CN102333859B - 由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌 - Google Patents

由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌 Download PDF

Info

Publication number
CN102333859B
CN102333859B CN200980135975.2A CN200980135975A CN102333859B CN 102333859 B CN102333859 B CN 102333859B CN 200980135975 A CN200980135975 A CN 200980135975A CN 102333859 B CN102333859 B CN 102333859B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
lactic acid
intestinal bacteria
strain
sucrose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980135975.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102333859A (zh
Inventor
森重敬
高桥克幸
高桥均
和田光史
望月大资
宫泽大辅
安乐城正
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsui Chemicals Inc
Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Chemical Industry Co Ltd filed Critical Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Publication of CN102333859A publication Critical patent/CN102333859A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102333859B publication Critical patent/CN102333859B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供生产乳酸的大肠杆菌和使用该生产乳酸的大肠杆菌由来自植物的含有蔗糖的原料生产乳酸的乳酸生产方法，所述大肠杆菌具有蔗糖非PTS基因组中的至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因，但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合，并且具有利用基因重组的乳酸生产增强系统。

Description

由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌
技术领域
本发明涉及一种由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌。
背景技术
乳酸是作为聚合物原料或农药、药物的中间体近年来备受关注的有用物质。乳酸有L-乳酸和D-乳酸，目前工业生产的聚乳酸是L-乳酸聚合物，但D-乳酸作为聚合物原料或农药、药物的中间体近年来也备受关注。自然界中存在乳酸菌或丝状菌等有效生产乳酸的微生物，在使用上述菌的乳酸制造方法中，已知有使用Lactbacillusdelbrueckii等作为能有效生产L-乳酸的微生物的方法，另外已知有使用Sporolactobacillus属的微生物等作为能有效生产D-乳酸的微生物的方法。
但是事实上在任一用途中，都要求作为原料的乳酸具有高光学纯度。
随着近年来研究的进展，已经发明了高选择性高生产率地生产D-乳酸的微生物(参见国际公开2005/033324号说明书)。
另外，还已知由作为廉价的糖原料的蔗糖高选择性地生产D-乳酸的大肠杆菌(参见Biotechnolohy Letters，Vol.27，pp.1891-1896(2005))。但是，由蔗糖生产D-乳酸的大肠杆菌生产率低，并且在蔗糖的同化上非常花费时间，这在工业化上已成为课题。
关于L-乳酸，虽然已知以葡萄糖为原料高选择性高生产率地生产L-乳酸的大肠杆菌(日本特开2007-49993号公报)，但还没有由蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌。
根据现有的知识，微生物同化蔗糖的机制大致分为蔗糖PTS(PhosPhoenolPyruvate：Carbohydrate PhosPhotransferase System)和蔗糖非PTS 2种(例如日本特开2001-346578号公报)。经过蔗糖非PTS时，微生物以蔗糖的形式吸收蔗糖，之后分解为葡萄糖和果糖。另一方面，经过蔗糖PTS时，微生物在吸收蔗糖时将蔗糖磷酸化，转化为蔗糖-6-磷酸。并且在微生物内部分解为葡萄糖-6-磷酸和果糖。
即，即使经过任一机制，来自蔗糖的果糖均首先以未被磷酸化的形式出现在微生物内部。并且为了将上述未被磷酸化的果糖(以下称作非磷酸化果糖)吸收入糖酵解系统，果糖需要被异构化为葡萄糖或被磷酸化。但是由于文献(参见FEMS Yeast Res，Vol.5，pp.1055-1062(2005)；PNAS，Vol.98(26)，pp.15257-15259(2001)；J.Bacteriology，Vol.184(19)，pp.5307-5316(2002))中暗示了该微生物为大肠杆菌(不包括能同化一部分蔗糖的大肠杆菌)时将非磷酸化果糖异构化为葡萄糖的活性、将果糖磷酸化的活性均非常低，所以即使成功地使非磷酸化果糖出现在大肠杆菌内部，但只要不采用特殊的手段，则不能期待该大肠杆菌同化非磷酸化果糖。
已知蔗糖非PTS由CscB(进行蔗糖的吸收)、CscA(在微生物内部进行蔗糖的分解)、CscK(进行果糖的磷酸化)，CscR(控制CscB、A、K的表达)4种因子构成。上述Biotechnolohy Letters，Vol.27，pp.1891-1896(2005)中记载了将上述4种因子导入到生产D-乳酸的大肠杆菌中，实现了由蔗糖以相对于糖为93％的收率、96.5g/L/120小时的生产率的生产。但是从工业化的观点考虑，该生产率为不充分的水平，期待生产率的进一步提高。
另外，Can.J.Microbiol.，Vol.45，pp.418-422(1999)公开了通过在大肠杆菌中只导入cscA，大肠杆菌能够以蔗糖为原料进行繁殖。但是，该文献中没有涉及重要的来自蔗糖的果糖的同化。以蔗糖为原料的大肠杆菌在物质生产中的重要的一点是由蔗糖原料实现高收率。因此来自蔗糖的葡萄糖和来自蔗糖的果糖被有效地同化是必要条件。然而在该文献中虽然公开了在大肠杆菌中只导入CscA、蔗糖被同化，但没有公开来自蔗糖的果糖被同化程度的任何数据。
关于cscA，已知通过导入cscA、cscB、cscK和cscR基因组使来自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的氨基酸例如色氨酸的产生进一步提高(例如日本特开2007-49993号公报)。
如上所述，由于由蔗糖生产乳酸的现有方法的生产率仍然较低，并且蔗糖的同化仍然非常花费时间，所以仍然需要提高充分利用廉价且工业上利用价值高的蔗糖的工业上生产乳酸的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法，所述生产乳酸的细菌能够在更短的时间内同化蔗糖，并且在由蔗糖更有效地生产乳酸方面是有用的。
本发明提供生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法。即，本发明如下所述。
[1]一种生产乳酸的大肠杆菌，具有蔗糖非PTS基因组中至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因，但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合，并且具有利用基因重组的乳酸生产增强系统。
[2]如[1]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中上述蔗糖非PTS基因组中只具有蔗糖水解酶基因，并且具有利用基因重组的乳酸生产增强系统。
[3]如[1]或[2]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述生产乳酸的大肠杆菌进一步具有提高果糖代谢能力的系统。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述乳酸生产增强系统包括丙酮酸甲酸裂解酶活性的失活或降低。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述乳酸生产增强系统包括用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH依赖性乳酸脱氢酶活性的增强。
[6]如[1]～[4]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述乳酸生产增强系统包括D-乳酸脱氢酶活性的增强、和该大肠杆菌本身具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶活性的失活或降低。
[7]如[1]～[4]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述乳酸生产增强系统包括L-乳酸脱氢酶活性的增强、和该大肠杆菌本身具有的D-乳酸脱氢酶活性及FMN依赖性L-乳酸脱氢酶活性的至少任一方的失活或降低。
[8]如[3]～[7]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述提高果糖代谢能力的系统是在果糖代谢途径中磷酸化能力的增强或果糖吸收能力的增强。
[9]如[8]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述果糖代谢途径中磷酸化能力的增强来自果糖-1-磷酸激酶活性。
[10]如[8]所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述果糖代谢途径中果糖吸收能力的增强来自该大肠杆菌本身具有的FruR活性的失活或降低。
[11]如[1]～[10]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述蔗糖水解酶基因来自埃希氏菌属细菌。
[12]如[1]～[10]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述蔗糖水解酶基因来自大肠杆菌O 157细菌。
[13]如[9]～[12]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述果糖-1-磷酸激酶来自埃希氏菌属细菌。
[14]如[9]～[12]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，上述果糖-1-磷酸激酶是来自大肠杆菌MG1655的蛋白质。
[15]如[1]～[14]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，生产乳酸的大肠杆菌是大肠杆菌K12衍生株。
[16]一种生产乳酸的方法，包括使用[1]～[15]中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌、由来自植物的含有蔗糖的原料生产乳酸。
根据本发明，可以提供生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法，所述生产乳酸的细菌能够在更短的时间内进行蔗糖的同化，并且在更有效地生产乳酸方面是有用的。
附图说明
[图1]为表示使用本发明的实施例10中的各种生产乳酸的细菌培养48小时后生成的乳酸的蓄积量的图。
具体实施方式
本发明的乳酸生产菌是具有蔗糖非PTS基因组中至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因(但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合)、并且具有利用基因重组的乳酸生产增强系统的生产乳酸的大肠杆菌。
本发明的生产乳酸的方法是包括使用上述生产乳酸的细菌、由来自植物的含有蔗糖的原料生产乳酸的乳酸生产方法。
本发明的乳酸生产菌由于具有蔗糖非PTS基因组中至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因(但是不包括阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合)、并且具有乳酸生产增强系统，所以能够将来自蔗糖的果糖磷酸化并吸收入菌体内，同时能使用乳酸生产增强系统将该果糖转化为乳酸。在不具有蔗糖同化能力的菌中赋予蔗糖非PTS基因组中至少包括蔗糖水解酶的1种以上的基因，从而以蔗糖为碳源生成产物的事例到目前为止还完全没有报道。
本发明发现通过将蔗糖非PTS基因组中的部分但并非全部基因、即至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因导入到生产乳酸的大肠杆菌中，可以高效地同化来自蔗糖的果糖、并且比现有技术更显著地提高生产率。结果能由来自植物的、廉价且在工业上价值高的蔗糖在短时间内有效地得到乳酸。
特别是由于本发明的生产乳酸的细菌不论作为其他糖资源的葡萄糖的是否存在，均能同化蔗糖或作为其分解产物的果糖来生产乳酸，所以可以在葡萄糖等其他的糖基质较少或枯竭前生产乳酸，因此是更有效的。
通常已知大肠杆菌中葡萄糖的吸收通常优先于果糖，在葡萄糖的存在下果糖未被充分代谢。另外，糖代谢对生物而言是基本的功能。因此，令人吃惊的是果糖代谢途径的磷酸化活性或果糖吸收能力的增强并未阻碍细菌的繁殖、并且并未受葡萄糖引起的代谢抑制(分解代谢物阻抑)的影响、而可以有效地进行乳酸的生产。
本发明中所谓的蔗糖非PTS基因组，是指微生物的蔗糖同化途径中与非PTS系统有关的基因组。详细而言，是由阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)、蔗糖透过酶(cscB)构成的基因组。本发明中，只要为上述基因组中的至少包括cscA的1种以上的基因即可，例如可以举出仅有cscA；cscA及cscK的组合；cscA及cscB的组合；cscA及cscR的组合；cscA、cscB和cscR的组合；cscA、cscK和cscR的组合。需要说明的是，本发明中，从导入的蔗糖非PTS基因组的基因的组合中排除阻抑蛋白(cscR)、蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合、和蔗糖水解酶(cscA)、果糖激酶(cscK)及蔗糖透过酶(cscB)的组合。
其中，从更有效地生产乳酸的观点考虑，优选只具有编码cscA的基因，不包括其他基因。
本发明中所谓的蔗糖水解酶(转化酶、CscA)，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号3.2.1.26、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反应的酶的总称。
该酶是K12株等大肠杆菌中本身不具有的酶，是包括质子共转运体、转化酶、果糖激酶及蔗糖特异性阻抑蛋白的非PTS代谢途径的酶的1种(参见Canadian Journal of Microbiology，(1991)vol.45，pp418-422)。本发明中通过赋予上述CscA、特别是只赋予cscA，菌体外的蔗糖可以在细胞膜上被分解为葡萄糖及果糖并被释放到细胞外，通过葡萄糖PTS及果糖PTS被磷酸化并被引入细胞质内。结果果糖能被供给至细菌中的果糖代谢系统，并可利用糖酵解系统被同化。
作为本发明的被导入宿主细菌的蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖水解酶(转化酶、CscA)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(StaPhylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。另外优选在cscA中添加用于使cscA移到菌体的外周胞质的信号序列。
作为本发明的被导入宿主细菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码阻抑蛋白(CscR)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(StaPhylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。
作为本发明的被导入宿主细菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码果糖激酶(CscK)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(StaPhylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。
作为本发明的被导入宿主细菌的蔗糖透过酶(CscB)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码蔗糖透过酶(CscB)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因的公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自欧文菌属菌(Erwinia)、变形杆菌属菌(Proteus)、弧菌属菌(Vibrio)、农杆菌属菌(Agrobacterium)、根瘤菌属菌(Rhizobium)、葡萄球菌属菌(StaPhylococcus)，双歧杆菌属菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。特别优选为具有来自大肠杆菌O 157株的基因的碱基序列的DNA。
本发明中所谓的蔗糖同化，是指将蔗糖直接、或低分子化或高分子化后、优选低分子化后引入生物体内的能力，或者代谢性地将蔗糖转化为其他物质的能力。另外，本发明中，所谓同化包括将蔗糖进一步低分子化的分解。详细而言，包括将蔗糖分解为D-葡萄糖和D-果糖。
本发明中所谓的果糖代谢能力的提高是指引入菌体内的果糖增加的状态。所谓的果糖代谢能力提高系统是指使果糖的代谢能力提高的结构。
需要说明的是，本发明中所谓的“宿主”，是指接收一个以上的基因从菌体外的导入、结果变为本发明的生产乳酸的大肠杆菌的该大肠杆菌。
本说明书中所述的数值范围表示包括分别以所记载的数值为最小值及最大值的范围。
本发明中所谓的乳酸生产增强系统，是指用于提高乳酸生产能力的结构，所述结构是通过基因重组被导入或改变的。上述的乳酸生产增强系统可以为使作为对象的大肠杆菌中原有的乳酸生产量增加的系统中的任意系统。可以优选举出与乳酸生产活性有关的酶活性的失活、降低或增强或它们的组合。如上所述，与上述CscA活性组合时，即使为本身不具有蔗糖同化能力的大肠杆菌，也可以有效地由蔗糖生产乳酸。
需要说明的是，本发明中“利用基因重组”的用语，包括全部通过在原有基因的碱基序列中插入其他DNA、或基因的某部分的取代、缺失或它们的组合而产生的碱基序列上的改变，例如该改变可以是突变产生的。
本发明中所谓的“失活”，是指无论利用现有的任何测定系统进行测定的该酶或作为转录因子的FruR的活性都在检测限以下的状态。此处所谓的FruR的活性，是指将利用被FruR控制的基因的表达生成的蛋白质的量、或蛋白质的功能定量化得到的值。
本发明中所谓的“降低”，是指通过编码该酶或作为转录因子的FruR的基因的基因重组，而使与进行上述处理前状态相比该酶或FruR的活性显著降低的状态。此处所谓的FruR的活性，是指将利用被FruR控制的基因的表达生成的蛋白质的量、或蛋白质的功能定量化得到的值。
从副产物的减少及乳酸生产量的增加的观点考虑，本发明中的乳酸生产增强系统优选包括丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低、用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH依赖性乳酸脱氢酶活性的增强、或上述双方(关于丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低，参见WO2005/033324。关于NADH依赖性D-乳酸脱氢酶活性的增强，参见Yang等的文献(Metab.Eng.Vol.1(2)，pp141-152(1999))。
本发明中所谓的丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)，是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号2.3.1.54、也称作甲酸乙酰基转移酶的酶。该酶是指可逆地催化由丙酮酸生成甲酸的反应的酶的总称。
作为本发明中的NADH依赖性乳酸脱氢酶，可以举出D-乳酸脱氢酶(LdhA)和L-乳酸脱氢酶(Ldh2)。所谓LdhA是指由丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的来自大肠杆菌的酶。所谓Ldh2是指由丙酮酸和NADH生成L-乳酸和NAD的酶，例如可以举出来自长双歧杆菌的酶。
本发明中所谓的乳酸脱氢酶活性的增强，是指通过编码LdhA或Ldh2的基因的基因重组，而使与进行上述处理前的状态相比由编码LdhA或Ldh2的基因生产的酶的活性显著增加的状态。
需要说明的是，乳酸包括D-乳酸及L-乳酸的光学异构体，所以本发明中也将包括为了提高任意一方的光学异构体的生产量的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶或NADH依赖性L-乳酸脱氢酶的活性的增强的系统特别称作“D-乳酸生产增强系统”或“L-乳酸生产增强系统”。因此，根据作为目标的乳酸的种类的不同可以适当地选择乳酸生产增强系统的种类。
特别是为了更快速地生成D-乳酸，D-乳酸生产增强系统可以进一步包括该大肠杆菌本身具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(Dld)活性的失活或降低。D-乳酸生产增强系统更优选能够包括下述两方：该大肠杆菌本身具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(Dld)活性的失活或降低；及丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性的失活或降低及NADH依赖性D-乳酸脱氢酶活性的增强的至少一方，最优选Dld活性的失活或降低、Pfl活性的失活或降低、及来自大肠杆菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(LdhA)活性的增强均具备的D-乳酸生产增强系统。
另外为了更快速地生成L-乳酸，L-乳酸生产增强系统可以进一步包括该大肠杆菌本身具有的FMN依赖性L-乳酸脱氢酶(LldD)活性或D-乳酸脱氢酶(LdhA)活性的失活或降低，优选LldD活性和LdhA活性同时失活或降低。更优选pfl活性、lld活性及ldhA活性的至少一者的活性失活或降低、且NADH依赖性L-乳酸脱氢酶活性增强。最优选Pfl活性及LldD活性及LdhA活性全部失活或降低、且来自双歧杆菌的NADH依赖性L-乳酸脱氢酶活性增强。
本发明中所谓的FMN依赖性L-乳酸脱氢酶(LldD)，是指基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号1.1.2.3的酶。该酶是催化由L-乳酸生成丙酮酸反应的酶的总称。
作为本发明中LdhA活性增强、且Pfl活性失活或降低的细菌的例子，可以举出WO2005/033324号中记载的MT-10934/pGlyldhA。
本发明中作为增强LdhA活性或Ldh2的方法之一，下述方法是有效的，即，将编码LdhA或Ldh2的基因和控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子连接，在该状态下组装到表达质粒中，再将表达质粒导入到所希望的细菌中。此种情况下的控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生物合成系统相关的蛋白质表达的基因的启动子是指通常在细菌内、优选在大肠杆菌内发挥作用的强启动子、且即使在葡萄糖存在下其表达也不易受抑制的启动子，具体而言，可以举出甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶(GlyA)启动子。如上所述得到的细菌在通气条件下生产D-乳酸或L-乳酸时，与ldhA或ldh2的表达未被增强时相比，提高了D-乳酸或L-乳酸的蓄积量，作为杂质的丙酮酸浓度减少，并且能提高D-乳酸或L-乳酸的光学纯度。
本发明中所谓的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(Dld)，是指催化在作为辅酶的氧化型黄素腺嘌呤二核苷酸的存在下由D-乳酸生成丙酮酸的反应的酶的总称。
本发明中作为以Dld活性失活或降低、且/或Pfl活性失活或降低、且/或LdhA活性增强为特征的微生物，可以举出WO2005/033324号中记载的大肠杆菌MT-10994(FERMBP-10058)株。
本发明中所谓的控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统或氨基酸生合成系统有关的蛋白质的表达的基因的启动子，是指通常在微生物内发挥作用的强启动子，且即使在葡萄糖存在下其表达也不易受抑制的启动子，具体而言可以举出甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。
本发明中所谓的启动子是指具有σ因子的RNA聚合酶结合、并开始转录的位点。例如来自大肠杆菌的GAPDH启动子在GenBankaccession number X02662的碱基序列信息中被记为碱基编号397-440。
本发明中作为具有下述特征的微生物，可以举出WO2005/033324号中记载的大肠杆菌MT-10994(FERM BP-10058)株，所述特征为：编码LdhA的基因在基因组上通过使用控制与糖酵解系统、核酸生物合成系统、或氨基酸生物合成系统有关的蛋白质的表达的基因的启动子而表达该ldhA，Pfl活性失活或降低，且/或Dld活性失活或降低。
大肠杆菌MT-10994株通过在基因组上与GAPDH启动子功能性地连接而使ldhA基因表达，另外通过基因破坏，PflB、Dld失活。基于涉及专利程序上的微生物保藏等国际认证的布达佩斯条约，本菌株于平成16年3月19日以保藏编号FERM BP-10058保藏在日本茨城县筑波市东1丁目1番1号中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
本发明的生产乳酸的细菌，从乳酸生产效率的观点考虑，优选进一步具有果糖代谢能力提高系统。作为上述果糖代谢能力提高系统，可以举出在果糖代谢途径中使磷酸化能力增强或果糖吸收能力增强的系统。此时，从乳酸生产效率的观点考虑，更优选果糖代谢途径中磷酸化能力的增强是赋予果糖-1-磷酸激酶活性，果糖吸收能力的增强来自FruR活性的降低。
本发明中能力的“赋予”或“增强”，除了包括将编码酶的基因从宿主细菌的菌体外导入菌体内之外，还包括使宿主细菌在基因组上具有的酶基因的启动子活性增强，或通过被其他的启动子取代使酶基因强表达。
本发明中所谓的磷酸化能力的“增强”是指磷酸化酶的活性提高从而使被磷酸化的基质的量、或从该被磷酸化的基质派生的代谢物的量显著增加的状态。
本发明中所谓果糖吸收能力的增强，是指FruR控制的酶活性通过编码FruR的基因的基因重组而与进行上述处理前的状态相比该酶活性显著下降的状态。
本发明中酶的活性可以为利用现有的测定系统的任一种测定的活性。
本发明中果糖-1-磷酸激酶(FruK)是基于国际生物化学联合(I.U.B.)酶委员会报告被归属于酶编号2.7.1.56、也被称作果糖磷酸激酶1的酶。在细菌类例如在大肠杆菌内的果糖吸收通常在葡萄糖的存在下被抑制，相对于此，到目前为止还完全未发现FruK表达的增强即使在葡萄糖的存在下也能促进果糖的吸收，并有助于生产D-乳酸的细菌中D-乳酸的生产率的提高。另外，利用上述CscA由蔗糖得到的果糖被吸收进细胞内并被代谢为果糖-1-磷酸后，仅通过一系列的果糖代谢系统中的FruK的表达增强即可提高乳酸的生产率，这也是预想之外的。
作为本发明的被导入宿主细菌的果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因，可以利用由具有该酶的生物得到的具有编码果糖-1-磷酸激酶(FruK)的基因的碱基序列的DNA、或基于该基因公知的碱基序列合成的合成DNA序列。作为优选例，可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)、假单胞菌属菌(Pseudomonas)、气杆菌属菌(Aerobacter)、梭状芽孢杆菌属菌(Clostridium)的基因，特别是可以举出来自埃希氏菌属菌(Escherichia)的基因，例如可以举出具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA。特别优选具有来自大肠杆菌MG1655株的基因的碱基序列的DNA。
本发明中的FruR控制构成果糖PTS途径的基因组的表达，即，控制果糖操纵子的表达，通过所述的果糖PTS途径，微生物将果糖磷酸化并引入细胞内。为大肠杆菌时，具体而言可以举出具有记载于GenBank accession number U00096中所记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的88028～89032的序列的基因。破坏FruR基因时，已知作为果糖的磷酸供体的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的合成活性被抑制，结果一般认为果糖未被吸收入菌体内(参见Microbiology Reviews，SePt.，PP.543-594(1993))。因此，fruR表达的降低可能促进果糖的吸收是完全在预想之外的，fruR表达的降低有助于生产D-乳酸的细菌中D-乳酸生产率的提高完全是新的发现。
作为本发明中表达被降低的FruR基因，可以为宿主细菌本身具有的基因，也可以为宿主细菌本身具有的具有编码FruR的基因的碱基序列的DNA、或基于FruR基因公知的碱基序列组装的合成DNA序列。
更优选蔗糖水解酶及果糖-1-磷酸激酶(FruK)均通过导入编码来自大肠杆菌O 157或大肠杆菌MG 1655的各个蛋白质的基因而得到。通过利用来自上述细菌的基因可以确保功能表达。
本发明中所谓赋予酶活性的细菌，是指通过某种方法从菌体外向菌体内被赋予了该酶活性的细菌。上述细菌例如可以使用利用基因重组技术将编码该酶及蛋白质的基因从菌体外导入菌体内等方法进行制作。将基因从菌体外导入菌体内时必要的基因组DNA的制备、DNA的切断及连接、转化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的设计、合成等的方法能够使用本领域技术人员熟知的一般方法进行。上述方法记载于Sambrook，J.，et.al.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，(1989)等中。
本发明中所谓的酶活性降低的细菌，是指与赋予上述活性的细菌相同地利用某种方法从菌体外到菌体内原有的活性被破坏的细菌。上述细菌例如可以通过破坏编码该酶及蛋白质的基因(基因破坏)制备。
本发明中所谓的基因破坏，是指为了使某基因的功能不能发挥而在该基因的碱基序列中引入突变、插入另外的DNA或使基因的某部分缺失。基因破坏的结果为：该基因不能转录为mRNA，从而使结构基因不被翻译；或者被转录的mRNA不完全，从而使被翻译的结构蛋白质的氨基酸序列中发生突变或缺失，不能发挥原有的功能。
基因破坏株的制备可以使用任意方法只要能得到该酶或蛋白质不表达的破坏株。已经报道了各种基因破坏的方法(自然育种、诱变剂添加、紫外线照射、放射线照射、随机突变、转座子、部位特异性基因破坏)，但从只能破坏某种特定基因的方面考虑，优选利用同源重组的基因破坏。利用同源重组的方法记载于J.Bacteriol.，161，1219-1221(1985)或J.Bacteriol.，177，1511-1519(1995)或Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，97，6640-6645(2000)中，该领域技术人员可以利用上述方法及其应用容易地实施。
本发明中所谓的大肠杆菌，是指无论本身是否具有由来自植物的原料生产乳酸的能力，均具有能通过使用某种方法而得到由来自植物的原料生产乳酸的能力的大肠杆菌。
此处作为导入上述各基因的大肠杆菌，可以为不具有乳酸生产能力的通常的大肠杆菌，也可以为允许上述各基因的导入及变更的任意大肠杆菌。较优选为预先赋予了乳酸生产能力的大肠杆菌，由此可以更有效地生产乳酸。特别是根据本发明对本身不具有蔗糖同化能力的大肠杆菌赋予蔗糖同化能力可以由蔗糖有效地生产乳酸。作为上述本身不具有蔗糖同化能力的大肠杆菌，可以举出K12株、B株、C株及其衍生株等。
作为上述生产乳酸的细菌，例如可以举出：国际公开2005/033324号说明书中记载的丙酮酸甲酸裂解酶(Pfl)活性失活或降低、且来自大肠杆菌的NADH依赖性D-乳酸脱氢酶(LdhA)活性增强的大肠杆菌；或者除在上述特性之外进而FAD依赖性D-乳酸脱氢酶(Dld)活性失活的大肠杆菌；或苹果酸脱氢酶(Mdh)活性失活或降低且Pfl活性失活或降低且/或Dld活性失活或降低的大肠杆菌等。
作为本发明中用于使各种基因表达的启动子，只要能控制上述任一种基因的表达即可，优选为通常在微生物内发挥作用的强启动子、且即使在葡萄糖存在下其表达也不易受到抑制的启动子，具体而言可以举出甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子或丝氨酸羟甲基转移酶的启动子。
另外作为用于使各种基因失活的方法，只要使用用于该目的的通常使用的方法即可，没有特殊限制，例如可以举出利用同源重组等的基因破坏。
本发明的生产乳酸的方法包括使用上述生产乳酸的细菌由来自植物的含有蔗糖的原料生产乳酸的方法，即，为包括使上述生产乳酸的细菌与来自植物的含有蔗糖的原料接触的工序、和将通过接触得到的乳酸回收的回收工序的方法。
上述乳酸生产方法中使用的来自植物的原料只要为从植物得到的碳源、且为来自植物的含有蔗糖的原料即可，没有特殊限制。本发明中是指根、茎、杆、枝、叶、花或种子等器官、含有它们的植物体、上述植物器官的分解产物，进而在由植物体、植物器官、或它们的分解产物得到的碳源中能在微生物的培养中用作碳源的也包含在来自植物的原料中。
包含在上述的来自植物的原料中的碳源中，除蔗糖之外，作为一般物质可以举出：淀粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖类，或大量含有上述成分的草木质分解产物或纤维素水解物等或它们的组合，进而来自植物油的甘油或脂肪酸也可以包含在本发明中的碳源中。
本发明中作为来自植物的原料的示例，可以优选举出粮食等农作物，例如玉米、米、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它们的组合，作为该原料的使用形式，可以为未加工品、榨汁、粉碎物等，没有特别限定。另外，也可以是只为上述碳源的形式。
接触工序中生产乳酸的细菌和来自植物的原料的接触通常可以在含有来自植物的原料的培养基中通过培养生产乳酸的细菌而进行。
来自植物的原料和生产乳酸的细菌的接触密度根据生产乳酸的细菌的活性而不同，通常情况下，作为培养基中来自植物的原料的浓度，相对于混合物的总质量，以葡萄糖换算可以使初始的糖浓度为20质量％以下，从细菌的耐糖性的观点考虑，优选使初始的糖浓度为15质量％以下。其他的各成分只要以微生物的培养基中通常添加的量添加即可，没有特殊限制。
另外作为培养基中的生产乳酸的细菌的含量，根据细菌的种类及活性而不同，但通常情况下初始菌浓度相对于培养液可以为0.1质量％～30质量％，从控制培养条件的观点考虑，优选为1质量％～10质量％。
作为用于培养生产乳酸的细菌的培养基，只要为含有碳源、氮源、无机离子、及为生产乳酸微生物所必需的有机微量元素、核酸、维生素类等的培养基即可，没有特殊限制。
作为碳源，可以适当使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖类；富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸；甲醇、乙醇、甘油等醇类及其他碳源。作为氮源，可以适当使用有机铵盐、无机铵盐、氨气、氨水等无机氮源、及蛋白质水解产物等有机体氮源及其他氮源。作为无机离子，可以根据需要适当使用镁离子、磷酸离子、钾离子、铁离子、锰离子及其他无机离子。
作为有机微量成分，可以适当使用维生素、氨基酸等及含有它们的酵母提取物、胨、玉米浆、酪蛋白分解物及其他有机微量成分。
需要说明的是，作为本发明中使用的培养基，从应用于工业生产的方面考虑，优选为液体培养基。
可以优选举出添加有2种以上氨基酸的培养基。通过使用上述培养基可以更有效地生产乳酸。所谓添加有2种以上的氨基酸的培养基，是指含有天然存在的各种氨基酸中的至少2种以上的培养基，也包括含有酵母提取物、酪蛋白水解物、胨、乳清、废糖蜜、玉米浆等天然物质或天然物质提取物的水解产物的培养基。为了得到较优选的结果，优选含有0.5质量％～20质量％、更优选含有2质量％～15质量％的选自酵母提取物、胨、乳清、废糖蜜及玉米浆中的至少1种或它们的混合物的培养基。特别是玉米浆的添加能得到明显的效果，此时不添加硫酸铵等盐反而有时得到更好的结果。培养基为通常的液体培养基。
培养条件根据制备的菌体、培养装置而改变，通常情况下优选在20℃～40℃，较优选在25℃～35℃下的培养温度下进行培养，优选利用NaOH、NH3等将pH调至4～9、更优选至6.0～7.2，更优选至6.5～6.9进行培养。培养时间没有特别限定，是菌体充分增殖、且乳酸生成所需要的时间。
培养时通常使用能控制温度、pH、通气条件、搅拌速度的培养槽，但本发明的培养并不限于使用培养槽。使用培养槽培养时，根据需要也可以预先进行作为预培养的种培养，然后将其必要量接种到预先配制的培养槽内的培养基中。
培养本发明中得到的微生物生产乳酸时，可以完全不进行通气，但为了得到较优选结果，进行通气较好。此处所谓的通气条件下，未必是必须将空气通过培养液中，也包括根据培养槽的形状一边适度地搅拌培养液一边将培养液上的空气层进行换气之类的上面通气，所谓的通气条件下是指使含有氧的气体流入培养槽的内部。
通气到液体中时，由于根据内压、搅拌桨位置、搅拌桨形状、搅拌速度的组合溶存的氧浓度发生变化，所以可以以乳酸的生产率及除乳酸之外的有机酸的量等为指标如下求出最适条件。例如，使用500g的培养液利用ABLE公司制培养装置BMJ-01等较小型的培养槽进行培养时，通过能够达到在常压下0.005L/分钟～0.5L/分钟的通气率和50rpm～500rpm的搅拌速度、较优选能够达到在常压下0.05L/分钟～0.25L/分钟的通气率和100rpm～400rpm的搅拌速度的通气条件可以得到合适结果。所述通气搅拌条件可以在以温度30℃的水为对象的情况下在常压下以1/h以上400/h以下的氧转移速度系数(kLa)进行氧的供给。
上述通气条件不需要从培养初期至结束一直维持，即使在培养工序的一部分维持上述通气条件也能够得到合适结果。
在回收工序中，回收由上述接触得到的乳酸，通常情况下也可以从通过上述培养得到的培养物中回收乳酸。
本发明中所谓的培养物，是指利用上述方法生产的菌体、培养液、及它们的处理物。
从培养物中回收乳酸的方法可以利用例如从培养液中收集等通常已知的方法，例如可以采用下述方法：利用离心分离等除去菌体后进行酸化、然后直接进行蒸馏的方法；形成丙交酯并进行蒸馏的方法；加入醇和催化剂进行酯化后进行蒸馏的方法；在有机溶剂中进行提取的方法；利用离子交换柱进行分离的方法；利用电透析进行浓缩分离的方法等和组合上述方法的方法。另外，由于利用本发明的方法生产的菌体产生了适合乳酸生产的酶组，所以利用菌体进一步生产、回收乳酸也被认为是从培养物回收乳酸的方法的一部分。
[实施例]
以下记载本发明的实施例，但是本发明并不受这些实施例的限制。需要说明的是，只要没有特殊说明，则“％”及“份”为质量基准。
[实施例1]
<大肠杆菌MG1655株dld基因缺失株的制备>
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，编码大肠杆菌的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶的基因(以下也简称dld)的碱基序列也被报道(Genbankaccession number M10038)。
基于大肠杆菌MG 1655株基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息，合成了下述4种寡核苷酸引物：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号1)、TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列号2)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列号3)及TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号4)。
通过Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley & Sons)记载的方法制备大肠杆菌MG1655株的基因组DNA，以所得的基因组DNA为模板，使用序列号1和序列号2的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.4kbp的DNA片段(以下也称作dld-L片段)，使用序列号3和序列号4的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.2kbp的DNA片段(以下也称作dld-R片段)。分别利用限制酶HindIII和PstI、PstI和XbaI消化所得的dld-L片段、dld-R片段。将该片段与利用HindIII、XbaI消化温度感受性质粒pTH18cs1(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.，Gene，Vol.241(1)，PP185-191(2000))所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒。将所得的质粒命名为pTHΔdld。
需要说明的是，大肠杆菌MG 1655株可以从作为细胞·微生物·基因库的美国模式菌种收集中心获得。
[实施例2]
于30℃下将实施例1中得到的质粒pTHΔdld转化到MG1655株中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的转化体涂布到琼脂平板上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。
进而再一次重复得到于42℃下繁殖的单菌落的操作，选择通过同源重组质粒整体被组装到染色体中的克隆体。确认了该克隆体的细胞质中不具有质粒。
然后将上述克隆体涂布在LB琼脂平板上，于30℃下培养一夜后，接种到LB液体培养基(3ml/试管)中，于42℃下振摇培养3～4小时。为了得到单菌落，将其进行适当地稀释(10-2～10-6左右)，涂布在LB琼脂平板上，于42℃下培养一夜，得到菌落。从出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在LB琼脂平板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，选出只在LB琼脂平板上繁殖的氯霉素感受性克隆体。然后使用上述目标克隆体的染色体DNA利用PCR扩增含有dld的约2.0kb的片段，选择dld基因区域缺失的株，以满足以上条件的克隆体作为dld缺失株，将所得的株命名为MG1655Δdld株。
[实施例3]
<大肠杆菌MG1655pflB、dld基因缺失株的制备>
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，编码大肠杆菌的丙酮酸甲酸裂解酶的基因(pflB)的碱基序列也被报道(Genbank accession number X08035)。为了克隆pflB基因的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：GCACGAAAGCTTTGATTACG(序列号5)、TTATTGCATGCTTAGATTTGACTGAAATCG(序列号6)TTATTGCATGCTTATTTACTGCGTACTTCG(序列号7)AAGGCCTACGAAAAGCTGCAG(序列号8)。
以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，使用序列号5和序列号6的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.8kbp的DNA片段(以下也称作pflB-L片段)，使用序列号7和序列号8的引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约1.3kbp的DNA片段(以下也称作pflB-R片段)。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用HindIII及SphI消化pflB-L片段，用SphI及PstI消化pflB-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)的HindIII及PstI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含pflB基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，命名为pTHΔpfl。
将所得的质粒pTHΔpfl转化到实施例2中得到的MG1655Δdld株中，得到于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的转化体涂布到琼脂平板上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述培养菌体，将培养的转化体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。
按照与实施例2相同的方法从所得的克隆体得到pfl基因被破坏的MG1655Δdld株，命名为MG1655ΔpflΔdld株。
[实施例4]
<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株的制备>
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠杆菌的mdh基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number M24777)。为了克隆mdh基因(939bp)的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：AAAGGTACCAGAATACCTTCTGCTTTGCCC(序列号9)、AAAGGATCCCCTAAACTCCTTATTATATTG(序列号10)、AAAGGATCCAAACCGGAGCACAGACTCCGG(序列号11)及AAATCTAGAATCAGATCATCGTCGCCTTAC(序列号12)。
以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号9和序列号10、序列号11和序列号12的组合，在通常条件下进行PCR，由此扩增约800bp(以下也称作mdh-L片段)及约1,000bp(以下也称作mdh-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用KpnI及BamHI消化mdh-L片段，用BamHI及XbaI消化mdh-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBank accession number AB019610)的KpnI及XbaI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含编码mdh的基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔmdh。
将质粒pTHΔmdh转化到实施例3中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdld株中，按照与实施例2相同的方法获得mdh基因被破坏的MG1655ΔpflΔdld株。将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdh株。
[实施例5]
<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的制备>
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠杆菌的aspA基因的碱基序列也被报道(Genbank accession number X04066)。为了克隆aspA基因(1,482bp)的碱基序列的附近区域，合成了下述4种寡核苷酸引物：TTTTGAGCTCGATCAGGATTGCGTTGGTGG(序列号13)、CGAACAGTAATCGTACAGGG(序列号14)、TACGATTACTGTTCGGCATCGACCGAATACCCGAG(序列号15)及TTTTTCTAGACCTGGCACGCCTCTCTTCTC(序列号16)。
以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号13和序列号14、序列号15和序列号16的组合，使用上述引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约910bp(以下也称作aspA-L片段)及约1,100bp(以下也称作aspA-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，利用DNA Blunting Kit(TAKARA BIO)将aspA-L片段和aspA-R片段的两者的末端平端化后，使用T4多核苷酸激酶按照常规方法磷酸化5’末端。另外，温度感受性质粒pTH18cs1经SmaI消化后，利用碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理。利用T4DNA连接酶使上述磷酸化的2种片段与脱磷酸化的质粒反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含aspA基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔasp。
将质粒pTHΔasp转化到实施例4中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdh株中，最终得到aspA基因被破坏的MG1655ΔpflΔdldΔmdh株，命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株。得到该株的详细方法基于本发明的实施例2中所述的方法。
[实施例6]
<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株的基因组上ldhA启动子对GAPDH启动子的取代>
大肠杆菌的ldhA基因的碱基序列已经被报道(GenBankaccession number U36928)。为了获得甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用AACGAATTCTCGCAATGATTGACACGATTC(序列号17)、及ACAGAATTCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号18)用PCR法进行扩增，利用限制酶EcoRI消化所得的DNA片段，由此得到约100bp编码GAPDH启动子的片段。进而为了获得D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用GGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGAAACT(序列号19)、及CCCAAGCTTTTAAACCAGTTCGTTCGGGC(序列号20)用PCR法进行扩增，利用限制酶EcoRI及HindIII消化所得的DNA片段，由此得到约1.0kbp的D-乳酸脱氢酶(ldhA)基因片段。将上述2个DNA片段与利用限制酶EcoRI及HindIII消化质粒pUC 18所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-ldhA。
进而使用基于大肠杆菌MG1655株的ldhA基因5’附近区域的基因信息制备的AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号21)和GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号22)，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR，由此扩增约1000bp的DNA片段。
另外，使用基于大肠杆菌MG1655株的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子的序列信息制备的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列号23)和基于大肠杆菌MG1655株的ldhA基因的序列信息制备的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列号24)，以预先制备的质粒pGAPldhA为模板进行PCR，得到由GAPDH启动子和ldhA基因的起始密码子的附近区域组成的约850bp的DNA片段。
分别利用限制酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI消化如上所述得到的片段，将该片段与利用KpnI和PstI消化温度感受性质粒pTH18cs1所得的片段混合，使用连接酶连接后，于30℃下转化到DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒，命名为pTH-GAPldhA。
将所得的质粒pTH-GAPldhA转化到实施例5中得到的大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp株，于30℃下在含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上培养一夜，得到转化体。将所得的转化体接种到含有10μg/ml氯霉素的LB液体培养基上，于30℃下培养一夜。然后为了得到上述的培养菌体，将培养的转化体涂布到含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。将所得的菌落于30℃下在不含氯霉素的LB液体培养基上培养一夜，进而涂布到不含氯霉素的LB琼脂平板上，得到于42℃下繁殖的菌落。
从出现的菌落中任意挑选100个菌落，使其分别在不含氯霉素的LB琼脂平板和含有10μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上繁殖，选出氯霉素感受性克隆体。然后使用上述目标克隆体的染色体DNA利用PCR扩增含有GAPDH启动子和ldhA基因的约800bp的片段，选择ldhA启动子区域被GAPDH启动子取代的株，将满足以上条件的克隆体命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。
[实施例7]
<大肠杆菌MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株的制备>
大肠杆菌的基因组DNA的全部碱基序列是公知的(GenBankaccession number U00096)，大肠杆菌MG1655的fruR基因的碱基序列已经被报道。即，fruR基因被记载在GenBank accession numberU00096中所记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的88028～89032。
为了克隆fruR基因(1005bp)的碱基序列的附近区域，合成了如下所示的4种寡核苷酸引物：TACTGCAGATCTCAATAACCGCTATCTGG(序列号25)、GCTCTAGATAGCCATTGTACTGGTATGG(序列号26)、TATCTAGATGCTCAGCCGTAGCTAAGC(序列号27)及CGAATTCATCCATCTGACATTCGCTGG(序列号28)。
以大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用序列号25和序列号26、序列号27和序列号28的组合，使用上述引物，在通常条件下进行PCR，由此扩增约950bp(以下也称作fruR-L片段)及约880bp(以下也称作fruR-R片段)的DNA片段。利用琼脂糖电泳分离、回收上述DNA片段，用PstI及XbaI消化fruR-L片段，用XbaI及EcoRI消化fruR-R片段。利用T4DNA连接酶使上述2种消化片段与温度感受性质粒pTH18cs1(GenBan kaccessionnumberAB019610)的PstI及EcoRI消化物反应后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到包含fruR基因的5’上游附近片段和3’下游附近片段的2个片段的质粒，将该质粒命名为pTHΔfruR。
将质粒pTHΔfruR转化到实施例6中得到的大肠杆菌MG 1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株中，按照与实施例2相同的方法获得fruR基因被破坏的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株。将该株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株。
[实施例8]
<来自大肠杆菌O 157的蔗糖水解酶(转化酶)的基因表达载体及该表达载体转化体的构建>
大肠杆菌O 157的转化酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码转化酶的基因(cscA)被记载在GenBank accessionnumber AE005174中所记载的大肠杆菌O 157株基因组序列的3274383～3275816。上述基因编码的蛋白质的N末端侧，存在与在单字母氨基酸标记中以MTQSRLHAA(序列号35)表示的、疏水性高并利用信号肽酶切断的氨基酸序列相同的序列。作为用于表达上述基因所必需的启动子的碱基序列，可以使用在GenBank accessionnumber X02662的碱基序列信息中被记于397-440的来自大肠杆菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子序列。
为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号29)、及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号30)用PCR法进行扩增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段，由此得到约110bp的相当于GAPDH启动子的DNA片段。将所得的DNA片段与利用限制酶NdeI及PvuII消化质粒pBR322(GenBankaccessionnumberJ01749)得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pBRgapP。
为了获得转化酶基因，使用大肠杆菌O 157的基因组DNA(SIGMA-ALDRICH：IRMM449)为模板，利用GATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGACGCAATCTCGATTGCATG(序列号31)、及ATGGTACCTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列号32)用PCR法进行扩增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到约1.4kbp的转化酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶XbaI及PshAI消化预先制成的质粒pBRgapP得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA。
将该质粒pGAP-cscA转化到实施例7中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株。
另外转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株。
[实施例9]
<来自大肠杆菌O 157的转化酶基因、来自大肠杆菌MG1655的果糖-1-磷酸激酶基因的表达载体及该表达载体转化体的构建>
大肠杆菌MG1655的果糖-1-磷酸激酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码果糖-1-磷酸激酶的基因(fruK)被记载在GenBank accession number U00096中所记载的大肠杆菌MG1655株基因组序列的2260387～2259449。
为了获得果糖-1-磷酸激酶基因，使用大肠杆菌MG1655的基因组DNA为模板，利用ATGGTACCGGAGAAAGTCTTATGAGCAGACGTGTTGCTAC(序列号33)、及TCGGATCCTTATGCCTCTCCTGCTGTCAG(序列号34)用PCR法进行扩增，利用限制酶KpnI消化所得的DNA片段，由此得到约1.0kbp的果糖-1-磷酸激酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶KpnI及EcoRV消化实施例8中制成的质粒pGAP-cscA所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-cscA-fruK。
将上述质粒pGAP-cscA-fruK转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-fruK株。
[实施例10]
<利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-fruK株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株生产D-乳酸>
作为预培养，是在3个装有25ml LB Broth、Miller培养液(Difco244620)的500ml容量带挡板的锥形瓶中分别植入实施例8中得到的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株(以下为“fruR破坏株”或“ΔfruR株”)、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株(以下为“cscA株”)、实施例9中得到的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-fruK株(以下为“fruK增强株”或“+fruK株”)，于35℃、以120rpm搅拌培养一夜。然后，在装有如表1所示的475g培养基的3台1L容量的培养槽(ABLE公司制培养装置BMJ-01)中，分别植入上述烧瓶的全部内容物。
[表1]
培养基组成
  蔗糖   12％
  玉米浆(日本食品化工制)   3％
  水   余量
在大气压下、透气量0.25L/min、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.4(用24％NaOH调节)下进行48小时的培养。培养结束后，使用日立制作所制高效液相色谱按照以下的设定定量所得的培养液中的乳酸浓度。测定结果示于表2及图1。
柱：ULTRON PS-80H(信和化工公司制)
洗脱液：高氯酸水溶液(pH2.1)
流速：1.0mL/min
检测器：UV检测器
测定波长：280nm
[表2]
在将包括cscA的4种非PTS蔗糖同化途径的基因(cscA、cscR、cscK、cscB)导入大肠杆菌而由蔗糖生产乳酸的公知例(BiotechnologyLetters.27，1891-1896(2005))中，为了生产96.5g的乳酸，需要120小时的培养时间。相对于此，本发明的上述生产乳酸的大肠杆菌(cscA、fruK增强株、fruR破坏株)的任一种均能以仅仅48小时的培养生产基本相同量以上的乳酸，证实了关于蔗糖的同化，通过导入一部分的蔗糖非PTS基因组的活性、特别是只导入cscA，可以大幅缩短生产乳酸的时间。
特别是明确了通过对cscA导入fruK基因，以蔗糖为原料的D-乳酸的生产率能提高约1.2倍，通过破坏fruR基因，D-乳酸的生产率能提高约1.1倍。
此时，在全部株中培养开始时投入的蔗糖完全消失。另外明确了通过导入fruK基因或破坏fruR基因，利用蔗糖的分解得到的果糖比未导入或破坏基因的株更快地被同化。
[比较例1]
<利用MG 1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pBRgapP株生产D-乳酸>
与实施例10相同地研究MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pBRgapP株的D-乳酸的生产。该株只要在导入的质粒中不含有cscA基因，则基本上与MG 1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株相同。培养基组成也与实施例10相同，但蔗糖是用过滤器过滤灭菌后进行使用的。48小时培养后的培养液中D-乳酸的浓度为0g/L。此时，培养液中的葡萄糖和果糖的浓度也为0g/L。
上述结果确认了如果缺失cscA基因，则不能同化蔗糖生产乳酸。
[实施例11]
<利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株由废糖蜜生产D-乳酸>
与实施例10相同地研究利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔaspΔfruR/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株由废糖蜜生产D-乳酸。
在装有475g以下表3所示的培养基的培养槽中植入与实施例10中所得的物质相同的预培养的烧瓶的全部内容物(25ml)。
[表3]
培养基组成
  废糖蜜   20％
  玉米浆(日本食品化工制)   5％
  水   余量
在大气压下、透气量0.25L/min、搅拌速度300rpm、培养温度35℃、pH7.4(用24％NaOH调节)下进行48小时的培养。
培养48小时后的培养液中的D-乳酸浓度为96.47g/L。此时，培养液中的葡萄糖、果糖和蔗糖的浓度为0g/L。
上述结果确认了使用本发明的生产乳酸的大肠杆菌，可以以废糖蜜为原料生产乳酸。
[实施例12]
<来自双歧杆菌的ldh2基因表达载体及该表达载体转化体MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株的构建>
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)被记载在GenBank accession number M33585中所记载的双歧杆菌基因组序列的555～1517。
作为用于使上述基因表达所必需的启动子的碱基序列，可以使用GenBank accession number X02662的碱基序列信息中被记于397-440的来自大肠杆菌的甘油醛3-磷酸脱氢酶(以下也称作GAPDH)的启动子序列。
为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG 1655株的基因组DNA为模板，利用CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号29)、及TCTAGAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号30)用PCR法进行扩增，利用限制酶NdeI消化所得的DNA片段，由此得到约110bp的相当于GAPDH启动子的DNA片段。将所得的DNA片段与利用限制酶NdeI及PvuII消化质粒pBR322(GenBank accession numberJ01749)所得的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pBRgapP。
为了获得L-乳酸脱氢酶基因，使用长双歧杆菌(ATCC15707)为模板，利用AATCTAGACGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列号36)、及CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列号37)用PCR法进行扩增，利用限制酶XbaI消化所得的DNA片段，由此得到约1.0kbp的L-乳酸脱氢酶基因片段。将所得的DNA片段与利用限制酶XbaI消化预先制成的质粒pBRgapP所得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pGAP-ldh2。
将上述质粒pGAP-ldh2转化到使用实施例3中制成的pTHΔpfl、利用与实施例2相同的方法使pfl基因缺失的MG1655株(也称作MG1655Δpfl株)的感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株。
[实施例13]
<利用MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株生产L-乳酸>
与实施例10相同地研究实施例12中得到的MG1655Δpfl/pGAP-ldh2株的由葡萄糖生产L-乳酸。
在装有475g如以下表4所示的培养基的培养槽中植入与实施例10中得到的物质进行同样地预培养的烧瓶的25ml内容物。
[表4]
培养基组成
 葡萄糖   12％
 酵母提取物(Difco公司制)   3％
 水   余量
在大气压下、透气量0.25L/min、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.5(用24％NaOH调节)下进行18小时的培养。
培养18小时后培养液中的L-乳酸浓度为97.02g/L。
上述结果确认了使用来自双歧杆菌的L-乳酸脱氢酶，可以由葡萄糖生产L-乳酸。
[实施例14]
<MG 1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株的构建>
将实施例12中制成的pGAP-ldh2质粒导入到实施例6中构建的D-乳酸生产株中制成转化体。具体而言如下进行。
将质粒pGAP-ldh2转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株的感受态细胞中。于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株。
[实施例15]
<利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株生产L-乳酸>
与实施例13同样地研究实施例14中得到的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-ldh2株的由葡萄糖生产L-乳酸。
在大气压下、透气量0.25L/min、搅拌速度200rpm、培养温度35℃、pH7.5(用24％NaOH调节)下进行18小时的培养。
培养18小时后培养液中的L-乳酸浓度为116.84g/L。
上述结果确认了使用D-乳酸生产用大肠杆菌株、以葡萄糖为原料可以生产L-乳酸。L-乳酸的生产可以通过使用F-试剂盒D-/L-乳酸(J·K·International产品编号1112821)测定L-乳酸量及D-乳酸量来确认。
[实施例16]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入株的构建>
将实施例6中使用的D-乳酸生产用大肠杆菌株(MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株)的ldhA基因置换为ldh2基因，并且对催化L-乳酸分解的酶的基因lldD进行破坏，构建L-乳酸生产用大肠杆菌株。进而破坏fruR基因，构建L-乳酸生产用大肠杆菌fruR破坏株。具体而言如下进行。
(ldhA 基因破坏株的制成)
基于MG1655基因组DNA的ldhA基因的附近区域的基因信息，合成下述4种寡核苷酸引物：AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列号21)、GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列号22)、GCTCTAGAGCATTCCTGACAGCAGAAGC(序列号38)及AACTGCAGTCGGCGTGTAGTAGTGAACC(序列号39)。使用上述引物，利用与实施例1相同的方法构建基因破坏用质粒pTHΔldhA。进而，将pTHΔldhA转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法选择ldhA缺失株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。
(dld基因回复突变株的制成)
基于大肠杆菌MG1655基因组DNA的dld基因附近区域的基因信息，合成了下述2种寡核苷酸引物：CAACACCAAGCTTTCGCG(序列号40)、TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列号41)。使用上述引物，以大肠杆菌MG 1655的基因组DNA为模板实施PCR，利用限制酶HindIII、XbaI切断所得的DNA片段。进而利用限制酶HindIII、XbaI切断质粒pTH18cs1，与上述dld片段混合后，用连接酶连接，构建质粒pTHDLD。进而，将pTHDLD转化到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法选择dld回复突变株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。
(lldD基因破坏株的制成)
基于MG1655株基因组DNA的lldD基因附近区域的基因信息，合成了下述4种寡核苷酸引物：GGAAGCTTCAAATTGGCGTCTCTGATCT(序列号42)、AAACCCGGGCCATCCATATAGTGGAACAGGAACGG(序列号43)、GGGCTCGAGTGGCGATGACGCTGACTGG(序列号44)及CGTCTAGAACGGGTAAATCTGGTGGTGACCGTCACCCG(序列号45)。使用上述引物利用与实施例1相同的方法构建基因破坏用质粒pTHΔlldD。进而，将pTHΔlldD转化到MG1655ΔpflΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入ΔldhA株感受态细胞中，使用与实施例2相同的方法选择lldD缺失株。将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldD/GAPldhA基因组插入ΔldhA株。
(ldh2基因基因组插入株的制成)
长双歧杆菌的L-乳酸脱氢酶的氨基酸序列和基因的碱基序列已经被报道。即，编码L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)被记载在GenBank accession numberM33585中所记载的双歧杆菌基因组序列的555～1517。
为了获得编码L-乳酸脱氢酶的基因(ldh2)，使用长双歧杆菌(ATCC15707)的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：AAGAATTCCGGAGAAAGTCTTATGGCGGAAACTACCGTTAAGC(序列号46)、CTGTCTAGATCAGAAGCCGAACTGGGCG(序列号47)。使用上述引物实施PCR，利用限制酶EcoRI及XbaI切断所得的DNA片段。
为了获得GAPDH启动子，使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板，合成了下述2种寡核苷酸引物：GGTCTAGAGCAATGATTGACACGATTCCG(序列号48)、CGGAATTCCGCTATTTGTTAGTGAATAAAAG(序列号49)。利用限制酶EcoRI及XbaI切断所得的DNA片段。
将利用XbaI切断上述所得的pTHΔldhA得到的质粒、上述得到的来自长双歧杆菌的ldh2的EcoRI-XbaI片段、及来自大肠杆菌的GAPDH启动子的EcoRI-XbaI片段进行混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α株感受态细胞(东洋纺绩株式会社DNA-903)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体中回收质粒pTHΔldhA：：GAPLDH2。将所得的质粒转化到MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlld/GAPldhA基因组插入ΔldhA株中，使用与实施例2相同的方法通过利用PCR扩增ldh2来选择ldh2基因组插入株。
将所得的株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株。
(fruR基因破坏株的制成)
将实施例7中制成的质粒pTHΔfruR转化到MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株中，按照与实施例2相同的方法获得fruR基因被破坏的MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株。将该株命名为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入株。
[实施例17]
<MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株的构建>
分别在实施例16中构建的L-乳酸生产用大肠杆菌株和L-乳酸生产用大肠杆菌fruR破坏株中导入蔗糖水解酶(转化酶)基因表达载体，构建由蔗糖生产L-乳酸的大肠杆菌株。具体而言如下进行。
将实施例8中构建的质粒pGAP-cscA转化到实施例16中制成的MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株和MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入株的感受态细胞中，分别于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株和MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株。
[实施例18]
<MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株的构建>
在实施例16中构建的L-乳酸生产用大肠杆菌株中导入蔗糖水解酶(转化酶)及果糖-1-磷酸激酶基因表达载体，构建生产L-乳酸的大肠杆菌fruK增强株。具体而言如下进行。
将实施例9中构建的质粒pGAP-cscA-fruK转化到实施例16中制成的MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入株的感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LBBroth，Miller琼脂平板上培养一夜，由此得到MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株。
[实施例19]
<利用MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株生产L-乳酸>
研究MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG 1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株的由废糖蜜生产L-乳酸。
作为预培养，是在装有50ml如表5所示的预培养培养基的500ml容量带挡板的锥形瓶中植入实施例17及实施例18中得到的MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株及MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株，于35℃下以120rpm搅拌培养一夜。然后，在装有475g如以下表6所示的培养基的培养槽中，分别植入25ml预培养的烧瓶的内容物，与实施例10同样地进行培养实验。
[表5]
预培养培养基组成
  废糖蜜   2％
  玉米浆(日本食品化工制)   10％
  水   余量
高压釜后，pH7.8(用24％NaOH调节)
[表6]
培养基组成
  废糖蜜   20％
  玉米浆(日本食品化工制)   5％
  水   余量
在大气压下、透气量0.25L/min、搅拌速度350rpm、培养温度35℃、pH7.5(用24％NaOH调节)下进行24小时的培养。
培养24小时后培养液中的L-乳酸浓度，为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株(cscA)时是75.12g/L，为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhAΔfruR/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA株(fruR破坏株)时是83.79g/L，为MG1655ΔpflΔmdhΔaspΔlldDΔldhA/GAPldh2基因组插入/pGAP-cscA-fruK株(fruK增强株)时是84.32g/L。
由此确认了使用本发明的生产乳酸的大肠杆菌可以以废糖蜜为原料生产L-乳酸。另外明确了通过破坏生产乳酸的大肠杆菌的fruR基因可以提高L-乳酸的生产率。进而明确了通过增强生产乳酸的大肠杆菌的fruK基因也可以提高L-乳酸的生产率。
[比较例2]
<来自大肠杆菌O 157的转化酶基因、来自发酵单胞菌的葡萄糖转运促进蛋白质(glf)基因的表达载体及该表达载体转化体的构建>
大肠杆菌的GAPDH基因的碱基序列已经被报道。为了获得甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，合成了具有下述碱基序列的引物：CCAAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCCGAGCTCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列号50)。使用大肠杆菌MG 1655株的基因组DNA为模板，并使用序列号50与序列号29的组合，利用PCR法扩增DNA片段。序列号29的引物在其5’末端侧具有NdeI识别位点，序列号50的引物从其5’末端依次具有HindIII、PstI、SalI、BamHI、SacI识别位点。利用限制酶NdeI和HindIII消化所得的DNA片段，由此得到约100bp的编码GAPDH启动子的片段。然后将上述DNA片段与利用NdeI、HindIII消化的大肠杆菌用克隆载体pBR322(GenBank accession number J01749)混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Bio公司制)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体回收质粒。将所述质粒命名为pGAP。
将上述质粒pGAP-cscA-glf转化到实施例6中制成的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株感受态细胞中，于37℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB Broth，Miller琼脂平板上培养一夜后，得到MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-glf株。
大肠杆菌O 157株具有的转化酶基因(cscA)的碱基序列已经被报道。即，被记载在GenBank accession number AE005174中所记载的大肠杆菌O 157株基因组序列的3274383-3275816。为了获得cscA基因，分别制备具有GCGGATCCGCTGGTGGAATATATGACGCAATCTCGATTGC(序列号51)及GACGCGTCGACTTAACCCAGTTGCCAGAGTGC(序列号52)碱基序列的引物。序列号51的引物从其5’末端侧依次具有BamHI识别位点和13个碱基长度的GAPDH基因的核糖体结合序列。序列号52的引物在其5’末端侧具有SalI识别位点。以上述2种引物和大肠杆菌O 157株的基因组DNA(SIGMA-ALDRICH：IRMM449)为模板，在通常条件进行PCR法，利用限制酶BamHI及SalI消化所得的DNA片段，由此得到约1.4kbp的转化酶基因(cscA)片段。将上述DNA片段与利用限制酶BamHI及SalI消化质粒pGAP得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Bio公司制)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养一夜，从所得的菌体回收质粒pGAP-cscA，由此构建转化酶基因(cscA)表达载体。
Zymomonas mobilis(ATCC 29191)具有的糖转运酶葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)的碱基序列已经被报道(GenBank accessionnumber M60615)。为了获得glf基因，分别制备了具有下述碱基序列的引物：CCTGTCGACGCTGGTGGAATATATGAGTTCTGAAAGTAGTCAGG(序列号53)及CTACTGCAGCTACTTCTGGGAGCGCCACA(序列号54)。序列号53的引物从其5’末端侧依次具有SalI识别位点和13个碱基的GAPDH基因的核糖体结合序列。序列号54的引物在其5’末端侧具有PstI识别位点。以上述2种引物和Zymomonas mobilis的基因组DNA为模板，在通常条件下进行PCR法，利用限制酶SalI及PstI消化所得的DNA片段，由此得到约1.4kbp的糖转运酶葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)片段。将上述DNA片段与利用限制酶SalI及PstI消化质粒pGAP-cscA得到的片段混合，使用连接酶连接后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(Takara Bio公司制)中，得到在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上繁殖的转化体。将所得的菌落于30℃下在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基上培养一夜，从所得的菌体回收质粒pGAP-cscA-glf，构建转化酶(cscA)基因及葡萄糖转运促进蛋白质(glf)基因表达载体。
<利用MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-glf株、MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株生产D-乳酸>
作为预培养，是在装有3ml LB Broth、Miller培养液(Difco244620)的试管中植入如上所述的MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-glf株，于30℃下、以200rpm搅拌培养9小时。
然后，在分别预先加入了10gCaCO3(化学纯1级)并进行了灭菌的100ml带挡板的4个锥形瓶中分别加入如表7所示的培养基20ml，然后分别在其中植入100μL预培养液，于35℃下、以90rpm搅拌培养48小时。作为对照，使用实施例10中所述的cscAMG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA株进行同样的培养，培养结束后，按照实施例10所述的方法对所得的培养液中的乳酸浓度进行定量。
48小时后培养液中的D-乳酸浓度，为cscA时是48.9g/L，为MG1655ΔpflΔdldΔmdhΔasp/GAPldhA基因组插入株/pGAP-cscA-glf株时是9.3g/L。
由上述结果可知，利用与cscA同样地作为与糖代谢系统相关的基因的葡萄糖转运促进蛋白质基因(glf)虽然增强了糖的吸收，但未见乳酸生产率提高的效果。
[表7]
培养基组成
  蔗糖   10％
  玉米浆(日本食品化工制)   5％
  水   余量
用NaOH调至pH8.0
2008年9月16日申请的日本国申请号第2008-237177号、2009年2月13日申请的日本国申请号第2009-32043号公开的全部内容通过参照被引入本说明书中。
本说明书中记载的全部文献、专利申请及技术标准通过参照被引入本说明书中，与每个文献、专利申请及技术标准通过参照被具体且单独记载的情况为相同程度。

Claims (10)

1.一种生产乳酸的大肠杆菌，具有蔗糖非PTS基因组中至少包括蔗糖水解酶基因的1种以上的基因，但是不包括编码阻抑蛋白的基因cscR、编码蔗糖水解酶的基因cscA、编码果糖激酶的基因cscK及编码蔗糖透过酶的基因cscB的组合和编码蔗糖水解酶的基因cscA、编码果糖激酶的基因cscK及编码蔗糖透过酶的基因cscB的组合，所述蔗糖非PTS基因组由编码阻抑蛋白的基因cscR、编码蔗糖水解酶的基因cscA、编码果糖激酶的基因cscK及编码蔗糖透过酶的基因cscB构成，并且，所述大肠杆菌还具有利用基因重组的乳酸生产增强系统、以及增强果糖代谢能力的系统，
所述增强果糖代谢能力的系统是在果糖代谢途径中磷酸化能力的增强或果糖吸收能力的增强，
所述磷酸化能力的增强来自果糖-1-磷酸激酶活性，
所述果糖吸收能力的增强来自该大肠杆菌本身具有的FruR活性的失活或降低，
所述乳酸生产增强系统包括丙酮酸甲酸裂解酶活性的失活或降低，和/或用于生成D-乳酸或L-乳酸的NADH依赖性乳酸脱氢酶活性的增强。
2.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中所述蔗糖非PTS基因组中只具有蔗糖水解酶基因，并且具有利用基因重组的乳酸生产增强系统。
3.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述乳酸生产增强系统包括：
D-乳酸脱氢酶活性的增强，和
所述大肠杆菌本身具有的FAD依赖性D-乳酸脱氢酶活性的、利用基因重组的失活或减低。
4.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述乳酸生产增强系统包括：
L-乳酸脱氢酶活性的增强，
该大肠杆菌本身具有的D-乳酸脱氢酶活性及FMN依赖性L-乳酸脱氢酶活性中的至少任一方的、利用基因重组的失活或降低。
5.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述蔗糖水解酶基因来自埃希氏菌属细菌。
6.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述蔗糖水解酶基因来自大肠杆菌O 157细菌。
7.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述果糖-1-磷酸激酶来自埃希氏菌属细菌。
8.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，所述果糖-1-磷酸激酶是来自大肠杆菌MG1655的蛋白质。
9.如权利要求1所述的生产乳酸的大肠杆菌，其中，生产乳酸的大肠杆菌是大肠杆菌K12衍生株。
10.一种生产乳酸的方法，包括使用权利要求1～9中任一项所述的生产乳酸的大肠杆菌，由来自植物的含有蔗糖的原料生产乳酸。
CN200980135975.2A 2008-09-16 2009-09-11 由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌 Active CN102333859B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-237177 2008-09-16
JP2008237177 2008-09-16
JP2009032043 2009-02-13
JP2009-032043 2009-02-13
PCT/JP2009/065957 WO2010032698A1 (ja) 2008-09-16 2009-09-11 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102333859A CN102333859A (zh) 2012-01-25
CN102333859B true CN102333859B (zh) 2015-04-22

Family

ID=42039522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980135975.2A Active CN102333859B (zh) 2008-09-16 2009-09-11 由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8679800B2 (zh)
EP (1) EP2336295B1 (zh)
JP (1) JP5243546B2 (zh)
CN (1) CN102333859B (zh)
BR (1) BRPI0919218A2 (zh)
CA (1) CA2737429C (zh)
TW (1) TWI456055B (zh)
WO (1) WO2010032698A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2652122B1 (en) 2010-12-13 2018-08-22 Myriant Corporation Method of producing succinic acid and other chemicals using sucrose-containing feedstock
JP5858463B2 (ja) * 2011-10-26 2016-02-10 三井造船株式会社 乳酸生産菌
KR101455360B1 (ko) * 2011-11-01 2014-10-28 아주대학교산학협력단 수크로오스 대사 회로가 재구축된 대장균
CN104487584B (zh) * 2012-07-23 2018-05-18 三井化学株式会社 D－乳酸的生产方法、聚合物的生产方法和聚合物
DK2930235T3 (da) * 2012-12-07 2021-06-07 Biogenics Korea Co Ltd Lactobacillus sp. med evne til at inducere IL-12 produktion, og fremgangsmåde til dyrkning af samme
US9708404B2 (en) * 2012-12-21 2017-07-18 Seattle Genetics, Inc. Anti-NTB-A antibodies and related compositions and methods

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2212447C2 (ru) 2000-04-26 2003-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты)
CN100560727C (zh) * 2003-09-30 2009-11-18 三井化学株式会社 用于生产d-乳酸的生物催化剂
JP4473219B2 (ja) 2003-09-30 2010-06-02 三井化学株式会社 Ｄ−乳酸生産用生体触媒
ES2401339T3 (es) 2005-08-10 2013-04-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materiales y métodos para producción eficiente de ácido láctico
JP4904186B2 (ja) 2007-03-28 2012-03-28 四国化成工業株式会社 屋上緑化プランター
JP4857214B2 (ja) 2007-07-27 2012-01-18 パナソニック株式会社 交通信号制御パラメータ設計装置及び交通信号制御パラメータ生成方法
CN101970648A (zh) * 2007-12-18 2011-02-09 韩国科学技术院 具有使用蔗糖作为碳源能力的重组微生物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sequenc similarities between the gene specifying 1-phosphofructokinase(fruK),genes specifying other kinases in Escherichia coli K12, and lacC of Staphylococcus aureus;Lisa M.D. Orchard;《Proc. R. Soc. Lond. B》;19901231;第242卷;87-90 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2737429A1 (en) 2010-03-25
WO2010032698A1 (ja) 2010-03-25
TWI456055B (zh) 2014-10-11
TW201016849A (en) 2010-05-01
EP2336295A1 (en) 2011-06-22
EP2336295A4 (en) 2014-01-22
US20110171704A1 (en) 2011-07-14
EP2336295B1 (en) 2018-01-24
CA2737429C (en) 2014-10-28
CN102333859A (zh) 2012-01-25
BRPI0919218A2 (pt) 2015-08-11
US8679800B2 (en) 2014-03-25
JP5243546B2 (ja) 2013-07-24
JPWO2010032698A1 (ja) 2012-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102159702B (zh) 生产乳酸的细菌及生产乳酸的方法
CN102197135B (zh) 生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的细菌及使用其生产2-脱氧蟹肌醇(doi)的方法
CN102165056B (zh) 生产l-氨基酸的微生物和使用其生产l-氨基酸的方法
CN101535489B (zh) 利用辅酶合成强化进行的羟基羧酸类的生产方法
CN102333859B (zh) 由来自植物的原料生产乳酸的方法及生产乳酸的细菌
JPWO2010032698A6 (ja) 植物由来原料から乳酸を生産する方法及び乳酸生産細菌
CN102791850B (zh) 生产能力高的异丙醇生产细菌
CN100560727C (zh) 用于生产d-乳酸的生物催化剂
JP6321645B2 (ja) ２−デオキシ−シロ−イノソースの生産方法
CN102498203B (zh) 异丙醇生产细菌及异丙醇生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant