CN1204254C - 编码使大肠杆菌具有l－高丝氨酸抗性的蛋白质的dna以及用于生产l－氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

在培养基中培养一种细菌以便在培养基中生产和积累氨基酸，并且从所述的培养基中回收氨基酸，所述的细菌具有生产氨基酸的能力，其中编码一种蛋白质的新基因(rhtB)得到增强，所说的蛋白质具有使细菌具备蛋白质L-高丝氨酸抗性之活性。

Description

编码使大肠杆菌具有L-高丝氨酸抗性的蛋白质的DNA 以及用于生产L-氨基酸的方法
本发明涉及一种用于生产氨基酸的方法，尤其涉及一种使用属于埃希氏杆菌属的细菌来生产L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-苏氨酸的方法。
根据大肠杆菌K-12，本发明人得到了一种具有thrR突变的突变体(本文称作rhtA23)，该突变体与基本培养基(Astaurova，O.B.等，《应用生物化学与微生物学》21，611-616(1985))中高浓度的苏氨酸(＞40mg/ml)或高丝氨酸(＞5mg/ml)有关。在rhtA23突变的基础上，得到了改进的苏氨酸生产菌株(苏联专利974817)、高丝氨酸和谷氨酸的生产菌株(Astaurova等，《应用生物化学与微生物学》27，556-561(1991))。
而且，本发明人已经揭示出rhtA基因存在于大肠杆菌染色体的18min处，并且rhtA基因与介于pexB和ompX基因之间的ORF1是相同的。已经把表达由ORF1编码的蛋白质的单元命名为rhtA(rht：对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)基因。rhtA基因包括包含SD序列、ORF1和一个终止子在内的5’-非编码区。另外，本发明人已经发现如果以多拷贝的状态进行克隆的话，野生型rhtA基因带有抗苏氨酸和高丝氨酸抗性，并且rhtA基因表达的增强提高了属于埃希氏杆菌属的具有生产L-赖氨酸、L-缬氨酸或L-苏氨酸能力的细菌的氨基酸生产率(第17届国际生物化学与分子生物学会议暨1997年美国生物化学与分子生物学协会年会文摘，旧金山，加利弗尼亚，1997年8月24-29日，1997，文摘号为457)。
据发现在克隆rhtA基因的过程中，在大肠杆菌中存在着至少两种以多拷贝的状态赋予了高丝氨酸抗性的不同的基因。其中的一个基因为rhtA基因，但另一个基因仍未阐明。
本发明的一个目的是提供一种参与高丝氨酸抗性的新的基因，以及用于以高产率生产氨基酸，尤其是L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苏氨酸的方法。
本发明人已经发现当通过多拷贝载体进行克隆时，位于大肠杆菌染色体86min处的区域给大肠杆菌的细胞赋予了L-高丝氨酸抗性，并且当扩增该区域时，与rhtA基因相仿，大肠杆菌的氨基酸的生产率得以提高。在这些发现的基础上，已经完成了本发明。
因此，本发明提供了：
(1)一种编码如下列(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：
(A)包含序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的蛋白质；或者
(B)包括在序列表SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列中含有一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质，并且所述的蛋白质具有使细菌具备蛋白质L-高丝氨酸抗性之活性，
(2)一种根据(1)的DNA，它是一种如下列(a)或(b)中定义的DNA：
(a)包含与序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸对应的核苷酸序列的DNA；或者
(b)在严格条件下与对应于序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列杂交的DNA，并且所述的DNA编码具有使所述的细菌具备蛋白质L-高丝氨酸抗性之活性的蛋白质，
(3)一种属于埃希氏杆菌属的细菌，其中所述细菌的L-高丝氨酸抗性通过在细菌细胞中扩增(1)的DNA的拷贝数得到增强，
(4)(3)的细菌，其中在细菌细胞中的多拷贝载体上携带了(1)的DNA，
(5)(3)的细菌，其中在细菌细胞中的转座子上携带了(1)的DNA，
(6)一种用于生产氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养具有生产氨基酸能力的(3)至(5)之任一的细菌以便在培养基中生产和积累氨基酸，以及从培养基中回收氨基酸的步骤，以及
(7)(6)的方法，其中所述的氨基酸为至少一种选自由下列氨基酸组成的组的氨基酸：L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苏氨酸。
本发明的DNA可以称作“rhtB基因”，由rhtB基因编码的蛋白质可以称作“RhtB蛋白质”，参与细菌的L-高丝氨酸抗性的RhtB蛋白质的活性(即使得细菌具有RhtB蛋白质L-高丝氨酸抗性的活性)可以称作“Rh活性”，并且在rhtB基因中编码RhtB蛋白质的结构基因称作“rhtB结构基因”。术语“增强了Rh活性”指的是给细菌赋予了高丝氨酸抗性，或者是通过增加RhtB蛋白质的分子的数量、增加RhtB蛋白质的比活或者针对RhtB蛋白质等的表达或活性等降低的负调节的灵敏性来增强所述的抗性。术语“编码蛋白质的DNA”指的是当所述的DNA为双链时，其中的一条链编码所述蛋白质的DNA。L-高丝氨酸抗性指的是细菌在含有一定浓度的L-高丝氨酸的基本培养基上生长的性质，其中在所述浓度下其野生型菌株无法生长(通常为10mg/ml)。生产氨基酸的能力指的是与其野生型菌株相比，细菌在培养基中更大量地生产和积累氨基酸的性质。
根据本发明，可以使属于埃希氏杆菌属的细菌具有对高浓度高丝氨酸的抗性。属于埃希氏杆菌属的细菌具有提高的高丝氨酸抗性以及在培养基中高产率地产生并积累氨基酸的能力，其中尤其是L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-苏氨酸。
下面将详细地解释本发明。
<1>本发明的DNA
本发明的DNA编码具有Rh活性并且具有序列表SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的蛋白质。更具体地讲，可以举出本发明DNA的实例为包含序列表中SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA。
本发明的DNA包括编码使大肠杆菌具有高丝氨酸抗性的RhtB蛋白质的DNA片段，它包括rhtB基因的调节元件和rhtB基因的结构部分、具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列对应于与GenBank登记号为M87049的序列互补的序列的一部分。SEQID NO：1包括f138(GenBank登记号为M87049的编号为第61959-61543的核苷酸)及其5’-侧翼区和3’-侧翼区，所述的f138为存在于大肠杆菌染色体86min处是已知的、但功能却未知ORF(开放读框)。在5’-侧翼区仅有160个核苷酸的f138不能赋予高丝氨酸抗性。在M87049的62160和61959之间(ORF f138的上游)不存在终止密码子。因此，编码区要长于201bp。因而，RhtB蛋白质以及编码所述蛋白质的rhtB基因是新的。
例如通过根据其中使用了mini-Mu d5005噬菌粒的方法(Groisman，E.A.等，《细菌学杂志》168，357-364(1986))采用诸如K12或W3110这样的大肠杆菌溶原菌株的溶胞产物感染大肠杆菌的Mucts溶原菌株、并从在含有卡那霉素(40μg/ml)和L-高丝氨酸(10mg/ml)的基本培养基上生长的菌落中分离出质粒DNA，可以得到rhtB基因。正如下面所述的实施例中说明的那样，将rhtB基因定位于大肠杆菌染色体的86min处。因此，通过菌落杂交或者PCR(聚合酶链式反应，参考White，T.J.等，《遗传学趋势》5，185(1989))便可以从大肠杆菌的染色体中得到包括rhtB基因在内的DNA片段，其中的PCR使用了具有与靠近大肠杆菌染色体86min处部分的区域对应的序列的寡核苷酸。另一方面，可以根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列设计寡核苷酸。通过使用具有与SEQ ID NO：1中编号为第557位核苷酸的上游区以及编号为第1171位核苷酸的下游区对应的核苷酸序列的寡核苷酸作为PCR的引物，便可以扩增整个的编码区。
通过使用市售的DNA合成仪(例如由应用生物系统公司生产的380B型DNA合成仪)、通过诸如phosphoamidite方法(参见《四面体通讯》22，1859(1981))这样的普通的方法可以进行寡核苷酸的合成。此外，通过使用市售的PCR设备(例如，由Takara Shuzo有限公司生产的PJ2000型DNA热循环仪)、使用Taq DNA聚合酶(由Takara Shuzo有限公司提供)并且根据由提供商指明的方法可以进行PCR。
编码本发明RhtB蛋白质的DNA可以编码包括在一个或多个位置上的一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加在内的RhtB蛋白质，条件是并不破坏由其编码的RhtB蛋白质的Rh活性。例如通过修饰所述的核苷酸序列可以得到编码与上述RhtB蛋白质基本相同的蛋白质的DNA，例如通过定向诱变方法从而使得在具体位点上的一个或多个氨基酸的残基涉及到缺失、取代、插入或者添加。通过常规公知的突变处理可以获得如上所述进行了修饰的DNA。突变处理包括一种用于在体外处理编码所述RhtB蛋白质的DNA的方法(例如用羟胺)，以及一种用紫外线照射或者诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸这样的通常用于突变处理的突变剂来处理微生物(例如属于埃希氏杆菌属且具有编码RhtB蛋白质的DNA的细菌)的方法。
通过在合适的细胞中以多拷贝表达经历了如上所述的体外诱变处理的DNA、研究其高丝氨酸抗性并选择出增加了所述抗性的DNA，便可以获得编码与RhtB蛋白质基本相同的蛋白质的DNA。而且，众所周知的是蛋白质的氨基酸序列和编码它的核苷酸序列可以在菌种、菌株、突变株或者变株之间略有不同，因此编码基本上相同蛋白质的DNA可以从属于埃希氏杆菌属的L-高丝氨酸抗性菌种、菌株、突变株和变株中得到。更具体地讲，通过从经历了突变处理的属于埃希氏杆菌属的细菌或者从属于埃希氏杆菌属细菌的自发突变株或变株中分离出在严格条件下与例如具有序列表SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA杂交并且编码具有Rh活性的蛋白质的DNA，便可以得到编码与RhtB蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA。在本文中，术语“严格条件”是指这样的一种条件，在该条件下形成了所谓的特异性杂交体、而不形成非特异性的杂交体。通过使用任何的数值来清楚地表达这一条件是困难的。但是，严格条件例如包括这样的一种条件，在该条件下具有高度同源性的DNA(例如具有不低于70％的同源性的DNA)彼此杂交、而具有低于上述同源性的DNA彼此不杂交。
<2>本发明属于埃希氏杆菌属的细菌
本发明属于埃希氏杆菌属的细菌为增强了Rh活性的属于埃希氏杆菌属的细菌。举例来说，属于埃希氏杆菌属的细菌为大肠杆菌。例如通过在细胞中扩增rhtB结构基因的拷贝数或者用重组DNA转化属于埃希氏杆菌属的细菌可以增强Rh活性，其中在重组的DNA中将包括编码RhtB蛋白质的rhtB结构基因在内的DNA片段与在属于埃希氏杆菌属的细菌中高效发挥作用的启动子序列相连。也可以通过用在属于埃希氏杆菌属的细菌中高效发挥作用的启动子序列代替染色体上rhtB基因的启动子序列来增强Rh活性。
通过将携带有rhtB结构基因的多拷贝载体引入属于埃希氏杆菌属的细菌细胞中便可以在细胞中进行rhtB结构基因的多拷贝数的扩增。更具体地讲，通过向属于埃希氏杆菌属的细菌细胞中引入携带有rhtB结构基因的质粒、噬菌体或转座子(Berg，D.E.与Berg，C.M.，《生物/技术》1，147，(1983))可以增加拷贝数。
举例来说，多拷贝载体有诸如pBR322、pMW118、pUC19等的质粒载体，以及诸如λ1059、λBF101、M13mp9等的噬菌体载体。举例来说，转座子为Mu、Tn10、Tn5等等。
例如可以通过D.M.Morrison的方法(《酶学中的方法》68，326(1979))或者其中用氯化钙处理受体细菌细胞以增加DNA的渗透力的方法(Mandel，M.与Higa，A.，《分子生物学杂志》53，159(1970))等方法来将DNA引入属于埃希氏杆菌属的细菌之中。
如果在如上所述的属于埃希氏杆菌属的氨基酸生产细菌中增强了Rh活性的话，那么可以提高氨基酸的产量。作为待增强其Rh活性的属于埃希氏杆菌属的细菌，使用了具有生产所需氨基酸能力的菌株。此外，可以将生产氨基酸的能力赋予其中增强了Rh活性的细菌。属于埃希氏杆菌属的氨基酸生产细菌的实例如下所述。
(1)L-苏氨酸生产菌
举例来说，属于埃希氏杆菌属的L-苏氨酸产生细菌可以是菌株MG442(Guayatiner等，Genetika(俄语)14，947-956(1978))。
(2)L-高丝氨酸生产菌
举例来说，属于埃希氏杆菌属的L-高丝氨酸产生细菌可以是菌株NZ10(thrB)。该菌株来源于作为Leu+回复体的已知菌株C600(thrB，leuB)(Appleyard R.K.，《遗传学》39，440-450(1954))。
在rhtB DNA片段的基础上得到了通过发酵用于生产氨基酸的新的氨基酸生产菌株大肠杆菌NZ10/pAL4，pRhtB；大肠杆菌MG422/pVIC40，pRhtB；以及大肠杆菌MG442/pRhtB。
所述的新菌株已于1998年10月6日保藏(根据基于布达佩斯条约的国际保藏)在俄罗斯国家工业微生物保藏所(VKPM)。菌株大肠杆菌NZ10/pAL4，pRhtB已按照保藏号VKPM B-7658进行了保藏；菌株大肠杆菌MG442/pRhtB已按保藏号VKPM B-7659进行了保藏；且菌株大肠杆菌MG422/pVIC40，pRhtB已按保藏号VKPM B-7660进行了保藏。
菌株大肠杆菌NZ10/pAL4，pRhtB(VKPM B-7658)显示出下列培养的形态学和生物化学特征。
细胞形态学.具有圆形末端的革兰氏阴性游动性弱的杆菌。纵向尺寸为1.5-2μm。
培养特征：
牛肉膏琼脂.在37℃下生长24小时后，生成了直径为1.5-3mm的圆形发白的半透明的菌落，特征为光滑的表面、规则或者略有波浪的边缘、中央略微鼓起、结构均匀、膏状稠度、易于乳化。Luria’s琼脂。在37℃下生长24小时后，发育成直径为1.5-2.5mm的发白的半透明的菌落，它具有光滑的表面、均匀的结构、膏状的稠度、易于乳化。
基本琼脂-浓液处理的(doped)培养基M9.在37℃下生长40至48小时后，形成直径为0.5-1.5mm的菌落，其颜色为浅灰白色、半透明、略呈凸形、具有有光泽的表面。
在牛肉膏肉汤中的生长.在37℃下生长24小时后，显示出浓厚的均匀的混浊、具有特有的气味。
生理学与生物化学特征：
在牛肉膏琼脂中在推进(thrust)接种的过程中生长。在整个接种区域内显示出良好的生长。所述微生物证实为兼性厌氧菌。
它不液化明胶。
特点是在牛奶上生长良好，同时伴随着牛奶的凝聚。
不产生吲哚。
温度条件.在20-42℃下在牛肉膏肉汤上生长，最佳温度位于33-37℃。
培养基的pH值.在pH值为6-8的液体培养基上生长，最佳值为7.2。碳源.在葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、木糖、甘油以及甘露糖醇上显示出生长良好，以便生成酸和气体。
氮源.同化呈铵盐、硝酸盐形式的氮以及来自一些有机化合物的氮。抗氨苄青霉酸、卡那霉素和L-高丝氨酸抗性.使用L-苏氨酸作为生长因子。
质粒的内含物.所述细胞含有确保了抗氨苄青霉素的抗性并且携带有苏氨酸操纵子的thrA基因的多拷贝的杂交体质粒pAL4，其编码导致高丝氨酸的生物合成增加的天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I。此外，所述的细胞含有确保了抗卡那霉素的抗性并携带有赋予了抗高丝氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的多拷贝的杂交体质粒pRhtB。
除了用L-异亮氨酸代替L-苏氨酸作为生长因子之外，菌株大肠杆菌MG422/pRhtB(VKPM B-7659)与菌株NZ10/pAL4，pRhtB具有相同的培养的形态学和生物化学特征。但是没有异亮氨酸，所述菌株可以缓慢地生长。此外，所述菌株的细胞仅含有确保了抗卡那霉素的抗性并携带有赋予了抗高丝氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的一个拷贝的杂交体质粒pRhtB。
除了用L-异亮氨酸代替L-苏氨酸作为生长因子之外，菌株大肠杆菌MG442/pVIC40，pRhtB(VKPM B-7660)与菌株NZ10/pAL4，pRhtB具有相同的培养的形态学和生物化学特征。但是没有异亮氨酸，所述菌株可以缓慢地生长。所述菌株的细胞含有确保了抗链霉素的抗性并携带有苏氨酸操纵子基因的多拷贝的杂交体质粒pVIC40。此外，它们含有确保了抗卡那霉素的抗性并携带有赋予了抗高丝氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的多拷贝的杂交体质粒pRhtB。
<3>用于生产氨基酸的方法
通过在培养基中培养如上所述通过扩增rhtB基因的拷贝数来增强Rh活性并且具有生产氨基酸能力的细菌、在培养基中生产和积累氨基酸并从培养基中回收氨基酸便可以高效地生产出氨基酸。举例来说，所述的氨基酸优选为L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸。L-缬氨酸和L-苏氨酸。
在本发明的方法中，可以按照与那些通过使用细菌发酵来生产氨基酸的常规方法类似的方式进行属于埃希氏杆菌属的细菌的培养以及从液体培养基中收集和纯化所述的氨基酸。在培养中所用的培养基可以是合成培养基或者天然培养基，只要所述的培养基包括碳源、氮源和无机物，以及如果需要的话还包括数量合适的所用细菌需要用于生长的营养物即可。碳源可以包括各种糖类(诸如葡萄糖和蔗糖)以及各种有机酸。取决于所用细菌的同化能力，可以使用包括乙醇和甘油在内的醇。作为氮源，使用氨、各种铵盐(诸如硫酸铵)、其它的氮化合物(诸如胺)、天然氮源(诸如胨、大豆水解质以及消化了的发酵微生物)。作为无机物，使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、碳酸钙。
培养优选是在诸如振荡培养、通风以及搅拌培养这样的需氧条件下进行的。培养的温度通常为20-40℃，优选30-38℃。培养的pH通常在5-9之间，优选在6.5-7.2之间。可以用氨水、碳酸钙、各种酸、各种碱以及缓冲溶液来调节培养物的pH。通常，1-3天的培养导致目标氨基酸在培养基中的积累。
通过在培养之后借助离心或膜过滤从培养基中除去诸如细胞这样的固体、然后借助离子交换收集和纯化目标氨基酸、浓缩和结晶分离方法等，可以进行氨基酸的回收。
图1显示rhtB基因的克隆、鉴定和失活。
图2显示RhtB蛋白质的氨基酸序列。
                             实施例
下面参照实施例更具体地解释本发明。在所述实施例中，除非另有说明，氨基酸均为L-型的。
实施例1：获得rhtB DNA片段
(1)将rhtB基因克隆进mini-Mu噬菌粒中
使用mini-Mu d5005噬菌粒(Groisman，E.A.等，《细菌学杂志》168，357-364(1986))在体内克隆野生型rhtB基因。菌株MG442的MuCts62溶原体用作供体。使用新鲜制备的溶胞产物感染菌株VKPMB-513的Mucts溶原性衍生物(Hfr K10 metB)。将细胞铺在含有甲硫氨酸(50μg/ml)、卡那霉素(40μg/ml)和高丝氨酸(10mg/ml)的M9葡萄糖基本培养基上。挑选并分离出在48小时后出现的菌落。分离出质粒DNA并且通过标准的技术将其用于转化菌株VKPM B-513。在如上所述含有卡那霉素的L-肉汤琼脂平板上选择转化体。从那些抗高丝氨酸的菌落中分离出质粒DNA，并通过对插入片段的结构的限制酶切作图进行分析。似乎已经从供体克隆出属于不同染色体区域的两种插入片段。因此，在大肠杆菌中存在着至少两种呈多拷贝状态并赋予了高丝氨酸抗性的不同的基因。两种插入片段其中之一为已经进行了报道的rhtA基因(第17届国际生物化学与分子生物学会议暨1997年美国生物化学与分子生物学协会年会文摘，旧金山，加利弗尼亚，1997年8月24-29日)。在两种插入片段的另一种当中，赋予了高丝氨酸抗性的长度最短的片段为0.8kb(图1)。
(2)鉴定rhtB基因
通过Sanger的双脱氧链终止法对插入片段测序。全面地测定两条DNA链的序列，并且重叠所有的接头。测序表明插入片段包含f138(GenBank登记号为M87049的编号为第61543-61959的核苷酸)及其201bp的上游区(M87049序列中的下游区)，所述的f138为存在于大肠杆菌染色体86min处是已知的、但功能却未知ORF(开放读框)。在5’-侧翼区中仅有160个核苷酸的f138不能赋予高丝氨酸抗性。在M87049的第62160与61959个核苷酸之间、ORF f138的上游不存在终止密码子。而且，在所述序列中存在一个紧跟着被预测为核糖体结合位点序列的ATG。较大的ORF(编号为第62160-61546个核苷酸)命名为rhtB基因。由所述基因推导的RhtB蛋白质高度疏水并且含有5个可能的跨膜节段。
实施例2：生产高丝氨酸生产菌株
通过质粒pAL4转化大肠杆菌的NZ10菌株以得到菌株NZ10/pAL4，其中所述质粒为pBR322载体并将编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因插入所述载体中。菌株NZ10为从大肠杆菌菌株C600(thrB，leuB)(Appleyard，《遗传学》39，440-452(1954))得到的leuB+-回复突变株(thrB)。
将rhtB基因插入质粒pUK21中以得到pRhtB，所述的质粒pUK21为一种其中卡那霉素抗性基因代替了氨苄青霉素抗性基因(Vieira，J.与Messing，J.，《基因》100，189-194(1991))的已知的质粒pUC19。
用pUK21或pRhtB转化菌株NZ10/pAL4，以得到菌株NZ10/pAL4，pUK21和NZ10/pAL4，pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的营养肉汤中分别培养如此得到的转化体18个小时，在20×200mm的试管中将0.3ml得到的培养物接种到3ml具有下列组成并含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨苄青霉素的发酵培养基中，并且在37℃下用旋转振荡器培养46小时。在培养之后，通过已知的方法测定培养基中高丝氨酸的积累量以及在560nm下培养基的吸光值。
发酵培养基的组成(g/L)
葡萄糖                                80
(NH4)2SO4                         22
K2HPO4                             2
NaCl                                  0.8
MgSO4·7H2O                        0.8
FeSO4·7H2O                        0.02
MnSO4·5H2O                        0.02
盐酸硫胺素                            0.0002
酵母提取物                            1.0
CaCO3                                30
(CaCO3是单独进行灭菌的。)
结果示于表1。正如表1所示，菌株NZ10/pAL4，pRhtB积累高丝氨酸的数量大于其中未增强rhtB基因的菌株NZ10/pAL4和NZ10/pAL4，pUK21的量。
                          表1
    菌株     OD560 高丝氨酸的积累量(g/L)
NZ10/pAL4     16.4     3.1
NZ10/pAL4，pUK21     14.3     3.3
NZ10/pAL4，pRhtB     15.6     6.4
实施例3：用引入pRhtB的菌株生产丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸
大肠杆菌MG442是一种已知的菌株(Gusyatiner等，1978，Genetika(俄文)14：947-956)。
用质粒pUK21和pRhtB转化菌株MG442，以得到菌株MG442/pUK21和MG442/pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素的营养肉汤中分别培养如此得到的转化体18个小时，在20×200mm的试管中将0.3ml得到的培养物接种到3ml实施例2中所述的并含有50mg/l卡那霉素的发酵培养基中，并且在37℃下用旋转振荡器培养40小时。在培养之后，通过已知的方法测定培养基中丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的积累量以及在560nm下培养基的吸光值。
结果示于表2。正如表2所示，菌株MG442/pRhtB积累丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的每一种的数量大于其中未增强rhtB基因的菌株MG442/pUK21的量。
                          表2
    菌株     OD560         积累量(g/L)丙氨酸    缬氨酸    异亮氨酸
MG442/pUK21     13.4   0.2       0.2        0.3
MG442/pRhtB     13.7   0.7       0.5        0.5
实施例4：生产苏氨酸生产菌株
通过普通的转化方法引入已知的质粒pVIC40(美国专利5,175,107(1992))来转化菌株MG442(实施例3)。在含有0.1mg/ml链霉素的LB琼脂平板上选择转化体。从而得到了新的菌株MG442/pVIC40。
用pUK21或pRhtB转化菌株MG442/pVIC40，以得到菌株MG442/pVIC40，pUk21和MG442/pVIC40，pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l链霉素的营养肉汤中分别培养如此得到的转化体18个小时，在20×200mm的试管中将0.3ml得到的培养物接种到3ml实施例2中所述的并含有50mg/l卡那霉素和100mg/l链霉素的发酵培养基中，并且在37℃下用旋转振荡器培养46小时。在培养之后，通过已知的方法测定培养基中苏氨酸的积累量以及在560nm下培养基的吸光值。
结果示于表3。正如表3所示，菌株MG442/pVIC40，pRhtB积累苏氨酸的数量大于其中未增强rhtB基因的菌株MG442/pVIC40以及MG442/pVIC40，pUk21的量。
                             表3
菌株     OD560     苏氨酸的积累量(g/L)
MG442/pVIC40     17     13.6
MG442/pVIC40，pUk21     16.3     12.9
MG442/pVIC40，pRhtB     15.2     16.3
实施例5：rhtB基因失活以及扩增对大肠杆菌抗某些氨基酸及氨基酸 类似物的抗性的影响
为了失活染色体rhtB基因，在pUK21载体的基础上构建质粒pNPZ46(图1)。它具有来自于大肠杆菌染色体86min处的DNA片段，以及rhtB基因及其5’-侧翼区和3’-侧翼区。然后，以pNPZ46质粒rhtB基因的ClaI-Eco47III片段取代含有pACYC184质粒的cat(CmR)基因(Chang与Cohen，《细菌学杂志》134，1141-1156，1978)的AsuII-BsrBI片段，以便提供pNPZ47质粒(图1)。为了把得到的插入且失活的rhtB基因引入大肠杆菌菌株N99(已知菌株W3350的链霉素抗性衍生物(Campbell，《病毒学》14，22-33，1961))的染色体中，使用了Parker和Marinus的方法(Parker，B.与Marinus，M.G.，《基因》73，531-535，1988)。通过噬菌体P1的转导并通过Southern杂交(Southern，E.M.，《分子生物学杂志》98，503-517，1975)证实了野生型等位基因对失活的所述基因的取代。
然后测试了如此获得的大肠杆菌菌株N99 rhtB∷cat、原始菌株N99(rhtB+)及其用pRhtB质粒转化的衍生物N99/pRhtB对某些氨基酸及氨基酸类似物的易感性。将在37℃下在M9基本培养基中用旋转振荡器过夜培养的菌株的培养物(109cfu/ml)按1∶100进行稀释，并在相同的条件下培养5小时。然后稀释如此得到的对数期的培养物，并将大约104个活细胞加入含有氨基酸或类似物加倍增加的M9琼脂的干燥好的测试平板中。在培养40-46小时之后，检测这些化合物的最小抑制浓度(MIC)。结果示于表4中。
                                表4
    底物                  MIC(μg/ml)
 N99(rhtB+)   N99/pRhtB   N99 rhtB∷cat
1.L-高丝氨酸     250     30000     125
2.L-苏氨酸     30000     50000     30000
3.L-丝氨酸     5000     10000     5000
4.L-缬氨酸     0.5     1     0.5
5.AHVA     50     2000     25
6.AEC     10     25     10
7.4-氮杂-DL-亮氨酸     40     100     40
从表4得出了除高丝氨酸以外，多拷贝的rhtB还使得细胞具有对苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、α-氨基-β-羟戊酸(AHVA)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和4-氮杂-DL-亮氨酸的抗性增加的性质。相反地，rhtB基因的失活增加了细胞对高丝氨酸和AHVA的敏感性。结合有关RhtB蛋白质与谷氨酸棒状杆菌的LysE赖氨酸流出(efflux)转运蛋白质(Vrljic等，《分子生物学》22，815-826，1996)的同源性的数据，这些结果表明针对rhtB基因产物的类似的功能。推测的流出转运蛋白质、RhtB对几种底物(氨基酸)具有特异性，或者作为扩增的结果可能显示出非特异性的效果。
                             序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>编码使大肠杆菌具有L-高丝氨酸抗性的蛋白质的DNA以及用于生产
L-氨基酸的方法
<130>
<140>RU 98118425
<141>1998-10-13
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1200
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(557)..(1171)
<400>1
agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60
ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120
cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180
tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240
tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300
cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360
tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420
tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480
tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540
acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg aca 592
                  Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr
                    1               5                  10
tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act atg   640
Ser Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met
         15                  20                  25
acc acc tcg ctc aac cac ggt tat ccg gcc ggt ggc gtc tat tgc tgg   688
Thr Thr Ser Leu Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp
     30                  35                  40
gct tca gac cgg act ggc gat tca tat tgt gct ggt tgg cgt ggg gtt   736
Ala Ser Asp Arg Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val
 45                  50                  55                  60
ggg acg cta ttt tcc cgc tca gtg att gcg ttt gaa gtg ttg aag tgg   784
Gly Thr Leu Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp
                 65                  70                  75
gca ggc gcg gct tac ttg att tgg ctg gga atc cag cag tgg cgc gcc   832
Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala
             80                  85                  90
gct ggt gca att gac ctt aaa tcg ctg gcc tct act caa tcg cgt cga   880
Ala Gly Ala Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg
         95                 100                 105
cat ttg ttc cag cgc gca gtt ttt gtg aat ctc acc aat ccc aaa agt    928
His Leu Phe Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser
    110                 115                 120
att gtg ttt ctg gcg gcg cta ttt ccg caa ttc atc atg ccg caa cag    976
Ile Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln
125                 130                 135                 140
ccg caa ctg atg cag tat atc gtg ctc ggc gtc acc act att gtg gtc    1024
Pro Gln Leu Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val
                145                 150                 155
gat att att gtg atg atc ggt tac gcc acc ctt gct caa cgg att gct    1072
Asp Ile Ile Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala
            160                 165                 170
cta tgg att aaa gga cca aag cag atg aag gcg ctg aat aag att ttc    1120
Leu Trp Ile Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe
        175                 180                 185
ggc tcg ttg ttt atg ctg gtg gga gcg ctg tta gca tcg gcg agg cat    1168
Gly Ser Leu Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His
    190                 195                 200
gcg tgaaaaataa tgtcggatgc ggcgtaaac                                1200
Ala
205
<210>2
<211>205
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu
  1               5                  10                  15
Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu
             20                  25                  30
Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp Ala ser Asp Arg
         35                  40                  45
Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val Gly Thr Leu Phe
     50                  55                  60
Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala Ala
 65                  70                  75                  80
Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala Ile
                 85                  90                  95
Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe Gln
            100                 105                 110
Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe Leu
        115                 120                 125
Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu Met
    130                 135                 140
Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile Val
145                 150                 155                 160
Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile Lys
                165                 170                 175
Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Phe
            180                 185                 190
Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala
        195                 200                 205

Claims (7)

1.一种编码如下列(A)或(B)中定义的蛋白质的DNA：
(A)包含序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的蛋白质；或者
(B)包含序列表中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列中含有一个氨基酸的缺失、取代、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白质，并且该蛋白质具有使含该蛋白质的细菌具备L-高丝氨酸抗性之活性。
2.一种如下列(a)或(b)中定义的DNA：
(a)包含序列表中SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA；或者
(b)在严格条件下与序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列杂交的DNA，并且其编码一种蛋白质，该蛋白质具有使含该蛋白质的所述的细菌具备L-高丝氨酸抗性之活性，以及其中所述DNA与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的编号为第557-1171位核苷酸的核苷酸序列之间的同源性不低于70％。
3.一种属于埃希氏杆菌属的细菌，其中所说细菌的L-高丝氨酸抗性通过在所说细菌的细胞中扩增如权利要求1中定义的DNA的拷贝数得到增强。
4.根据权利要求3的细菌，其中在所说细菌细胞的多拷贝载体上携带有如权利要求1定义的DNA。
5.根据权利要求3的细菌，其中在所说细菌细胞的转座子上携带有如权利要求1定义的DNA。
6.一种用于生产氨基酸的方法，该方法包括下列步骤：
在培养基中培养具有生产所述氨基酸能力的如权利要求3至5之任一所定义的细菌，以便在培养基中生产和积累所述的氨基酸，以及
从培养基中回收所述的氨基酸，其中所述氨基酸是L-高丝氨酸、L-丙氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-苏氨酸。
7.一种用于生产氨基酸的方法，该方法包括下列步骤：
在培养基中培养具有生产所述氨基酸能力的如权利要求3至5之任一所定义的细菌，以便在培养基中生产和积累所述的氨基酸，以及
从培养基中回收所述的氨基酸，其中所说的氨基酸为至少一种选自由下列氨基酸组成的组的氨基酸：L-丙氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸。
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