CN102791850B - 生产能力高的异丙醇生产细菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种异丙醇生产大肠杆菌和包括使用所述异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料生产异丙醇的异丙醇生产方法，所述异丙醇生产大肠杆菌具备异丙醇生产系统，并且具有选自经强化的苹果酸脱氢酶活性、经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性、及经强化的硫解酶活性组成的组中的至少一种的强化酶活性。

Description

生产能力高的异丙醇生产细菌
技术领域
本发明涉及异丙醇生产细菌及使用其的异丙醇生产方法。
背景技术
丙烯是聚丙烯等合成树脂或石油化学制品的重要的基础原料，被广泛应用于汽车用减震器、食品容器、薄膜、医疗器械等。
因为由植物来源原料制造出的异丙醇可经脱水工序转化为丙烯，所以有希望作为碳中和的丙烯的原料。根据京都议定书，所有发达国家有义务于2008年至2012年间使二氧化碳排放量与1990年相比削减5％，在这种情况下，碳中和的丙烯由于其广泛适用性而对地球环境极其重要。
已知将植物来源原料同化来生产异丙醇的细菌。例如，国际公开2009/008377号说明书中公开了为了以葡萄糖为原料生产异丙醇而经修饰的细菌，记载了其由于异丙醇的选择性高因而具有作为工业生产用生物催化剂优异的性质。
异丙醇制造大肠杆菌中，由于异丙醇的原料是葡萄糖，所以由于糖酵解及异生而得到的大量化合物均可成为副产物。另一方面，由于上述化合物有时是为了使大肠杆菌生长繁殖而必须的物质，所以不能完全抑制上述副反应所消耗的葡萄糖的量。因此，为了使副产物最小化且提升异丙醇的生产速度，需要一边考虑大肠杆菌内发生的所有的代谢反应、一边使代谢为异丙醇的趋势最大，从生物活性和物质生产的观点考虑，提出了多种技术方案。
例如，国际公开2009/008377号说明书中，公开了导入有乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各基因、可由植物来源原料生成异丙醇的异丙醇生产细菌。对上述异丙醇生产细菌的能力记载如下：生产速度为0.6g/L/hr，蓄积量为28.4g/L。
国际公开2009/049274号说明书及Appl.Environ.Biotechnol.，73(24)，pp.7814-7818，(2007)中，公开了导入有乙酰CoA酰基转移酶、乙酰乙酰CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶及仲醇脱氢酶的各基因、制造异丙醇的大肠杆菌。对上述细菌的能力记载如下：生产速度为0.4g/L/hr，收率为43.5％，蓄积量为4.9g/L。
国际公开2009/028582号说明书中，公开了导入有乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及乙酰CoA酰基转移酶的各基因、制造异丙醇的大肠杆菌。对上述细菌的能力记载如下：蓄积量为9.7g/L。
Appl.Microbiol.Biotechnol.，77(6)，pp.1219-1224，(2008)中公开了导入有硫解酶、CoA-转移酶、乙酰乙酸酯脱羧酶、伯醇-仲醇脱氢酶的各基因、制造异丙醇的大肠杆菌。对上述细菌的能力记载如下：生产速度为0.6g/L/hr，收率为51％，蓄积量为13.6g/L。
国际公开2009/103026号说明书中，公开了导入有乙酰乙酸脱羧酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及乙酰CoA酰基转移酶及异丙醇脱氢酶的各基因、可制造异丙醇的大肠杆菌。记载了上述细菌的能力可期待如下：收率为50％，生产速度为0.4g/L/hr，最终生产量为14g/L。
国际公开2009/247217号说明书中，公开了导入有乙酰乙酸酯脱羧酶、CoA转移酶、硫解酶及2-丙醇脱氢酶的各基因、可制造异丙醇的大肠杆菌。对上述细菌的能力记载如下：最终生产量为2g/L。
在此，异丙醇脱氢酶、仲醇脱氢酶、伯醇-仲醇脱氢酶及2-丙醇脱氢酶是名称不同但催化相同反应的酶，CoA转移酶、乙酰乙酰CoA转移酶、乙酰CoA：乙酸酯CoA-转移酶及CoA-转移酶是名称不同但催化相同反应的酶。另外，乙酰乙酸脱羧酶和乙酰乙酸酯脱羧酶是名称不同但催化相同反应的酶，硫解酶和乙酰CoA酰基转移酶也是名称不同但催化相同反应的酶。因此，对于上述文献中的异丙醇生产大肠杆菌来说，虽生产能力各有不同，但为了制造异丙醇而进行利用的酶是与国际公开2009/008377号说明书所记载的、乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶4种酶相同的酶，在为了提高生产能力或收率等情况下，一直以来研究上述4种酶。
另一方面，作为提高微生物中的物质生产的收率及生产能力的方法，已知有使微生物具有的酶苹果酸脱氢酶缺失的方法。
例如，国际公开2009/023493号说明书中，记载了如下内容：在利用大肠杆菌进行的1，4-丁二醇的生产中，通过将该大肠杆菌具有的苹果酸脱氢酶基因破坏或将苹果酸脱氢酶基因和转氢酶基因同时破坏从而提高收率。
另外，国际公开2009/012210号说明书中，记载了如下内容：在利用大肠杆菌进行的乙醇的生产中，通过同时破坏该大肠杆菌具有的苹果酸脱氢酶基因和D-乳酸脱氢酶基因从而提高收率。
进而，在国际公开2009/111672号说明书中，记载了如下内容：在利用酵母进行的十二烷醇的生产中，同时破坏该酵母具有的乙醛-CoA脱氢酶基因、D-乳酸脱氢酶基因和苹果酸脱氢酶基因，具有提高生产能力的效果。
发明内容
然而，可生产异丙醇的上述细菌均难以说具有充分的生产能力，提高利用异丙醇生产细菌进行的异丙醇生产的收率和生产速度是应解决的重大课题。
本发明的目的在于提供可迅速且高收率地生产异丙醇的大肠杆菌及使用该大肠杆菌的异丙醇生产方法。
本发明是鉴于上述状况而完成的，本发明的异丙醇生产大肠杆菌及异丙醇生产方法如下所述。
〔1〕一种异丙醇生产大肠杆菌，具备异丙醇生产系统，在大肠杆菌中具有选自经强化的苹果酸脱氢酶活性、经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性、及经强化的硫解酶活性组成的组中的至少一种强化酶活性。
〔2〕如[1]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性包括上述经强化的苹果酸脱氢酶活性。
〔3〕如[1]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性包括上述经强化的苹果酸脱氢酶活性及上述经强化的硫解酶活性。
〔4〕如[1]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性包括上述经强化的苹果酸脱氢酶活性及上述经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性。
〔5〕如[1]所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性为上述经强化的苹果酸脱氢酶活性及上述经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性及上述经强化的硫解酶活性。
〔6〕如[1]～[5]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性来源于由从菌体外导入的酶基因引起的强化及由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化中的至少一种。
〔7〕如[1]～[6]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性来源于宿主大肠杆菌的基因组上的强化及由质粒导入引起的强化中的至少一种。
〔8〕如[1]～[7]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述强化酶活性来源于编码来自埃希氏菌(escherichia)属细菌的各酶的基因。
〔9〕如[1]～[8]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统由乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶、及硫解酶的各酶基因构建。
〔10〕如[1]～[8]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述异丙醇生产系统由上述乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各酶基因构建，并且，各酶基因各自独立地来源于选自由梭状芽胞杆菌(Clostridium)属细菌、芽孢杆菌(Bacillus)属细菌及埃希氏菌属细菌组成的组中的至少一种原核生物。
〔11〕如[1]～[8]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，上述乙酰乙酸脱羧酶活性来源于编码来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的酶的基因，上述异丙醇脱氢酶活性来源于编码来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的酶的基因，上述CoA转移酶活性、硫解酶活性、苹果酸脱氢酶活性及NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性来源于编码来自大肠杆菌(Escherichia coli)的各酶的基因。
〔12〕一种异丙醇生产方法，包括使用[1]～[11]中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料生产异丙醇。
附图说明
[图1]本发明的评价实验1涉及的比较各种IPA生产大肠杆菌的IPA生产能力的图。
具体实施方式
本发明的异丙醇生产大肠杆菌是异丙醇生产系统大肠杆菌，具备异丙醇生产系统，并且具有选自经强化的苹果酸脱氢酶活性、经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性、及经强化的硫解酶活性组成的组中的至少一种的强化酶活性。
由于本发明的异丙醇生产大肠杆菌中具备上述3种酶活性中的至少一种的强化酶活性，所以可快速且高收率地生产异丙醇。
即，本发明为了提高异丙醇生产系统的活性，进行了多种研究，结果发现，将作为处于葡萄糖的代谢途径中的酶之一的苹果酸脱氢酶的活性、参与NADH及NADP+的氧化还原的酶即NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性、作为异丙醇生产系统之一的硫解酶活性中的至少任一种的活性强化，由此，作为由该大肠杆菌产生的产物的异丙醇的生产速度提升，收率提高。
本发明中的“活性”或“能力”的“强化”泛指强化前的异丙醇生产大肠杆菌中的各种酶活性在强化后得到提高。
作为强化的方法，只要是可提高异丙醇生产大肠杆菌本来具有的各种酶的活性即可，没有特别限制，可举出由从菌体外导入的酶基因引起的强化、由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化或它们的组合。
作为由从菌体外导入的酶基因引起的强化，具体而言，可举出如下方式或其组合：将编码比宿主来源的酶活性高的酶的基因从宿主细菌的菌体外导入至菌体内，追加由导入的酶基因产生的酶活性、或将由宿主来源的酶基因产生的酶活性置换为由该导入的酶基因产生的酶活性；使宿主来源的酶基因或来自菌体外的酶基因的数目增加为2个以上。
作为由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化，具体而言，可举出如下方式或其组合：将增强酶基因的表达的碱基序列从宿主细菌的菌体外导入至菌体内；将宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子置换为其他启动子从而强化酶基因的表达。
本发明中“宿主”是指一种大肠杆菌，所述大肠杆菌接受一种以上的基因从菌体外导入，结果形成本发明的异丙醇生产大肠杆菌。
需要说明的是，本说明书中术语“工序”不仅指独立的工序，即使在不能与其他工序明确区别时，只要实现本工序所期望的作用，也包含在本术语的含义之内。
本说明书中使用“～”表示的数值范围表示包含将“～”前后所记载的数值分别作为最小值及最大值的范围。
以下，对本发明进行说明。
本发明中的苹果酸脱氢酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.40的、催化从L-苹果酸生成丙酮酸和CO2的反应的酶的总称。
作为上述酶，可举出例如来自如下原虫或细菌的酶：阴道毛滴虫(Tritrichomonasvaginalis)等三毛滴虫属(Tritrichomonas属)原虫、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等根瘤菌属(Rhizobium)细菌、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus fataricus)等硫化叶菌属(Sulfolobus)细菌、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等棒状杆菌属(Corynebacterium属)细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属(Escherichia 属)细菌、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)等中华根瘤菌属(Sinorhizobium属)细菌。
作为本发明中使用的苹果酸脱氢酶的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的苹果酸脱氢酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选例子，可列举出来源于根瘤菌、硫化叶菌、棒状杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或中华根瘤菌属细菌等原核生物的DNA，特别优选为具有大肠杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。
为了提高有用物质的生产而强化苹果酸脱氢酶的活性及编码该酶的基因表达的见解，迄今为止尚未出现。反而，在利用微生物进行的物质生产中，如WO2009/023493、WO2009/012210、WO2009/111672中所记载的那样，为了提高生产能力或收率，一般认为应使存在于微生物内的苹果酸脱氢酶的活性或编码该酶的基因缺失。因此，通过强化苹果酸脱氢酶的活性从而提高异丙醇的生产速度和收率完全在预料之外。
本发明中的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.6.1.2的、催化以下反应的酶的总称。
在此，NADP是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotidephosphate)，NADPH是指其还原型。另外，NAD是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide)，NADH是指其还原型。
作为NAD(P)+转氢酶(AB特异性)，可举出例如来源于如下细菌的NAD(P)+转氢酶：大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)及荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)等红细菌属(Rhodobacter属)细菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)等克雷伯氏菌属(Klebsiella属)细菌。
作为本发明中使用的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选例子，可列举出来源于埃希氏菌属细菌、红细菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌等原核生物的DNA，可例示例如具有大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有大肠杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的硫解酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.3.1.9的、催化从乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA的反应的酶的总称。
作为上述酶，可举出例如来自如下细菌的酶：丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽胞杆菌属细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属细菌、盐杆菌种(Halobacterium sp.)细菌、生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)等动胶菌属细菌、根瘤菌种(Rhizobium sp.)细菌、大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)等慢生根瘤菌属细菌、热带假丝酵母(Candidatropicalis)等假丝酵母菌属细菌、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)等链霉菌属细菌、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)等肠球菌属细菌。
作为本发明中使用的硫解酶的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的硫解酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选例子，可举出具有来源于下述细菌的基因的碱基序列的DNA，所述细菌为丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等梭状芽胞杆菌属细菌、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌、盐杆菌种的细菌、生枝动胶菌等动胶菌属细菌、根瘤菌种的细菌、大豆慢生根瘤菌等慢生根瘤菌属细菌、热带假丝酵母等假丝酵母菌属细菌、新月柄杆菌等柄杆菌属细菌、山丘链霉菌等链霉菌属细菌、粪肠球菌等肠球菌属细菌。作为更优选的例子，可举出来源于梭状芽胞杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌等原核生物的DNA，特别优选具有来源于丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
本发明的异丙醇生产大肠杆菌具备上述3种酶活性分别提高而得到的强化酶活性中的至少一种的酶活性。3种强化酶活性中，就硫解酶活性而言，由于硫解酶也为构成后述的异丙醇生产系统之一的酶，因而当作为该大肠杆菌的强化酶活性的对象被包含时，需要进一步强化硫解酶活性。作为上述强化如前所述，可举出在质粒或基因组上强化编码硫解酶的基因表达；增加硫解酶基因的复制数；或它们的组合等。
本发明中的异丙醇生产大肠杆菌是具备异丙醇生产系统的大肠杆菌，是指通过基因重组导入或改变而得到的具有异丙醇生产能力的大肠杆菌。上述异丙醇生产系统只要是使作为对象的大肠杆菌生产异丙醇的系统，就可以是任一系统。
可优选举出参与异丙醇的生产的酶活性的强化。在本发明中的异丙醇生产大肠杆菌中，乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性及前述的硫解酶活性的4种酶活性更优选如下得到：从菌体外赋予或在菌体内使其表达增强；或进行上述双方。
本发明中的术语“通过基因重组”，只要是向原有的基因的碱基序列中插入其他DNA、或通过基因的某部分的置换、缺失或其组合而引起碱基序列上的改变，即可包括所有方式，例如，也可以是发生突变而得到。
本发明中的乙酰乙酸脱羧酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号4.1.1.4的、催化从乙酰乙酸生成丙酮的反应的酶的总称。
作为上述酶，可举出例如来自如下细菌的酶：丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽胞杆菌属细菌、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)等芽孢杆菌属细菌。
作为本发明的导入至宿主细菌的乙酰乙酸脱羧酶的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的乙酰乙酸脱羧酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的例子，可举出来源于梭状芽胞杆菌属细菌或芽孢杆菌属细菌的DNA，可例示例如具有丙酮丁醇梭菌、多粘芽孢杆菌来源的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有丙酮丁醇梭菌来源的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的异丙醇脱氢酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号1.1.1.80的、催化从丙酮生成异丙醇的反应的酶的总称。
作为上述酶，可举出例如来自拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽胞杆菌属细菌的酶。
作为本发明的导入至宿主细菌的异丙醇脱氢酶的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的异丙醇脱氢酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的例子，可举出来源于梭状芽胞杆菌属细菌的DNA，例如为具有拜氏梭菌来源的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的CoA转移酶是指，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.8.3.8的、催化从乙酰乙酰CoA生成乙酰乙酸的反应的酶的总称。
作为上述酶，可举出例如来自如下细菌或锥虫的酶：丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等梭状芽胞杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)等Faecalibacterium属细菌、粪球菌(Coprococcus)属细菌、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)等锥虫、大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属细菌。
作为本发明中使用的CoA转移酶的基因，可利用具有编码从上述各来源生物得到的CoA转移酶的基因的碱基序列的DNA或基于该公知的碱基序列合成出的合成DNA序列。作为优选的例子，可举出具有来自丙酮丁醇梭菌等梭状芽胞杆菌属细菌、肠道罗斯氏菌等罗斯氏菌属细菌、普拉梭菌等Faecalibacterium属细菌、粪球菌属细菌、布氏锥虫等锥虫、大肠杆菌等埃希氏菌属细菌的基因的碱基序列的DNA。作为更优选的例子，可举出来自梭状芽胞杆菌属细菌或埃希氏菌属细菌的DNA，特别优选为具有来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的用于生产异丙醇的硫解酶是指，如前所述，分类为依据国际生物化学联合会(I.U.B.)酶委员会报告的酶编号2.3.1.9的、催化从乙酰CoA生成乙酰乙酰CoA的反应的酶的总称。上述硫解酶的相关事项可直接适用前述事项。
其中，就上述4种酶而言，从酶活性的观点考虑，分别优选为来自选自梭状芽胞杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌组成的组中的至少一种的酶，其中，进一步优选乙酰乙酸脱羧酶及异丙醇脱氢酶来自梭状芽胞杆菌属细菌，CoA转移酶活性及硫解酶活性来自埃希氏菌属细菌的情况；和上述4种酶均来自梭状芽孢杆菌属细菌的情况。
其中，从酶活性的观点考虑，优选本发明涉及的4种酶分别是来自丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌或大肠杆菌中任一种的酶，更优选乙酰乙酸脱羧酶是来自丙酮丁醇梭菌的酶，CoA转移酶及硫解酶分别是来自丙酮丁醇梭菌或大肠杆菌的酶，异丙醇脱氢酶是来自拜氏梭菌的酶，从酶活性的观点考虑，上述4种酶中，特别优选乙酰乙酸脱羧酶活性来自丙酮丁醇梭菌，上述异丙醇脱氢酶活性来自拜氏梭菌，CoA转移酶活性及硫解酶活性来自大肠杆菌。
本发明中，作为具有包含硫解酶活性的异丙醇生产系统的异丙醇生产大肠杆菌的例子，可举出WO2009/008377号中记载的pIPA/B株或pIaaa/B株。另外，该大肠杆菌中，在参与异丙醇生产的酶中，CoA转移酶活性和硫解酶活性的增强是通过强化该大肠杆菌的基因组上的各基因的表达来进行的。包括异丙醇脱氢酶活性和乙酰乙酸脱羧酶活性的增强通过质粒强化各基因的表达而得到的株(有时称为pIa/B::atoDAB株)。
本发明中，作为强化酶活性，从更有效地提高异丙醇生产能力的观点考虑，优选包含经强化的苹果酸脱氢酶活性。进一步优选包含经强化的苹果酸脱氢酶活性及经强化的硫解酶活性；或包含经强化的苹果酸脱氢酶活性及经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性；最优选同时具备经强化的苹果酸脱氢酶活性及经强化的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性及经强化的硫解酶活性的强化酶活性。
另外，本发明中，最优选增强编码上述苹果酸脱氢酶、NAD(P)+转氢酶(AB特异性)及硫解酶的各基因的表达。由此，与单独强化各酶活性的情况相比，可惊人地提高异丙醇的生产能力及收率。
作为本发明中的异丙醇生产大肠杆菌的优选方式，是在上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株中强化苹果酸脱氢酶活性、或除了强化苹果酸脱氢酶活性之外还将NAD(P)+转氢酶(AB特异性)及/或硫解酶活性强化的株。上述株中的硫解酶活性也可以是在质粒和基因组两者上增强编码硫解酶的基因的表达而得到的。
作为进一步优选的方式，是在上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株中强化苹果酸脱氢酶活性或除了强化苹果酸脱氢酶活性之外同时还将NAD(P)+转氢酶(AB特异性)及/或硫解酶的活性强化的株。上述株中的硫解酶活性也可以是在质粒和基因组两者上增强编码硫解酶的基因的表达而得到的。
作为特别优选的方式，是在上述pIPA/B株、pIaaa/B株或pIa/B::atoDAB株中同时强化苹果酸脱氢酶活性、NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性及硫解酶活性的株。上述株中硫解酶活性也可以是在质粒和基因组两者上增强编码硫解酶的基因的表达。
作为最优选的方式，是在上述或pIa/B::atoDAB株中同时强化苹果酸脱氢酶活性、NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性及硫解酶活性的株。上述株中，硫解酶活性可以是在质粒和基因组两者上增强编码硫解酶的基因的表达而得到的。
本发明中的基因的启动子只要是可控制上述任一基因的表达的启动子即可，是恒常地在微生物内发挥功能的强力的、并且即使在葡萄糖存在下表达也不易受到抑制的启动子，具体而言，可举出甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下有时称为GAPDH)的启动子和丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。
本发明中的启动子是指与具有Sigma因子的RNA聚合酶连接的、开始转录的部位。例如，大肠杆菌来源的GAPDH启动子，在基因库登录号X02662的碱基序列信息中，被记载于碱基编号397-440中。
大肠杆菌来源的CoA转移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因(atoB)以atoD、atoA、atoB的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵子(Journal of Baceteriology Vol.169pp 42-52 Lauren Sallus Jenkins等)，因此，通过改变atoD的启动子，可同时控制CoA转移酶基因和硫解酶基因的表达。
由此，CoA转移酶活性及硫解酶活性通过宿主大肠杆菌的基因组基因得到时，从获得充分的异丙醇生产能力的观点考虑，优选通过将担负两种酶基因的表达的启动子置换为其他启动子等，而增强两种酶基因的表达。作为用于增强CoA转移酶活性及硫解酶活性的表达的启动子，可举出前述的大肠杆菌来源的GAPDH启动子等。
本发明中的上述酶活性可以从菌体外向菌体内导入，或者通过将宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或置换为其他启动子而使酶基因强表达。
酶活性的导入可以通过例如使用基因重组技术将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内来进行。此时，被导入的酶基因相对于宿主细胞为同种或不同种均可。在从菌体外向菌体内导入基因时所需要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等方法，可通过本领域技术人员公知的通常方法来进行。上述方法记载在Sambrook，J.，et.al.，”MolecularCloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，(1989)等中。
本发明中酶活性经强化的大肠杆菌是指，通过任意方法将该酶活性强化而得到的大肠杆菌。上述大肠杆菌例如可使用如下方法制成：使用与上述相同的基因重组技术，使用质粒将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入至菌体内；或通过将宿主大肠杆菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性强化或置换为其他启动子来使酶基因强表达等方法。
本发明中大肠杆菌，是指不论本来是否具有从植物来源原料生产异丙醇的能力，通过使用任意手段而可具有从植物来源原料生产异丙醇的能力的大肠杆菌。
此处，对于作为上述基因重组的对象的大肠杆菌，可以是不具有异丙醇生产能力的大肠杆菌，只要是可进行上述各基因的导入及改变，就可以是任意的大肠杆菌。
可更优选预先赋予异丙醇生产能力的大肠杆菌，由此，可更高效地生产异丙醇。
作为上述异丙醇生产大肠杆菌，可举出例如WO2009/008377号说明书中记载的赋予乙酰乙酸脱羧酶活性、异丙醇脱氢酶活性、CoA转移酶活性、及硫解酶活性的、可从植物来源原料生成异丙醇的异丙醇生成大肠杆菌等。
本发明的异丙醇生产方法包括使用上述异丙醇生产大肠杆菌从植物来源原料生产异丙醇，即，包括使上述异丙醇生产大肠杆菌与植物来源原料接触进行培养的工序、和将通过接触而得到的异丙醇回收的回收工序。
上述异丙醇生产方法中使用的植物来源原料只要是从植物得到的碳源、且是植物来源原料，就没有特别限制。本发明中，是指根、茎、干、枝、叶、花、种子等器官、包含它们的植物体、上述植物器官的分解产物，进而，在从植物体、植物器官、或它们的分解产物得到的碳源中，可在微生物培养时作为碳源利用的物质也包含在植物来源原料中。
上述植物来源原料中包含的碳源中，通常可举出淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类、或大量含有上述成分的草木质分解产物、纤维素水解物等或它们的组合，进而，植物油来源的甘油或脂肪酸也可包含在本发明中的碳源中。
作为本发明中的植物来源原料的例子，可以优选举出谷物等农作物，玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等，或它们的组合，作为上述原料的使用形态，为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，可以为仅是上述碳源的形态。
就培养工序中的异丙醇生产大肠杆菌与植物来源原料的接触而言，通常通过在含有植物来源原料的培养基中培养异丙醇生产大肠杆菌来进行。
植物来源原料与异丙醇生产大肠杆菌的接触密度随着异丙醇生产大肠杆菌的活性不同而不同，通常，作为培养基中的植物来源原料的浓度，以葡萄糖换算，可使初始的糖浓度相对于混合物的总质量为20质量％以下，从大肠杆菌的耐糖性的观点考虑，优选使初始的糖浓度为15质量％以下。其他各成分以通常添加的量向微生物的培养基中添加即可，没有特别限制。
另外，作为培养基中的异丙醇生产大肠杆菌的含量，随着大肠杆菌的种类及活性的不同而不同，通常使初始的菌浓度相对于培养液为0.1质量％至30质量％，从控制培养条件的观点考虑，可使其为1质量％～10质量％。
作为异丙醇生产大肠杆菌的培养中使用的培养基，只要是含有碳源、氮源、无机离子、及为了使微生物生产乳酸而需要的有机微量元素、核酸、维生素类等的通常使用的培养基，就没有特别限制。
在进行本发明的培养时，对培养条件没有特别限制，例如，在需氧条件下，一边将pH和温度适当地控制在pH4～9、优选pH6～8、温度20℃～50℃、优选25℃～42℃的范围内，一边进行培养。
向上述混合物中通气体的通气量没有特别限制，当仅使用空气作为气体时，通常为0.02vvm～2.0vvm(vvm：通气容量〔mL〕/液容量〔mL〕/时间〔分钟〕)，从抑制对大肠杆菌的物理损伤的观点考虑，优选在0.1vvm～2.0vvm的条件下进行。
可使培养工序从培养开始持续至混合物中的植物来源原料被消耗、或至异丙醇生产大肠杆菌的活性消失。培养工序期间随着混合物中的异丙醇生产大肠杆菌的数目及活性、以及植物来源原料的量的不同而不同，但通常为1小时以上、优选为4小时以上即可。另一方面，通过进行植物来源原料或异丙醇生产大肠杆菌的再投入，可使培养期间无限制地持续。但从处理效率的观点考虑，通常可使培养期间为5天以下，优选为72小时以下。其他条件可直接应用通常的培养中使用的条件。
作为将培养液中蓄积的异丙醇回收的方法，没有特别限制，例如可采用如下方法：在通过离心分离等从培养液中除去菌体后，用蒸馏或膜分离等通常的分离方法将异丙醇分离的方法。
需要说明的是，对于本发明的异丙醇的生产方法，在用于生产异丙醇的培养工序之前，也可包括预培养工序，所述预培养工序用于使使用的异丙醇生产大肠杆菌为适当的菌数或适度的活性状态。预培养工序只要是利用对应于异丙醇生产细菌的种类的通常使用的培养条件的培养即可。
本发明的异丙醇的生产方法优选包括培养工序和回收工序，所述培养工序一边向含有上述异丙醇生产细菌及植物来源原料的混合物中供给气体、一边培养该异丙醇生产大肠杆菌，所述回收工序将通过上述培养生成的异丙醇从混合物中分离并回收。
根据上述方法，一边向混合物中供给气体一边培养生产大肠杆菌(通气培养)。通过上述通气培养，生产的异丙醇被释放到混合物中，同时从混合物中蒸发，结果，可容易地从混合物中分离生成的异丙醇。另外，由于生成的异丙醇连续地从混合物中分离，因而可抑制混合物中异丙醇的浓度上升。由此，无需特别考虑异丙醇生产大肠杆菌相对于异丙醇的耐受性。
需要说明的是，本方法中的混合物只要是以通常用于大肠杆菌的培养的基本培养基为主体即可。关于培养条件可直接适用上述事项。
在回收工序中，回收在培养工序中生成的、从混合物分离得到的异丙醇。作为上述回收方法，只要可以收集通过通常培养从混合物中蒸发的气体状或飞沫状的异丙醇即可。作为这样的方法，可以举出收纳到通常使用的密闭容器等收集构件中等，其中，从可以只将异丙醇高纯度地回收的观点考虑，优选为包括使用于捕集异丙醇的捕集液与从混合物中分离得到的异丙醇接触的方法。
本方法中，可以以将异丙醇溶解在捕集液或混合物中的方式进行回收。作为这样的回收方法，可举出例如国际公开2009/008377号说明书中记载的方法等。回收的异丙醇可使用HPLC等通常的检测方法进行确认。可根据需要对回收的异丙醇进行进一步精制。作为上述精制方法，可举出蒸馏等。
当回收的异丙醇为水溶液的状态时，本异丙醇的生产方法除了回收工序之外还可进一步包括脱水工序。异丙醇的脱水可通过常规方法进行。
作为在能以溶解在捕集液或混合物中的形态回收的异丙醇的生产方法中能够使用的装置，可举出例如国际公开2009/008377号说明书的图1所示的生产装置。
在上述生产装置中，在容纳有含有异丙醇生产细菌和植物来源原料的培养基的培养槽上，连接有用于从装置外部注入气体的注入管，能够对培养基通气。
另外，在培养槽上通过连接管连接有捕获槽，所述捕获槽容纳有作为捕集液的捕获液(trap solution)。此时，向捕获槽移动的气体或液体与捕获液接触发生起泡。
由此，在培养槽中通过通气培养生成的异丙醇由于通气而蒸发，易于从培养基中分离，并且在捕获槽中被捕获液捕集。结果，能够以进一步精制的形态连续且简便地生产异丙醇。
通过本发明的异丙醇的生产方法，可快速生成异丙醇，与不应用本发明的情况相比，按照同样的方法通常得到的生产速度高。虽然随着生产方法的条件或使用的异丙醇生产大肠杆菌的状态的不同而不同，但可使生产速度为0.7～2.0g/L/hr、优选0.9～1.9g/L/hr。另外，通过本发明的异丙醇的生产方法，可高效地从葡萄糖生成异丙醇，与不应用本发明的情况相比，按照同样的方法通常得到的收率高。虽然随着生产方法的条件或使用的异丙醇生产大肠杆菌的状态的不同而不同，但在培养工序结束时，可使收率为51～80％、优选51～66％。
本发明中的收率表示基于底物葡萄糖转化为代谢产物异丙醇的化学计量式的转化率。异丙醇制造大肠杆菌中，由于从1mol葡萄糖生成1mol异丙醇，因而，考虑到葡萄糖及异丙醇的分子量(葡萄糖＝180，异丙醇＝60)，即使180g葡萄糖全部转化为异丙醇也仅生成60g异丙醇，不能得到在其以上的值。将该理论上最大的转化率在本发明作为收率100％。
如上所述，由于本发明的异丙醇生产大肠杆菌可快速且高收率地生产异丙醇，因而，例如在使用本发明的大肠杆菌催化剂进行异丙醇的制造时，培养72小时，可蓄积97g/L以上的异丙醇，与以往的催化剂相比，可获得更高的生产能力。
[实施例]
以下记载本发明的实施例，但本发明不受它们的限制。需要说明的是，记载中的“％”只要没有特别说明，是质量基准。
[实施例1]
<[B::pntA]大肠杆菌B株pnt基因组强化株的制作>
将大肠杆菌B株的基因组上的pntA基因启动子置换为GAPDH启动子，将pntA基因的表达强化。
大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(基因库登录号U00096)，编码大肠杆菌的NAD(P)+转氢酶(AB特异性)α亚基的基因(以下，有时简称为pntA)的碱基序列也有报道(基因库登录号X04195)。另外也已知，在大肠杆菌MG1655株的基因组DNA上，pntA形成膜转氢酶β亚基(pntB)和操纵子。
作为为了使上述基因表达而必需的启动子的碱基序列，可使用在基因库登录号X02662的碱基序列信息中、记载于397-440中的大肠杆菌来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下，有时称为GAPDH)的启动子序列。为了取得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，通过cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列号1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列号2)，使用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶MfeI及EcoRI进行消化，从而得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段、与将质粒pUC19(基因库登录号X02514)用限制性内切酶EcoRI进行消化并且进行碱性磷酸酶处理而得到的片段混合，用连接酶连接，然后转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。对于得到的菌落中10个，分别在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，将质粒回收，选出在用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列，将GAPDH启动子被正确插入的质粒作为pUCgapP。将得到的pUCgapP用限制性内切酶EcoRI及HindIII进行消化。
进而，为了取得pntA，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，通过gcagcaattgctggtggaacatatgcgaattggcataccaag(序列号3)、及ggacaagcttaatttttgcggaacattttcagc(序列号4)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶MfeI及HindIII进行消化，从而得到约1.6kbp的pntA片段。将该DNA片段与之前用限制性内切酶EcoRI及HindIII进行消化后的pUCgapP混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，确认pntA被正确插入，将该质粒命名为pGAPpntA。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可由美国标准生物品收藏中心(American TypeCulture Collection)获得。
如前所述，已经知晓大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，还报道了pntA附近的碱基序列。使用基于大肠杆菌MG1655株的pntA的5’附近区域的基因信息制成的atggtaccgcagtaatacgctggttgc(序列号5)和cctctagacttccatcggttttattgatgatgg(序列号6)，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.0kbp的DNA片段。将该DNA片段用限制性内切酶KpnI和XbaI进行处理。
另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列信息制作的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列号7)、和基于大肠杆菌MG1655株的pntA的序列信息制作的序列号4的引物，将之前制作的表达载体pGAPpntA作为模板进行PCR，得到具有GAPDH启动子和pntA的约1.7kbp的DNA片段。将该DNA片段用限制性内切酶XbaI和HindIII进行处理。
将如上所述得到的pntA5’附近区域的DNA片段、及具有GAPDH启动子和pntA的DNA片段、与将温度敏感性质粒pTH18cs1(基因库登录号AB019610)〔Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)〕用KpnI和HindIII进行消化而得到的DNA片段混合，使用连接酶连接后，转化至DH5α株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认pntA5’附近区域、GAPDH启动子、pntA被正确插入。将该质粒转化至大肠杆菌B株(ATCC11303)中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42℃下进行培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30℃下培养4小时，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42℃下进行生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的基因组DNA中使含有GAPDH启动子和pntA的约1.7kbp片段扩增，选择pntA启动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌B株pntA缺失GAPppntA基因组插入株(以下，有时简称为B::pnt株)。
需要说明的是，大肠杆菌B株(ATCC11303)可由作为细胞·微生物·基因库的美国标准生物品收藏中心获得。
[实施例2]
<[pGAP-Iaaa/B::pnt]导入有大肠杆菌来源硫解酶基因、大肠杆菌来源CoA转移酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源异丙醇脱氢酶基因表达载体的大肠杆菌B株pnt基因组强化株的制作>
如下所述，制作强化了NAD(P)+转氢酶(AB特异性)基因(pnt)的表达的异丙醇制造大肠杆菌。
通过将WO2009/008377的实施例4中记载的pGAP-Iaaa转化至实施例1中制作的B::pnt株中，而得到pGAP-Iaaa/B::pnt株。pGAP-Iaaa是具有如下功能的表达载体质粒，所述功能为将大肠杆菌来源硫解酶基因、大肠杆菌来源CoA转移酶基因、丙酮丁醇梭菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、及拜氏梭菌来源异丙醇脱氢酶基因使用大肠杆菌来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子进行强表达。pGAP-Iaaa的制作方法明确记载于WO2009/008377的实施例4中。
[实施例3]
<[B::atoDAB]大肠杆菌B株atoDAB基因组强化株的制作>
大肠杆菌来源的CoA转移酶基因(atoD及atoA)和硫解酶基因(atoB)以atoD、atoA、atoB的顺序在大肠杆菌基因组上形成操纵子(Journal of Baceteriology Vol.169 pp42-52 Lauren Sallus Jenkins等)，因此，通过改变atoD的启动子，可同时控制CoA转移酶基因和硫解酶基因的表达。因此，制作将宿主大肠杆菌的基因组上的atoD基因的启动子置换为GAPDH启动子、基因组上的atoD、atoA及atoB基因的表达得到强化的大肠杆菌。
大肠杆菌MG1655株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(基因库登录号U00096)，编码大肠杆菌MG 1655株的CoA转移酶α亚基的基因(以下，有时简称为atoD)的碱基序列也有报道。即，atoD记载于基因库登录号U00096中记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2321469～2322131中。
作为为了使上述基因表达而必需的启动子的碱基序列，可使用在基因库登录号X02662的碱基序列信息中、记载于397-440中的大肠杆菌来源的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的启动子序列。为了取得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG 1655株的基因组DNA作为模板，通过cgctcaattgcaatgattgacacgattccg(序列号1)、及acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg(序列号2)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶MfeI及EcoRI进行消化，从而得到约100bp的编码GAPDH启动子的DNA片段。将得到的DNA片段、与将质粒pUC19(基因库登录号X02514)用限制性内切酶EcoRI进行消化并且进行碱性磷酸酶处理而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上进行生长繁殖的转化体。对于得到的菌落中10个，分别在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，将质粒回收，选出在用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化时GAPDH启动子未被切除的质粒，进而确认DNA序列，将GAPDH启动子被正确插入的质粒作为pUCgapP。将得到的pUCgapP用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化。
进而，为了取得atoD，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板，通过cgaattcgctggtggaacatatgaaaacaaaattgatgacattacaagac(序列号8)、及gcggtaccttatttgctctcctgtgaaacg(序列号9)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化，从而得到约690bp的atoD片段。将该DNA片段与之前用限制性内切酶EcoRI及KpnI进行消化后的pUCgapP混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。从得到的菌体中回收质粒，确认atoD被正确插入，将该质粒命名为pGAPatoD。
需要说明的是，大肠杆菌MG1655株可由美国标准生物品收藏中心获得。
如上所述，大肠杆菌MG1655株的基因组DNA中的atoD的碱基序列也有报道。使用基于大肠杆菌MG1655株的atoD的5’附近区域的基因信息制作的gctctagatgctgaaatccactagtcttgtc(序列号10)和tactgcagcgttccagcaccttatcaacc(序列号11)，将大肠杆菌MG1655株的基因组DNA作为模板进行PCR，由此扩增了约1.1kbp的DNA片段。
另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的GAPDH启动子的序列信息制作的ggtctagagcaatgattgacacgattccg(序列号12)和基于大肠杆菌MG1655株的atoD的序列信息制作的序列号9的引物，将之前制作的表达载体pGAPatoD作为模板进行PCR，得到具有GAPDH启动子和atoD的约790bp的DNA片段。
将如上所述得到的片段分别用限制性内切酶PstI和XbaI、XbaI和KpnI进行消化，将该片段与将温度敏感性质粒pTH18cs1(基因库登录号AB019610)〔Hashimoto-Gotoh，T.，Gene，241，185-191(2000)〕用PstI和KpnI进行消化而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至DH5α株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中在30℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒。将该质粒转化至大肠杆菌B株(ATCC11303)中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，在30℃下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42℃下进行培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30℃下培养2小时，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA中使含有GAPDH启动子和atoD的约790bp片段扩增，选择atoD启动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌B株atoD缺失GAPpatoD基因组插入株(以下，有时简称为B::atoDAB株)。
[实施例4]
<[pGAP-Ia]梭状芽胞杆菌属细菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源异丙醇脱氢酶基因表达载体的构建>
为了取得异丙醇脱氢酶基因(IPAdh)，使用拜氏梭菌NRRL B-593的基因组DNA作为模板，通过aatatgcatgctggtggaacatatgaaaggttttgcaatgctagg(序列号13)、及gcggatccctcgagttataatataactactgctttaattaagtc(序列号14)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶SphI、BamHI进行消化，从而得到约1.1kbp的异丙醇脱氢酶片段。将得到的DNA片段、与将pBRgapP(记载于WO2009/008377的实施例4中)用限制性内切酶SphI及BamHI进行消化从而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上进行生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认IPAdh被正确插入，将该质粒命名为pGAP-IPAdh。
为了取得乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)，使用丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因组DNA作为模板，通过cactcgaggctggtggaacatatgttaaaggatgaagtaattaaacaaattagc(序列号15)、及ggaattcggtaccgtcgactctagaggatccttacttaagataatcatatataacttcagc(序列号16)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行消化，从而得到约700bp的乙酰乙酸脱羧酶片段。将得到的DNA片段、与将之前制作的质粒pGAP-IPAdh用限制性内切酶XhoI及EcoRI进行消化从而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认adc被正确插入，将该质粒命名为pGAP-Ia。
需要说明的是，拜氏梭菌NRRL B-593可由作为细胞·微生物库的VTT生物品收藏中心得到。
[实施例5]
<[pGAP-Ia-gapP-atoB]梭状芽胞杆菌属细菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源异丙醇脱氢酶基因及大肠杆菌来源硫解酶基因表达载体的构建>
大肠杆菌B株的基因组DNA的全碱基序列是公知的(基因库登录号CP000819)，编码大肠杆菌的硫解酶(乙酰CoA酰基转移酶)的基因(atoB)的碱基序列也有报道(基因库登录号U08465)。为了克隆atoB(1,185bp)，合成两种cgggatccttaattcaaccgttcaatcac(序列号17)、ttccatatgaaaaattgtgtcatcgtc(序列号18)所示的寡核苷酸引物。分别地，序列号17的引物在5’末端侧具有NdeII识别位点，序列号18的引物在5’末端侧具有BamHI识别位点。
使用QIAGEN公司制的DNeasy Tissue试剂盒制备大肠杆菌B株(ATCC11303)的基因组DNA，将得到的基因组DNA作为模板，对于序列号17和序列号18的引物对，通过进行PCR而扩增了约1.2kb的DNA片段(以下，有时称为atoB片段)。将该atoB片段用琼脂糖电泳进行分离、回收，用NdeI及BamHI进行消化。将该消化片段、与上述pBRgapP的NdeI及BamHI消化物混合，用T4DNA连接酶反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺织公司制)中，得到在含有50μg/ml氨苄西林的LB琼脂板上在37℃下生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认atoB被正确插入，将该质粒命名为pGAP-atoB。将得到的质粒pGAP-atoB用BglII及BamHI进行消化，将含有GAPDH启动子和atoB的片段用琼脂糖电泳进行分离、回收，将该片段作为gapP-atoB。将该片段gapP-atoB、与将实施例4中制成的质粒pGAP-Ia用限制性内切酶BamHI进行消化从而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上进行生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认gapP-atoB被正确插入，将该质粒命名为pGAP-Ia-gapP-atoB。
[实施例6]
<[pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株]导入有pGAP-Ia-gapP-atoB的大肠杆菌B株atoDAB基因组强化株的制作>
将上述实施例5中记载的pGAP-Ia-gapP-atoB转化至实施例3中制成的B::atoDAB株中，得到在质粒和基因组双方将硫解酶基因(atoB)的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株。
[实施例7]
<[pGAP-Ia-maeB]梭状芽胞杆菌属细菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源异丙醇脱氢酶基因及大肠杆菌来源苹果酸脱氢酶基因表达载体的构建>
为了取得苹果酸脱氢酶基因，使用大肠杆菌B株(ATCC11303)的基因组DNA作为模板，通过cgggatcccggagaaagtcatatggatgaccagttaaaacaaag(序列号19)、及gctctagattacagcggttgggtttgcgc(序列号20)，用PCR法进行扩增，将得到的DNA片段用限制性内切酶BamHI及XbaI进行消化，从而得到约2300bp的苹果酸脱氢酶片段。将得到的DNA片段、与将在实施例4中制成的质粒pGAP-Ia用限制性内切酶XbaI及BamHI进行消化从而得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上进行生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认苹果酸脱氢酶基因被正确插入，将该质粒命名为pGAP-Ia-maeB。
[实施例8]
<[pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株]导入有pGAP-Ia-maeB的大肠杆菌B株atoDAB基因组强化株的制作>
将上述实施例7中记载的pGAP-Ia-maeB转化至实施例3中制成的B::atoDAB株中，得到将苹果酸脱氢酶基因(maeB)的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株。
[实施例9]
<[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB]梭状芽胞杆菌属细菌来源乙酰乙酸脱羧酶基因、梭状芽胞杆菌属细菌来源异丙醇脱氢酶基因、大肠杆菌来源苹果酸脱氢酶基因及大肠杆菌来源硫解酶基因表达载体的构建>
把将上述实施例7中制作的质粒pGAP-Ia-maeB用限制性内切酶BamHI进行消化从而得到的片段、与同实施例5同样操作得到的DNA片段gapP-atoB混合，使用连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺织株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄西林的LB琼脂板上生长繁殖的转化体。将得到的菌落在含有50μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中在37℃下培养一夜，从得到的菌体中回收质粒，确认gapP-atoB被正确插入，将该质粒命名为pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB。
[实施例10]
<[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株]导入有pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB的大肠杆菌B株atoDAB基因组强化株的制作>
将在上述实施例9中记载的pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB转化至在实施例3中制成的B::atoDAB株中，得到将苹果酸脱氢酶基因(maeB)和硫解酶基因(atoB)双方的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株。
[实施例11]
<[B::atoDAB::pnt]大肠杆菌B株atoDAB及pnt基因组强化株的制作>
将与实施例1同样操作得到的、将pntA5’附近区域的DNA片段和具有GAPDH启动子及pntA的DNA片段导入至温度敏感性质粒pTH18cs1而得到的质粒转化至实施例3中制作的B::atoDAB株中，在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上在30℃下培养一夜，得到转化体。将得到的转化体接种于含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基，在30℃下培养一夜。将得到的培养菌体涂布于含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上，在42℃下进行培养，得到菌落。将得到的菌落在不含抗生素的LB液体培养基中在30℃下培养2小时，涂布于不含抗生素的LB琼脂板上，得到在42℃下生长繁殖的菌落。
从出现的菌落中随机选出100个菌落，分别使它们在不含抗生素的LB琼脂板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂板上生长繁殖，选出氯霉素敏感性的克隆。进而，通过PCR从上述克隆的染色体DNA中使含有GAPDH启动子和pntA的约1.7kbp片段扩增，选择pntA启动子区域被GAPDH启动子置换的株，将满足以上条件的克隆命名为大肠杆菌B株atoD缺失GAPpatoDGAPppntA基因组插入株(以下，有时也简称为B::atoDAB::pnt株)。
[实施例12]
<[pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt]导入有pGAP-Ia-maeB的大肠杆菌B株atoD缺失GAPpatoDGAPppntA基因组插入株的制成>
将在实施例7中记载的pGAP-Ia-maeB转化至在实施例11中制作的B::atoDAB::pnt株中，得到将苹果酸脱氢酶基因(maeB)和NAD(P)+转氢酶(AB特异性)基因(pnt)双方的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt。
[实施例13]
<[pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt]导入有pGAP-Ia-gapP-atoB的大肠杆菌B株atoD缺失GAPpatoDGAPppntA基因组插入株的制成>
将在实施例5中记载的pGAP-Ia-gapP-atoB转化至在实施例11中制作的B::atoDAB::pnt株中，得到在质粒及基因组双方将硫解酶基因(atoB)的表达强化、并且将NAD(P)+转氢酶(AB特异性)基因(pnt)的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt。
[实施例14]
<[pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株]导入有pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB的大肠杆菌B株atoDAB及pntA基因组强化株的制作>
将在上述实施例9中记载的pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB转化至在实施例11中制作的B::atoDAB::pnt株中，得到将苹果酸脱氢酶基因(maeB)和NAD(P)+转氢酶(AB特异性)基因(pnt)的表达强化、并且在质粒及基因组双方将硫解酶基因(atoB)的表达强化的异丙醇制造大肠杆菌pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株。
[评价实验1]
<利用[pGAP-Iaaa/B株][pGAP-Iaaa/B::pntA株][pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株][pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株][pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株][pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt][pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt][pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株]进行的异丙醇的生产>
本评价实验中，使用WO2009/008377号说明书图1所示的生产装置进行异丙醇的生产。培养槽使用3升容量的槽，捕获槽使用10L容量的槽。培养槽、捕获槽、注入管、连接管、排出管均由玻璃制成。在捕获槽中以9L的量注入作为捕获液的水(捕获水)。需要说明的是，在培养槽上设置废液管，将由于糖或中和剂的流加而增量的培养液适当的排出至培养槽外。
将WO2009/008377号说明书中记载的pGAP-Iaaa/B株、上述实施例2中制作的pGAP-Iaaa/B::pnt株、实施例6中制作的pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株、实施例8中制作的pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株、实施例10中制作的pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株、实施例12中制作的pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt株、实施例13中制作的pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株、及实施例14中制作的pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株接种于装有100mL含有50μg/mL氨苄西林的LB Broth，Miller培养液(Difco244620)的500mL容量的锥形瓶中作为预培养，一边在培养温度30℃下、以120rpm的转速进行搅拌一边进行预培养，培养一夜。
需要说明的是，就WO2009/008377号说明书中记载的pGAP-Iaaa/B株而言，只不过是为了生产异丙醇而赋予了硫解酶活性，均未进行对苹果酸脱氢酶活性及NAD(P)+转氢酶(AB特异性)活性双方的强化，因而，与本发明的异丙醇生产大肠杆菌不同。
将得到的预培养物45mL移至装有以下所示组成的培养基855g的3L容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMS-PI)中，进行培养。培养在大气压下、通气量0.9L/min、搅拌速度550rpm、培养温度30℃、pH7.0(用NH3水溶液调节)的条件下进行。从培养开始直至8小时后的期间，以7.5g/L/小时的流速添加45wt/wt％的葡萄糖水溶液。然后，以20g/L/小时的流速添加45wt/wt％的葡萄糖水溶液。从培养开始直至72小时，进行数次菌体培养液的取样，通过离心操作除去菌体，然后通过HPLC按照常规方法测定得到的培养上清液中及捕获水中的异丙醇的蓄积量。需要说明的是，测定值是培养后的培养液与捕获水(9L)中的合计值。结果如图1及表1所示。进而，生产速度、收率及异丙醇蓄积量归纳示于表2。
需要说明的是，表1中的数值表示g/L，图1中的符号如下所述：
黑圆点：pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株；
黑方块：pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株；
白圆点：pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株；
白三角形：pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株；
白方块：pGAP-Iaaa/B::pnt株；
×；pGAP-Iaaa/B株；
白菱形：pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt株；
黑菱形：pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt株。
<培养基组成>
玉米浆(日本食品化工制)：20g/L
Fe2SO4·7H2O：0.1g/L
K2HPO4：2g/L
KH2PO4：2g/L
MgSO4·7H2O：2g/L
(NH4)2SO4：2g/L
Adekanol LG126(旭电化工业)0.1g/L
(剩余部分：水)
[表1]
[表2]
由上述结果可知，相对于以往的异丙醇制造大肠杆菌(pGAP-Iaaa/B株)，仅强化了NAD(P)+转氢酶(AB特异性)基因(pnt)的表达的株(pGAP-Iaaa/B::pntA株)、用仅赋予硫解酶基因(atoB)的表达及基因组强化双方强化的株(pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB株)、仅强化了苹果酸脱氢酶基因(maeB)的表达的株(pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株)，与以往的异丙醇生产大肠杆菌相比，均显示高的生产能力，以蓄积量计，分别为约1.7倍、约2.0倍、及约2.1倍。另外，仅强化了苹果酸脱氢酶基因(maeB)的表达的株(pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB株)中，丙酮、甲酸、乙酸等副产物减少。
另外，在强化了atoB及maeB双方的情况(pGAP-Ia-maeB-gapP-atoB/B::atoDAB株)、强化了maeB及pnt双方的表达的情况(pGAP-Ia-maeB/B::atoDAB::pnt)、强化了atoB及pnt的情况(pGAP-Ia-gapP-atoB/B::atoDAB::pnt)、强化了atoB及maeB及pnt3种全部酶基因的表达的情况下，异丙醇生产能力进一步提高，以蓄积量计，分别为约2.4倍、约2.3倍、约2.4倍、及约2.8倍。尤其是，可知在同时强化了NAD(P)+转氢酶(AB特异性)(pnt)、硫解酶基因(atoB)及苹果酸脱氢酶基因(maeB)的表达的情况下，与pGAP-Iaaa/B株相比，生产速度、收率和蓄积量均有令人惊异的提高，生产速度提高至3.2倍，收率提高至2.1倍，蓄积量提高至2.8倍。
将2010年3月9日提出申请的日本专利申请第2010-052249号公开的全部内容作为参照引入本说明书中。
本说明书中记载的所有文献、专利申请、及技术标准作为参照援引至本说明书中，各个文献、专利申请、及技术标准作为参照被引入的情况与具体且分别地记载的情况程度相同。

Claims (9)

1.一种异丙醇生产大肠杆菌，是具备由乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各酶基因构建的异丙醇生产系统的大肠杆菌，其具有经强化的苹果酸脱氢酶活性，
所述经强化的苹果酸脱氢酶活性来源于由从菌体外导入的酶基因引起的强化及由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化中的至少一种。
2.如权利要求1所述的异丙醇生产大肠杆菌，其还包含经强化的硫解酶活性，
所述经强化的硫解酶活性来源于由从菌体外导入的酶基因引起的强化及由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化中的至少一种。
3.如权利要求1所述的异丙醇生产大肠杆菌，其还具有经强化的AB特异性NAD(P)+转氢酶活性。
4.如权利要求3所述的异丙醇生产大肠杆菌，其还包含经强化的硫解酶活性，
所述经强化的硫解酶活性来源于由从菌体外导入的酶基因引起的强化及由菌体内的酶基因的表达增强引起的强化中的至少一种。
5.如权利要求1～4中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，所述经强化的酶活性来源于宿主大肠杆菌的基因组上的强化及由质粒导入引起的强化中的至少一种。
6.如权利要求1～4中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，所述经强化的酶活性来源于编码来自埃希氏菌属细菌的各酶的基因。
7.如权利要求1～4中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，所述异丙醇生产系统由所述乙酰乙酸脱羧酶、异丙醇脱氢酶、CoA转移酶及硫解酶的各酶基因构建，并且，各酶基因各自独立地来源于选自由梭状芽胞杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌及埃希氏菌属细菌组成的组中的至少一种的原核生物。
8.如权利要求1～4中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌，其中，所述乙酰乙酸脱羧酶活性来源于编码来自丙酮丁醇梭菌的酶的基因，所述异丙醇脱氢酶活性来源于编码来自拜氏梭菌的酶的基因，所述CoA转移酶活性、硫解酶活性、苹果酸脱氢酶活性及AB特异性NAD(P)+转氢酶活性来源于编码来自大肠杆菌的各酶的基因。
9.一种异丙醇生产方法，包括使用权利要求1～8中任一项所述的异丙醇生产大肠杆菌由植物来源原料生产异丙醇。
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