CN101437949B - 利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法 - Google Patents

利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法 Download PDF

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Abstract

使用微生物生产羟基羧酸，所述微生物通过向微生物中导入编码NADH脱氢酶的基因，强化NADH脱氢酶功能，使氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力提高。

Description

利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法
技术领域
本发明涉及一种生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的微生物和使用微生物生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的方法。 
背景技术
羟基羧酸类中，存在作为聚合物原料或药物中间体有用、并正在探求其高效的生产方法的物质。作为其一例，可以举出乙醇酸(α-羟基乙酸)。乙醇酸已逐渐用作洗涤剂或化妆品原料，但近年作为用作气体隔离性聚合物或医疗用聚合物的聚乙醇酸原料而受到关注。作为气体隔离性材料受到关注的原因在于，聚乙醇酸层具有较高的氧气隔离性，具有作为用于包装在氧存在下易变质的食品或碳酸饮料的材料的性能。 
目前市场上销售的化学合成品的乙醇酸含有很多杂质，作为聚合物原料存在纯度方面的问题。其原因在于，上述杂质不仅阻碍乙醇酸的脱水缩合反应，而且作为杂质之一的甲氧基乙酸是怀疑具有致癌性的化合物，故不期望包含在食品或饮料的包装材料中。尽管从技术上讲可以通过精制除去杂质，但上述精制品的价格升高，作为廉价的包装材料原料并不现实。 
为了避免化学合成品的乙醇酸中呈现的上述问题，人们正在尝试通过以乙二醇作为原料的生物学方法来制造乙醇酸。专利文献1及专利文献2中，公开了通过微生物生产乙醇酸的方法，其特征在于，在含有乙二醇的培养基中培养属于毕赤氏酵母(Pichia)属、红酵母(Rhodotorula)属、掷孢酵母(Sporobolomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、球拟酵母(Torulopsis)属的酵母、属于诺卡氏菌(Nocardia)属的菌株、属于红球菌(Rhodococcus)属的菌株、 或大肠杆菌B(Escherichia coli B)株，从培养液中分离.采集乙醇酸。专利文献1及专利文献2的实施例记载的乙醇酸生产方法中，乙醇酸蓄积浓度最高的是使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的方法，经30小时的反应可以得到35.3g/L的乙醇酸。非专利文献1中指出，对于使用内西毕赤酵母(Pichia naganishii)的乙醇酸生产，进一步改善反应条件，经120小时的反应可以得到105g/L的乙醇酸。 
专利文献3中公开了将编码乳醛还原酶(lactaldehyde reductase)的基因和编码乳醛脱氢酶(lactaldehyde dehydrogenase)的基因以质粒的形态导入微生物，由此赋予或强化该酶活性，通过使用上述微生物，将以乙二醇为代表的末端具有羟基的脂肪族多元醇作为原料，可以生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸，进而通过破坏微生物具有的编码乙醇酸氧化酶的基因使该酶活性钝化，由此提高乙醇酸的生产率。 
在利用上述现有方法生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸的反应中，由于供给到反应中的菌体量多，所以存在以下问题，即，随着菌体量多而导致制造成本升高或夹杂来自菌体的杂质，进而在羟基羧酸类制造后为了废弃菌体耗费而大量劳力和成本。 
使用氧化酶由醇制造酮的方法中，利用由随反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时简称为NADH)使反应所需的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，有时简称为NAD)再生的下述技术。即，将用于生产目标酮的氧化反应和用于再生NAD的酮的还原反应2个反应组合的方法、或组合利用谷氨酸脱氢酶的酮戊二酸还原反应的技术等。 
上述再生NAD的技术中，具有下述缺陷，即，必须向反应体系中添加用于NAD再生的反应基质，并且由于NAD再生反应导致反应体系内蓄积副产物。 
在由醇制造酮中，作为弥补上述缺陷的NAD再生方法，可以举出利用NADH脱氢酶的方法，即，通过微生物具有的呼吸链，还原分子状氧，生成水，由此再生NAD(专利文献4)，但尚未报道利用强化了酶活性的微生物的实例。
专利文献1：特开平10-174593号公报 
专利文献2：特开平10-174594号公报 
专利文献3：国际公开第2005/106005号说明书 
专利文献4：特开2005-218349号公报 
非专利文献1：Biosci.Biotechnol.Biochem.，Vol.65(10)，pp.2265-2270，(2001) 
发明内容
化学合成法中，在所得羟基羧酸的纯度方面并不充分，另外，采用现有的生物学方法，存在向生产反应供给的菌体量多、菌体废弃等问题。本发明所要解决的课题在于，提供一种能够以较少的菌体量高效地生产、有利于工业的羟基羧酸类的生产方法、及适用于该生产方法的微生物。 
本发明人等为了解决上述课题，进行潜心研究，结果发现，在使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的方法中，通过使用强化了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸再生能力的微生物，能够以较少的菌体量高效地生产羟基羧酸。 
即，本发明如以下〔1〕至〔9〕所述。 
〔1〕一种羟基羧酸的生产方法，所述方法使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸，其特征在于，使用强化了NADH脱氢酶活性的微生物。 
〔2〕如〔1〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性的微生物。 
〔3〕如〔1〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了的微生物。 
〔4〕如〔2〕所述的生产方法，其特征在于，微生物是将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物本来的活性降低了的微生物。 
〔5〕如〔1〕～〔4〕中任一项所述的生产方法，其特征在于，末端具有羟基的脂肪族多元醇为乙二醇，羟基羧酸为乙醇酸。
〔6〕一种微生物，所述微生物强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性且强化了NADH脱氢酶的活性。 
〔7〕如〔6〕所述的微生物，其特征在于，使乙醇酸氧化酶活性钝化或低于微生物本来的活性。 
〔8〕如〔1〕～〔5〕中任一项所述的生产方法，其中，微生物为大肠杆菌。 
〔9〕如〔6〕或〔7〕所述的微生物，其中，微生物为大肠杆菌。 
根据本发明，能够以较少的菌体量高效地生产以乙醇酸为代表的羟基羧酸类。 
附图说明
根据下述优选实施方案、及附带的以下附图进一步详细说明上述目的、及其他目的、特征及优点。 
[图1]为表示参考例1中细胞内的NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)的经时变化的曲线图。图中的□表示△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的NADH/NAD比。图中的○表示△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的NADH/NAD比。 
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。 
本实施方案是羟基羧酸的生产方法。此方法在使用微生物由末端具有羟基的脂肪族多元醇制造羟基羧酸的方法中，使用强化了NADH脱氢酶活性的微生物。 
所谓微生物，是指无论本来是否具有由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的能力，只要通过使用某些方法可以获得由末端具有羟基的脂肪族多元醇生产羟基羧酸的能力的微生物即可，可以为任意微生物。优选举出埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌(Corynebacterium)属、链球菌 (Streptococcus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属、酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、耶罗威亚酵母(Yarrowia)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、脉孢菌(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、木霉(Trichoderma)属等宿主载体类的开发的细菌、放线菌、酵母、霉，可以较优选地举出大肠杆菌(Escherichia coli)。 
另外，所谓末端具有羟基的脂肪族多元醇，只要是在碳链末端具有羟基、且分子内具有2个以上羟基的脂肪族化合物即可，对其结构没有特殊的限制，但作为上述化合物，可以举出乙二醇、二甘醇、丙三醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2，4-丁三醇等。 
另外，所谓羟基羧酸，是指上述末端具有羟基的脂肪族多元醇类的一个具有羟基的末端碳被氧化形成羧酸的化合物。作为上述化合物，可以举出乙醇酸、羟基乙氧基乙酸、甘油酸、3-羟基丙酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、4-羟基丁酸、2，4-二羟基丁酸等。 
本实施方案中，所谓烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，只要没有标明氧化型及还原型，则指二者中的任一个。 
本实施方案中，作为末端具有羟基的脂肪族多元醇，可以使用乙二醇。另外，作为羟基羧酸，可以优选使用乙醇酸。 
另外，所谓NADH脱氢酶，是指属于以国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告为基准的酶编号1.6.5.3、1.6.99.3、或1.6.99.5，可逆地催化以泛醌、二甲基维生素K2类(dimethyl menaquinone)、维生素K2类等醌类作为电子受体由NADH生成NAD的反应的酶的总称。优选为属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.6.99.3的NADH脱氢酶，以大肠杆菌为例时，可以举出由GenBank登录号V00306报道的由ndh基因编码的NADH脱氢酶。
所谓强化NADH脱氢酶活性，优选其活性与强化前相比提高2倍以上。酶活性提高的微生物例如可以使用下述方法制作，即，使用基因重组技术将编码该酶的基因导入野生型微生物(或重组前的微生物)中的方法或在基因组内向编码该酶的基因的启动子中导入变异等方法。作为向野生型微生物(或重组前的微生物)中导入该基因的方法，可以举出将该基因以质粒的形态导入微生物。向微生物中导入基因时使用的基因组DNA的配制、质粒的配制、DNA的切断及连接、转化、PCR(聚合酶链反应)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常用方法进行。上述方法记载于Sambrook，J.，et.al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等中。 
本实施方案涉及的微生物强化乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一个的酶活性。 
此处，所谓乳醛还原酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.1.1.77，可逆地催化在作为辅酶的NAD的存在下由1，2-丙二醇生成乳醛的反应的酶的总称。 
另外，所谓乳醛脱氢酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.2.1.22，催化在作为辅酶的NAD的存在下由乳醛生成乳酸的反应的酶的总称，且也指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.2.1.21，催化在作为辅酶的NAD的存在下由乙醇醛生成乙醇酸的反应的酶乙醇醛脱氢酶(Glycolaldehyde dehydrogenase)的总称。其原因在于，在使用大肠杆菌的在先文献中已经报道了乳醛脱氢酶和乙醇醛脱氢酶为相同的酶(Caballero，E.，et.al.，J.Biol.Chem.，Vol.258，pp.7788-7792(1983))。 
另外，所谓强化乳醛还原酶及乳醛脱氢酶中至少一种的酶活性，是指以大肠杆菌为例时，优选上述酶中至少一个的酶活性为野生株(或重组前的微生物)的20倍以上，较优选为100倍以上。 
酶活性提高的微生物，可以使用下述方法制作，例如，使用基因重组技术将编码该酶的基因导入野生型的微生物(或重组前的微生 物)中的方法、或在基因组内向编码该酶的基因的启动子中导入变异等方法。作为向野生型微生物(或重组前的微生物)中导入该基因的方法，例如可以举出以质粒的形态将该基因导入微生物。在向微生物中导入基因时所用的基因组DNA的配制、质粒的配制、DNA的切断及连接、转化、PCR、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常用方法进行。上述方法记载于上述Sambrook，J.等的文献中。 
例如，乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性提高的大肠杆菌，可以如下制作。 
大肠杆菌的乳醛还原酶的基因(以下，有时简称为fucO)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号M31059)。另外，大肠杆菌的乳醛脱氢酶的基因(以下，有时简称为aldA)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号M64541)。 
为了获取fucO，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用作为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到fucO片段。 
另外，为了获得aldA，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用作为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到aldA片段。 
进而，为了获取甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，以大肠杆菌的基因组DNA为模板，使用作为引物的寡核苷酸采用PCR法扩增，用限制酶消化所得的DNA片段，由此得到编码GAPDH启动子的DNA片段。 
将上述3个DNA片段和通过用限制酶消化质粒得到的片段结合后，转化至大肠杆菌中，得到生长在LB琼脂培养板中的转化体。在LB液体培养基中培养所得菌落，从所得菌体中回收质粒。通过将本质粒导入任意的宿主大肠杆菌中，能够制作乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性提高的大肠杆菌。 
本实施方案涉及的微生物，将乙醇酸氧化酶活性钝化或比微生物 本来的活性降低。 
此处，所谓乙醇酸氧化酶，是指属于以I.U.B.酶委员会报告为基准的酶编号1.1.3.15，可逆地催化由乙醇酸生成乙醛酸的反应的酶的总称。 
另外，所谓乙醇酸氧化酶活性的钝化，是指其酶活性完全消失。另外，所谓乙醇酸氧化酶活性的降低，是指其酶活性的一部分消失，优选相对于野生株(或重组前的微生物)具有的乙醇酸氧化酶活性为2分之1以下，较优选为10分之1以下。为了使酶功能钝化、或降低，有下述方法：向编码其蛋白质的基因中导入变异或使其缺失、取代、或者添加使其蛋白质特异地钝化的试剂、照射紫外线等方法。对于使靶基因缺失的方法、或使其变异的方法、及将其取代的方法，可以采用本领域技术人员熟知的常法进行。具体而言，可以举出大肠杆菌MT-11032株作为通过破坏为编码乙醇酸氧化酶的基因的glcDEF，使乙醇酸氧化酶活性钝化的微生物。 
大肠杆菌MT-11023株通过基因破坏使得乙醇酸氧化酶钝化，因此可以使用此菌株实施本发明。本菌株基于国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，于平成17年3月10日保藏于茨城县筑波市东1段1番1号的中央第6独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号为FERM BP-10293。 
所谓向微生物中导入编码某靶酶的基因时的“以质粒的形态”，是指将该基因与载体连接，制成重组质粒，采用转化等方法将其导入该微生物。另外，将在微生物内恒久地发挥功能的强启动子和靶基因功能性连接时，根据质粒具有的复制子的性质，即使使用据说是每个微生物细胞的拷贝数少的质粒，也能实现本发明的目的。作为上述具有复制子的质粒，可以举出pACYC184(GenBank登录号X06403)等。 
实施本实施方案的生产方法时，通常情况下使用培养基，培养微生物使其增殖，得到必要量的微生物菌体。 
本发明中，用于培养的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子及根据需要含有其他有机微量成分的培养基即可，没有特殊的限制。作为碳源，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸，甲醇、乙醇、丙三醇等醇类及其他。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、氨水、蛋白质水解物等无机及有机的氮源及其他。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸根离子、钾离子、铁离子、锰离子、硫酸根离子及其他。作为有机微量成分，可以适当地使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆、酪蛋白分解物及其他。 
作为用于培养的培养基，从供给工业生产方面考虑时，优选液体培养基。 
另外，培养基组成，优选为聚胨0.5g/L以上10g/L以下、Fe2SO40.02g/L以上0.3g/L以下、K2HPO4 0.5g/L以上5g/L以下、KH2PO4 0.5g/L以上5g/L以下、MgSO4·7H2O 0.5g/L以上5g/L以下、(NH4)2SO4 0.3g/L以上15g/L以下、烟酸0.02g/L以上1g/L以下(溶剂为水)。 
本实施方案涉及的微生物的培养时，培养条件没有特殊的限制，一边适当地控制pH和温度，一边进行培养。可以为需氧条件，也可以为厌氧条件，但优选为需氧条件。通气量优选每1L培养基为0.2L/min以上3L/min以下，较优选为0.5L/min以上2L/min以下。另外，搅拌速度优选为200rpm以上1000rpm以下，较优选为500rpm以上800rpm以下。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。另外，也可以使用能够实现与上述通气、搅拌条件相当的溶存氧供给的气泡塔等进行培养。 
pH优选为5以上8以下，较优选pH为7.0以上7.4以下，最优选pH为7.2。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。 
另外，温度优选为25℃以上40℃以下，较优选为33℃以上37℃以下，最优选为35℃。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。 
培养所需的时间为12小时以上50小时以下。由此，能够得到每单位菌体重量的羟基羧酸生产量多的菌体。 
作为羟基羧酸生产中使用的溶剂，可以举出磷酸钾缓冲液等缓冲液、或上述微生物培养中使用的培养基、及纯水。另外，可以使原料的脂肪族多元醇和溶剂的混合液与事先培养得到的微生物菌体接触，进行反应。对于微生物菌体，可以举出直接使用培养结束的培养液的方法、或从培养液中只回收菌体进行使用的方法。 
本发明生产方法的反应时，反应条件没有特殊的限制，一边适当地控制pH和温度，一边反应。 
例如，优选pH为6以上9以下，较优选pH为7.0以上8.0以下，最优选pH为7.2。由此，能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。 
另外，温度优选为20℃以上45℃以下的范围内，特别优选为30℃以上40℃以下，最优选为35℃。由此，能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。 
另外，反应优选为需氧条件。通气量优选每1L反应液为0.1L/min以上2.0L/min以下，较优选为0.2L/min以上1.0L/min以下。另外，搅拌速度优选为200rpm以上1000rpm以下，较优选为400rpm以上800rpm以下。由此，能够得到添加到反应液中的每单位菌体量的羟基羧酸生产量提高的效果。另外，也可以使用能够实现与上述通气、搅拌条件相当的溶存氧供给的气泡塔等进行反应。 
另外，通过使反应时间为12小时以上96小时以下，能够以80％以上的收率得到羟基羧酸。 
作为回收如上所述得到的反应液中蓄积的为产物的羟基羧酸的方法，没有特殊的限制，但是，例如可以采用经离心等从反应液中除去菌体后、使用合成吸附树脂的方法或使用沉淀剂的方法、采用其他常用收集分离方法进行分离的方法。 
实施例 
(制造例1)大肠杆菌MG1655glcDEF缺失株的制作 
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBanak登录号U00096)，大肠杆菌的乙醇酸氧化酶的基因(以下，有时简称为glcDEF)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号L43490)。
使用根据大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的glcDEF附近区域的基因信息制成的、序列号1(TTGGTACCGTTCTGCCAGCAACTGACG)及序列号2(TGTCTAGAGTACCTCTGTGCGTCACTGG)及序列号3(GCTCTAGACGCTTTGTTGTGTTGTGTGG)及序列号4(AACTGCAGGATCGGTCAATGATTGCAGC)的寡核苷酸，进行PCR。通过将所得DNA片段分别用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化，由此分别得到约670bp、790bp的片段。将此DNA片段与将温度敏感性克隆载体pTH18csl(GenBank登录号AB019610)(Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000))用KpnI、PstI消化得到的片段混合，使用连接酶结合后，于30℃下转化至DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一晚，从所得菌体中回收质粒。 
于30℃下将此质粒转化至大肠杆菌MG1655株中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板中于30℃下培养一晚，得到转化体。将所得转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，于30℃下培养一晚。然后，为了得到上述的培养菌体，将其涂布在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板上，得到于42℃下生长的菌落。将所得菌落于30℃下在不含药物的LB液体培养基中培养一晚，进而涂布在不含药物的LB琼脂培养板上，得到于42℃下生长的菌落。 
从呈现的菌落中随机挑取100个菌落，使各菌落生长在不含药物的LB琼脂培养板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂培养板上，选择只生长在不含药物的LB琼脂培养板上的氯霉素敏感性的克隆体。进而，由上述目标克隆体的染色体DNA通过PCR使包含glcDEF的约3.8kbp片断扩增，选出glcDEF区域缺失的菌株，将所得菌株命名为MG1655glcDEF缺失株(以下，有时简称为△glcDEF)。需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可以从美国典型菌种保藏中心(AmericanType Culture Collection)获得。 
(制造例2)乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体的构建
大肠杆菌的乳醛还原酶的基因(以下，有时简称为fucO)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号M31059)。另外，大肠杆菌的乳醛脱氢酶的基因(以下，有时简称为aldA)的碱基序列也已经被报道(GenBank登录号M64541)。 
为了获取fucO，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号5(GCTCTAGACGGAGAAAGTCTTATGATGGCTAACAGAATGATTCTG)及序列号6(GTGAAGCTTGCATTTACCAGGCGGTATGG)所示的寡核苷酸通过PCR法进行扩增，通过将所得DNA片段用限制酶XbaI及HindIII消化，得到约1.2kbp的fucO片段。进而，为了获取aldA，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号7(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGTCAGTACCCGTTCAACATCC)及序列号8(GCTCTAGACTCTTTCACTCATTAAGACTG)所示的寡核苷酸通过PCR法进行扩增，通过将所得DNA片段用限制酶EcoRI及XbaI消化，得到约1.5kbp的aldA片段。 
进而，为了获取甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号9(AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC)及序列号10(ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG)所示的寡核苷酸通过PCR法进行扩增，通过将所得DNA片段用限制酶EcoRI消化，得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。 
使用连接酶将上述3个DNA片段、和通过将质粒pUC18(东洋纺织社制)用限制酶EcoRI及HindIII消化得到的片段连接，然后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚，从所得菌体中回收质粒，将此质粒命名为pGAPfucO-aldA。 
(制造例3)利用乳醛还原酶、乳醛脱氢酶同时表达载体构建△glcDEF株转化体 
将制造例2所得的质粒pGAPfucO-aldA转化至制造例1所得的 △glcDEF株中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，由此得到△glcDEF/pGAPfucO-aldA株。 
(实施例1)乳醛还原酶、乳醛脱氢酶、NADH脱氢酶同时表达载体的构建和利用该载体构建△glcDEF株转化体 
大肠杆菌的NADH脱氢酶的基因(以下，有时简称为ndh)的碱基序列已经被报道(GenBank登录号V00306)。为了获取ndh，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号11(CGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGACTACGGCATTGAAAAAGATTGTG)及序列号12(GGTCTAGACGATTAATGCAACTTC AAACG)所示的寡核苷酸采用PCR法扩增，由此得到约1.3kbp的ndh片段。将所得ndh片段进行T4DNA多聚核苷酸激酶处理。 
将此DNA片段、和将制造例2中制成的pGAPfucO-aldA质粒用HindIII消化、进行末端平滑处理、脱磷酸化处理得到的片段混合，用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株(东洋纺织社制)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中生长的转化体。将所得菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中培养一晚，由所得菌体中回收质粒，将此质粒命名为pGAPfucO-aldA-ndh。将所得质粒pGAPfucO-aldA-ndh转化至制造例1所得的△glcDEF株中，通过于37℃下在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂培养板中培养一晚，得到△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株。 
(实施例2)利用△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的乙醇酸生产 
作为前培养，将实施例1所得的△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株植菌到加入三角烧瓶中的25mL LB Broth，Miller培养液(Difco244620)中，在培养温度35℃、120rpm的条件下搅拌培养一晚。将全部前培养液移到加入475g组成如下所示的培养基的1L容量的培养槽(ABLE社制培养装置BMJ-01)中进行培养。培养在大气压下、通气量0.5L/min、搅拌速度800rpm、培养温度35℃、pH7.2(用NH3水溶液调整)的条件下进行。在上述条件下最初的葡萄糖完全耗尽后，在剩余时间内以培养基中的葡萄糖浓度低于0.1g/L的可变速度， 供给总量40g的葡萄糖。 
<培养基组成> 
聚胨：          7g/L 
葡萄糖：        30g/L 
烟酸：          0.1g/L 
Fe2SO4：        0.09g/L 
K2HPO4：        2g/L 
KH2PO4：        2g/L 
MgSO4·7H2O：   2g/L 
(NH4)2SO4：     5g/L 
溶剂：水 
将培养开始后24小时的菌体通过离心(8000rpm、20分钟)集菌。秤量4.5g集菌后的湿菌体，与65g乙二醇一同悬浮于蒸馏水中，使最终液体量为500ml。将悬浮液移至ABLE公司制培养装置BMJ-01的培养槽中，进行反应70小时。反应在大气压下、通气量0.25L/min、搅拌速度550rpm、反应温度35℃、pH7.2(用NH3水溶液调整)的条件下进行。使用日立制作所制高效液相色谱，按照以下设定，对所得反应液中的乙醇酸蓄积量进行定量。 
色谱柱：ULTRONPS-80H(信和化工社制) 
洗脱液：高氯酸水溶液(pH2.1) 
流速：1.0mL/min 
检测器：UV检测器测定波长：280nm 
另外，在50℃下使部分湿菌体干燥后，根据此干燥重量求出用于反应的菌体的干燥菌体重量。△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株中，每1g干燥菌体生产39.8g乙醇酸。 
另外，确认△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株的生长速度，与比较例1中的△glcDEF/pGAPfucO-aldA株相同，未出现由ndh强化引起的生长延迟。 
(比较例1)利用△glcDEF/pGAPfucO-aldA株的乙醇酸生产
制造例3所得的ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA株，与实施例2相同地进行培养及乙醇酸生产。ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA株中每1g干燥菌体的乙醇酸生产量为20.2g。 
(参考例1)ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株、ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA株中的细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量的测定
ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株、及ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA株，与实施例2相同地进行培养及乙醇酸生产。 
对于乙醇酸生产时的ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株及ΔglcDEF/pGAPfucO-aldA株，在一定时间内取样，对于各个菌株，分别取样1mL置于2个微量沉淀管中，在4℃下离心，集菌。2个沉淀管中1个用于测定NAD，1个用于测定NADH，分别进行以下处理。 
NAD测定用样品中，每1.5mg集菌的湿菌体加入400μL的0.04mol/L盐酸水溶液，悬浮。将悬浮液在90℃下加热3分钟后，在冰上骤冷。使用此处理液的上清液，制成组成如下所示的反应液。需要说明的是，作为1mol/L Tris-HCl，使用pH9.0的溶液。另外，作为醇脱氢酶，使用将SIGMA社制醇脱氢酶(A3263)溶解于10mmol/L Tris-HCl(pH8.8)中形成400单位/mL(其中，1单位为在pH8.8、25℃的条件下，1分钟内将1μmol乙醇变为乙醛所需的酶量)的液体。反应液在450nm处的吸光度根据TetraColor ONE(生化学工业社制)的方案进行测定。需要说明的是，对SIGMA公司制NAD的溶液进行相同处理，测定处理后的溶液，由此制作标准曲线，求出样品的NAD浓度。 
向NADH测定用样品中，每1.5mg集菌的湿菌体加入400μL的0.04mol/L氢氧化钾水溶液，使其悬浮。将悬浮液在90℃下加热3分钟后，在冰上骤冷。使用此处理液的上清液，制成如下组成的反应液。需要说明的是，作为1mol/L Tris-HCl，使用pH8.8的溶液。另外，作为醇脱氢酶，使用将SIGMA公司制醇脱氢酶(A3263)溶解于10mmol/LTris-HCl(pH8.8)中形成的400单位/mL(其中，1单位是在pH8.8、25℃的条件下、1分钟内将1μmol乙醇变为乙醛所需的酶量)的液体。 
反应液在450nm处的吸光度根据TetraColor ONE(生化学工业社制)的方案进行测定。需要说明的是，对SIGMA公司制NADH的溶液进行相同处理，测定处理后的溶液，由此制作标准曲线，求出样品的NADH浓度。图1表示此时的NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)。横轴表示反应时间(hr)、纵轴表示NADH/NAD比(NADH含量/NAD含量)。 
△glcDEF/pGAPfucO-aldA-ndh株，通常情况下NADH/NAD比的值小，表示从NADH再生为NAD。 
<反应液组成> 
样品上清液：            25μL 
1mol/L Tris-HCl：       25μL 
25％乙醇：              10μL 
纯水：                  20μL 
TetraColor ONE(生化学工业社制)：10μL 
醇脱氢酶：10μL 
产业上的可利用性 
本发明的羟基羧酸的生产方法及微生物，可以用于作为聚合物原料或药物中间体有用的乙醇酸等羟基羧酸类的制造。
序列表
<110>三井化学株式会社
<120>利用辅酶再生进行的羟基羧酸类的生产方法
<130>MC-90129WO
<150>JP06-129986
<151>2006-05-09
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>1
ttggtaccgt tctgccagca actgacg    27
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>2
tgtctagagt acctctgtgc gtcactgg   28
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>3
gctctagacg ctttgttgtg ttgtgtgg   28
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>4
aactgcagga tcggtcaatg attgcagc                        28
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>5
gctctagacg gagaaagtct tatgatggct aacagaatga ttctg    45
<210>6
<211>29
<212>DNA
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<220>
<223>PCR引物
<400>6
gtgaagcttg catttaccag gcggtatgg                       29
<210>7
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>7
cgaattccgg agaaagtctt atgtcagtac ccgttcaaca tcc      43
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>8
gctctagact ctttcactca ttaagactg                       29
<210>9
<211>30
<212>DNA
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<220>
<223>PCR引物
<400>9
aacgaattct cgcaatgatt gacacgattc                         30
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<400>10
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<400>11
cgaattccgg agaaagtctt atgactacgg cattgaaaaa gattgtg     47
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>12
ggtctagacg attaatgcaa cttcaaacg                        29

Claims (2)

1.一种乙醇酸的生产方法，所述方法使用微生物由乙二醇生产乙醇酸，其特征在于，使用重组微生物，
所述重组微生物通过将编码来自大肠杆菌的乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因导入大肠杆菌，强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性，并且，将所述大肠杆菌的乙醇酸氧化酶活性钝化或比大肠杆菌本来的活性降低，
并且，通过将编码来自大肠杆菌的NADH脱氢酶的基因导入大肠杆菌，强化了NADH脱氢酶活性。
2.一种重组微生物，所述重组微生物通过将编码来自大肠杆菌的乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的基因导入大肠杆菌，强化了乳醛还原酶及乳醛脱氢酶的酶活性，
将所述大肠杆菌的乙醇酸氧化酶活性钝化或比大肠杆菌本来的活性降低，
并且，通过将编码来自大肠杆菌的NADH脱氢酶的基因导入大肠杆菌，强化了NADH脱氢酶活性。
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