域 本發明關於利用微生物生產物質的方法。在本發明中 ’微生物典型上係選自傳統上用於生產物質之屬於埃希氏 菌屬或棒形菌屬之細菌。欲製造之物質可選自那些傳統上 經由利用微生物來製造者，例如：L -胺基酸，核酸，抗 生素，維他命，生長因子，生理學上的活性物質，等。本 發明揭示在利用微生物產生物質之方法中，用來改良最終 標的物質生產力的方法。 相關枝藝的說明 許多有機體係經由呼吸作用來取得生命活動所需之能 量。在微生物的呼吸作用中，不同酵素通常係根據種類或 生長環境來作用，而能量獲得效率也有顯著變化。碳水化 合物’蛋白質及脂S矢酸係經由糖解作用，/3 -氧化作用， 等製成乙醯基-輔酶A，而在檸檬酸循環中被分解。然後 ，以NADH型式保存之能量再藉著NADH脫氫酶（ N D Η )以及接下去之由氧化還原酶所組成之電子轉移系 統的輔助，讓質子從微生物細胞排出，以藉此形成介於胞 漿膜內、外之間的質子濃度梯度。此質子濃度梯度係做爲 腺苷三磷酸酶（A Τ Ρ )合成作用的驅動力。此時，根據 N D Η和氧化還酶之組合，在電子轉移途徑之間存在著一 顯示出高質子排出力的途徑及一低質子排出力的途徑。一 般以爲，高質子排出力的途徑顯示出高能效率，而低質子 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 、1Τ -線- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -4- 1238192 A7 B7 五、發明説明（2) 排出力之途徑顯示出低能效率。因此，一種微生物係同時 含有並行之多種呼吸鏈電子轉移途徑，且那些途徑包括高 能效率及低能效率途徑。 在有氧情況中，大腸埃希氏菌之呼吸鏈中有二種 N D Η及二種終端氧化酶。也就是，在N D Η方面，已知 有局能效率之N D Η - 1 (由n u 〇操縱子所編碼）及低 能效率之N D Η - Π (由n d h所編碼）。還有，在終端 氧化酶方面，已知有①細胞色素6 0型氧化酶（由 c y 〇 A B C D操縱子所編碼），其被分類爲S ο x Μ型 (凱茲利沙納，J ·及沙洛斯提，Μ ·)生物化學的趨勢 ，科學，20 ，44 3 — 448 (1995)並顯出高會g 效率，及②細胞色素b d型氧化酶（由c y d A B編碼） ，其顯示出低能效率。雖然已知這些呼吸鏈酵素的表現量 會因對生長環境的反應而有所變化（米納喜瓦等，生物化 學期刊，265 : 11198 — 11203 (1990) ;燦，等，細菌學期刊，1 7 8 ·· 1 0 9 4 - 1 0 9 8 ( 1 9 9 6 );格林，等，分子微生物學，12 : 433 -444 (1994) ，·邦格等，分子微生物學，16 ·· 5 21-534(1995))，但目前對其表現型式的生 理意義仍有許多不淸楚的地方。 還有，在穀胺酸棒桿菌中已肯定有一種細胞色b c 1 複合物，並且至少有二種終端氧化酶：S ο X Μ型氧化酶 及細胞色素b d型氧化酶的存在（關於代謝工程之第二次 座談會’演講摘要，1 9 9 9 )。這顯示從醌池至氧分子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~----i——— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5- 1238192 A 7 __B7__ 五、發明説明（3) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的電子轉移途徑包括二種途徑：一種利用細胞色素b c 1 複合物及S ο x Μ型氧化酶的途徑及一種僅利用細胞色素 b d型氧化酶的途徑。前者被認爲是種高能效率的電子轉 移途徑，其中之轉移-電子的質子轉移値爲高轉移値，而 後者是種低能效率的電子轉移途徑，其中之轉移一電子的 質子轉移値爲低轉移値。 在大腸埃希氏菌之終端氧化酶方面，若培養養所產生 的爲僅具細胞色素b 〇型氧化酶之突變種的有氧培養時， 當將僅具細胞色素b d型氧化酶的變種與具有二種細胞色 素氧化酶的野生種相比較時，則發現，僅具細胞色素b d 型氧化酶之變種的生長量最低，且此係取決於終端氧化酶 之種類和能量獲得效率（日本發酵及生物工程學會年會， .演講摘要，第3 5 7號）。 還有，缺乏某些呼吸鏈酵素之變種的能量效率報導於 (卡豪，等，細菌學期刊，175:3020-3925 (1 9 9 3 ))中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然而，經由擴增該提供高效率之呼吸鏈基因（如：那 些編碼N D Η - I和S ο X Μ型氧化酶之基因）並沒有關 於能量效率改變的發現，且亦不曾知道要嚐試利用它來製 造物質。還有，也未曾有利用低效率呼吸鏈酵素之缺失（ 如：N D Η - Π及細胞色素b d型氧化酶）來製造物質的 嚐試。 本發明的摘述 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -6- 1238192 Α7 Β7 五、發明説明（4) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 活體內在生物合成物質（如：L -胺基酸和核酸）時 需要能量。那時所使用的大部分能量係由N A D Η，N A D Ρ Η ’等之還原力，以及以a τ P型式保存之能量所組 成。因此，本發明者構想出：若在利用微生製造標的物質 的方法中能增加製造標的物質時所使用之能量的供應，則 可增加標的物質的製造量。根據此觀念，本發明的目的係 建構一具改良之能量效率的微生物並提供一利用其來製造 標的物質的方法。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明者設想一能增加能量供應之微生物可藉由加強 一顯示出高能獲得效率之呼吸鏈途徑或使一顯示低能量獲 得效率之呼吸鏈缺乏來建構。明確地說，在大腸埃希氏菌 方面，被認爲具改良之能量效率的菌株可經由擴增編碼細 胞色素b 〇型氧化酶（此爲一種高能效率之呼吸鏈酵素） 的基因來製備，或亦可經由刪除一編碼N D Η - Π (此爲 一種低能效率之呼吸鏈酵素）的基因來製造。然後，經由 利用它們來製造L -胺基酸，結果發現：在其能量效率經 過改良的菌株中，其L -胺基酸的產量亦增加。因此，本 發明達成。 也就是，本發明提供下述者。 (1 ) 一種利用微生物生產標的物質的方法，其包含 將微生物培養在介質中，並在介質中累積該標的物質，並 收集該標的物質，其中該微生物係從具有高能效率之呼吸 鏈途徑及低能效率之呼吸鏈途徑爲其呼吸鏈途徑的母微生 物菌株中建構出來，且該微生物係一種具有下列之一或二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -7- 1238192 A7 一 —_ B7 五、發明説明（5) 種特性的變種或基因重組菌株： (A )該高能效率之呼吸鏈途徑被增強， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (B )該低能效率之呼吸鏈途徑缺乏。 (2 )如第（1 )項之生產標的物質的方法，其中該 高能效率呼吸鏈途徑係經由將一編碼牽涉到該呼吸鏈之酵 素的基因複製數增加或改良該基因之表現調節序列來增強 〇 (3 )如第（1 )或（2 )項之用於生產標的物質的 方法’其中該低能效率之呼吸鏈途徑係經由將一編碼牽涉 到該呼吸鏈之酵素的基因瓦解來刪除。 (4 )如第（1 )至（3 )項中之任一項用於生產標 的物質的方法，其中該高能效率呼吸鏈之酵素包括 S ο χΜ型氧化酶，b c 1複合物，NDH - 1或其中之 二或三種。 (5 )如第（1 )至（4 )項中之任一項用於生產標 的物質的方法，其中該低能效率呼吸鏈之酵素包括：細胞 色素b d型氧化酶，NDH — Π或此二者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (6 )如（1 )至（5 )項中之任一項用於生產標的 物質的方法，其中S ο X Μ型氧化酶之活性經過增強，且 在該微生中之NDH-Π被刪除。 (7 )如第（1 )至（6 )項中之任一項用於生產標 的物質的方法，其中該S ο X Μ型氧化酶係細胞色素b 〇 型氧化酶。 (8 )如第（1 )至（7 )項中之任一項用於生產標 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -8- 1238192 A7 _ B7 五、發明説明（6) 的物質的方法，其中該微生物係屬於埃希氏菌或棒形菌屬 的細菌。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (9 )如第（1 )至（8 )項中之任一項用於生產標 的物質的方法，其中該標的物質係L -胺基酸或核酸。 根據本發明，在利用微生物來生產標的物質的方法中 包含了下列步驟：將微生物培養在介質中以生產並累積標 的物質，該標的物質之生產力可根據不同於傳統策略之原 則來改良。 圖形的簡單說明 第1圖示爲用於製造NDH-Π基因被瓦解之菌株的 質體pTS - Ληο!!!之構造。 第二圖示爲ΡΜΑΝ997之構造。 本發明之詳細說明 本發明將詳細說明於下。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 由本發明之生產方法所生產之物質並無特別限制，只 要其爲可由微生物製造之物質。其實例包括，如：不同之 L 一胺基酸，如：L 一蘇胺酸，L 一賴胺酸，L 一榖胺酸 ，L 一白胺酸，L —異白胺酸，L —纈胺酸及L 一苯丙胺 酸；核酸，如：鳥苷酸及肌苷酸；維他命；抗生素；生長 因子）；生理學上之活性物質，等。 用於本發明之微生物是種具有能生產上述標的物質之 能力的微生物，其係從一種具有高能效率之呼吸鏈途徑及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -9- 1238192 Α7 Β7 五、發明説明（7) 低能效率之呼吸鏈途徑爲其呼吸鏈途徑之母菌株建構而來 ’其具有下列之一或二種特性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A )該高能效率之呼吸鏈途徑被增強， (B )該低能效率之呼吸鏈途徑缺乏。 一般而言，包括大腸埃希氏菌及棒形菌在內的微生物 同時含有多種並行之呼吸鏈電子轉移途徑，包括那些具有 每電子高質子轉移値及低質子轉移値者。例如，在大腸埃 希氏菌中，在NADH電子供應者方面，有NDH I及 NDHn做爲NADH脫氫酶來催化質子從NADH轉移 至醌池。在這些中，N D Η I顯示出高能效率，而 N D Η Π顯示低能效率。也就是，N D Η Π所顯示出之以 一電子可排出之質子分子數（質子轉移値）爲〇，然而 N D Η I之質子轉移値則被認爲係2。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在本發明中，這類顯出如上述之每電子高質子轉移値 之途徑，亦即，高能效率之呼吸鏈途徑，被增強，而低能 效率之呼吸鏈途徑則被去除。該高能效率之呼吸鏈途徑可 經由增強牽涉到呼吸鏈途徑之酵素的活性.來增強。該低能 效率途徑可經由降低或排除牽涉到呼吸鏈途徑之呼吸鏈酵 素的活性來去除。 該牽涉到呼吸鏈途徑之呼吸鏈酵素並無特別限制，只 要其爲一構成呼吸鏈途徑之酵素。明確地說，其實例包括 催化電子從電子供應者轉移至醌池（如：泛醌，二甲基萘 醌及萘醌）之脫氫酶，以及催化電子從醌池轉移至電子供 應者之氧化酶。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -10- 1238192 A7 B7 五、發明説明（8) 可催化經由將電子從酿池轉移來製造水分子之反應的 氧化酶被歸納爲S ο X Μ型（b 〇型）及b d型。該b 0 型之電子轉移値爲2，然而bd型者爲1。因此，該bo 型顯出較高之能量效率。 在本發明中，用於能量效率之、高〃及、\低〃等詞並 無絕對意義，但它們用來表示如上述之相關槪念。 以下說明加強高能效率之呼吸鏈酵素活性的方法，以 及排除低能效率呼吸鏈酵素活性的方法。 例如：爲了加強高能效率呼吸鏈酵素之活性，可藉著 下述方法來製備重組之D N A :以一在微生物細胞中作用 之介體（以一種多組複製型介體較佳）來連接一編碼該酵 素的基因片段，並將其引入微生物中以將細胞轉化。在轉 化株細胞中之編碼該酵素的基因複製數可藉此增加，因而 擴大該酵素活性。此步驟將藉由示範編碼細胞色素b 0型 氧化酶之高能效呼吸鏈酵素的基因一 C y 〇操縱子（ cyoABCDE)說明於下。 大腸埃希氏菌之c y 〇操縱子的序列已有報告（夏普 利等，之生物化學期刊，2 6 5 : 1 1 1 8 5 -1 1 1 9 2 ( 1 9 9 0 ))，因此，該操縱子可根據此序 列來選殖。也可使用屬於埃希氏菌屬之細菌基因或衍生自 其它有機體（如：棒形菌）之基因來做爲C y 〇操縱子。 例如，能在大腸埃希氏菌細胞中自主複製之質體即可 用來做爲用於基因選殖及將基因引入微生物之介體。其特 殊實例包括 PUC19，pUC18，PBR322， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------.——^#—^1 — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -11 - 1238192 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（9) pHSG299，PHSG298，PHSG399， PHSG398，RSF101〇，PSTV29 ;等。 在將基因引入棒形菌方面，能在棒形菌及大腸埃希氏菌中 自主複製之運輸介體爲較佳者。能在棒形菌內自主複製之 質體實例列於下。 P A Μ 3 3 0 (比較日本專利未審查刊物（日本專利 公開公報）號5 8 — 6 7 6 9 9 ) Ρ Η Μ 1 5 1 9 (比較日本專利未審查刊物號5 8〜 7 7 8 9 5 ) P A J 6 5 5 (比較日本專利未審查刊物5 8 -1 9 2 9 0 0 ) P A J 6 1 1 (比較日本專利未審查刊物5 8 -1 9 2 9 0 0 ) P A J 1 8 4 4 (比較日本專利未審查刊物號5 8〜 1 9 2 9 0 0 ) P c G 1 (比較日本專利未審查刊物號5 7 -1 3 4 5 0 0 ) P c G 2 (比較日本專利未審查刊物號5 8 -3 5 1 9 7 ) P C G 4 (比較日本專利未審查刊物號5 7 -1 8 3 7 9 9 ) P C G 1 1 (比較日本專利未審查刊物號5 7 -1 8 3 7 9 9 ) Ρ Η K 4 (比較日本專利未審查刊物號5 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X：297公釐） -------- - 裝 „ 訂 . (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} -12- 1238192 A7 B7 五、發明説明（ 7 4 9 1) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了連接含c y 〇操縱子之D N A片段及介體以形成 重組D N A，首先以適合c y ◦操縱子終端之限制酶來分 解介體。連接作用通常係利用如T 4 D N A連接酶之類 的連接酶來進行。 爲了將依上述製備之重組D N A引入微生物內，可使 用任何已知之轉化方法。例如，可使用已報導過之適用於 大腸埃希氏菌K - 1 2的方法，此方法係以氯化鈣來處理 接受者細胞以增加D N A之通透性（曼度，Μ _及希嘉， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A ·，分子生物學期刊，5 3 ，1 5 9 ( 1 9 7 ◦)); 及已導過之適用於枯草枯菌的方法，此方法係從處於生長 相之細胞製備 '勝任細胞〃，再將D N A引入其中（唐肯 ，C.H.，威爾森，G.A·及揚，F.E. ，基因1 ’1 5 3 ( 1 9 7 7 ))。除了這些，還可使用適用枯草 桿菌，放射桿菌及酵母菌之方法，此方法係將D N A —接 受者細胞製成原生質體或原生質球，此種質體或質球可容 易地取得重組D N A，然後，再將該重組D N A引入細胞 中（張，S.及可安，S.N.，Molec. Gen. Genet.，1 6 8， 111 ( 1 9 7 9 );畢伯，Μ. J.，瓦德，J. Μ.和赫伍，Ο. A.，自然，274，398(1978);希南，A.，希 克斯，J.B·和芬克，G.R.，Proc. Natl. Sci.，USA，7 5， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8 1 ))。棒形菌之轉化作用可經由電 脈衝法來達成（見日本專利未審刊物號2 - 2 0 7 7 9 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -13- 1238192 A7 B7 五、發明説明（11) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞色素b 〇型氧化酶活性之擴增也可藉由讓宿主染 色體D N A上有c y 〇操縱子之多倍複製體存在來達成。 爲了將c y 〇操縱子之多倍複製體引入微生物（如：屬於 $矢希氏菌屬和棒形菌屬者）之染色體DN A中，利用一種 其多重複製物存在於染色體D N A中之序列來做爲標的以 進行同源重組。存在於轉化子終端之重覆D N A，或倒轉 重複部分可用來做爲其多重複製物存在於染色體D NA中 之序列。還有，如日本專利未審刊物號2 - 1 0 9 9 8 5 中所揭7^的’也可將c y 〇操縱子併入轉位子中，並使其 轉移以將c y 〇操縱子之多重複製物引入染色體DNA中 。藉由任一方法皆可增加轉化株細胞內之c y 〇操縱子的 複製數，結果，可增強細胞色素b 0型氧化酶活性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 細胞色素b 〇型氧化酶之活性增強作用除了根據前述 之基因擴增作用來增強外，也可經由以一較強者來替代 c y 〇操縱子之表現調節序列來達成（見日本專利未審刊 物號1 一 2 1 5 2 8 0 )。例如：已知1 a c啓動子， 七1*5啓動子，丨1*(：啓動子，13(：啓動子。入噬菌體 之Pr啓動子及Pl啓動子，還有t e t啓動子，amyE 啓動子’等爲強啓動子。這些啓動子之取代作甩可加強 c y 〇啓動子之表現，並因此而加強細胞色素b 〇型氧化 酶之活性。表現調節序列之增強作用可與增加c y 〇操縱 子之複製數聯合一起。 高能呼吸鏈酵素活性的增強作用亦可經由引入如下述 這類突變來取得：該酵素之胞內活性係經由一微生物之致 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - 1238192 A7 _ B7 五、發明説明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 變處理來增加。這類突變之實例包括：編碼區發生突變而 增加酵素之特殊活性，表現調節序列中發生突變而增加基 因表現量，等。可提出之致變處理的方法有··經由紫外線 照射之處理的方法，或以常用於突變處理之致變處理劑（ 如：N —甲基一 N / —硝基一 N —亞硝基胍（N T G )和 亞硝酸）處理。 爲了減低或排除低能效率呼吸鏈之活性，將突變引人 酵素基因內，以使酵素之胞內活性減低或排除，或者，該 微生物之染色體上的基因被瓦解以致於該基因無法正常作 用。以下，藉著示範編碼N D Η — Π之n d h (此爲一低 能效率呼吸鏈基因）來說明瓦解n d h基因的方法。 大腸埃希氏菌之n d h序列已有報告（揚等，歐洲生 .化學期刊，1 1 6 : 1 6 5 — 1 7 0 ( 1 9 8 1 ))，因 此’該基因可根據此序列來選殖。也可使用屬於埃希氏菌 屬細菌之基因，或從其它有機體，如：棒形菌，衍生得來 之基因，如：ndh基因。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在染色體上之n d h基因可藉著含有經過修改之帶內 部缺失的n d h基因（如此將無法功能正常地產生N D Η - Π，稱爲缺失型n d h基因）來轉化微生物，並使該缺 失型n d h基因與染色體上之n d h基因間發生重組，因 而將在染色體上之n d h基因瓦解。這類以同源重組法來 瓦解基因的方法早已建立好，而有些方法係利用線形 D N A，一種含溫度敏感性之複製控制區的質體，等來進 行的。本發明中，較全適的方法爲該種利用含有溫度敏感 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -15- 1238192 A7 B7 五、發明説明（ 个生複製控制區之質體的方法。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在宿主染色體上之n d h基因可以依下述方法以缺失 型n d h基因來取代。也就是，先經由插入一溫度敏感性 複製控制區，缺失型n d h基因及與藥物抗性相關之標記 基因來備重組D N A，再以該重組D N A來轉化微生物。 還有，將所產生之轉化株培養在使溫度敏感性複製控制區 不會作用之溫度下，然後，可將轉化株培養在含有藥物之 介質中，以取得那些在其染色體DNA中有重組DNA嵌 入的轉化株。 在這類其染色體D NA中有重組D NA嵌入其中之菌 種中’該缺失型n d h基因係與原本存在該染色體上之 n d h基因重組，當將該二個染色體n d h基因及缺失型 n d h基因的并合基因，插入染色體中時需讓該重組 ϋ N A之其餘部分（介體節段，溫度敏感性複製控制區及 藥物抗性標記）存在於此二倂合基因之間。因此，該轉化 株會表現N D Η - Π，因爲在此狀態中，正常n d h基因 爲顯性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然後，爲了僅將缺失型n d h基因留在染色體上，可 將二個n d h基因重組，以將一複製的n d h基因與介體 節段（包括溫度敏感性複製控制區及藥物抗性記號）從染 色體上一起排.除。在該種情況中，正常n d h基因留在染 色體DNA上，而缺失型n d h基因則從染色體DNA被 切除’或是’相反的，該缺失型n d h基因留在染色體 D N A上，而正常^ d h基因則從染色體D N A被切除。 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1238192 A7 _____B7 _ __ 五、發明説明（14 在二種情況中，當將細胞培養在該溫度敏感性複製控制區 已可作用的溫度下時，該被切除之D N A可以以質體的型 式保留在細胞內。接著，將細胞培養在該溫度敏感性複製 控制區不能作用的溫度下以脫離質體D N A，如此可取得 ndh基因缺失變種。 在大腸埃希氏菌方面，具溫度敏感性複製已之介體的 實例包括，例如：說明於國際專利刊物W〇9 9 / 03988中之質體pMAN997，等，而在棒形菌方 面，具溫度敏感性複製源之介體的實例包括，如：揭示於 日本專利未審刊物號5 — 749 1中之質體PHSC4， 等。然而，質體並不限於這些，且其它介體也可使用。 依上述方法所得之這類微生物的特殊實例包括：其 S ο X Μ型氧化酶或N D Η — I ，或此二者被增強的微生 物，其細胞色素b d型氧化酶或N D Η — Π之活性或此二 者之活性被減弱或排除的微生物，及其S ο X Μ型氧化酶 或N D Η - I ，或此二者被增強，且細胞色素b d型氧化 酶或N D Η - Π之活性，或此二者之活性被減低或排除之 微生物。更明確地說，可提出的有，例如：其S ο X Μ型 氧化酶之活被增強，且缺乏之N D Η - Π之大腸埃希氏菌 。S ο X Μ型氧化酶之實例包括細胞色素b 〇型氧化酶。 用於本發明之微生物並無特別限制只要其具上述之性 質’而其實例包括下列菌種：屬於埃希氏菌屬者，如：大 腸埃希氏菌，棒形菌，如：發酵乳短桿菌（Brevibacterium lactofermentum )(榖胺酸棒桿菌），桿菌，如：枯草桿 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ -17- —----.——壯衣—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1238192 A7 B7 五、發明説明（1弓 菌，沙雷菌，如：黏質沙雷菌，酵母菌，如：啤酒釀母菌 ，等。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 當發酵產品是L -蘇胺酸時，可特別提出的是大腸埃 希氏菌VKPMB—3996(RIA 1867)(參 考美國專利案5 ，1 7 5 ，1 0 7 )，嗜乙醯乙酸棒桿菌 AJ 12318 (FERM BP — 1172)(參考美 國專利號5，1 8 8，9 4 9 )等；在賴胺酸方面，可提 出的有：大腸埃希氏菌AJ11422(NRRL B— 12185，FERM BP — 1543)(參考美國專 利號4，346 ，170)，大腸埃希氏菌W3110 ( t y r A )(此菌種係經由將質體p H A T e r m從大腸 埃希氏菌W3110 (tyrA)/pHATerm( TERM B P — 3 6 5 3 )排除來取得，參考國際專利 刊物W Ο 9 5 / 1 6 0 4 2 )，發酵乳短桿菌 AJ12435 (FERM BP—2294)(美國專 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 利號5 ，3〇4 ，4 7 6 )，發酵乳短桿菌A J 3 9 9 0 (ATCC31269)(參考美國專利號 4 ’ 066 ，501)等；在L —榖胺酸方面，可提出的 有：大腸埃希氏菌AJ 12624 (FERM BP — 3 8 5 3 )(參考法國專利未審刊物號 2’680’178)，發酵乳短桿菌AJ12821) FERM BP - 4172)(日本專利未審刊物號5 — 2 6 8 1 1 ，法國專利未審刊物號2，7 0 1 ，4 8 9 ) ’發酵乳短桿菌AJ12475(FERM BP- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（21〇χ 297公釐） -18- 1238192 A/ B7 五、發明説明（1与 2 9 2 2 )(參考美國專利辦ς 不」號5 ’272，067)，發酵乳短桿菌AJ13〇29 9 ( F E R μ BP- 5189 H參考國際專利申請案JP95…586)等；在 L—白胺酸方面，可提出的有：大腸埃希氏菌 5 2 7 4 )(參考日本 3 4 3 9 7 )，發酵乳短桿 p〜2516)(參考美國 專利號397〇519)等；在異白胺酸方 AJ11478 (FERm P 專利刊物（Kokoku)號6 2〜3 菌 AJ3718 (FERm 面，到提出的 (VKPM B — 4781 )(參考歐洲專利未審刊物號5工9，i i 3)，黃色短 桿菌 AJ1214 9(FERm bp — 759)(參考 美國專利號4 ’ 6 5 6 ’ 1 3 5 )等；在[—纈胺酸方面 ，可提出的爲大腸埃希氏菌v L 1 9 7 〇 ( V κ p M B 一 4 4 1 1 )(參考歐洲專利未審刊物號5 1 9，r 3 )’發酵乳短桿囷AJ 12341 (FERM BP — 1763)(參考美國專利號5，188，948) 有：大腸埃希氏菌K X 1 4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ;在L -苯丙胺酸方面，可提出的有：大腸埃希氏菌 AJ 126 0 4 (FERM BP-3579 )( 利未審刊物號5 - 2 3 6 9 4 7，歐洲專利未審刊物 488 ’ 424)，發酵乳短桿菌AJ 12637 ( FERM BP-4160)(參考法國專利未審 2，686，898)，等。 在用於本發明之微生物中，根據標的物質，可 涉到該標的物質之生物合成作用之酵素的活性。還 )，等 曰本專 號 刊物號 增強牽 有，可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19 1238192 Α7 Β7 五、發明説明（1乃 以將對生產標的物質不利的酵素之活性降低或排除。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 標的物質可經由下述方法取得：將這類微生物依上述 方法培養於介質中來生產並累積該標的物質，再從介質中 收集之。 用於製造標的物質之介質可根據欲使用之微生物，從 傳統使用之知名介質中篩選出來。也就是，如需要時，介 質可以是種含碳源、氮源、無機離子、及其它有機成分之 平常介質。進行本發明時不需要任何特殊介質。 在碳源方面，可使用下列物質做爲來源；糖類，如： 葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或澱粉水解產物）；醇類， 如：甘油或山梨糖醇；有機酸類，如：富馬酸、檸檬酸或 琥珀酸，等。 在氮源方面，可使用下列物質做爲來源，無機銨鹽類， 如：硫酸銨，氯化銨或磷酸鏡；有機氮，如：大豆水解產 物；氨氣；水溶性氨，等。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 最好能讓所需物質，如：維他命B i，L -高絲胺酸及 L -酪胺酸或酵母萃取物以適當量含於其中做爲有機微量 養分。除了上述物質，如需要時，可少量加入磷酸鉀、硫 酸鎂、鐵離子、鎂離子，等。 培養作用可根據所使用之微生物，在所篩選出之傳統 所熟知的條件下進行。例如，培養最好是在有氧條件下進 行1 6 - 1 2 0小時。培養進行時，培養溫度最好控制在 2 5 °C至4 5 °C之間，且p Η値最好控制在5 — 8之間。 調整Ρ Η値時可使用無機或有機，酸性或鹼性物質以及氨 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -20- 1238192 Α7 Β7 五、發明説明（1弓 氣，等。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) %養後，要從介質中收集代謝產物時，本發明並不需 要任何特別的方法。也就是，本發明可利用傳統上所熟知 之離子交換技術，沈澱技術及其他技術的組合來進行。 進行本發明的最好樽$ 以下，本發明將參考下列實例做更詳細的解說。 :細胞色素6 〇型氧化酶某因的潠殖 編碼大腸埃希氏菌細胞色素b 〇型氧化酶之c y 〇操 縱子（c y oABCDE)序列已有報告（契普利等，生 物化學期刊，2 6 5 ·· 1 1 1 8 5 - 1 1 1 9 2 ( 19 9 0))，因此，操縱子之選殖係根據此序列。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 明確地說，標的c y 〇操縱子基因係從含該c y 〇操 縱子之可哈洛（可哈洛，等，細胞，5 0 : 4 9 5 - 5 0 8 (1987))噬菌體集合庫取得。噬菌體DNA係從 含該操縱子之、、可哈若〃噬菌體克隆1 4 7 〔 2 Η 5〕， 利用威惹（Wizard)又製品（Promega)取得。以P s h Β I來分解所取得之噬菌體D N A 1 4 7 〔 2 Η 5〕，將所 取得之含c y 〇操縱子的5 . 5 k b片段二端鈍化，再將 其插入pMWl 1 9 (Nippon基因）的Sma I位置中， 以選殖該含一啓動因子區之c y 〇操縱子。在所得之質體 中，該c y 〇操縱子係插在與p M W 1 1 9上乳糖操縱子 啓動因子相反的方向中。此質體定名爲pMM (CYO) Β 〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -21 - 1238192 Α7 Β7 五、發明説明（均 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將質體p M W ( c Y〇）B引入大腸埃希氏 W 3 1 1 0菌株（從國家遺傳學會’曰本 Shizuoka， M i s h i a m，取得）中以得到W 3 1 1 0 / pMW (CY〇）B 。存在於W3 1 1 ◦和W3 1 1 0/ p M W ( C Y〇）B菌株之細胞萃取物的泛醇氧化酶活性 可利用已知之方法（吉塔等，生物化學期刊’ 2 5 9 : 3368-3374 (1984))，以終端氧化酶活性 來測量。結果顯示於表1中。 表1 :泛醇氧化酶活性 菌株 泛醇氧化酶活性 (毫莫耳/分/毫克蛋白質） W3110/pMW19 0.28 W3110/pMW(CY〇）B 0 . 5 6

結果發現，如表1中所示，引入P M W ( C Y 0 ) B 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 之菌株中的終端氧化酶活性被增強。此增強之終端氧化酶 活性被認爲係經由增強c y 〇操縱子來使細胞色素b 〇型 氧化酶活性增加而造成的。 實例2 : N D Η - Π缺失菌株的取得 爲了製造N D Η - Π缺失菌株，先製備一經內部切開 之N D Η Π部分序列（分裂型N D Η - Π基因）。根據已 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） ' "~' -22- 1238192 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2() 知之編碼大腸埃希氏菌N D Η - π的基因n d h序列來選 殖N D Η - Π的部分序列（揚等，歐洲生化學期刊， 116:165 - 170(1981)) ° 明確地說，依下述來製備分裂型NDH - Π基因（第 1圖），首先，經由P C R，利用n d h — 1 ( S E Q ID N〇：l)和ndh — 2(SEQ ID N〇： 2 )做爲引物，來擴增約2 . 4 b之含N D H - Π部分序 列的D N A片段。將此片段選殖入p g E M - T介體（ Promega )中以得到p G Ε Μ — n d h。以限制酶 Ec oRI和S t u I來分解pGEM—ndh，收集所 得之0.5 1^1)片段並連接至以£(：〇1^1和81113 1分 解過之 PTWV229 ( Takara Shuzo )以取得 p T W V — n d h 〇 然後，以限制酶S t u I分解p G E M - n d h，收 集所得之0 · 9 kb DNA片段並將其插入pTWV -n d h的H i n c Π位置。如此，可取得 pTWVAn d h，此 pTWVAn d h 含有一部分 pTWV2 2 9之多一選殖位置在n d h的部分序列中。

在含該n d h序列之質體pTWVAn d h中，將一 衍生自P T W V 2 2 9之1 7 b p序列插入該n d h序列 中的S t u I位置處。隨後，將一經由利用H i n d m和 EcoRI分解pTWVAndh後所得之1·5kb片 段插入該溫度敏感性質體P M A N 9 9 7 (參考國際專利 刊物 W 〇 9 9 / 〇 3 9 8 8 )之 H i n d m 和 E c o R I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐοχ297公釐） I ， 裝 ^ 訂 . (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -23- 1238192 A7 B7 五、發明説明（21) 位置中間，以取得P T S - △ n d h。利用P T s — (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) △ n d η之溫度敏感性（Matuyama等，細菌學期刊， 162:1196(1985))，藉由一般同源重組技 術，在此質體P T S - △ n d h和W 3 1 1 0菌株之 n d h基因組間進行同源重組以取得不會表現正常N D Η 一 Π蛋白質的W3110 (ndh)菌株，因爲該從 PTWV229衍生得來之17bp序列係插入基因組上 的n d h編碼區中。來自W 3 1 1 0 ( t y r A )之 t y r A缺失係藉由P 1轉導作用引入W 3 1 1 Ο ( n d h )菌株中，利用四環素抗性做爲標記來取得W 3110 (ndh， tyrA)菌株。 前述之p M A N 9 9 7係經由將p M A N Ο 3 1 (細 菌學期刊，1 6 2，1 1 9 6 ( 1 9 8 5 ))和 p U C 1 9 ( Takara Shuzo)之 V s p I — H i n d H[片 段進交換來取得（第2圖）。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 還有，雖然W 3 1 1 〇 ( t y r A )在歐洲利未審刊 物號4 8 8 4 2 4 / 1 9 9 2中有詳細說明，但其製備方 法將簡單解說於下。 大腸埃希氏菌3 1 1 〇菌株係從國家遺傳學會取得（ Mishima, Shizuoka)。將此菌株接種在含鏈黴素之L B盤 上，篩選出形成克隆的菌株以取得抗鏈黴素菌株。將篩選 出之抗鏈黴素菌株與大腸埃希氏菌K - 1 2 ME 8 4 2 4菌株混合一起，並在3 7 °C下，完整的介質 (L —肉湯：1%貝克多（Bacto )胰蛋白腺，〇 _ 5 %酵 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ 210X297公釐） -24 - 1238192 A7 五、發明説明（勾 母年取物’ 〇 · 5 % N a C 1 )中，以闽& +丄巷 ;ψ 以固疋培養的型式培 養1 5分以誘發接合作用。大腸埃希氏菌]^一1 2 Μ Ε 8424菌株具有（Hfrp〇45，thi， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) relA1，tyrA：:Tnl〇?Ung-i， n a d B )之遺傳特性，而其可自國家遺傳學會取得。然 後，將培養接種於含鏈黴素，四環素及L 一酪胺酸之完整 介質（L —肉湯：1%貝克多胰蛋白腺，〇 , 5%酵母萃 取物，〇 · 5 % N a C 1 ，]_ . 5 %瓊脂）中，並篩選出 形成克隆的菌株。此菌株命名爲大腸埃希氏菌（ W3110(tyrA)菌株。 歐洲專利未審刊物號4 8 8 4 2 4 / 1 9 9 2中揭示 了 §午多經由將質體引入上述菌株中所取得之菌株。例如， 經由引入質體p H A T e r m所取得之菌株稱爲大腸埃希 氏菌W3110 (tyrA)/pHATerm，其於 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 9 9 1年1 1月1 6日存放於國際貿易及工業部，工業 科學及技術處，國家生物科學及人類技術學會（日本， Ibaraki-ken，Tsukuba-shi，1-3 Higashi l-Chome，郵遞區號 :3 0 5 )(目前是獨立的行政團體，國家進階工業科學 及技術學會，國際專利有機體存放處（日本，Ibaraki-ken， Tsukuba-shi5 1-1 Higashi l-Chome5 Chuo Dai-6，郵遞區號 :3 0 5 - 5 4 6 6 ))，此爲布達佩斯條約規定下之國 際貯存處，同意號碼爲F E R Μ Β Ρ - 3 6 5 3。經由 傳統方法將質體p H A T e r m從上述菌株中排除可取得 大腸埃希氏菌W3 1 1 〇 ( t y rA)菌株。 本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210x297公釐） -25- 1238192 A7 B7 五、發明説明（θ 實例3 : L -賴胺酸之生產 將在實例1中所取得之質體p M W ( C Y〇）B引入 W 3 1 1 0 ( t y r A )菌株，以及在實例2中所取得之 W3110 (ndh， tyrA)菌株中以各得到 W3110 (tyrA)/pMW(CY〇）B及 W3110 (ndh，tyrA)/pMW(CY〇）B 。類似地，將 P M W 1 1 9 引入 W 3 1 1 Ο ( t y r A )

中以取得W3110 (tyrA)/pMW119 菌株。 經由在培養瓶中之培養來評估這些W 3 1 1 Ο ( t y r A )/pMW(CY〇）B菌株，W3110(ndh， t y r A ) / p M W ( C Y〇）B菌株及做爲對照組之 W3110 (tyrA)/pMW119 的 L —賴胺酸生 產力。在3 7 °C下，利用具下列組成物之介質進行培養 2 4至4 8小時，並一邊攪動，結果顯示於表2中。 I . 裝 „ 訂 · I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (介質組成物） 葡萄糖 MgS04 · 7H2〇 KH2P〇4 FeS04 · 7H2〇 MnS〇4 · 5H2〇 酵母萃取物（狄夫可，Ditco

L 酪胺酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 40克/升 1克/升 1克/升 0.01克/升 0.01克/升 2克/升 0.1克/升或0.05克/升 -26- 1238192 A7 ______ B7 五、發明説明（24 以KOH將介質調整爲pH7 . 〇 ，並在1 1 5°C下 ，壓熱ίο分鐘。然而，葡萄糖及MgS〇4· 7h2 ◦係 經分開滅囷。遠有，在培養前，將已在1 8 〇 〇c下經乾燥 滅菌之根據日本藥典的C a C〇3 3 0克/升和1 0 ◦微 克/升之抗生素’安苄青黴素，加入介質中。 ·· L -賴胺酸製造量 菌株 L 一賴胺酸（克/升） _ W3110 ( tyrA) /pMWl9 0.29 一 W3110(tyrA)/pMW(CY〇）B 0.48 _ W3110(ndh, 0.53 tyrA)/pMW(CY〇） 結果發現經由增強細胞色素b 0型氧化酶活性可改良 製造L -賴胺酸之大腸埃希氏菌的L -賴胺酸生產力。這 被認爲係由於高能效率之呼吸鏈途徑被增強因而改良能量 獲得效率，而此能量係用於生產L -賴胺酸，這使得L -賴胺酸的產量增加。 結果發現經由刪除N D Η - Π可改良生產L 一賴胺酸 之大腸埃希氏菌的L -賴胺酸生產力。這被認爲係由於低 能效率呼吸鏈途徑有缺失，因而改良了能量獲得效率’而 此能量係用於生產L -賴胺酸，這使得L 一賴胺酸的產量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） m · 111 —^m i-···-··^ —ϋ·^— ΛΜΜββββ —Βϋϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -27- 1238192 A7 B7 五、發明説明（2弓 增力D。 鬣過4 : L 一蘇胺S#之生產 將由即述方法所取得之質體p M w ( C Y〇）B引入 製造L 一穌胺酸的細菌’大腸埃希氏菌ν κ ρ μ Β -3 9 9 6 ( R I Α 1867 )中（參考美國專利號 5 ，工75 ，1〇7，以下稱爲、、B — 菌株） 中’以取得B — 3996/pMW(CY〇）B鏈。此B 一3996鏈中帶有質體？又1〇40(國際專利刊物 W 0 9 0 / 0 4 6 3 6 )，其係經由將蘇胺酸操縱子插入 一含有鏈黴素抗性標記之廣宿主一範圍介體質體P a Y C 32中來取得（參考奇斯托洛達失，a.Y.，柴甘可夫 ，Y.D.，質體，1986， 16， 161—167) 。該B - 3 9 9 6鏈存放於U S S R抗生素硏究學會（ V N I I A )中，登記號碼R ! a 1 8 6 7。 經由將p M W 1 1 9引入B — 3 9 9 6中來取得做爲 對照組之Β - 3 9 9 6 / p M W 1 1 9。經由在培養瓶中 進行培養來評估這些Β - 3 9 9 6/pMW ( CYO) Β 及B - 3 9 9 6/pMWl 1 9之L 一蘇胺酸製造力。培 養係利用具有表3中所列之組成物的介質，在3 7 °C下進 行3 8小時，並一邊於1 1 4 一 1 1 6 r p m攪拌。將表 3中之成分A，成分B和成分C分開製備及殺菌，然後， 將其冷卻並以1 6/2 0體積之成分A，4/2 0體積之 成分B及3 0克/升之成分C的比例進行混合。結果顯示 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-----’---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -28 - 1238192 A7 B7 五、發明説明（2今 於袠4中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 13 :蘇胺酸製備介質 A (NH4)2S〇4 ---------- 16克/升 KH2P〇4 1克/升 FeSCU · 7H2〇 0.01克/升 MnS04 · 4H20 〇.〇1克/升 酵母萃取物（狄夫可） 2克/升 L-異白胺酸 5〇毫克/升 菸鹼酸 10毫克/升 以KOH調爲Ph7.0,並在1 1 5°c下，壓熱滅菌10分鐘 (16/20 體積） B 在115t，壓熱滅菌1〇分鐘之 20%葡萄糖（4/20體積） MgS04· 7H2〇 1克/升 C 根據日本藥典之CaC03,在l8〇°C下乾燥滅菌（30克/升 )，抗生素（100微克/升之鏈黴素及5微克/升之卡納黴 素） ___-^ ——HI —>---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇X297公釐） 29- 1238192 A7 B7 五、發明説明（约 表4 : L -蘇胺酸之製造量 __ 菌株 L — Thr (克/升） B-3996/pMW119 13.1 B-39996/pMW(CYO)B 14.3 結果發現製造L -蘇胺酸之大腸埃希氏菌的L -蘇胺 酸製造力可經由增強細胞色素b 〇型氧化酶活性來改良。 實例5 : L -苯丙胺酸之生產 根據一般用於質體之純化方法從大腸埃希氏菌 W3110(tyrA)/pACMAB，pBR-a r 〇 G 4菌株收集質體P A C M A B。此質體係經由將 一含有與去敏感型〜克里斯美酸〃變化酶（chorismate mutase ) /普酚尼克酸脫氫酶（CM - PDH)有關之基 因的DNA片段插入介於質體介體pACYC 1 8 4 ( A p ）之B a m Η I和H i n d ΠΙ限制位間的適當1 一苯 丙胺酸生物合成系統中所取得的（參考國際專利刊物W〇 97 / 0 8333)。該 W 3 1 1 0 ( t y r A ) / pACMAB’ pBR— a r o G4 菌種（所命爲 AJ126〇4)係於1991年1月28日存放於國際 貿易及工業部，工業科學及技術處，國家生物科學及人類 —技術學會（日本，Ibaraki-ken，Tsukuba_shi5 1-3 Higashi 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -30- 1238192 A7 B7 五、發明説明（2今 l-Chome，郵遞區號：3 0 5 )，同意號碼爲F E R Μ Ρ - 1 1 9 7 5。然後，其係在布達佩斯條約的規定下’ 於1 9 9 1年9月2 6日轉移至國際貯存處，同意號碼爲 F E R Μ ΒΡ3579。 以S a 1 I將質體P A C M A Β分解，使端處鈍化， 將上述之可哈洛噬菌體DNA14 7〔2H5〕以 PshBI進行分解來產生含5·5kb cy0操縱子 之vv鈍端〃型D N A片段，再將此D N A片段插入前述之 鈍端型質體pACMAB。將所產生之質體pACMAB —cy〇引入 W3110 (tyrA/pBR— aro G 4 )中。將所得之轉化株於供製造L -苯丙胺酸的介質 中（1升水中含20克葡萄糖，29 . 4克磷酸氫二鈉， 6克磷酸二氫鉀，1克氯化鈉，2克氯化鈉，10克檸檬 酸鈉，0 . 4克穀胺酸鈉，3克硫酸鎂七水合物， 0 . 23克氯化鈣，2毫克硫胺鹽酸鹽，及100毫克L —酪胺酸，p Η 7 · 0 )，在3 7 °C下，培養4 0小時。 藉由高效能液態色層分析法來定量介質中所含之L -苯丙 胺酸。結果示於表5中。 表5 : L -苯丙胺酸之製造量 菌株 L-Phe(克 / 升） W3 1 10(tyrA)/pACMAB, pBR-aroG4 3 . 9 W3 1 10(tyrA)/pACMAB-cyo, pBR-aroG4 ----- 4 . 2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I-----*--裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -31 - 1238192 A7 B7 五、發明説明（2$ 結果發明：製造L -苯丙胺酸之大腸埃希氏菌的L -苯丙胺酸生產力可經由增強細胞色素b 〇型氧化酶活性來 良改 ---------裝----Ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) !% 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -32- 1238192 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（3C)序列表 <110> Ajinomoto Co.，Inc. <120>利用微生物生產物質的方法 <130> 0P1 186 <141> 2000-07-05 <150> JP 2000-204252 <151> 2001-07- <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <2 1 0> 1 <21 1> 25 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22 3>人工序列的說明：NDH-Π基因（ndh-l)擴增用之引物 —----*---- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -33- 1238192 Μ Β7

五、發明説明（3D <400> 1 cgatggaagc ttccgcgatt atggg 25

<210> 2 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列 <220> <22 3>人工序列的說明：NDH- Π基因（ndh-2)擴增用之引物 <400> 2 aagcgcggaa ttcgtccttc aatcatc 27 II— I I II 1!· fm -1-- I I - ...... (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂----- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 »1 ...... -- IJ - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -34-

Claims (1)

1238192 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 第901 1 6463號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 民國94年1月14日修正 1. 一種產製選自L-離胺酸、L-蘇胺酸或L-苯丙胺酸 的L-胺基酸之方法，該方法利用埃希氏菌屬（Escherichia )或棒桿菌屬（Coryneform)細菌之突變菌株或基因重組 菌株且包含下述之步驟：於培養基中培養該菌株以於該培 養基中產製並累積該L-胺基酸及收集該L-胺基酸，其中該 菌株具有增強之細胞色素bo型氧化酶活性及/或缺少NDH-II活性。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞色素bo 型氧化酶之活性係藉由於該菌株中增加編碼該細胞色素bo 型氧化酶之基因的套數或修飾該基因之表現調控序列而得 以增強。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中NDH-II活性 係藉由於該菌株中破壞編碼NDH-II之基因而缺少。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）