BR112016007286B1

BR112016007286B1 - Métodos de controle de amônia e para produção de uma substância alvo, e, aparelho para controle de amônia

Info

Publication number: BR112016007286B1
Application number: BR112016007286-3A
Authority: BR
Inventors: Ryo Takeshita
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2021-07-20
Also published as: EP3053999A4; US20150337254A1; JPWO2015050234A1; ES2761596T3; CN106459857A; RU2628696C1; EP3053999B1; CN106459857B; KR20160062151A; EP3053999A1; US9708577B2; JP5958653B2; BR112016007286A2; JP2016106637A; PL3053999T3; WO2015050234A1; KR101783681B1

Abstract

métodos de controle de amônia e para produção de uma substância alvo, e, aparelho para controle de amônia um método de controle de amônia para controlar a concentração de amônia de um meio de cultura contido em um tanque de cultura, em que a concentração de amônia no tanque de cultura é controlada usando um aparelho de controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia no tanque de cultura, um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada alimentador de amônia e no sensor de amônia, que o método compreende as seguintes etapas realizadas pela parte de controle: etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada para cálculo da concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura substituindo o sinal proveniente do sensor de amônia em uma curva de calibração que representa a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura e um sinal proveniente do sensor de amônia; e uma etapa de direção de fornecimento de amônia para direcionamento do alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção se refere a um aparelho para controlaramônia e a um método de controle de amônia, especialmente um aparelho para controlar amônia e método de controle de amônia que são para controlar a concentração de amônia de um meio de cultura contido em um tanque de cultura.Fundamentos da Invenção

[002] Há muito tempo, amônia é uma fonte de fornecimento muitoimportante de nitrogênio como um nutriente indispensável usado para fermentação.

[003] Como uma técnica existente para medir a concentração deamônia, existe uma técnica de usar um eletrodo de íon.

[004] Por exemplo, no método descrito no Documento de Patente 1,a concentração de amônia em um meio de fermentação líquida é controlada para ser menor ou igual a uma certa concentração e, por meio disso, bactérias de fermentação são cultivadas a um valor de pH mais alto. Os contraíons ao serem adicionados no meio para a produção de uma substância básica por fermentação são por meio disso reduzidos, e o processo de fabricação é significativamente simplificado em consequência disso.Referência à Técnica Anterior

Documento de Patente

[005] Documento de Patente 1: Publicação de Patente InternacionalWO2006/038695

Descrição da InvençãoObjetivo a ser Alcançado pela Invenção

[006] Entretanto, a técnica convencional acima mencionada tem um problema de que é difícil controlar diretamente a concentração de amônia no meio de fermentação líquido, ou seja, medir ou controlar diretamente a concentração de amônia em um tanque de cultura durante a cultura.

[007] A saber, ela tem um problema que, como mostrado na Fig. 9(fluxograma mostrando um exemplo de processo convencional de controle de concentração de amônia), a fim de saber a concentração de amônia total (concentração total de NH3 e NH4+) no meio de cultura, é necessária uma série de operações de amostrar o meio de cultura do interior do tanque de cultura (Etapa SA-1), misturar o meio de cultura amostrado com um líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH) (Etapa SA-2), e medir continuamente a amônia existente que foi convertida em amônia não ionizada (NH3) fora do tanque de cultura (Etapa SA-3). Ou seja, é difícil realizar esterilmente a série de operações para a medição com o meio de cultura amostrado fora do tanque de cultura. Além disso, uma vez que o meio de cultura usado para a medição contém o líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH), ele não pode ser reciclado para o tanque de cultura e deve ser descartado. Portanto, uma maior frequência de medição provoca maior desperdício do meio de cultura, e o número de vezes de medição real é limitado (Etapa SA-4).

[008] Além disso, no tanque de cultura, amônia é continuamenteconsumida, mas a taxa de consumo de amônia não é constante. Portanto, ela também tem um problema de que, como mostrado na Fig. 9, mesmo se a concentração de amônia for medida pela operação de amostragem acima mencionada com um certo intervalo (Etapa SA-5), a evolução de curto período do mesmo não pode ser conhecida e, portanto, a concentração de amônia no meio de cultura não pode ser controlada para ser constante (Etapa SA-6).

[009] Além disso, mesmo se a amônia não ionizada (NH3)parcialmente existente no meio de cultura for medida com um eletrodo de íon em vista dos problemas acima mencionados da técnica convencional, ela apresenta um problema de que não é fácil verificar os valores medidos para corrigir erros que ocorrem durante a cultura. Isto se dá em virtude de, a fim de saber a concentração de amônia correta presente, ser necessário medir a concentração de amônia total para um meio de cultura amostrado que foi misturado com um líquido de reação fortemente alcalino de maneira que a amônia no meio de cultura seja convertida em amônia não ionizada (NH3).

[0010] A saber, que é em virtude de, na fermentação usual, o valor de pH do meio de cultura ser em uma faixa fracamente acídia a fracamente alcalina (pH em torno de 5 a 9), assim uma parte ou substancialmente toda a amônia existente no meio de cultura existe como ionizada, íon de amônio (NH4+) e, portanto, é difícil obter a concentração de amônia total (concentração total de NH3 e NH4+) no meio de cultura apenas medindo a concentração de amônia não ionizada (NH3) com o eletrodo de íon acima mencionado. Portanto, a concentração de amônia total não pode ser corretamente controlada.

[0011] A presente invenção foi realizada em vista dos problemas apresentados, e um objetivo da presente invenção é prover um aparelho para controlar amônia e método de controle de amônia que permite a cultura com controle contínuo e arbitrário da concentração de amônia no meio de cultura. MEIOS PARA OBTER O OBJETIVO

[0012] A fim de obter o objetivo mencionado anteriormente, a presente invenção provê o seguinte método e aparelho.(1) Um método de controle de amônia para controlar a concentração de amônia de um meio de cultura contido em um tanque de cultura, em que a concentração de amônia no tanque de cultura é controlada usando um aparelho para controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia no tanque de cultura, um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia, e cujo método compreende as etapas seguintes realizadas pela parte de controle:uma etapa de criação da curva de calibração de criar uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura e um sinal do sensor de amônia,uma etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada de calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura contido no tanque de cultura substituindo o sinal do sensor de amônia na curva de calibração, euma etapa de direcionamento do fornecimento de amônia de direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura, quando a concentração de amônia não ionizada calculada é menor que uma concentração predeterminada.(2) O método de controle de amônia como mencionado anteriormente, compreendendo adicionalmente uma etapa de criação da curva de calibração de criar a curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura e o sinal do sensor de amônia.(3) O método de controle de amônia como mencionado anteriormente, em que o aparelho para controle de amônia é adicionalmente conectado em um sensor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura,cujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia total de calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada e um valor de pH medido com o sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia representando uma razão existente de concentração de amônia não ionizada e concentração de amônia dissociada no meio de cultura contido no tanque de cultura para cada valor de pH, eem que, na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, a concentração de amônia total é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.(4) O método de controle de amônia como mencionado anteriormente, que compreende prover um sensor de amônia externo fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada, eobter um sinal do sensor de amônia externo medindo a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura, que, depois da coleta no tanque de cultura, se torna suficientemente alcalino para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo, como um sinal para verificação, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de verificação de verificar a curva de calibração de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir do sinal para verificação com base na curva de calibração corresponde à concentração de amônia total calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia total.(5) O método de controle de amônia como mencionado anteriormente, em que o aparelho para controle de amônia é conectado no sensor de amônia externo, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de entrada de sinal para verificação de entrar com o sinal do sensor de amônia externo, como o sinal para verificação.(6) Um método para produção de uma substância alvo por fermentação compreendendo cultivar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um tanque de cultura contendo um meio de cultura, e coletar a substância alvo da cultura em que o microrganismo é cultivado com concentração de amônia de controle do meio de cultura pelo método de controle de amônia como mencionado anteriormente.(7) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a substância alvo é um L-aminoácido, um ácido orgânico, um ácido nucleico, um álcool ou uma proteína.(8) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a substância alvo é um aminoácido básico selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-arginina e L-histidina.(9) O método de produção como mencionado anteriormente, que compreende reduzir a quantidade de íons de sulfato e/ou íons de cloreto usados como contraíons do aminoácido básico ajustando a concentração de amônia total do meio de cultura para ficar em uma certa faixa de concentração durante pelo menos uma parte do processo de cultura total.(10) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 300 mM ou menos.(11) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 200 mM ou menos.(12) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 100 mM ou menos.(13) Um aparelho para controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia em um tanque de cultura, um sensor de amônia, e uma parte de controle, em que:o sensor de amônia responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura,a parte de controle é conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia,a parte de controle cria uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia,calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura substituindo o sinal do sensor de amônia na curva de calibração, edirecionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada.(14) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é adicionalmente conectado em um sensor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura, eem que a parte de controle adicionalmente calcula concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada calculada pelo dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada e o valor de pH medido com o sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia representando uma razão existente de concentração de amônia não ionizada e concentração de amônia dissociada no meio de cultura para cada valor de pH, ea concentração de amônia total é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.(15) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, em que a parte de controle adicionalmente:verifica a curva de calibração de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir de um sinal para verificação com base na curva de calibração corresponda à concentração de amônia total calculada pelo dispositivo de cálculo da concentração de amônia total, eo sinal para verificação é:um sinal obtido com um sensor de amônia externo provido fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada preparando o sensor de amônia externo, emedir a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura que, depois da coleta no tanque de cultura, é tornada suficientemente alcalina para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo.(16) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é conectado no sensor de amônia externo, eem que a parte de controle entra adicionalmente com o sinal do sensor de amônia externo como o sinal para verificação.(17) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é configurado para manter a concentração de amônia total em uma faixa predeterminada.(18) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, compreendendo adicionalmente uma interface do usuário.(19) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é configurado para controle em tempo real de amônia em um meio de cultura, preferivelmente para controle em tempo real in situ de amônia em um meio de cultura.(20) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é adaptado para controlar amônia em um meio de cultura de um ou mais tanques de cultura, preferivelmente 1 a 10 tanques de cultura.(21) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é adaptado para controlar amônia no meio de cultura em intervalos de 5 minutos ou menos, preferivelmente 1 segundo ou menos.(22) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é adaptado para verificar a curva de calibração em intervalos de 12 horas ou menos, preferivelmente 8 horas ou menos.(23) O aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente, que é adaptado para controlar amônia em pelo menos uma parte do período de cultura ou todo o período de cultura.(24) Um método para produção de uma substância alvo por fermentação compreendendo cultivar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um tanque de cultura contendo um meio de cultura para produzir e acumular a substância alvo no meio de cultura, em que a concentração de amônia total do meio de cultura é ajustada para ficar em uma certa faixa de concentração durante pelo menos uma parte do processo de cultura total, usando o aparelho para controle de amônia como mencionado anteriormente.(25) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 300 mM ou menos.(26) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 200 mM ou menos.(27) O método de produção como mencionado anteriormente, em que a certa faixa de concentração é 100 mM ou menos.

Efeito da Invenção

[0013] De acordo com a presente invenção, uma curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura e sinal do sensor de amônia (por exemplo, tensão elétrica) é criada, a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura é calculada com um sinal do sensor de amônia com base na curva de calibração, e o alimentador de amônia é direcionado para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma certa concentração. Portanto, a presente invenção tem efeitos que operações estéreis são permitidas para uma série de operações para a medição em um tanque de cultura, e a cultura pode ser realizada com controle contínuo e arbitrário da concentração de amônia no meio de cultura sem desperdiçar o meio de cultura.

[0014] Adicionalmente, de acordo com uma modalidade da presente invenção, a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura é calculada, o valor de pH no tanque de cultura é medido com um sensor de pH, a concentração de amônia total é calculada a partir da concentração de amônia não ionizada calculada, e o valor de pH medido com base em uma curva de dissociação de amônia armazenada em uma parte de armazenamento e, quando a concentração de amônia total calculada for menor que uma concentração predeterminada, o alimentador de amônia é direcionado para fornecer amônia no tanque de cultura. Portanto, a presente invenção tem efeitos que a concentração de amônia total (concentração total de NH3 e NH4+) do meio de cultura pode ser diretamente medida a partir do valor de pH e da concentração de amônia não ionizada (NH3) baseados na curva de dissociação de amônia, e por meio disso a cultura pode ser realizada adicionalmente controlando corretamente a concentração de amônia.

[0015] Entretanto, de acordo com a presente invenção, investigando a concentração de amônia total de um meio de cultura, que foi coletada do tanque de cultura e suspensa em um líquido de reação fortemente alcalino de maneira que íon de amônio seja convertido em amônia não ionizada, usando um aparelho de medição de amônia comum externo; e calcular a concentração de amônia não ionizada no meio de cultura substituindo o valor de concentração de amônia total anterior na equação de dissociação de amônia e usando um valor de pH acima mencionado do meio de cultura armazenada na etapa de medição do valor de pH, a curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada e a saída do sensor (tensão elétrica) pode ser verificada. Portanto, erros gerados durante a cultura podem ser corrigidos.Breve Descrição dos Desenhos

[0016] Fig. 1A é um fluxograma mostrando um exemplo do processo do controle de concentração de amônia de acordo com a presente invenção.

[0017] Fig. 1B é um fluxograma mostrando um outro exemplo do processo do controle de concentração de amônia de acordo com a presente invenção.

[0018] Fig. 2 é um diagrama configuracional teórico mostrando a configuração básica da presente invenção.

[0019] Fig. 3 é um gráfico mostrando um exemplo da curva de dissociação de amônia usada para a presente invenção.

[0020] Fig. 4 é um diagrama de blocos lógico mostrando um exemplo da configuração do aparelho para controle de amônia 100 de acordo com a presente invenção.

[0021] Fig. 5 é um fluxograma mostrando um exemplo do processamento operacional básico realizado com o aparelho para controle de amônia 100 de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0022] Fig. 6 é um fluxograma mostrando detalhes de um exemplo do processo realizado com o aparelho para controle de amônia 100 de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0023] Fig. 7 mostra resultados do controle de concentração de amônia obtidos na produção de arginina (Arg) realizada usando o aparelho do exemplo.

[0024] Fig. 8 mostra acúmulo de Arg na produção de Arg realizada usando o aparelho do exemplo.

[0025] Fig. 9 é um fluxograma mostrando um exemplo do processo de controle de concentração de amônia convencional.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

[0026] Em seguida, modalidades do aparelho para controle de amônia e método de controle de amônia da presente invenção serão explicadas com detalhes com referência aos desenhos. Entretanto, a presente invenção não é limitada a essas modalidades.[Sumário da invenção]

[0027] Em seguida, esboço da presente invenção será explicado com referência às Figs. 1A, 1B, 2, e 3, e então configuração, processo, etc. da presente invenção serão explicados com detalhes. Fig. 1A é um fluxograma mostrando um exemplo do processo do controle de concentração de amônia de acordo com a presente invenção, Fig. 1B é um fluxograma mostrando um outro exemplo do processo do controle de concentração de amônia de acordo com a presente invenção, Fig. 2 é um diagrama configuracional teórico mostrando a configuração básica do aparelho da presente invenção, e Fig. 3 é um gráfico mostrando um exemplo da curva de dissociação de amônia usada para a presente invenção.

[0028] O método da presente invenção é um método de controle de amônia para controlar a concentração de amônia em um tanque de cultura, usando um aparelho para controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia no tanque de cultura, um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia. Como mostrado na Fig. 1A, o método da presente invenção compreende realizar um processo com o aparelho para controle de amônia baseado na entrada de um sinal do sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e produzir uma direção para o alimentador de amônia que fornece amônia no tanque de cultura. O termo “conectado” é suficiente para ser funcionalmente conectado, e pode ser conectado por um sistema com fio ou sem fio.

[0029] O método da presente invenção compreende as etapas seguintes realizadas pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada de calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura, substituindo o sinal do sensor de amônia em uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia, euma etapa de direcionamento do fornecimento de amônia de direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura, quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada.

[0030] O método pode compreender adicionalmente uma etapa de criação da curva de calibração de criar uma curva de calibração, representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia. Como para a curva de calibração, ela pode ser criada provendo soluções de amônia a concentrações conhecidas, e imergindo um eletrodo nas soluções para representar graficamente tensões mostradas pelo eletrodo.

[0031] Na etapa de criação da curva de calibração, é criada uma curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e o sinal do sensor de amônia. Esta criação pode compreender leitura de uma curva de calibração de uma parte de armazenamento provida no aparelho para controle de amônia, ou alimentação de uma curva de calibração externa.

[0032] O sensor de amônia responde a amônia não ionizada, e é normalmente um sensor compreendendo uma membrana de seleção de amônia e um eletrodo interno. O sinal do sensor de amônia não é particularmente limitado desde que ele seja um sinal gerado respondendo a amônia não ionizada, e uma tensão de um eletrodo interno é normalmente usada. Entretanto, ele pode ser convertido em uma outra característica elétrica usando um circuito elétrico. Adicionalmente, uma característica elétrica como essa já que tensão pode ser usada como um sinal analógico original, ou como um sinal numérico obtido por conversão analógica em digital.

[0033] Uma curva de calibração pode ser criada investigando de antemão a relação entre um sinal como esse e a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura. Uma curva de calibração criada como descrito anteriormente pode ser armazenada em uma parte de armazenamento. A forma para o armazenamento não é particularmente limitada, e a curva de calibração pode ser armazenada na forma de uma tabela, ou uma equação aritmética representando uma curva de calibração pode ser armazenada.

[0034] Na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada,concentração de amônia não ionizada do meio de cultura é calculada substituindo o sinal do sensor de amônia na curva de calibração. Quando a curva de calibração é armazenada na forma de uma tabela, o cálculo por substituição na curva de calibração pode ser realizado lendo um valor registrado na posição correspondendo ao valor substituído do sinal. Quando a curva de calibração é armazenada como uma equação aritmética, ela pode ser realizada por cálculo substituindo o valor alimentado do sinal na equação.

[0035] Na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada, o alimentador de amônia é direcionado para fornecer amônia no tanque de cultura.

[0036] O alimentador de amônia não é particularmente limitado, desde que ele possa controlar o fornecimento de amônia no tanque de cultura com base em uma direção gerada na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia. Por exemplo, o alimentador de amônia é constituído de maneira que, em respostas à direção gerada na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, uma válvula eletromagnética de linha de gás de amônia é aberta para fornecer amônia.

[0037] Amônia pode ser amônia gasosa ou amônia aquosa. Amônia pode também ser fornecida na forma de uma solução aquosa de um composto que gera íon de amônio quando ele é dissolvido, tal como sulfato de amônio. Taxa de fornecimento de amônia fornecida pelo alimentador de amônia é selecionada de maneira que a concentração de amônia não deve mudar rapidamente, em consideração do tamanho do tanque de cultura, frequência de direções gerada na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia e assim por diante. A concentração de amônia total é normalmente controlada para ser 1 a 350 mM, mais desejavelmente 2,5 a 300 mM, ainda mais desejavelmente 2,5 a 200 mM, ainda mais desejavelmente 3 a 100 mM, ainda mais desejavelmente 3 a 50 mM em termos de amônia.

[0038] Uma modalidade da direção pode ser uma saída de um sinal elétrico que opera diretamente um dispositivo como uma válvula do alimentador de amônia envolvido no controle do fornecimento de amônia, ou quando o alimentador de amônia tem uma função de comunicação, ela pode ser uma saída de um sinal de comunicação para controlar uma válvula ou similares pela função de comunicação.

[0039] O aparelho para controle de amônia da presente invenção pode ser conectado adicionalmente em um sensor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura. Nesta modalidade, o método da presente invenção compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia total de calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada, calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada e o valor de pH do sensor de pH, com base em uma curva de dissociação de amônia representando razões existentes de concentração de amônia não ionizada e concentração de íon de amônio no meio de cultura para cada valor de pH, ena etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, a concentração de amônia total é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.

[0040] A relação das razões existentes de concentração de amônia não ionizada e concentração de íon de amônio no meio de cultura para cada valor de pH, pode ser teoricamente calculada, ou realmente medida. Com base nesta relação, a curva de dissociação pode ser criada.

[0041] A curva de dissociação criada como descrito anteriormente é armazenada na parte de armazenamento. Uma modalidade do armazenamento não é particularmente limitada, e a curva de dissociação pode ser armazenada na forma de uma tabela bidimensional, ou uma equação aritmética representando a curva de dissociação pode ser armazenada. Além disso, ela pode ser armazenada junto com a curva de calibração a ser armazenada na etapa de armazenamento da curva de calibração na forma de uma tabela, ou uma equação aritmética representando a curva de dissociação em combinação com a curva de calibração pode ser criada e armazenada.

[0042] A curva de dissociação de amônia será explicada com referência à Fig. 3. Na Fig. 3, o eixo vertical indica a razão existente (%) de amônia não ionizada (NH3) e íon de amônio (NH4+) no tanque de cultura, e o eixo horizontal indica o valor de pH no tanque de cultura. As curvas mostradas no gráfico da Fig. 3 são as curvas de dissociação de amônia não ionizada (NH3) e íon de amônio (NH4+) em vários valores de pH. Como mostrado na Fig. 3, amônia não ionizada (NH3) e íon de amônio (NH4+) existem em quantidades substancialmente equivalentes em torno de pH 9 e, quando o valor de pH fica maior, amônia não ionizada (NH3) aumenta, enquanto que íon de amônio (NH4+) diminui. A amônia não ionizada e íon de amônio são os mesmos da amônia não ionizada (NH3) e amônia dissociada (NH4+), respectivamente.

[0043] Como descrito anteriormente, em fermentação usual, o valor de pH do meio de cultura é em uma faixa fracamente acídia a fracamente alcalina (em torno de pH 5 a 9), assim a maior parte da amônia existente no meio de cultura existe como íon de amônio (NH4+) e, portanto, foi convencionalmente impossível obter a concentração de amônia total (concentração total de NH3 e NH4+) no meio de cultura apenas medindo a concentração de amônia não ionizada (NH3). Entretanto, de acordo com a presente invenção, a curva de dissociação de amônia é criada de antemão para o meio de cultura a ser usado como um pré-processamento e, portanto, a concentração de amônia total (concentração total de NH3 e NH4+) pode ser calculada a partir da concentração de amônia não ionizada (NH3) com base na curva de dissociação de amônia.

[0044] Na etapa de cálculo da concentração de amônia total, a concentração de amônia total é calculada a partir da concentração de amônia não ionizada calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada e um valor de pH medido com o sensor de pH com base na curva de dissociação de amônia. Quando a curva de dissociação de amônia é armazenada na forma de uma tabela, o cálculo a partir da concentração de amônia não ionizada e o valor de pH com base na curva de dissociação de amônia pode ser realizado lendo um valor registrado em um endereço correspondendo à concentração de amônia não ionizada alimentada e valor de pH. Quando uma equação aritmética é armazenada, o cálculo pode ser realizado por cálculo substituindo os valores alimentados na equação.

[0045] Um exemplo do cálculo da concentração de amônia total é mostrado em (1) a (3) a seguir.(1) Primeiramente, substituindo a tensão do sensor de amônia no tanque de cultura (por exemplo, 0,5 V) na equação aritmética representando a curva de calibração, é calculada a concentração de amônia não ionizada (por exemplo, 30 mM).(2) Em seguida, substituindo o valor de pH no tanque de cultura medida com o sensor de pH (por exemplo, pH 6) na equação aritmética representando a curva de dissociação, é estimada a razão existente de amônia não ionizada (por exemplo, 40%).(3) Usando a razão existente estimada de amônia não ionizada (por exemplo, 40%) e a concentração de amônia não ionizada calculada em (1) (por exemplo, 30 mM), cálculo é realizado, por exemplo, como a seguir: "30 mM x (100/40) = 75 mM", para calcular a concentração de amônia total (75 mM neste caso).

[0046] Na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, quando a concentração de amônia não ionizada é menor que uma concentração predeterminada, o alimentador de amônia é direcionado para fornecer amônia no tanque de cultura. Alternativamente, quando a concentração de amônia total é menor que uma concentração predeterminada, o alimentador de amônia pode ser direcionado para fornecer amônia no tanque de cultura.

[0047] O aparelho para controle de amônia pode ser conectado adicionalmente em um sensor de amônia externo provido fora do tanque de cultura. Medindo uma tensão do sensor de amônia externo para um meio de cultura que foi coletado do tanque de cultura e suspenso em um líquido de reação fortemente alcalino, de maneira que o íon de amônio seja convertido na amônia não ionizada, a curva de calibração pode ser verificada de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada substituindo a tensão medida na curva de calibração corresponde à concentração de amônia total calculada.

[0048] A função de calcular automaticamente a concentração de amônia total com base na curva de dissociação de amônia usando um valor de pH realmente medido do meio de cultura contido no tanque de cultura, pode ser usada apenas para a verificação, e a concentração real de amônia no tanque de cultura pode ser controlada com base na concentração de amônia não ionizada (NH3).

[0049] Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, quando a verificação é realizada, a curva de calibração pode ser verificada de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada substituindo a tensão medida pelo sensor de amônia externo para um meio de cultura amostrado, que foi suspenso em um líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH) de maneira que amônia no meio de cultura seja convertida em amônia não ionizada na curva de calibração, corresponde à concentração de amônia total calculada pelo cálculo da concentração de amônia total.

[0050] De uma maneira geral, o aparelho da presente invenção tem a seguinte configuração básica. Ou seja, o aparelho para controle de amônia compreende pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia em um tanque de cultura, um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia. O alimentador de amônia pode ser adaptado para fornecer amônia em um tanque de cultura. O sensor de amônia é adaptado para responder a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura. Como mostrado na Fig. 2, o aparelho para controle de amônia da presente invenção pode ser configurado para ser conectado em um alimentador de amônia que fornece amônia em um tanque de cultura, e um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada em meio de cultura contido no tanque de cultura, e compreende uma parte de armazenamento e uma parte de controle. O termo “conectado” significa funcionalmente conectado, e pode ser conectado por um sistema com fio ou sem fio.

[0051] A parte de controle compreende:um dispositivo de criação de curva de calibração para criar uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia,um dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada para calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura a partir do sinal do sensor de amônia com base na curva de calibração, e um dispositivo de direcionamento do fornecimento de amônia para direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura, quando a concentração de amônia não ionizada for menor que uma concentração predeterminada.

[0052] A parte de controle pode compreender:uma parte de armazenamento configurada para armazenar uma curva de calibração predeterminada, ou um dispositivo de criação de curva de calibração configurado para criar uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia,um dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada configurado para calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura a partir do sinal do sensor de amônia com base na curva de calibração, eum dispositivo de direcionamento do fornecimento de amônia configurado para direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura, quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada.

[0053] O aparelho da presente invenção pode compreender adicionalmente um dispositivo de cálculo da concentração de amônia total para calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada, calculada com a dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada e o valor de pH do sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia, representando razões existentes de concentração de amônia não ionizada e concentração de íon de amônio no meio de cultura contido no tanque de cultura para cada valor de pH.

[0054] O dispositivo de cálculo da concentração de amônia total pode ser configurado para calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada, calculada pelo dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada e o valor de pH do sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia, representando uma razão existente de concentração de amônia não ionizada e concentração de íon de amônio no meio de cultura para cada valor de pH.

[0055] Os componentes desses dispositivos são os mesmos daqueles explicados para as etapas do método da presente invenção.

[0056] A parte de controle pode compreender adicionalmente:um dispositivo de verificação configurado para verificar a curva de calibração de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir de um sinal para verificação com base na curva de calibração corresponda à concentração de amônia total calculada pelo dispositivo de cálculo da concentração de amônia total, eem que os dispositivos de verificação são configurados para usar um sinal para verificação que pode ser:um sinal obtido com um sensor de amônia externo provido fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada, eobtido medindo a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura, que, depois da coleta no tanque de cultura, é tornada suficientemente alcalina para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo.

[0057] A parte de controle pode ser adicionalmente adaptada para alimentar o sinal do sensor de amônia externo como o sinal para verificação.

[0058] O aparelho para controle de amônia pode ser configurado para manter a concentração de amônia total de um meio de cultura em uma faixa predeterminada.

[0059] O aparelho para controle de amônia pode compreender adicionalmente uma interface do usuário.

[0060] O aparelho para controle de amônia pode ser configurado para controle em tempo real de amônia em um meio de cultura, preferivelmente para controle em tempo real in situ de amônia em um meio de cultura.

[0061] O aparelho para controle de amônia pode ser adaptado para controlar amônia em um meio de cultura de um ou mais tanques de cultura, opcionalmente 1 a 10 tanques de cultura.

[0062] O aparelho para controle de amônia pode ser adaptado para controlar amônia no meio de cultura em intervalos de 5 minutos ou menos, preferivelmente 1 segundo ou menos.

[0063] O aparelho para controle de amônia pode ser adaptado para verificar a curva de calibração em intervalos de 12 horas ou menos, preferivelmente 8 horas ou menos.

[0064] O aparelho para controle de amônia pode ser adaptado para controlar amônia por pelo menos uma parte do período de cultura ou todo o período de cultura.

[0065] O tempo real ou tempo real in situ usado aqui significa controlar a concentração de amônia em um tempo predeterminado, ou seja, medir a concentração de amônia no tanque de cultura e fornecer amônia em meio dentro de um tempo predeterminado. Por exemplo, como para o tempo para medir amônia, ele pode adaptado para medir em intervalos de 5 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, ou 30 segundos ou menos. Como para o tempo para fornecer amônia, ele pode ser adaptado para fornecer em 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, 10 segundos ou menos, 5 segundos ou menos, ou 1 segundo ou menos.

[0066] Como para o tempo do controle total, ele pode ser adaptado para controlar em intervalos de 5 minutos ou menos, 3 minutos ou menos, 1 minuto ou menos, 30 segundos ou menos, ou 1 segundo ou menos.

[0067] O tempo e intervalo podem ser selecionados dependendo de uma taxa de mudança da concentração de amônia não ionizada ou da concentração de amônia total que pode ocorrer no meio de cultura no tanque de cultura durante a cultura. Por exemplo, eles podem ser adaptados para permitir que a mudança na concentração de amônia não ionizada no meio de cultura durante a cultura seja 0,5 mM ou menos, 0,2 mM ou menos, 0,1 mM ou menos no intervalo de medição, ou adaptados para permitir que a mudança na concentração de amônia total no meio de cultura durante a cultura seja 80 mM ou menos, 20 mM ou menos, 10 mM ou menos no intervalo de medição.

[0068] Em seguida, um exemplo da configuração do aparelho para controle de amônia será explicado.[Configuração do aparelho para controle de amônia 100]

[0069] Fig. 4 é um diagrama de blocos lógico mostrando um exemplo da configuração do aparelho para controle de amônia 100 no qual a presente invenção é aplicada, e ela mostra conceitualmente apenas uma parte da configuração com relação à presente invenção.

[0070] Como mostrado na Fig. 4, o aparelho para controle de amônia 100 da presente invenção é conectado no tanque de cultura 200, no alimentador de amônia 300 que fornece amônia no tanque de cultura 200, no sensor de amônia 10 que é inserido no tanque de cultura 200 e mede uma tensão de saída, e no sensor de pH 20 que é inserido no tanque de cultura 200 e mede valor de pH. Adicionalmente, o aparelho para controle de amônia 100 compreende uma parte de controle 102, tal como CPU, que controla integralmente todo o aparelho para controle de amônia 100, uma parte de saída de controle 104 que é conectada no alimentador de amônia 300, etc., uma parte de entrada de sinal 108 que é conectada no sensor de amônia 10, um sensor de amônia externo 12, o sensor de pH 20, etc., e uma parte de armazenamento 106 que armazena vários tipos de bases de dados, tabelas, e assim por diante, e essas partes são conectadas comunicativamente por meio de canais de comunicação arbitrária.

[0071] Na Fig. 4, o alimentador de amônia 300 compreende pelo menos um tanque de amônia 30 que contém amônia dentro, uma válvula 32 que ajusta quantidade de amônia fornecida a partir do tanque de amônia 30, e um comutador 31 que controla abertura e fechamento da válvula 32. Este alimentador de amônia 300 tem uma função de fornecer amônia no tanque de cultura 200 de acordo com direções enviadas do aparelho para controle de amônia 100.

[0072] Na Fig. 4, o tanque de cultura 200 contém o meio de cultura dentro, e é conectado no aparelho para controle de amônia 100 por meio do sensor de amônia 10 e do sensor de pH 20, que são inseridos no tanque de cultura 200. Adicionalmente, o tanque de cultura 200 é conectado no alimentador de amônia 300 por meio de um tubo para fornecer amônia do tanque de amônia 30 ou similares. Fig. 4 mostra o tanque de cultura 200 conectado em um béquer para amostragem ou similares no qual o sensor de amônia externo 12 é inserido por meio de um tubo para coletar uma amostra do meio de cultura como um exemplo. Entretanto, o tanque de cultura 200 pode não necessariamente ser conectado em um béquer como esse, e um usuário pode coletar uma amostra do tanque de cultura 200, e o sensor de amônia externo 12 pode ser usado para um béquer ou similares para o qual a amostra é levada.

[0073] Na Fig. 4, a parte de armazenamento 106 do aparelho para controle de amônia 100 que armazena vários tipos de bases de dados, tabelas, arquivos (arquivo de curva de dissociação de amônia 106a até arquivo de concentração de amônia total 106e) compreende um dispositivo de armazenamento tal como unidade de disco fixo, e armazena vários tipos de programas, tabelas, arquivos, bases de dados, e assim por diante usados para vários processamentos.

[0074] Entre esses componentes da parte de armazenamento 106, o arquivo de curva de dissociação de amônia 106a é um dispositivo de armazenamento de curva de dissociação de amônia que armazena a curva de dissociação de amônia mostrando razões existentes de concentração de amônia não ionizada e concentração de íon de amônio no tanque de cultura 200 para cada valor de pH, que é criada por processamento realizado pela parte de controle 102.

[0075] Adicionalmente, o arquivo de curva de calibração 106b é um dispositivo de armazenamento de curva de calibração que cria e armazena uma curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 e a tensão do sensor de amônia 10.

[0076] Adicionalmente, o arquivo da concentração de amônia não ionizada 106c é um dispositivo de armazenamento da concentração de amônia não ionizada que armazena a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 medida com o sensor de amônia 10, pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b medindo a tensão do sensor de amônia 10 e substituindo a tensão na curva de calibração.

[0077] Adicionalmente, o arquivo de valor de pH 106d é um dispositivo de armazenamento do valor de pH que armazena valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura 200 medido pela parte de medição do valor de pH 102c com o sensor de pH 20.

[0078] Adicionalmente, o arquivo de concentração de amônia total 106e é um dispositivo de armazenamento da concentração de amônia total que armazena a concentração de amônia total no tanque de cultura 200 calculada pela parte de cálculo da concentração de amônia total 102d a partir da concentração de amônia não ionizada armazenada no arquivo da concentração de amônia não ionizada 106c e o valor de pH armazenado no arquivo de valor de pH 106d com base na curva de dissociação de amônia armazenada no arquivo de curva de dissociação de amônia 106a.

[0079] Adicionalmente, na Fig. 4, a parte de saída de controle 104 controla as comunicações entre o aparelho para controle de amônia 100 e o alimentador de amônia 300. Ou seja, a parte de saída de controle 104 tem uma função de comunicação de transmitir um sinal para abertura e fechamento da válvula 32 controlando o comutador 31 do alimentador de amônia 200 de maneira que o alimentador de amônia 300 fornece amônia no tanque de cultura 200 em uma quantidade direcionada pelo aparelho para controle de amônia 100.

[0080] Adicionalmente, na Fig. 4, a parte de entrada de sinal 108 controla o sensor de amônia 10, o sensor de amônia externo 12, e o sensor de pH 20. O sensor de amônia 10 é um sensor para medir concentração de amônia não ionizada (NH3) entre a amônia contida no meio de cultura contido no tanque de cultura 200, e compreende, por exemplo, um eletrodo de íon ou similares. Adicionalmente, este sensor de amônia 10 pode ser conectado em um amplificador de NH3 11 que amplifica um sinal representando a concentração de amônia não ionizada (NH3) medida no tanque de cultura 200, e transmite-a para a parte de entrada de sinal 108. Uma vez que o sensor de amônia externo 12 e o amplificador de NH3 13 são similares, explicações dos mesmos são omitidas. Adicionalmente, o sensor de pH 20 é um sensor para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura 200, e compreende, por exemplo, um eletrodo de pH ou similares. Adicionalmente, este sensor de pH 20 pode ser constituído de maneira a ser conectado em um amplificador de pH 21 que amplifica o sinal representando o valor de pH medido no tanque de cultura 200, e transmite-o para a parte de entrada de sinal 108.

[0081] Adicionalmente, na Fig. 4, a parte de controle 102 tem uma memória interna para armazenar programas de controle, tais como OS (Sistema Operacional), programas que definem vários tipos de procedimentos de processamento, e dados necessários, e realiza processamentos de informação para realizar vários processos com esses programas e assim por diante. A parte de controle 102 é constituída, no sentido funcional e conceitual, de maneira a compreender a parte de criação da curva de calibração 102a, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b, a parte de medição do valor de pH 102c, a parte de cálculo da concentração de amônia total 102d, a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e, a parte de medição da tensão para verificação 102f, e a parte de verificação 102g.

[0082] Entre esses, a parte de criação da curva de calibração 102a é um dispositivo de criação de curva de calibração que cria uma curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 e a tensão do sensor de amônia 10.

[0083] Adicionalmente, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b é um dispositivo de cálculo da concentração de amônia não ionizada que calcula a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 substituindo a tensão do sensor de amônia 10 na curva de calibração.

[0084] Adicionalmente, a parte de medição do valor de pH 102c é um dispositivo de medição do valor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura 200 com o sensor de pH 20.

[0085] Adicionalmente, a parte de cálculo da concentração de amônia total 102d é um dispositivo de cálculo da concentração de amônia total para calcular a concentração de amônia total no tanque de cultura 200 a partir da concentração de amônia não ionizada armazenada no arquivo da concentração de amônia não ionizada 106c, e o valor de pH armazenado no arquivo de valor de pH 106d com base na curva de dissociação de amônia armazenada no arquivo de curva de dissociação de amônia 106a.

[0086] Adicionalmente, a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e é um dispositivo de direcionamento do fornecimento de amônia que direciona o alimentador de amônia 300 para fornecer amônia no tanque de cultura 200, quando a concentração de amônia não ionizada calculada pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b for menor que uma concentração predeterminada. Adicionalmente, a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e pode direcionar o alimentador de amônia 300 para fornecer amônia no tanque de cultura 200, quando a concentração de amônia total calculada pela parte de cálculo da concentração de amônia total 102d for menor que uma concentração predeterminada

[0087] Adicionalmente, a parte de medição da tensão para verificação 102f é um dispositivo de medição de tensão para verificação para medir tensão para um meio de cultura que foi coletado do tanque de cultura 200, e suspenso em um líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH) de maneira que íon de amônio seja convertido em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo 12.

[0088] Adicionalmente, a parte de verificação 102g é um dispositivo de verificação para verificar uma curva de calibração armazenada no arquivo de curva de calibração 106b de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada substituindo a tensão medida com a parte de medição da tensão para verificação 102f na curva de calibração represente a concentração de amônia total, calculada pela concentração de amônia total.[Processamento realizado por aparelho para controle de amônia 100]

[0089] Em seguida, um exemplo de processamento realizado pelo aparelho para controle de amônia 100 constituído como descrito anteriormente será explicado com detalhes com referência às Figs. 5 e 6. Fig. 5 é um fluxograma mostrando um exemplo do processamento operacional básico realizado pelo aparelho para controle de amônia 100 de acordo com esta modalidade, e Fig. 6 é um fluxograma mostrando detalhes de um exemplo do processamento realizado pelo aparelho para controle de amônia 100 de acordo com esta modalidade.[Processamento operacional básico]

[0090] Primeiramente, um exemplo do processamento operacional básico realizado pelo aparelho para controle de amônia 100 nesta modalidade será explicado com referência à Fig. 5.(Pré-processamento)

[0091] Como mostrado na Fig. 5, como um pré-processamento, a parte de controle 102 pode criar uma curva de dissociação de amônia (referir- se à Fig. 3) que mostra a razão existente da concentração de amônia não ionizada e da concentração de íon de amônio no tanque de cultura 200 para cada valor de pH, e armazena-a no arquivo de curva de dissociação de amônia 106a (Etapa SB-1). Ou seja, a parte de controle 102 pode criar uma curva de dissociação de amônia calculando as razões existentes de amônia não ionizada e íon de amônio para vários valores de pH com base na constante de dissociação de amônia, e plotando os valores calculados na forma de um gráfico.(Processamento principal)

[0092] Em seguida, a parte de criação da curva de calibração 102a cria uma curva de calibração que representa a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 e a tensão do sensor de amônia 10 (Etapa SB-2).

[0093] Em seguida, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b calcula a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 substituindo a tensão do sensor de amônia 10 na curva de calibração (Etapa SB-3). Em seguida, o processo avança para o processamento da Etapa SB-6.

[0094] Na Etapa SB-3 mencionada anteriormente, após a concentração de amônia não ionizada ser calculada pelo processamento na parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b, os processamentos da Etapa SB-4 e Etapa SB-5 podem ser realizados.

[0095] A parte de medição do valor de pH 102c mencionada anteriormente pode medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura 200 com o sensor de pH 20 (Etapa SB-4). Adicionalmente, a parte de cálculo da concentração de amônia total 102d pode calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada calculada pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b e pelo valor de pH medido com a parte de medição do valor de pH 102c com base na curva de dissociação de amônia armazenada no arquivo de curva de dissociação de amônia 106a (Etapa SB-5).

[0096] Em seguida, a parte de controle 102 julga se a concentração de amônia não ionizada medida pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b é ou não menor que uma concentração predeterminada (Etapa SB-6). A parte de controle 102 pode julgar se a concentração de amônia total medida pela parte de medição de amônia total 102d é ou não menor que uma concentração predeterminada (Etapa SB-6).

[0097] Em seguida, quando a parte de controle 102 julga que a concentração de amônia não ionizada medida pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b na Etapa SB-3 é menor que a concentração predeterminada (Etapa SB-6, Sim), a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e direciona o alimentador de amônia 300 para fornecer amônia no tanque de cultura 200 (Etapa SB-7). A parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e pode direcionar o alimentador de amônia 300 para fornecer amônia no tanque de cultura 200, quando a parte de controle 102 julga que a concentração de amônia total medida pela parte de medição de amônia total 102d é menor que a concentração predeterminada (Etapa SB-6, Sim) (Etapa SB-7).

[0098] Por outro lado, quando a parte de controle 102 julga que a concentração de amônia não ionizada medida pela parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b não é menor que a concentração predeterminada (Etapa SB-6, Não), o processo retorna para o processamento da Etapa SB-3.

[0099] Adicionalmente, quando a parte de controle 102 julga que a concentração de amônia total medida pela parte de medição de amônia total 102d não é menor que a concentração predeterminada (Etapa SB-6, Não), os processamentos da Etapa SB-8 a Etapa SB-10 podem ser realizados.

[00100] A parte de controle 102 pode julgar se a curva de calibração criada na Etapa SB-2 deve ou não ser verificada (Etapa SB-8). Embora a Fig. 5 mostre um exemplo no qual é julgado se o processamento de verificação é iniciado após fornecimento de amônia é direcionado (Etapa SB-6), o julgamento pode ser realizado em qualquer momento de acordo com entrada do usuário, ou pode ser automaticamente realizado para cada período estabelecido de antemão.

[00101] Adicionalmente, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a verificação deve ser realizada (Etapa SB-8, Sim), a parte de medição da tensão para verificação 102f pode medir uma tensão do sensor de amônia externo 12 para um meio de cultura que foi coletado do tanque de cultura 200, e suspenso em um líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH) de maneira que íon de amônio é convertido em amônia não ionizada (Etapa SB-9).

[00102] Adicionalmente, a parte de verificação 102g pode verificar a curva de calibração de maneira que a concentração de amônia não ionizada calculada substituindo a tensão medida pela parte de medição da tensão para verificação 102f na curva de calibração armazenada no arquivo de curva de calibração 106b corresponda à concentração de amônia total calculada pelo cálculo da concentração de amônia total (Etapa SB-10).

[00103] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a verificação não deve ser realizada (Etapa SB-8, Não), o processo retorna para o processamento da Etapa SB-3.

[00104] Estes processamentos operacionais básicos (Etapa SB-2 a Etapa SB-10) são repetidamente realizados durante a cultura. Por meio disso, a concentração de amônia no tanque de cultura 200 pode ser controlada, e a cultura pode ser realizada com controle contínuo e arbitrário da concentração de amônia no meio de cultura. Agora, a explicação dos processamentos operacionais básicos do aparelho para controle de amônia 100 da presente invenção é finalizada.[Detalhes do processamento de controle de amônia]

[00105] Em seguida, detalhes de um exemplo do processamento realizado pelo aparelho para controle de amônia 100 de acordo com esta modalidade da presente invenção serão explicados com referência à Fig. 6.

[00106] Como mostrado na Fig. 6, a parte de controle 102 julga se a curva de dissociação de amônia criada e/ou a concentração de amônia total calculada deve ou não ser verificada (Etapa SC-1). O conteúdo do processamento desta Etapa SC-1 é o mesmo daquele do processamento da Etapa SB-7 mostrado na Fig. 5. Além do mais, como descrito anteriormente, se este processamento de verificação é iniciado pode ser julgado em qualquer momento de acordo com entrada do usuário, ou automaticamente julgado para cada período estabelecido de antemão.

[00107] Em seguida, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a verificação deve ser realizada (Etapa SC-1, Sim), uma curva de calibração é criada para o meio de cultura contido no tanque de cultura 200 (Etapa SC-2).

[00108] A "curva de calibração" mencionada anteriormente é uma equação de relacionamento representando o relacionamento entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 e a tensão medida com o sensor de amônia 10, e nesta modalidade, ela é usada para medir a concentração de amônia não ionizada (C) substituindo a tensão medida com o sensor de amônia 10 nas Etapas SC-7 e SC-10 descritas posteriormente na curva de calibração.

[00109] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a verificação não deve ser realizada (Etapa SC-1, Não), o processo avança para o processamento da Etapa SC-3.

[00110] Em seguida, a parte de controle 102 julga se um parâmetro de controle para o tanque de cultura 200 deve ou não ser mudado (Etapa SC-3).

[00111] O parâmetro de controle mencionado anteriormente é, por exemplo, valor SV (Valor Ajustado), valor TC (Ciclo de Tempo), valor ON (Em Tempo), ou similares. O valor SV é um valor pré-estabelecido da concentração de amônia total ou concentração de amônia não ionizada (mM) a ser controlado. Adicionalmente, o valor TC representa ciclo para julgar fornecimento de amônia (segundo). Adicionalmente, o valor ON representa tempo (segundo) para realizar a fornecimento de amônia em um ciclo. Especificamente, quando os parâmetros de controle são estabelecidos, por exemplo, como a seguir: valor SV = 50 mM, valor TC = 10 segundos, e valor ON = 1 segundo, se amônia deve ou não ser fornecida é julgado uma vez em 10 segundos e, se a concentração de amônia realmente medida for maior que 50 mM, amônia não é fornecida. Ou seja, a válvula eletromagnética da entrada para gás de amônia é mantida fechada. Adicionalmente, quando a concentração de amônia realmente medida for menor que 50 mM, amônia é fornecida por 1 segundo. Ou seja, a válvula eletromagnética é aberta.

[00112] Quando a parte de controle 102 tiver julgado que o parâmetro de controle deve ser mudado (Etapa SC-3, Sim), um parâmetro de controle valor é alimentado (Etapa SC-4).

[00113] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que o parâmetro de controle não deve ser mudado (Etapa SC-3, Não), o processo avança para o processamento da Etapa SC-5.

[00114] Em seguida, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b incorpora a tensão (A) do sensor de amônia 10 (por exemplo, eletrodo de íon) inserido no tanque de cultura 200 (Etapa SC-5). Ou seja, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b mede a tensão do sensor de amônia 10.

[00115] Em seguida, a parte de medição do valor de pH 102c incorpora o valor de pH (B) do eletrodo de pH do sensor de pH 20 inserido no tanque de cultura 200 (Etapa SC-6). Ou seja, a parte de medição do valor de pH 102c mede o valor de pH (B) do meio de cultura contido no tanque de cultura 200 com o sensor de pH 20.

[00116] Em seguida, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b calcula a concentração de amônia não ionizada (C) substituindo a tensão (A) incorporada na Etapa SC-5 na curva de calibração criada na Etapa SC-2 (Etapa SC-7). Ou seja, a parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102b calcula a concentração de amônia não ionizada (C) no tanque de cultura 200 substituindo a tensão do sensor de amônia 10 na curva de calibração.

[00117] Em seguida, a parte de cálculo da concentração de amônia total 102d calcula a concentração de amônia total (D) baseada no valor de pH (B) incorporado na Etapa SC-6, na concentração de amônia (C) calculada na Etapa SC-7, e na curva de dissociação de amônia (referir-se à Fig. 3) criada pela parte de controle 102 como o pré-processamento (Etapa SC-8). Ou seja, a parte de cálculo da concentração de amônia total 102d calcula a concentração de amônia total (D) no tanque de cultura 200 a partir da concentração de amônia não ionizada (C) armazenada no arquivo de amônia não ionizada 106c e o valor de pH (B) armazenado no arquivo de valor de pH 106d com base na curva de dissociação de amônia armazenada no arquivo de curva de dissociação de amônia 106a.

[00118] Em seguida, a parte de controle 102 julga se correção de um ponto deve ou não ser realizada (Etapa SC-9).

[00119] A "correção de um ponto" mencionada anteriormente é um de os métodos para padronização, e padroniza um objeto usando uma amostra de padronização de um ponto. Nesta modalidade, a amostra de padronização de um ponto são os dados de medição obtidos com um aparelho externo de medição (tensão (A’)), e a padronização do termo é usada no mesmo significado daquele da verificação.

[00120] Quando a parte de controle 102 tiver julgado que a correção de um ponto deve ser realizada (Etapa SC-9, Sim), a parte de medição da concentração de amônia para verificação 102f e a parte de verificação 102g incorpora os dados de medição (tensão (A’)) obtidos com o aparelho de medição externa (sensor de amônia externo 12 etc.), e realiza a correção de um ponto para a curva de calibração de maneira que a concentração de amônia não ionizada (C') obtida substituindo os dados de medição (tensão (A’)) na curva de calibração, corresponda à concentração de amônia total (D) calculada na Etapa SC-8 (Etapa SC-10). Ou seja, a parte de medição da tensão para verificação 102f mede a tensão (A’) do sensor de amônia externo 12 para um meio de cultura que foi coletado do tanque de cultura 200 e suspenso em um líquido de reação fortemente alcalino (por exemplo, NaOH), de maneira que íon de amônio seja convertido em amônia não ionizada e a parte de verificação 102g verifica a curva de calibração, de maneira que a concentração de amônia não ionizada (C') calculada substituindo a tensão (A’) medida com a parte de medição da tensão para verificação 102f na curva de calibração armazenada no arquivo de curva de calibração 106b, corresponda à concentração de amônia total (D) calculada pelo cálculo da concentração de amônia total.

[00121] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a correção de um ponto não deve ser realizada (Etapa SC-9, Não), o processo avança para o processamento da Etapa SC-11.

[00122] Em seguida, a parte de controle 102 determina qual modo de controle de amônia é escolhido (Etapa SC-11).

[00123] O modo de controle de amônia mencionado anteriormente é, por exemplo, um modo para realizar o controle com a concentração de amônia total, um modo para realizar o controle com a concentração de amônia não ionizada, ou similares, e na Etapa SC-11, a parte de controle 102 pode escolher o modo de controle de concentração de amônia total ou o modo de controle de concentração de amônia não ionizada como o modo de controle de amônia.

[00124] Em seguida, quando a parte de controle 102 escolheu o modo de controle de concentração de amônia total como o modo de controle de amônia (Etapa SC-11, modo de controle de concentração de amônia total), ela estabelece o modo no qual a concentração de amônia é controlada com base na concentração de amônia total no tanque de cultura 200. Em seguida, a parte de controle 102 gera direções para controle a ser enviadas para o aparelho de cultura incluindo o alimentador de amônia 300 conectado no tanque de cultura 200, etc. usando a concentração de amônia total (D) calculada na Etapa SC-8 ou a concentração de amônia total (D') verificada na Etapa SC-10, e valores pré-estabelecidos e parâmetros de controle (por exemplo, valor SV servindo como um índice para controle de concentração de amônia) estabelecidos no aparelho para controle de amônia 100 (Etapa SC- 12).

[00125] Em seguida, a parte de controle 102 julga se o controle calculado na Etapa SC-12 é ou não necessário (Etapa SC-13). Por exemplo, a parte de controle 102 julga se a concentração de amônia total é ou não menor que uma concentração predeterminada.

[00126] Em seguida, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a direção de controle é necessária (por exemplo, a concentração de amônia total é menor que uma concentração predeterminada) (Etapa SC-13, Sim), a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e produz uma direção de controle, tal como uma direção para adicionar amônia no tanque de cultura 200 de um tanque de amônia 30 em uma quantidade direcionada, para o alimentador de amônia 300. Ou seja, a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e opera o comutador 31 para abrir e fechar a válvula 32 através da parte de saída de controle 104 para controlar a abertura e fechamento da válvula 32, de maneira que amônia seja fornecida no tanque de cultura 200 do tanque de amônia 30 em uma quantidade de acordo com a direção de controle.

[00127] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a direção de controle é desnecessária (por exemplo, a concentração de amônia total não é menor que a concentração predeterminada) (Etapa SC-13, Não), o processo retorna para o processamento da Etapa SC-5.

[00128] Quando o processo retorna para Etapa SC-11, e a parte de controle 102 tiver escolhido o modo de controle de concentração de amônia não ionizada como o modo de controle de amônia, um modo no qual o controle é realizado com base na concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 é estabelecido (Etapa SC-11, modo de controle de concentração de amônia não ionizada). Em seguida, a parte de controle 102 gera direções de controle para o aparelho de cultura incluindo o alimentador de amônia 300 conectado no tanque de cultura 200, etc., usando a concentração de amônia não ionizada (C) que foi calculada na Etapa SC-7, valores pré-estabelecidos e parâmetros de controle (por exemplo, valor SV servindo como um índice de controle de concentração de amônia) estabelecidos no aparelho para controle de amônia 100 (Etapa SC-15).

[00129] Em seguida, a parte de controle 102 julga se o controle calculado na Etapa SC-15 é ou não necessário (Etapa SC-16). Por exemplo, a parte de controle 102 julga se a concentração de amônia não ionizada é menor que uma concentração predeterminada.

[00130] Em seguida, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a direção de controle é necessária (por exemplo, a concentração de amônia não ionizada é menor que uma concentração predeterminada) (Etapa SC-16, Sim), a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e produz uma direção de controle, tal como uma direção para adicionar amônia no tanque de cultura 200 do tanque de amônia 30 em uma quantidade direcionada para o alimentador de amônia 300. Ou seja, a parte de direcionamento do fornecimento de amônia 102e opera o comutador 31 para mudar abertura e fechamento da válvula 32 através da parte de saída de controle 104 para controlar a abertura e fechamento da válvula 32 de maneira que amônia seja fornecida do tanque de amônia 30 no tanque de cultura 200 em uma quantidade de acordo com a direção de controle.

[00131] Por outro lado, quando a parte de controle 102 tiver julgado que a direção de controle é desnecessária (por exemplo, a concentração de amônia não ionizada não é menor que a concentração predeterminada) (Etapa SC-16, Não), o processo retorna para o processamento da Etapa SC-5.

[00132] Agora, explicação detalhada de um exemplo do processamento do aparelho para controle de amônia 100 é finalizada.

[00133] Explicação desta modalidade é também finalizada.[Outras modalidades]

[00134] Embora uma modalidade da invenção tenha sido explicada anteriormente, a presente invenção pode ser implementada como várias modalidades diferentes dentro do escopo técnico da presente invenção definidas nas reivindicações anexas, além da modalidade explicada anteriormente.

[00135] Por exemplo, embora a presente invenção senha sido explicada anteriormente para um caso onde o aparelho para controle de amônia 100 realiza controle de amônia para fermentação realizada no tanque de cultura 200, ela pode ser usada não apenas para fermentação, mas também um outro uso tal como uso em um tanque de reação para indústria química, etc.

[00136] Adicionalmente, entre os processamentos explicados para a modalidade, todos ou uma parte dos processamentos explicados para ser automaticamente realizados podem também ser manualmente realizados, e todos ou uma parte dos processamentos explicados para ser manualmente realizados podem também ser realizados automaticamente por métodos conhecidos.

[00137] Além do mais, os procedimentos de processamento, procedimentos de controle, nomes específicos mencionados nas referências acima mencionadas e nos desenhos, informação incluindo parâmetros tais como dados registrados, condições de pesquisa, etc. para os processamentos, e configuração de base de dados podem ser arbitrariamente mudados, a menos que especificamente indicado.

[00138] Adicionalmente, os componentes mostrados nos desenhos para o aparelho para controle de amônia 100 são esquematicamente mostrados para indicar as funções dos mesmos, e eles podem não necessariamente ser constituídos fisicamente como mostrado nos desenhos.

[00139] Por exemplo, todas ou uma parte das funções de processamento dos componentes do aparelho para controle de amônia 100, especialmente as funções de processamento da parte de controle 102, podem ser realizadas com CPU (Unidade de Processamento Central) e programas para ser interpretados e executados por CPU, ou com hardware baseado em lógica por fio. Os programas são gravados em uma mídia de gravação descrita posteriormente, e lidos mecanicamente pelo aparelho para controle de amônia 100 como exigido. Ou seja, programas de computador para dar comandos para CPU para realizar vários processamentos por cooperação com OS (Sistema Operacional) são armazenados na parte de armazenamento 106, tal como ROM e HD. Esses programas de computador são executados sendo carregados em RAM, e cooperam com CPU para constituir a parte de controle 102.

[00140] Adicionalmente, os programas de computador podem serarmazenados em um servidor de programa de aplicação conectado no aparelho para controle de amônia 100 através de uma rede arbitrária, e todo ou uma parte deles pode ser carregada como exigido.

[00141] Adicionalmente, os programas de acordo com a presente invenção podem também ser armazenados em uma mídia de gravação legível por computador. A "mídia de gravação" mencionada anteriormente inclui "mídia física portátil" arbitrária, tais como disco flexível, disco magneto- óptico, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, e DVD, bem como "mídia de comunicação" para armazenar programas temporariamente tais como linhas de comunicação e ondas portadoras usadas para transmitir os programas através das redes, das quais exemplos típicos são LAN, WAN e a internet.

[00142] Adicionalmente, o termo "programa" significa um método de processamento de dados descrito em uma linguagem arbitrária ou método de descrição, e o formato do mesmo tal como código de fonte e código binário não é limitado. Além do mais, o "programa" não deve necessariamente ser limitado àqueles constituídos como software independente, mas inclui aqueles distribuídos como uma pluralidade de módulos ou bibliotecas, e aquele que realiza as funções dos mesmos através de cooperação com outros programas separados, dos quais exemplo típico é OS (Sistema Operacional). Além do mais, como configurações concretas para ler mídia de gravação no aparelho mostrado na modalidade, procedimentos para ler os programas, procedimentos para instalá-los após leitura, e assim por diante, configurações e procedimentos bem conhecidos podem ser usados.

[00143] A parte de armazenamento 106 que armazena vários tipos das bases de dados (arquivo de curva de dissociação de amônia 106a até arquivo de concentração de amônia total 106e) e assim por diante, é um dispositivo de armazenamento compreendendo um dispositivo de memória tais como RAM e ROM, uma unidade de disco fixo tais como disco rígido, um disco flexível, um disco óptico, ou similares, e armazena vários tipos de programas, tabelas, bases de dados, arquivos para páginas da web, etc. usados para vários processamentos ou apresentação em web sites.

[00144] Adicionalmente, o aparelho para controle de amônia 100 pode também ser realizado conectando um processador de informação tais como computadores pessoais e estações de trabalho existentes em um objeto de controle, e instalando software (incluindo programas, dados, etc.) para realizar o método da presente invenção no processador de informação.

[00145] Além disso, modos específicos de distribuição e integração do aparelho não são limitados àqueles mostrados nos desenhos, e o aparelho pode ser constituído distribuindo ou integrando funcional ou fisicamente toda ou uma parte do aparelho em unidades arbitrárias de acordo com várias adições de componentes etc.

[00146] O método de controle de amônia e aparelho para controle de amônia acima mencionados podem ser usados para os métodos seguintes. Por exemplo, eles podem ser usados para um método para produção de uma substância alvo por fermentação usando um microrganismo, especificamente, um método de cultivar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um meio líquido contido em um tanque de fermentação para produzir e acumular a substância alvo no meio.

[00147] Exemplos da substância alvo referidos na presente invenção incluem L-aminoácidos, ácidos nucleicos, álcoois, proteínas e assim por diante. Na presente invenção, o "L-aminoácido" não é particularmente limitado, desde que ele seja um L-aminoácido que pode ser acumulado em um meio em fermentação usando um microrganismo. Embora o tipo do L- aminoácido não seja particularmente limitado, exemplos incluem aminoácidos básicos tais como L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina, aminoácidos alifáticos tais como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina e glicina, aminoácidos que são ácidos hidroxi-monoaminocarboxílico tais como L-treonina e L-serina, aminoácidos cíclicos tal como L-prolina, aminoácidos aromáticos tais como L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano, aminoácidos contendo enxofre tais como L-cisteína, L-cisteína e L-metionina, aminoácidos acídicos tais como ácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, L- glutamina e L-asparagina e amidas ácidas dos mesmos.

[00148] O microrganismo usado na presente invenção pode ter uma capacidade de produzir dois ou mais tipos de aminoácidos. O L-aminoácido referido na presente invenção pode ser um L-aminoácido livre, ou pode ser um sal tais como sulfato, cloridrato, e carbonato de L-aminoácido.

[00149] Na presente invenção, o "ácido nucleico" não é particularmente limitado, desde que ele seja um ácido nucleico que pode ser acumulado em um meio em fermentação usando um microrganismo. Exemplos do ácido nucleico incluem nucleosídeos de purina, nucleosídeos de purina e assim por diante. Os nucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina, e assim por diante, e os nucleosídeos de purina incluem ésteres de 5'-fosfato do nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico, (inosina-5'-fosfato, daqui em diante também referido como "IMP"), ácido xantílico (xantosina-5'-fosfato, daqui em diante também referido como "XMP"), ácido guanílico (guanosina-5'-monofosfato, daqui em diante também referido como "GMP"), ácido adenílico (adenosina-5'- monofosfato, daqui em diante também referido como "AMP") e assim por diante.

[00150] Na presente invenção, o "ácido orgânico" não é particularmente limitado, desde que ele seja um ácido orgânico que pode ser acumulado em um meio em fermentação usando um microrganismo. Exemplos do ácido orgânico incluem ácido lático, ácido acético, ácido cítrico, ácido glucônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico e assim por diante.

[00151] Na presente invenção, o "álcool" não é particularmente limitado, desde que ele seja um álcool que pode ser acumulado em um meio em fermentação usando um microrganismo. Exemplos do álcool incluem, por exemplo, etanol, isobutanol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, glicerol, 2,3-butanodiol e assim por diante.

[00152] Exemplos do microrganismo usável na presente invenção incluem, especificamente, bactérias Enterobacteriaceae que pertencem ao gênero Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou similares, bactérias corineformes, bactérias de Bacillus, bactérias de Streptococcus, leveduras de Saccharomyces e assim por diante. Ele é preferivelmente um microrganismo para o qual substituição genética é possível.

[00153] Exemplos das bactérias Escherichia incluem Escherichia coli e assim por diante. Quando Escherichia coli é melhorada usando técnicas de engenharia genética, a cepa K12 de E. coli e derivados da mesma, a cepa 1655 de Escherichia coli (ATCC 47076) e a cepa W3110 de Escherichia coli (ATCC 27325), podem ser usadas. Para obter a cepa K-12 de Escherichia coli e as cepas derivadas, elas podem ser providas, por exemplo, pela American Type Culture Collection (ATCC, Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).

[00154] Como as bactérias Escherichia, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabela 1), tal como Escherichia coli, podem ser utilizadas. Exemplos de cepas tipo selvagem de Escherichia coli incluem, por exemplo, a cepa K12 e derivados da mesma, cepa MG1655de Escherichia coli (ATCC No. 47076), cepa W3110 (ATCC No. 27325) e assim por diante. Elas são disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC, Adress: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América).

[00155] Exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e assim por diante, e exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis. Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou similares, com base na análise de sequência de nucleotídeos de 16S RNAr, etc.. Tanto as bactérias Enterobacter quanto bactérias Pantoea podem ser usadas desde que a bactéria escolhida seja classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de Pantoea ananatis é melhorada por uma técnica de engenharia genética, cepa AJ13355 de Pantoea ananatis (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e derivados das mesmas podem ser usados. Essas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando elas foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, elas foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis com base em sequenciamento de nucleotídeo de 16S RNAr e assim por diante como descrito anteriormente.

[00156] As bactérias corineformes são um grupo de microrganismos definido em Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., p.599 (1974), e microrganismos classificados em tais bacilos Gram-positivos e Gram-positivos aeróbicos e não ácidos resistentes que são incapazes de esporular podem ser usados. As bactérias corineformes incluem bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibacterium, mas são atualmente unidos no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255260 (1991)), e bactérias que pertencem ao gênero Brevibacterium ou Microbacterium, que estão estritamente relacionados com o gênero Corynebacterium.

[00157] Exemplos específicos de tais bactérias corineformes incluem as seguintes espécies:Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicumCorynebacterium liliumCorynebacterium melassecolaCorynebacterium thermoaminogenes (Corynebacteriumefficiens) Corynebacterium herculisBrevibacterium divaricatumBrevibacterium flavumBrevibacterium immariophilumBrevibacterium lactofermentumBrevibacterium roseumBrevibacterium saccharolyticumBrevibacterium tiogenitalis Corynebacterium ammoniagenesBrevibacterium albumBrevibacterium cerinumMicrobacterium ammoniaphilum

[00158] Exemplos específicos dessas bactérias incluem as seguintescepas: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511Corynebacterium callunae ATCC 15991Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032,ATCC 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965Corynebacterium efficiens AJ12340 (FERM BP-1539)Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020Brevibacterium flavum (FERM BP-2205)Brevibacterium immariophilum ATCC 14068Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869(Corynebacterium glutamicum ATCC 13869)Brevibacterium roseum ATCC 13825Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium tiogenitalis ATCC 19240Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111Brevibacterium cerinum ATCC 15112Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

[00159] Essas cepas são disponíveis, por exemplo, pela American Type Culture Collection (ATCC) (endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América). Ou seja, números de registro são dados para cada qual das cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando esses números de registro. Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection (referir-se a http://www.atcc.org/). A cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (agência administrativa atualmente independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, Room No. 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) com um número de acesso de FERM BP-1539 sob as provisões do Tratado de Budapeste. A cepa AJ12418 foi depositada em 5 de janeiro de 1989 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (agência administrativa atualmente independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary) com um número de acesso de FERM BP-2205 sob as provisões do Tratado de Budapeste.

[00160] Quando bactérias Bacillus são usadas, exemplos das mesmas incluem Bacillus subtilis, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus pumilus e assim por diante.

[00161] Exemplos de Bacillus subtilis incluem cepa 168 Marburg de Bacillus subtilis (ATCC 6051), cepa PY79 de Bacillus subtilis (Plasmid, 1984, 12, 1-9) e assim por diante. Exemplos de Bacillus amiloliquefaciens incluem cepa T de Bacillus amiloliquefaciens (ATCC 23842), cepa N de Bacillus amiloliquefaciens (ATCC 23845) e assim por diante. Exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacillus pumilus Gottheil No. 3218 (ATCC 21005) (Patente U.S. No. 3.616.206) e assim por diante.

[00162] Em seguida, serão descritos métodos para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido ou ácido nucleico em tais cepas mães como mencionado anteriormente.

[00163] Para conferir a capacidade de produzir um L-aminoácido ou um ácido nucleico, métodos convencionalmente empregados no melhoramento de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (vide "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a Edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp. 77-100), podem ser usados. Tais métodos incluem métodos de adquirir um mutante auxotrófico, uma cepa resistente análoga, ou um mutante de regulação metabólica, ou construir uma cepa recombinante de forma que ela sobre expresse uma enzima de biossíntese de L-aminoácido ou ácido nucleico. No melhoramento de bactérias produtoras de L-aminoácido, uma única ou duas ou três ou mais das propriedades descritas anteriormente tais como auxotrofia, resistência análoga, ou mutação de regulação metabólica podem ser conferidas. Expressão de uma única ou duas ou três ou mais enzimas de biossíntese de L- aminoácido pode ser intensificada. Além disso, os métodos de conferir propriedades tais como uma mutação auxotrófica, resistência análoga, ou mutação de regulação metabólica podem ser combinados com os métodos de intensificar as enzimas de biossíntese.

[00164] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente ao análogo de L-aminoácido ou ácido nucleico, ou cepa mutante de regulação metabólica tendo uma capacidade de produzir um L-aminoácido ou ácido nucleico podem ser obtidas submetendo uma cepa mãe ou cepa tipo selvagem a uma mutagênese convencional, tal como exposição a raios-X ou irradiação UV, ou tratamento com um mutágeno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etc., e então selecionando aquelas que exibem uma autotrofia, resistência análoga, ou mutação de regulação metabólica, e que também têm a capacidade de produzir um L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

[00165] Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica tendo uma capacidade de produzir um L-aminoácido podem ser obtidas submetendo uma cepa mãe ou cepa tipo selvagem a uma mutagênese convencional, tal como exposição a raios-X ou irradiação de UV, ou tratamento com um mutágeno tal como N- metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou metanossulfonato de etila (EMS), etc., e então selecionando aquelas que exibem uma autotrofia, resistência análoga, ou mutação de regulação metabólica e que também têm a capacidade de produzir um L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

[00166] Métodos para conferir capacidade de produzir aminoácido e bactérias produtoras de aminoácido serão especificamente exemplificados a seguir.(Bactérias produtoras de L-lisina)

[00167] Bactérias produtoras de L-lisina e métodos para construí-las são exemplificadas a seguir.

[00168] Exemplos de cepas tendo capacidade de produzir L-lisina incluem, por exemplo, cepas resistentes análogas a L-lisina e cepas mutantes de regulação metabólica. Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não se limitando a hidroxamato de oxalisina, lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), Y-metillisina, α-clorocaprolactama e assim por diante. Cepas mutantes tendo resistência a análogos de lisina podem ser obtidas submetendo uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae ou uma bactéria corineforme a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-lisina incluem AJ11442 de Escherichia coli (FERM BP-1543, NRRL B-12185, vide Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-18596 e Patente U.S. No. 4.346.170), cepa VL611 de Escherichia coli (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2000-189180) e assim por diante. Como uma Escherichia coli de produção de L-lisina, a cepa WC196 pode também ser usada (vide Publicação Internacional WO96/17930).

[00169] Além disso, uma bactéria de produção de L-lisina pode também ser construída aumentando atividade de uma enzima do sistema de biossíntese de L-lisina. Aumento de atividade de uma enzima como essa pode ser obtido aumentando o número de cópias do gene que codifica para a enzima em células, ou modificando uma sequência de controle de expressão da mesma. Aumento de número de cópias de um gene que codifica para uma enzima de sistema de biossíntese de L-lisina em células e modificação de uma sequência de controle de expressão pode ser obtida da mesma maneira daquela para os genes gltP e gltS descritos a seguir.

[00170] Exemplos de genes que codificam para enzimas biossintéticas de L-lisina incluem genes que codificam para enzimas do caminho de diaminopimelato tal como gene de di-hidrodipicolinato sintase (dapA), gene da aspartoquinase (lysC), gene de di-hidrodipicolinato redutase (dapB), gene de diaminopimelato descarboxilase (lysA), gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (WO96/40934 para todos os genes anteriores), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 60-87788), gene de aspartato aminotransferase (aspC) (Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) No. 6-102028), gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2003-135066), e gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (WO00/61723), e genes que codificam para enzimas de caminho do ácido aminoadípico tal como gene de homoaconitato hidratase (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2000157276). Além do mais, a cepa mãe pode mostrar um maior nível de expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica para nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (pntAB) (Patente U.S. No. 5.830.716), o gene ybjE que codifica para uma proteína tendo atividade de excreção de L-lisina (WO2005/073390), o gene que codifica para glutamato desidrogenase (gdhA) (Gene 23:199-209 (1983)), ou uma combinação arbitrária desses. Abreviações para os genes são mostradas nos parênteses. Entre os genes acima mencionados, o gene ybjE é preferido.

[00171] Sabe-se que o di-hidrodipicolinato sintase tipo selvagem derivado de Escherichia coli sofre de inibição de realimentação por L-lisina, e sabe-se que a aspartoquinase tipo selvagem derivado de Escherichia coli apresenta supressão e inibição de realimentação por L-lisina. Portanto, quando os genes dapA e lysC são usados, esses genes são preferivelmente genes que codificam para enzimas mutantes dessensibilizadas para a inibição de realimentação por L-lisina.

[00172] Exemplos de DNA que codifica um di-hidrodipicolinato sintetase mutante dessensibilizado para a inibição de realimentação por L- lisina incluem um DNA que codifica uma proteína como essa tendo uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo de histidina na posição 118 é substituído por resíduo de tirosina. Exemplos de DNA que codifica uma aspartoquinase mutante dessensibilizada para a inibição de realimentação por L-lisina incluem um DNA que codifica um AKIII tendo uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323, e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por resíduos de isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para esses mutantes, vide Patente U.S. Nos. 5.661.012 e 6.040.160). DNAs mutantes como essas podem ser obtidos por mutagênese específica do sítio usando PCR ou similares.

[00173] Plasmídeos de ampla faixa de hospedeiro RSFD80, pCAB1, e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene dapA mutante que codifica um di-hidrodipicolinato sintase mutante e um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase mutante (Patente U.S. No. 6.040.160). A cepa JM109 de Escherichia coli transformada com RSFD80 foi denominada AJ12396 (Patente U.S. No. 6.040.160), e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agência administrativa atualmente independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary) em 28 de outubro de 1993 e foi atribuído com um número de acesso de FERM P-13936, e o depósito foi então convertido em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 1 de novembro de 1994 e foi atribuído com um número de acesso de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtido pela da AJ12396 por um método convencional.

[00174] Além disso, bactérias produtoras de L-aminoácido podem ter atividade reduzida de uma enzima que catalisa uma reação ramificando de um caminho da biossíntese de L-aminoácido e produzindo um outro composto, ou podem ser deficientes em uma atividade como essa, ou elas podem ter atividade reduzida de uma enzima que age negativamente na síntese ou acúmulo de L-aminoácido, ou podem ser deficientes em uma atividade como essa. Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homoserina desidrogenase, lisina descarboxilase (cadA, ldcC), enzima málica, e assim por diante, e cepas nas quais atividades dessas enzimas são diminuídas ou deletadas são descritas em WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175 e assim por diante.

[00175] Prefere-se que expressões tanto dos genes cadA quanto ldcC que codificam lisina descarboxilase sejam diminuídas a fim de diminuir ou deletar a atividade de lisina descarboxilase. Expressão de ambos os genes pode ser diminuída, por exemplo, pelo método descrito em WO2006/078039.

[00176] A fim de reduzir ou eliminar as atividades dessas enzimas, uma mutação pode ser introduzida nos genes das enzimas em um genoma por um método de mutagênese usual ou técnica de recombinação genética de forma que atividades intracelulares das enzimas sejam reduzidas ou eliminadas. Tal introdução de uma mutação pode ser obtida, por exemplo, usando recombinação genética para eliminar os genes que codificam para as enzimas no genoma ou para modificar uma sequência de controle de expressão tal como um promotor ou a sequência Shine-Dalgarno (SD). Ela pode também ser obtida introduzindo uma mutação para substituição de aminoácido (mutação com troca de sentido), um códon de parada (mutação sem sentido), ou uma mutação de desvio no quadro para adicionar ou deletar um ou dois nucleotídeos nas regiões que codificam para as enzimas no genoma, ou deletar parcial ou totalmente os genes (J. Biol. Chem., 272:86118617 (1997)). As atividades enzimáticas podem também ser diminuídas ou eliminadas construindo um gene que codifica para uma enzima mutante, de cuja região de codificação é total ou parcialmente deletado, e substituindo-o por um gene normal em um genoma por recombinação homóloga ou similares, ou introduzindo um transpóson ou fator IS no gene.

[00177] Por exemplo, a fim de introduzir uma mutação que diminui ou elimina as atividades das enzimas acima mencionadas por recombinação genética, os métodos seguintes são usados. Um gene mutante é preparado modificando uma sequência parcial de um gene objetivo de forma que ele não codifique uma enzima que pode funcionar normalmente, e então uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para fazer com que recombinação de um gene correspondente no genoma com o gene mutante use o gene mutante em substituição ao gene objetivo no genoma. Exemplos de tal substituição genética usando recombinação homóloga incluem métodos de usar um DNA linear tal como o método denominado integração Red-driven (Datsenko, K. A, and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645 (2000)), e o método utilizando a integração Red driven em combinação com um sistema excisivo derivado de X fago (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., J. Bacteriol., 184:5200-5203 (2002)) (referir-se à WO2005/010175), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível a temperatura (Patente U.S. No. 6.303,383, Pedido de Patente Japonês em aberto No. 05-007491) e assim por diante. Além disso, tal mutagênese específica do sítio baseada em substituição genética usando recombinação homóloga pode também ser realizada usando um plasmídeo que não é capaz de replicar em um hospedeiro.

[00178] Exemplos preferidos de bactérias produtoras de L-lisina incluem Escherichia coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WO2006/078039). A cepa foi construída introduzindo o plasmídeo pCABD2 contendo genes da biossíntese de lisina (Patente U.S. No. 6.040.160) na cepa WC196 tendo genes cadA e ldcC rompidos, que codificam lisina descarboxilase. A cepa WC196 foi reproduzida a partir da cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, substituindo o gene lysC tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 com um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase mutante III na qual treonina na posição 352 foi substituída com isoleucina, resultando em dessensibilização da inibição de realimentação do mesmo por L-lisina (Patente U.S. No. 5.661.012), e conferindo resistência AEC para a cepa resultante (Patente U.S. No. 5.827.698). A cepa WC196 foi designada Escherichia coli AJ13069, depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (agência administrativa atualmente independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, Room No. 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 6 de dezembro de 1994, e foi atribuída com um número de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995, e foi atribuído com um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. No. 5.827.698). A cepa WC196ΔcadAΔldcC por si mesma é também uma bactéria de produção de L-lisina preferida. A WC196ΔcadAΔldcC foi designada AJ110692, e depositada no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, a agência administrativa independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, Room No. 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional e foi atribuído com um número de acesso de FERM BP-11027.

[00179] O plasmídeo pCABD2 contém um gene mutante dapA derivado de Escherichia coli e que codifica para um di-hidrodipicolinato sintase (DDPS) tendo uma mutação para dessensibilização para a inibição de realimentação por L-lisina, um gene lysC mutante derivado de Escherichia coli e que codifica para aspartoquinase III tendo uma mutação para dessensibilização para a inibição de realimentação por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e que codifica para di-hidrodipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e que codifica para diaminopimelato desidrogenase.

[00180] Os procedimentos descritos anteriormente para intensificar expressão genética das enzimas envolvidas na biossíntese de L-lisina, e os métodos para reduzir as atividades enzimáticas podem similarmente ser aplicados aos genes que codificam para outras enzimas de biossíntese de L- aminoácido.(Bactérias produtoras de L-Triptofano)

[00181] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas mães usáveis para derivá-las incluem, mas não se limitando a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 de E. coli (DSM10123) que são deficientes em triptofanoil- RNAt sintetase codificado por gene trpS mutante (Patente U.S. No. 5.756.345), SV164 de E. coli (pGH5) tendo um alelo serA que codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizado para a inibição de realimentação por serina e um alelo trpE que codifica antranilato sintase dessensibilizado para inibição de realimentação por triptofano (Patente U.S. No. 6.180.373), AGX17 de E. coli (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente de triptofanoase (Patente U.S. No. 4.371.614), AGX17/pGX50,pACKG4-pps de E. coli no qual uma capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é intensificada (WO97/08333, Patente U.S. No. 6.319.696) e assim por diante. Bactérias produtoras de L- Triptofano que pertencem ao gênero Escherichia que têm atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou yddG podem também ser usadas (Pedidos Publicados de Patente U.S. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

[00182] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas mães usáveis para derivá-las também incluem cepas nas quais uma ou mais atividades das enzimas seguintes são intensificadas: antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato desidrogenase (serA), e triptofano sintase (trpAB). O antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase são ambos submetidos a inibição de realimentação por L-triptofano e L-serina e, portanto, uma mutação que dessensibiliza as enzimas para a inibição de realimentação pode ser introduzida nessas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo uma mutação como essa incluem SV164 de E. coli que abriga antranilato sintase dessensibilizado e uma cepa SV164 transformante obtida introduzindo no SV164 de E. coli o plasmídeo pGH5, que contém um gene serA mutante que codifica um fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizado para inibição de realimentação (WO94/08031).

[00183] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas mães usáveis para derivá-las também incluem uma cepa que tem atividade intensificada de 3-fosfoserina fosfatase (serB) (Patente U.S. No. 4.371.614), uma cepa que tem atividade intensificada de fosfoenolpiruvato carboxiquinase (pckA) (WO2004/090125), e uma cepa na qual enzimas do caminho do ácido glioxílico são constitutivamente expressas (WO2005/103275).

[00184] L-Triptofano, L-fenilalanina, e L-tirosina são todos aminoácidos aromáticos e compartilham um caminho da biossíntese comum. Exemplos dos genes que codificam as enzimas de biossíntese para esses aminoácidos aromáticos incluem deoxiarabino-heptulosonato fosfato sintase (aroG), 3-de-hidroquinato sintase (aroB), ácido chiquímico desidratase (aroE), chiquimato quinase (aroL), 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (aroA), e corismato sintase (aroC) (Publicação de Patente Europeia No. 763127 A). Sabe-se que esses genes são controlados pelo repressor de tirosina (tyrR) e, portanto, atividade de uma enzima de biossíntese de aminoácido aromático pode também ser aumentada deletando o gene tyrR (vide Publicação de Patente Europeia No. 763127 A). As abreviações em parênteses depois dos nomes da enzima representam os nomes do gene (o mesmo deve se aplicar nas mesmas ocasiões a seguir).

[00185] A fim de intensificar a produtividade de cada qual dos aminoácidos aromáticos alvos, sistema de biossíntese de um aminoácido sem ser o aminoácido alvo pode ser atenuado. Por exemplo, quando o aminoácido alvo é L-triptofano, caminhos biossintéticos de L-fenilalanina e/ou L-tirosina podem ser atenuados (Patente U.S. No. 4.371.614).

[00186] Na presente invenção, a expressão "aumento de atividade de enzima" corresponde, por exemplo, a um número aumentado de moléculas de enzima por célula, atividade específica aumentada por molécula de enzima e assim por diante. Por exemplo, a atividade pode ser aumentada aumentando a quantidade de expressão do gene da enzima. Atividade intracelular de uma enzima é preferivelmente aumentada para ficar maior que aquela de uma cepa não modificada, por exemplo, uma cepa tipo selvagem, do microrganismo.

[00187] Além disso, 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintetase (aroF, aroG) é submetido a inibição de realimentação por aminoácidos aromáticos. Portanto, a enzima pode ser modificada de forma que seja dessensibilizada para a inibição de realimentação. Uma bactéria de produção de L-aminoácido aromático pode ser obtida, por exemplo, introduzindo um aroF mutante no qual o resíduo do ácido L-aspártico na posição 147 ou o resíduo de L-serina na posição 181 a partir do N-terminal é substituído por um outro aminoácido, ou introduzindo um gene aroG mutante no qual um de o resíduo do ácido L-aspártico na posição 146, o resíduo de L- metionina na posição 147, o L-prolina na posição 150 e o resíduo de L- alanina na posição 202, ou tanto o resíduo de L-metionina na posição 157 quanto o resíduo de L-alanina na posição 219 a partir do N-terminal são substituídos por outro(s) aminoácido(s) (EP0488424).

[00188] Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas mães usáveis para derivá-las também incluem cepas nas quais o operon triptofano contendo um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizado para inibição foi introduzido (Pedido de Patente Japonês em aberto Nos. 5771397, 62-244382, Patente U.S. No. 4.371.614). Entretanto, capacidade de produção de L-triptofano pode ser conferida intensificando a expressão de um gene que codifica triptofano sintase no operon triptofano (trpBA). Triptofano sintase consiste em subunidades α e β que são codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além do mais, capacidade de produção de L-triptofano pode ser melhorada intensificando a expressão do operon de isocitrato liase- malato sintase (WO2005/103275).

[00189] As bactérias corineformes, AJ12118 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-478, Patente Japonesa No. 01681002), que é resistente a sulfaguanidina, a bactéria corineforme introduzida com o operon triptofano (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 63-240794), e a bactéria corineforme introduzida com um gene que codifica para chiquimato quinase derivado de uma bactéria corineforme (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 01-994749) podem ser usadas.(Bactérias produtoras de L-fenilalanina)

[00190] Exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina e cepas mães usáveis para derivá-las incluem, mas não se limitando a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como AJ12739 de E. coli (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), HW1089 de E. coli (ATCC 55371) que abrigam um gene pheA34 mutante (Patente U.S. No. 5.354.672), MWEC101-b de E. coli (Patente Coreana No. 8903681), NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B- 12146, e NRRL B-12147 de E. coli (Patente U.S. No. 4.407.952). Também, como uma cepa mãe, K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB de E. coli (FERM BP- 3566), K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] de E. coli (FERM BP-12659), K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] de E. coli (FERM BP-12662) e K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] de E. coli chamada as AJ12604 (FERM BP- 3579) pode também ser usada (EP 488424 B1). Além disso, bactérias produtoras de L-fenilalanina que pertencem ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou o gene yddG podem também ser usadas (Pedidos Publicados da Patente U.S. No. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

[00191] Como bactérias corineformes de produção de fenilalanina, as Corynebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP- 2062), e K78 (FERM BP-2063) (Publicação de Patente Europeia No. 331145 A, Pedido de Patente Japonês em aberto No. 02-303495), das quais atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase ou piruvato quinase é reduzida, cepa auxotrófica de tirosina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 05-049489), e assim por diante podem ser usadas.

[00192] Uma bactéria que produz eficientemente fenilalanina pode também ser obtida modificando uma bactéria de forma que ela incorpore subprodutos, por exemplo, aumentando a quantidade de expressão do gene de absorção de L-triptofano, tnaB ou mtr, ou o gene de absorção de L-tirosina, tyrP (EP 1484410).(Bactérias produtoras de L-tirosina)

[00193] Exemplos de bactérias produtoras de tirosina incluem bactérias Escherichia com um gene de prefenato desidratase dessensibilizado (tyrA) (Publicação de Patente Europeia No. 1616940 A).(Bactérias produtoras de L-valina)

[00194] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-valina incluem, mas não se limitando a cepas que foram modificadas para sobre-expressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. No. 5.998.178). Prefere-se que a região no operon ilvGMEDA que é exigido para atenuação seja removida de forma que expressão do operon não seja atenuada pela L-valina que é produzida. Além disso, prefere-se que o gene ilvA no operon seja rompido de forma que atividade de treonina deaminase seja diminuída.

[00195] Exemplos de cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem cepas mutantes com amino-acil t- RNA sintetase tendo uma mutação (Patente U.S. No. 5.658.766). Por exemplo, VL1970 de E. coli, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina RNAt sintetase, pode ser usado. VL1970 de E. coli foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 24 de junho de 1988 com um número de acesso VKPM B-4411.

[00196] Adicionalmente, mutantes que exigem ácido lipoico para crescer e/ou não têm H+-ATPase podem também ser usados como cepas mães (WO96/06926).

[00197] Exemplos de bactérias produtoras de L-valina de bactérias corineformes incluem, por exemplo, cepas modificadas de forma que expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética de L-valina É intensificada. Exemplos da enzima de biossíntese de L-valina incluem enzimas codificadas por genes presentes no operon ilvBNC, ou seja, ácido aceto-hidróxi sintetase codificado por ilvBN e isomero-redutase codificado por ilvC (WO00/50624). Uma vez que o operon ilvBNC é submetido a regulação de expressão por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, é desejável eliminar atenuação para evitar supressão de expressão por L-valina que é produzida.

[00198] Capacidade de produção de L-Valina pode ser conferida a bactérias corineformes, e a capacidade de produção de L-Valina de bactérias corineformes pode ser melhorada diminuindo ou eliminando a atividade de pelo menos um tipo de enzima que é envolvida em um caminho metabólico que diminui a produção de L-valina. Por exemplo, diminuição da atividade de treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina, ou atividade de uma enzima que é envolvida em D-pantotenato síntese é contemplada (WO00/50624).

[00199] Exemplos de métodos para conferir capacidade de produção de L-Valina também incluem conferir resistência a um análogo de aminoácido ou similares.

[00200] Exemplos incluem, por exemplo, cepas mutantes que são auxotróficas para L-isoleucina e L-metionina, e resistentes a D-ribose, purina ribonucleosídeo ou pirimidina ribonucleosídeo, e têm uma capacidade de produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29, Publicação de Patente Japonesa No. 53-025034), cepas mutantes resistentes a policetídeos (FERM P-1763, FERM P-1764, Publicação de Patente Japonesa No. 06-065314), e cepas mutantes resistentes a L-valina em um meio contendo ácido acético como a única fonte de carbono e sensíveis a análogos de ácido pirúvico (β- ácido fluorpirúvico etc.) em um meio contendo glicose como a única fonte de carbono (FERM BP-3006, BP-3007, Patente Japonesa No. 3006929).

[00201] Um exemplo de um gene envolvido na síntese de aminoácidos de cadeia ramificada é o operon ilvGMEDA, e este operon é submetido a controle de expressão (atenuação) por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L- leucina. Portanto, produtividade de um microrganismo para esses L- aminoácidos pode ser melhorada introduzindo no microrganismo o operon ilvGMEDA no qual a região exigida para a atenuação é removida ou mutada.(Bactérias produtoras de L-Isoleucina)

[00202] Exemplos de Bactérias produtoras de L-Isoleucina e cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-Isoleucina incluem, mas não se limitando a mutantes tendo resistência a 6-dimetilaminopurina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 5-304969), mutantes tendo resistência a um análogo de isoleucina tais como hidroxamato de tiaisoleucina e isoleucina, e mutantes tendo resistência a hidroxamato de DL-etionina e/ou arginina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 5-130882). Além do mais, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas em biossíntese de L-isoleucina, tais como treonina deaminase e ácido aceto- hidróxi sintase, podem também ser usadas como as cepas mães (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2-458, Patente Francesa No. 0356739, e Patente U.S. No. 5.998.178).

[00203] Exemplos de cepas produtoras de L-isoleucina de bactérias corineformes incluem a bactéria corineforme na qual o gene brnE que codifica para uma proteína de excreção do aminoácido de cadeia ramificada é amplificado (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2001-169788), a bactéria corineforme conferida com capacidade de produção de L-isoleucina por fusão de protoplasto com uma bactéria de produção de L-lisina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 62-74293), a bactéria corineforme na qual homoserina desidrogenase é intensificada (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 62-91193), a cepa resistente a treonina hidroxamato (Pedido de Patente Japonês em aberto No 62-195293), cepa resistente a ácido α- cetomalônico (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 61-15695), e a cepa resistente a metil lisina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 61-15696).(bactérias produtoras de L-Leucina)

[00204] Exemplos de L-leucina-bactérias produtoras e cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-leucina incluem, mas não se limitando a bactérias Escherichia, tal como cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. No. 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3- hidroxileucina, 4-azaleucina e 5,5,5-trifluorleucina (Publicação de Patente Japonesa No. 62-34397 e Pedido de Patente Japonês em aberto No. 8-70879); cepas de E. coli obtida pelo método de engenharia genética descrito em WO96/06926; e E. coli H-9068 (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 870879).

[00205] Bactérias produtoras de L-Leucina podem também ser melhoradas intensificando a expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina. Exemplos de tais genes incluem genes do operon leuABCD, que são preferivelmente representados por um gene leuA mutante que codifica para isopropilmalato sintase dessensibilizado para inibição de realimentação por L-leucina (Patente U.S. No. 6.403.342). Além do mais, bactérias produtoras de L-leucina podem também ser melhoradas intensificando a expressão de um ou mais genes que codificam para proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

[00206] Exemplos de cepas produtoras de L-leucina de bactériascorineformes incluem as cepas resistentes a 2-tiazolealanina e β- hidroxileucina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 8-266295), o cepa resistente a análogo de valina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 63248392), a cepa auxotrófica de valina (Publicação de Patente Japonesa No. 38-4395), a cepa resistente a S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC) (Publicação de Patente Japonesa No. 51-37347), e a cepa auxotrófica de fenilalanina, valina e isoleucina (Publicação de Patente Japonesa No. 54-36233).(Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico)

[00207] Exemplos preferidos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico incluem, por exemplo, cepas nas quais a expressão de um gene que codifica uma enzima biossintética do ácido L-glutâmico é intensificada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitando a genes que codificam glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi) e assim por diante.

[00208] Exemplos de cepas que foram modificadas de forma que expressão do gene de citrato sintetase, do gene de fosfoenolpiruvato carboxilase, do gene de isocitrato desidrogenase, do gene de piruvato desidrogenase e/ou do gene de glutamato desidrogenase é intensificada incluem aqueles descritos em EP 1078989 A, EP 955368 A, EP 952221 A e EP 1033407 A.

[00209] A modificação para conferir capacidade de produção de ácido L-glutâmico pode também ser obtida diminuindo ou eliminando atividade de uma enzima que catalisa uma reação ramificando do caminho da biossíntese de ácido L-glutâmico e produzindo um composto sem ser ácido L-glutâmico. Exemplos de uma enzima como essa que catalisa uma reação ramificando do caminho da biossíntese de ácido L-glutâmico e produzindo um composto sem ser ácido L-glutâmico incluem isocitrato liase, α-cetoglutarato desidrogenase, ácido aceto-hidróxi sintase, acetolactato sintase, formato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, 1-pirrolina-5-carboxilato desidrogenase e assim por diante.

[00210] Por exemplo, a fim de diminuir a atividade de α-cetoglutarato desidrogenase, uma modificação pode ser realizada usando o gene sucA (odhA) que codifica para a subunidade E1o da enzima. Exemplos de cepas com atividade de α-cetoglutarato desidrogenase diminuída incluem, por exemplo, as seguintes cepas:Cepa ΔS de Brevibacterium lactofermentum (WO95/34672)AJ12821 de Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-4172;Patente Francesa No. 9401748)AJ12822 de Brevibacterium flavum (FERM BP-4173; Patente Francesa No. 9401748)AJ12823 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-4174;Patente Francesa No. 9401748)AJ13601 de Pantoea ananatis (FERM BP-7207)AJ13410 de Klebsiella planticola (FERM BP-6617)AJ13355 de Pantoea ananatis (FERM BP-6614)

[00211] AJ13356 de Pantoea ananatis é deficiente em atividade de α-cetoglutarato desidrogenase em consequência de ruptura do gene da subunidade αKGDH-E1 (sucA). Esta cepa foi identificada como Enterobacter agglomerans quando ela foi isolada e depositada como o Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, ela foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeos de 16S RNAr e assim por diante. Embora AJ13356 tenha sido depositada no depositário acima mencionado como Enterobacter agglomerans, ela é descrita como Pantoea ananatis nesta especificação.

[00212] Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico pode também ser conferida a bactérias corineformes por um método de amplificar o gene yggB (NCgl 1221;NP_600492. Reporta pequena condutância. [gi:19552490], WO2006/070944), ou um método de introduzir um gene yggB mutante no qual uma mutação é introduzida na região de codificação.

[00213] Exemplos de outros métodos para conferir ou intensificar capacidade de produção de ácido L-glutâmico incluem um método de conferir resistência a um análogo de ácido orgânico, um inibidor de cadeia respiratória, etc., e um método de conferir sensibilidade a um inibidor de síntese da parede celular. Exemplos de tais métodos incluem o método de conferir resistência a ácido monofluoracético (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 50-113209), o método de conferir resistência a adenina ou timina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-065198), o método de atenuar urease (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 52-038088), o método de conferir resistência a ácido malônico (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 52-038088), o método de conferir resistência a benzopironas ou naftoquinonas (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-1889), o método de conferir resistência a HOQNO (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-140895), o método de conferir resistência a ácido a-cetomalônico (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-2689), o método de conferir resistência a guanidina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-35981), o método de conferir sensibilidade a penicilina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 4-88994) e assim por diante.

[00214] Exemplos específicos de tais cepas resistentes incluem as seguintes cepas:AJ3949 de Brevibacterium flavum (FERM BP-2632; Pedido de Patente Japonês em aberto No. 50-113209)AJ11628 de Corynebacterium glutamicum (FERM P-5736;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-065198)AJ11355 de Brevibacterium flavum (FERM P-5007; Pedido dePatente Japonês em aberto No. 56-1889)AJ11368 de Corynebacterium glutamicum (FERM P-5020;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-1889)Brevibacterium flavum AJ11217 (FERM P-4318; Pedido dePatente Japonês em aberto No. 57-2689)Corynebacterium glutamicum AJ11218 (FERM P-4319;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-2689)AJ11564 de Brevibacterium flavum (FERM BP-5472; Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-140895)AJ11439 de Brevibacterium flavum (FERM BP-5136; Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-35981)H7684 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-3004;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 04-88994)AJ11426 de Brevibacterium lactofermentum (FERM P-5123;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-048890)AJ11440 de Corynebacterium glutamicum (FERM P-5137;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56-048890)AJ11796 de Brevibacterium lactofermentum (FERM P-6402;Pedido de Patente Japonês em aberto No. 58-158192)(Bactérias produtoras de L-treonina)

[00215] Exemplos preferidos de bactérias produtoras de L-treonina incluem bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae na qual uma atividade de enzima do sistema de biossíntese de L-treonina é intensificada. Exemplos de genes que codificam para enzimas biossintéticas de L-treonina incluem o gene de aspartoquinase III (lysC), gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd), gene de aspartoquinase I (thrA), gene de homoserina quinase (thrB), e gene de treonina sintase (thrC) codificado pelo operon thr. Dois ou mais tipos desses genes podem ser introduzidos. Os genes que codificam para as enzimas biossintéticas de L-treonina podem ser introduzidos em uma bactéria de Enterobacteriaceae com decomposição de treonina diminuída. Exemplos da bactéria Escherichia com decomposição de treonina diminuída incluem, por exemplo, o cepa TDH6 que é deficiente em atividade de treonina desidrogenase (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2001-346578) e assim por diante.

[00216] As atividades das enzimas biossintéticas de L-treonina são inibidas pela L-treonina do produto final e, portanto, enzimas biossintéticas de L-treonina são preferivelmente modificadas de maneira a ser dessensibilizadas para a inibição de realimentação por L-treonina durante a construção de cepas produtoras de L-treonina. Os genes thrA, thrB e thrC acima descritos constituem o operon de treonina que tem uma estrutura atenuadora. A expressão do operon de treonina é inibida por isoleucina e treonina no meio de cultura e também reprimida por atenuação. Esta atenuação pode ser eliminada ou reduzida removendo uma sequência líder ou atenuador na região de atenuação (Lynn, S.P., Burton, W.S., Donohue, T.J., Gould, R.M., Gumport, R.I., and Gardner, J.F.J., Mol. Biol. 194:59-69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808).

[00217] O promotor nativo presente na região à montante do operon de treonina pode ser substituído por um promotor não nativo (WO98/04715), ou o operon de treonina pode ser construído de forma que expressão dos genes biossintéticos de treonina seja controlada pelo repressor e promotor de X-fago (Patente Europeia No. 0593792). Além disso, bactérias Escherichia mutantes que são dessensibilizadas para inibição de realimentação por L-treonina podem ser obtidas selecionando cepas resistentes a ácido α-amino-β- hidroxi- isovalérico (AHV).

[00218] Prefere-se que o número de cópias do operon resistente a inibição de realimentação modificado de treonina seja aumentado, ou a expressão do operon modificada seja aumentada conectando-o em um promotor potente no hospedeiro. O número de cópias pode ser aumentado, além de amplificação usando um plasmídeo, transpóson, Mu-fago, ou similares de forma que o operon seja transferido para o cromossomo.

[00219] O gene que codifica aspartoquinase III (lysC) é preferivelmente modificado de forma que a enzima seja dessensibilizada para inibição de realimentação por L-lisina. Um gene lysC resistente a inibição de realimentação modificado como esse pode ser obtido pelo método descrito na Patente U.S. No. 5.932.453.

[00220] Bactérias produtoras de L-treonina podem também ser preferivelmente obtidas intensificando a expressão de genes envolvidos no caminho glicolítico, ciclo TCA, ou cadeia respiratória, ou genes que regulam expressão desses genes, ou genes envolvidos em absorção de açúcar, além dos genes da enzima biossintética de L-treonina. Exemplos desses genes que são efetivos para produção de L-treonina incluem o gene de trans-hidrogenase (pntAB, Patente Europeia No. 733712), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC, WO95/06114), gene de fosfoenolpiruvato sintase (pps, Patente Europeia No. 877090), e gene de piruvato carboxilase derivados de bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (WO99/18228, Publicação de Patente Europeia No. 1092776 A).

[00221] Bactérias produtoras de L-treonina podem também ser preferivelmente obtidas intensificando a expressão de um gene que confere resistência a L-treonina e/ou um gene que confere resistência a L-homoserina, ou conferindo resistência a L-treonina e/ou resistência a L-homoserina na bactéria hospedeira. Exemplos dos genes que conferem a resistência acima mencionada incluem o gene rhtA (Res. Microbiol. 154:123-135 (2003)), gene rhtB (Publicação de Patente Europeia No. 0994190 A), gene rhtC (Publicação de Patente Europeia No. 1013765 A), gene yfiK, e gene yeaS (Publicação de Patente Europeia No. 1016710 A). Métodos exemplares para conferir resistência a L-treonina a uma bactéria hospedeira incluem aqueles descritos na Publicação de Patente Europeia No. 0994190 A e WO90/04636.

[00222] VKPM B-3996 de E. coli (Patente U.S. No. 5.175.107) pode ser exemplificada como uma bactéria de produção de L-treonina. A cepa VKPM B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Rússia, 117545 Moscow 1, Dorozhny proezd, 1) com o número de registro VKPM B-3996. A cepa VKPM B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 (WO90/04636) que foi obtido inserindo os genes biossintéticos de treonina (operon de treonina, thrABC) em um vetor de plasmídeo pAYC32 de ampla faixa de hospedeiro contendo o marcador de resistência a estreptomicina (Chistorerdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986)). Em pVIC40, aspartoquinase I-homoserina desidrogenase I codificada pelo gene thrA no operon de treonina é dessensibilizada para inibição de realimentação por L-treonina.

[00223] VKPM B-5318 de E. coli (referir-se à Patente Europeia No. 0593792) pode também ser exemplificada como uma bactéria de produção de L-treonina preferida. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) GNII Genetika em 3 de maio de 1990 com um número de registro de VKPM B-5318. A cepa VKPM B-5318 é prototrófica com referência a L-isoleucina, e abriga um DNA de plasmídeo recombinante construído de forma que o operon de treonina, isto é, genes da biossíntese de treonina, deficientes na região atenuadora, que é uma região de regulação de transcrição originalmente contida, seja localizado à jusante do repressor C1, promotor PR, e o gene que codifica para N-terminal da proteína Cro sensíveis a temperatura derivados de X fago, e a expressão dos genes da biossíntese de treonina é regulada pelo repressor e o promotor derivados de X fago.(Bactérias produtoras de L-arginina)

[00224] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-arginina incluem, mas não se limitando a cepas bacterianas de Escherichia, tal como cepa 237 de E. coli (VKPM B-7925) (Pedido Publicado de Patente U.S. No. 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas que abrigam N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russo No. 2001112869), cepa 382 de E. coli (VKPM B-7926) (EP 1170358 A1), e um cepa de produção de arginina transformada com o gene argA que codifica N-acetilglutamato sintetase (EP 1170361 A1).

[00225] Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-arginina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem o gene de N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), gene de ornitina acetil transferase (argJ), gene de N-acetilglutamato quinase (argB), gene de acetilornitina transaminase (argD), gene de ornitina carbamoil transferase (argF), gene do ácido argininossuccínico sintetase (argG), gene do ácido argininossuccínico liase (argH), e gene de carbamoil fosfato sintetase (carAB).

[00226] Exemplos de bactérias corineformes que têm A capacidade de produção de L-arginina incluem, mas não se limitando a cepas tipo selvagem de bactérias corineformes; bactérias corineformes resistentes a certos agentes incluindo medicamentos sulfa, 2-tiazolealanina, ácido α-amino-β- hidroxivalérico e assim por diante; bactérias corineformes que exibem L- histidina, L-prolina, L-treonina, L-isoleucina, L-metionina, ou L-triptofano auxotrofia além da resistência a 2-tiazolealanina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 54-44096); bactérias corineformes resistentes a ácido cetomalônico, ácido fluormalônico, ou ácido monofluoracético (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-18989); bactérias corineformes resistentes a argininol (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 62-24075); bactérias corineformes resistentes a X-guanidina (X representa um derivado de ácido graxo ou cadeia alifática, Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2-186995) e assim por diante. A bactéria corineforme deficiente em repressor de L- arginina (Pedido Publicado de Patente U.S. No. 20020045233) e a bactéria corineforme das quais atividade de glutamato desidrogenase é aumentada (Publicação de Patente Europeia No. 1057893 A) são também cepas adequadas para produção de L-arginina.

[00227] Especificamente, as seguintes cepas podem ser exemplificadas: AJ11169 de Brevibacterium flavum (BP-6892), AJ12092 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-6906), AJ11336 de Brevibacterium flavum (FERM BP-6893), AJ11345 de Brevibacterium flavum (FERM BP- 6894), e AJ12430 Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-2228). As cepas AJ11169 e AJ12092 são as cepas de 2-tiazolealanina resistentes descritas no Pedido de Patente Japonês em aberto No. 54-44096, a cepa AJ11336 é a cepa resistente a argininol e sulfadiazina descrita na Publicação de Patente Japonesa No. 62-24075, a cepa AJ11345 é a cepa que é resistente a argininol, 2-tiazolealanina, e sulfaguanidina, e exibe auxotrofia a histidina descrita na Publicação de Patente Japonesa No. 62-24075, e a cepa AJ12430 é a cepa resistente a octilguanidina e 2-tiazolealanina descrita no Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2-186995.

[00228] AJ12092 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-6906)foi depositada em 29 de setembro de 1983 em National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (agência administrativa atualmente independente, National Institute of Tecnology and Evaluation, International Patent Organism Depositary, Room No. 120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, 292-0818, Japão) com um número de acesso de FERM P-7273, e o depósito original foi convertido em um depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 1 de outubro de 1999, e foi atribuído com um número de acesso de FERM BP-6906.

[00229] Exemplos de bactérias Escherichia tendo capacidade de produção de L-arginina incluem Escherichia coli introduzida com o gene argA (vide Pedido de Patente Japonês em aberto No. 57-5693), e a cepa 237 Escherichia coli, que é um derivado de produção de L-arginina da cepa mutante utilizando ácido acético de (Pedido de Patente Russo No. 2000117677). A cepa 237 foi depositada em Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) GNII Genetika com o número de acesso VKPM B-7925 desde 10 de abril de 2000, e o depósito original foi convertido em um depósito internacional com base no Tratado de Budapeste, em 18 de maio de 2001. A cepa 382 de Escherichia coli tendo uma mutação para resistência a inibição de realimentação por L-arginina, que é um derivado da cepa 237 (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2002-017342) pode também ser usada. A cepa 382 de Escherichia coli foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms com um número de VKPM B-7926 em 10 de abril de 2000, e o depósito foi convertido em uma deposição internacional com base no Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

[00230] Exemplos de bactérias Serratia tendo capacidade de produção de L-arginina incluem Serratia marcescens deficiente na capacidade de decompor L-arginina, e que exibe resistência a antagonistas de arginina e canavanina e autotrofia para lisina (vide Pedido de Patente Japonês em aberto No. 52-8729).(Bactérias produtoras de L-histidina)

[00231] Exemplos de cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-histidina incluem, mas não se limitando a cepas bacterianas de Escherichia, tais como cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, RU2003677), cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, RU2119536), NRRL B-12116 a B-12121 de E. coli (Patente U.S. No. 4.388.405), H-9342 de E. coli (FERM BP-6675), H-9343 de E. coli (FERM BP-6676) (Patente U.S. No. 6.344.347), H-9341 de E. coli (FERM BP-6674) (EP 1085087), e AI80/pFM201 de E. coli (Patente U.S. No. 6.258.554).

[00232] Exemplos de cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-histidina também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam enzimas biossintéticas de L-histidina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem o gene ATP fosforibosiltransferase (hisG), gene de fosforibosil AMP ciclo-hidrolase (hisI), gene de fosforibosil-ATP pirofosfo-hidrolase (hisIE), gene de fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), gene de amidotransferase (hisH), gene de histidinol fosfato aminotransferase (hisC), gene de histidinol fosfatase gene (hisB), gene de histidinol desidrogenase (hisD) e assim por diante.

[00233] Sabe-se que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina e, portanto, a capacidade de produzir L-histidina pode também ser eficientemente intensificada introduzindo uma mutação que confere resistência a inibição de realimentação no gene que codifica para ATP fosforibosiltransferase (hisG) (Patentes Russas Nos. 2003677 e 2119536).

[00234] Exemplos específicos de cepas tendo capacidade de produção de L-histidina incluem FERM-P 5038 e 5048 de E. coli que foram transformadas com um vetor que carrega um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 56005099), cepas de E. coli transformadas com um gene que codifica uma proteína envolvida em aminoácido exportam (EP 1016710 A), cepa 80 de E. coli que é resistente a sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, e estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa No. 2119536) e assim por diante.(Bactérias produtoras de L-cisteína)

[00235] Exemplos de cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-cisteína incluem, mas não se limitando a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tal como JM15 de E. coli que é transformada com diferentes alelos de cysE que codifica serina acetiltransferases resistente a realimentação (Patente U.S. No. 6.218.168, Pedido de Patente Russo No. 2003121601), W3110 de E. coli com genes sobre-expressos que codificam proteínas que promovem excreção de substâncias tóxicas para células (Patente U.S. No. 5.972.663), cepas de E. coli com atividade de cisteína desulfo-hidrase reduzida (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 11-155571), W3110 de E. coli com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WO01/27307A1) e assim por diante.(Bactérias produtoras de L-serina)

[00236] Exemplos de cepas mães usáveis para derivar bactérias produtoras de L-serina incluem bactérias corineformes nas quais o gene de fosfoserina fosfatase é amplificado (Pedido de Patente Japonês em aberto Nos. 2001-275689 e 11-253187), bactérias corineformes tendo D-3- fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizado para inibição, que é derivado de bactérias corineformes tendo capacidade de produção de L-serina e resistentes a azaserina ou β-(2-tienil)-DL-alanina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 11-266881), e bactérias corineformes de produção serina resistentes a azaserina ou tienilalanina, e deficientes em capacidade de decomposição de serina (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 10-248588).

[00237] Métodos para conferir capacidade de produção de ácido nucleico a um microrganismo e bactérias produtoras do ácido nucleico serão exemplificados a seguir.

[00238] Um microrganismo tendo uma capacidade de produzir um ácido nucleico pode ser obtido conferindo, por exemplo, auxotrofia de nucleosídeo de purina ou resistência a um medicamento tal como análogo de purina a tais bactérias como descrito anteriormente (referir-se à Publicação de Patente Japonesa Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895). Por exemplo, uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistência a medicamento pode ser obtida por um tratamento com um mutágeno que é usado para tratamento usual de mutagênese tal como N-metil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou metanossulfonato de etila (EMS).

[00239] Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeo de purina incluem os seguintes.

[00240] Como um exemplo específico de cepa de produção de inosina que pertence ao gênero Bacillus, a cepa KMBS16 de Bacillus subtilis pode ser usada. Esta cepa é derivada da cepa trpC2 de Bacillus subtilis conhecida (168 Marburg), em que o gene purR que codifica o operon repressor de purina (purR::spc), o gene purA que codifica succinil-AMP sintase (purA::erm), e o gene deoD que codifico purina nucleosídeo fosforilase (deoD::kan) são rompidos (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2004-242610, Pedido Publicado de Patente U.S. No. 2004166575 A1). A cepa AJ3772 de Bacillus subtilis (FERM P-2555, Pedido de Patente Japonês em aberto No. 62-014794) e assim por diante pode também ser usada.

[00241] Exemplos de bactérias Bacillus tendo uma capacidade de produzir guanosina incluem a bactéria Bacillus tendo atividade de IMP desidrogenase aumentada (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 358787), bactéria Bacillus obtida introduzindo um vetor incluindo um gene que confere resistência a análogo de purinas ou decoinina em um mutante auxotrófico de adenina (Publicação de Patente Japonesa No. 4-28357) e assim por diante.

[00242] Exemplos de bactérias Bacillus que produzem uma purina nucleotídeo incluem os seguintes.

[00243] Como bactérias Bacillus de produção de ácido inosínico, cepa de produção de inosinas de Bacillus subtilis que têm atividade fosfatase atenuada foram reportadas (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). Exemplos de bactérias produtoras de ácido guanílico incluem mutantes de bactérias Bacillus que têm auxotrofia de adenina, resistência a sulfóxido de decoinina ou metionina e uma capacidade de produzir ácido 5'-guanílico (guanosina-5'-monofosfato, daqui em diante também referido como "GMP") (Publicação de Patente Japonesa No. 56-12438).

[00244] Além disso, uma bactéria de produção de ácido xantílico pode ser construída pelo método usado para melhorar bactérias corineformes, um exemplo típico de que é Corynebacterium ammoniagenes. Por exemplo, obtendo uma cepa intensificada por PRPP amidotransferase (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 8-168383), uma cepa resistente a aminoácido alifático (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 4-262790), ou um cepa resistente a de-hidroprolina (Publicação de Patente de Coreia do Sul Não examinada No. 2003-56490), uma bactéria de produção de ácido xantílico pode ser construída.

[00245] Entretanto, métodos exemplares para melhorar bactérias Bacillus que têm uma capacidade de produzir uma substância derivada de purina também incluem intensificar atividade de uma enzima que é envolvida em biossíntese de purina que é comum para a biossíntese de nucleosídeos de purina e nucleosídeos de purina, isto é, enzima de biossíntese de purina, em células bacterianas.

[00246] Exemplos da enzima envolvida na biossíntese de purina incluem, por exemplo, fosforibosil pirofosfato amidotransferase, fosforibosil pirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]) e assim por diante.

[00247] Alguns dos catabólitos produzidos por metabolismo de fontes de açúcar tal como glicose que escoam para o caminho de pentose fosfato são convertidos em ribose-5-fosfato por meio de ribulose-5-fosfato. A partir da ribose-5-fosfato biossintetizada, fosforibosil pirofosfato (PRPP) é produzido, que é um precursor indispensável para biossínteses de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano. Especificamente, ribose-5-fosfato é convertida em PRPP por fosforibosil pirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade de produzir substância derivada de purina pode ser conferida a uma bactéria Bacillus ou a capacidade de a bactéria poder ser intensificada modificando a bactéria, de forma que a atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase dos mesmos seja aumentada.

[00248] A atividade da fosforibosil pirofosfato sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Switzer et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou pelo método de Roth et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus na qual a atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase é aumentada pode ser produzida, por exemplo, aumentando a expressão de um gene que codifica a fosforibosil pirofosfato sintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método de usar um plasmídeo ou integrando o gene em um cromossomo, que pode ser realizado da mesma maneira daquela do método descrito no Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2004-242610.

[00249] Por outro lado, quando PRPP, que é um precursorindispensável para biossínteses de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano, é produzido, parte dele é convertida em nucleosídeos de purina e nucleosídeos de purina pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genes que codificam tais enzimas incluem os genes do operon de purina de Bacillus subtilis, especificamente, genes do operon de purEKB- purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD (Ebbole D.J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (no momento, também denominadopurEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilis e seus parentes mais próximos, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, GenBank Accession No. NC_000964), e os genes do regulon pur de Escherichia coli (Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

[00250] Dessa maneira, intensificando a expressão desses genes, uma capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode também ser conferida ou intensificada. Além do mais, genes do operon de purina que podem ser usados para a presente invenção não são limitados a esses, e genes derivados de outros microrganismos, animais e plantas podem também ser usados.

[00251] Exemplos do método para aumentar expressão do operon de purina incluem aumentar a expressão de genes do operon de purina em uma bactéria Bacillus por um método de usar um plasmídeo, integrando os genes em um cromossomo, ou similares.

[00252] O segundo método para aumentar expressão do operon de purina inclui substituir um promotor nativo do operon de purina com um promotor mais forte, e substituir a região -35 ou -10 do promotor nativo com uma sequência consenso.

[00253] Por exemplo, em Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B. subtilis, ATCC 6051), a sequência -35 do operon de purina é uma sequência consenso (TTGACA), mas a sequência -10 é TAAGAT, que difere da sequência consenso TATAAT (Ebbole, D.J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, substituindo a sequência -10 (TAAGAT) com uma sequência consenso, ou aproximando a sequência -10 (TAAGAT) próximo da sequência consenso, ela pode ser mudada para TATAAT, TATGAT ou TAAAAT e, por meio disso, a atividade transcricional do operon de purina pode ser aumentada. Uma sequência promotora pode ser substituída pelo mesmo método daquele da substituição genética, que é descrito a seguir.

[00254] O terceiro método para aumentar expressão do operon de purina inclui diminuir a quantidade de expressão do repressor do operon de purina (Patente U.S. No. 6.284.495).

[00255] A quantidade de expressão do repressor do operon de purina (purina repressor) pode ser diminuída, por exemplo, por um método de tratar uma bactéria Bacillus com irradiação de raio ultravioleta ou um mutágeno usado em um tratamento de mutagênese usual tal como NTG ou EMS e selecionar um mutante mostrando expressão diminuída do repressor de purina.

[00256] Além disso, uma bactéria Bacillus com expressão diminuída do repressor de purina pode também ser obtida, por exemplo, além de um tratamento de mutagênese, substituindo um gene que codifica o repressor de purina em um cromossomo (purR, GenBank Accession NC_000964) com um gene correspondente que não funciona normalmente (a seguir, também referido como “gene tipo rompido”) por recombinação homóloga utilizando uma técnica de recombinação genética (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202).

[00257] Além disso, uma capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode também ser intensificada atenuando a absorção de substância derivada de purinas nas células. Por exemplo, a absorção de nucleosídeos de purina pelas células pode ser atenuada bloqueando uma reação envolvida na absorção de nucleosídeos de purina pelas células. Exemplos da reação envolvida na absorção de nucleosídeos de purina pelas células incluem reações catalisadas por nucleosídeo permeases.

[00258] Além disso, quando um nucleosídeo de purina é produzido, a atividade de uma enzima que decompõe a substância derivada de purinas pode ser diminuída a fim de intensificar a capacidade de produzir o nucleosídeo de purina. Exemplos de uma enzima como essa incluem purina nucleosídeo fosforilase.

[00259] Nucleosídeos de purina biossintetizados de PRPP por enzimas envolvidas na biossíntese de purina são desfosforilados e, por meio disso, convertidos em um nucleosídeo de purina. Para causar eficientemente acúmulo de um nucleosídeo de purina, é preferível reduzir atividades de purina nucleosídeo fosforilases, que adicionalmente degradam nucleosídeos de purina em hipoxantina ou similares. Ou seja, é preferível atenuar ou eliminar a atividade de uma purina nucleosídeo fosforilase que emprega nucleosídeos de purina tal como inosina como um substrato.

[00260] Especificamente, a atividade purina nucleosídeo fosforilase pode ser diminuída rompendo os genes deoD e pupG que codificam purina nucleosídeo fosforilase em bactérias Bacillus. A bactéria Bacillus usada na presente invenção pode ser modificada rompendo um ou ambos os genes deoD e pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, aqueles genes derivados de bactérias Bacillus (deoD; Genbank Accession No. NC_000964, pupG; Genbank Accession No. NC_000964) podem ser usados.

[00261] A capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode também ser intensificada diminuindo a atividade de succinil-AMP sintase. Exemplos do gene que codifica succinil-AMP sintase incluem o gene purA. Exemplos do gene purA incluem, por exemplo, aqueles tendo a sequência de nucleotídeos registrada como GenBank Accession No. NC_000964 (região de codificação corresponde aos números de nucleotídeo 4153460 a 4155749 da fita complementar).

[00262] A capacidade de produzir uma substância derivada de purina pode também ser intensificada diminuindo a atividade de inosina monofosfato (IMP) desidrogenase. Exemplos do gene que codifica IMP desidrogenase incluem o gene guaB. Exemplos do gene guaB incluem, por exemplo, aqueles tendo a sequência de nucleotídeos registrada como GenBank Accession No. NC_000964 (região de codificação corresponde aos números de nucleotídeo 15913 a 17376).

[00263] Entretanto, como um método para intensificar uma capacidade de produzir substância derivada de purina, amplificação de um gene que codifica uma proteína tendo uma atividade de excretar uma substância derivada de purina pode ser contemplada. Um exemplo de uma bactéria na qual um gene como esse foi amplificado é uma bactéria Bacillus na qual o gene rhtA é amplificado (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2003219876).

[00264] Exemplos mais específicos do microrganismo usável para a presente invenção incluem, por exemplo, AJ11442 de Escherichia coli (NRRL B-12185, FERM BP-1543, referir-se à Patente U.S. No. 4.346.170), AJ3990 de Brevibacterium lactofermentum (ATCC 31269, referir-se à Patente U.S. No. 4.066.501) etc. para L-lisina como a substância alvo, VKPM B-3996 de Escherichia coli (RIA1867, VKPM B-3996, referir-se à Patente U.S. No. 5.175.107), AJ12318 de Corynebacterium acetoacidophilum (FERM BP- 1172) (referir-se à Patente U.S. No. 5.188.949), etc. para L-treonina, AJ12604 de Escherichia coli (FERM BP-3579, referir-se à Publicação de Patente Europeia No. 488.424 A), AJ12637 de Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-4160, referir-se ao Pedido de Patente Francês em aberto No. 2.686.898) etc. para L-fenilalanina, AJ12624 de Escherichia coli (FERM BP- 3853, referir-se ao Pedido de Patente Francês em aberto No. 2.680.178), AJ12475 de Brevibacterium lactofermentum (FERM BP-2922, referir-se à Patente U.S. No. 5.272.067) etc. para ácido L-glutâmico, AJ11478 de Escherichia coli (FERM P-5274, referir-se à Publicação de Patente Japonesa No. 62-34397), AJ3718 de Brevibacterium lactofermentum (FERM P-2516, referir-se à Patente U.S. No. 3.970.519), etc. para L-leucina, KX141 de Escherichia coli (VKPM B-4781, referir-se à Publicação de Patente Europeia No. 519.113 A), AJ12149 de Brevibacterium flavum (FERM BP-759, referir- se à Patente U.S. No. 4.656.135), etc. para L-isoleucina, VL1970 de Escherichia coli (VKPM B-4411, referir-se à Publicação de Patente Europeia No. 519.113 A), AJ12341 de Brevibacterium lactofermentum (FERM BP- 1763, referir-se à Patente U.S. No. 5.188.948), etc. para L-valina, e AJ12092 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-6906) para L-arginina.

[00265] Produção de uma substância alvo usando a presente invenção pode ser obtida controlando a concentração de amônia para ficar em uma certa faixa de concentração por pelo menos um período exigido, ou seja, pelo menos parte do período, em todo o processo de cultura durante a fermentação.

[00266] O período exigido em todo o processo de cultura durante fermentação significa um período no qual a cultura é realizada com a concentração de amônia sendo controlada em uma certa concentração. Prefere-se que o controle seja durante o período no qual a produção da substância é realizada. Por exemplo, quando o método da presente invenção inclui um estágio para proliferar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância (fase de proliferação) e um estágio para produzir a substância (fase de produção da substância), a concentração de amônia pode ser controlada em uma certa concentração na fase de produção da substância, e a concentração de amônia pode ou não ser controlada em uma certa concentração na fase de proliferação para proliferar o microrganismo.

[00267] A "fase de proliferação" significa o estágio quando a fonte de carbono é basicamente usada para crescimento de célula, ou seja, o estágio quando o microrganismo está proliferando logaritmicamente, que pode ser um período de 3 horas, preferivelmente 6 horas, mais preferivelmente 10 horas a partir do início da cultura. A "fase de produção da substância” significa o estágio quando a fonte de carbono é principalmente usada para produção de substância, que pode ser um período após 3 horas, preferivelmente após 6 horas, mais preferivelmente após 10 horas a partir do início da cultura.

[00268] A certa faixa de concentração pode ser usada tanto para o método de realizar a cultura controlando a concentração de amônia em uma certa faixa, quanto o método de realizar a cultura controlando a concentração de amônia para não ficar maior que uma certa concentração.

[00269] A presente invenção pode ser aplicada a um método de cultivo no qual íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como contraíons de aminoácidos (em seguida, ele pode ser descrito como fermentação de carbonato). Quando um aminoácido básico tal como L-lisina é produzido, a produção pode ser realizada por um método no qual fermentação é realizada controlando a pressão no tanque de fermentação para ficar positiva durante a fermentação, ou fornecendo gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo gás dióxido de carbono no meio para prover um período de cultura onde o meio contém 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato, de forma que esses íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato sirvam como contraíons de cátions principalmente compreendendo o aminoácido básico, e o aminoácido básico objetivo é então coletado (Pedido de Patente Japonês em aberto No. 2002-65287, Pedido Publicado de Patente U.S. No. 2002/0025564, EP 1813677 A).

[00270] O período exigido em todo o processo de cultura durante fermentação no método de cultivo no qual íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como contraíons de um aminoácido básico e coleta do aminoácido alvo básico, não é particularmente limitado, desde que a produtividade desejada seja obtida, mas especificamente, por exemplo, pode ser não menos que um décimo, preferivelmente não menos que um quanto de todo o processo de cultura durante a fermentação principal. Mais especificamente, ele pode incluir um período no qual o pH do meio aumenta devido à escassez de contraíons tais como íons de sulfato e cloreto usados no meio enquanto a substância básica alvo acumula.

[00271] Na fermentação de carbonato, pressão no tanque de fermentação pode ser controlada para ser positiva durante a fermentação, e/ou gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo gás dióxido de carbono pode ser fornecido no meio. Ambas as operações anteriores são preferivelmente realizadas de forma que exista um período de cultura onde preferivelmente 20 mM ou mais, mais preferivelmente 30 mM ou mais, em particular preferivelmente 40 mM ou mais, de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato estão presentes no meio. A pressão interna do tanque de fermentação, quantidade de fornecimento de gás dióxido de carbono ou gás misto contendo gás dióxido de carbono, ou o volume de fornecimento de gás limitado pode ser determinado, por exemplo, medindo íons de bicarbonato ou íons de carbonato no meio, ou o pH ou concentração de amônia do meio.

[00272] De acordo com a fermentação de carbonato, é possível manter o pH do meio baixo de forma que a quantidade de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato presente no meio exigido como contraíons seja menor que aquela usada nos métodos convencionais. Quando o pH é controlado com amônia, amônia é fornecida a fim de aumentar o pH, e ele pode servir como uma fonte de nitrogênio para o aminoácido básico. Exemplos de cátions sem ser o aminoácido básico no meio incluem K, Na, Mg, Ca etc. originando em componentes do meio. Esses preferivelmente existem em uma quantidade de 10% ou menos, preferivelmente 5% ou menos, mais preferivelmente 2% ou menos dos cátions totais.

[00273] Além disso, a pressão interna do tanque de fermentação durante fermentação pode ser feita positiva, por exemplo, tornando a pressão de fornecimento de gás maior que a pressão de exaustão. Tornando a pressão interna do tanque de fermentação positiva, o gás dióxido de carbono gerado por fermentação dissolve no meio de cultura para gerar íons de bicarbonato ou íons de carbonato, e esses podem servir como contraíons do aminoácido básico. A pressão interna do tanque de fermentação é, especificamente, 0,03 a 0,2 MPa, preferivelmente 0,05 a 0,15 MPa, mais preferivelmente 0,1 a 0,3 MPa, em termos da pressão manométrica (diferença de pressão com relação à pressão atmosférica). Entretanto, fornecendo gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo gás dióxido de carbono no meio de cultura, gás dióxido de carbono pode ser dissolvido no meio. Além disso, durante o fornecimento de gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo dióxido de carbono no meio, a pressão interna do tanque de fermentação pode ser ajustada para ser positiva.

[00274] A pressão interna do tanque de fermentação pode ser ajustada para ser positiva, por exemplo, tornando a pressão de fornecimento de gás maior que a pressão de exaustão. Especificamente, é preferível cultivar ajustando a pressão parcial de oxigênio maior que aquela de dióxido de carbono. Além disso, quando gás dióxido de carbono é fornecido no meio, por exemplo, dióxido de carbono puro ou um gás misto contendo 5 % em volume ou mais de dióxido de carbono pode ser borbulhado no meio.

[00275] Os métodos acima mencionados para dissolver íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio podem ser usados sozinhos, ou dois ou mais deles podem ser usados em combinação.

[00276] Nos métodos convencionais, uma quantidade suficiente de sulfato de amônio ou cloreto de amônio é normalmente adicionada no meio para servir como contra-ânions do aminoácido básico a ser produzido, e produtos de decomposição de ácido sulfúrico ou ácido clorídrico de proteínas etc. são também adicionados no meio com um componente nutriente. Portanto, os íons de sulfato e íons de cloreto gerados deles estão presentes no meio. Portanto, a concentração dos íons de carbonato fracamente acídicos é extremamente baixa durante a cultura, tal como da ordem de ppm. A modalidade anterior da presente invenção é caracterizada em que esses íons de sulfato e íons de cloreto são reduzidos, e o gás dióxido de carbono liberado pelo microrganismo durante fermentação é dissolvido no meio no ambiente de fermentação acima mencionado e usado como contraíons. Portanto, na modalidade apresentada da presente invenção, não é necessário adicionar íons de sulfato ou íons de cloreto no meio em uma quantidade maior que a quantidade exigida para o crescimento. Prefere-se que uma quantidade apropriada de sulfato de amônio ou similares seja adicionada no meio em um estágio inicial da cultura, e a adição é terminada no meio da cultura. Alternativamente, sulfato de amônio ou similares pode ser alimentado mantendo ao mesmo tempo o equilíbrio com os íons de carbonato ou íons de bicarbonato dissolvidos no meio. Entretanto, como uma fonte de nitrogênio do aminoácido básico, amônia pode ser alimentada no meio. Amônia pode ser fornecida no meio sozinha, ou junto com outros gases.

[00277] Menores concentrações de ânions sem ser íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio são mais preferidas desde que elas estejam presentes em quantidades que são exigidas para o crescimento do microrganismo. Exemplos de tais ânions incluem íons de cloreto, íons de sulfato, íons de fosfato, ácidos orgânicos ionizados, íons de hidróxido e assim por diante. A concentração molar total desses outros íons é normalmente preferivelmente 900 mM ou menos, mais preferivelmente 700 mM ou menos, ainda mais preferivelmente 500 mM ou menos, adicionalmente preferivelmente 300 mM ou menos, em particular preferivelmente 200 mM ou menos.

[00278] Reduzir as quantidades de íons de sulfato e/ou íons de cloreto a ser usadas é um dos objetivos da modalidade anterior da presente invenção, e a quantidade total de íons de sulfato ou íons de cloreto, ou ambos contidos no meio é normalmente 700 mM ou menos, preferivelmente 500 mM ou menos, mais preferivelmente 300 mM ou menos, ainda mais preferivelmente 200 mM ou menos, em particular preferivelmente 100 mM ou menos.

[00279] Se sulfato de amônio for adicionado em um meio como uma fonte de contraíon de um aminoácido básico, gás dióxido de carbono no meio de cultura é normalmente eliminado por íons de sulfato. Entretanto, na modalidade anterior da presente invenção, não é necessário adicionar uma quantidade em excesso de sulfato de amônio no meio e, portanto, gás dióxido de carbono pode ser facilmente dissolvido no meio de fermentação.

[00280] Além disso, na modalidade anterior da presente invenção, é preferível controlar a concentração de amônia total no meio até um ponto tal que "produção do aminoácido básico não seja inibida". Exemplos das condições para obter um propósito como esse incluem, por exemplo, aquelas para prover rendimento e/ou produtividade de preferivelmente 50% ou mais, mais preferivelmente 70% ou mais, em particular preferivelmente 90% ou mais do rendimento e/ou produtividade obtidos em condições ideais. Especificamente, a concentração de amônia total no meio é, por exemplo, 300 mM ou menos, 250 mM ou menos, 200 mM ou menos, 100 mM ou menos, ou 50 mM ou menos. O grau de dissociação da amônia diminui a medida em que o pH fica maior. Amônia não ionizada é mais tóxica para bactérias do que íons de amônio. Portanto, o limite superior da concentração de amônia total deve ser determinado dependendo do pH do meio de cultura. Ou seja, à medida que o pH do meio de cultura aumenta, a concentração de amônia total aceitável diminui. Portanto, a concentração de amônia total acima mencionada "que não inibe a produção de aminoácido básico" é preferivelmente determinada para cada valor de pH específico. Entretanto, a faixa de concentração de amônia total que é aceitável no mais alto nível de pH durante a cultura pode ser usada como o limite superior da concentração de amônia total por todo o período de cultura.

[00281] Por outro lado, a concentração de amônia total que funciona como uma fonte de nitrogênio exigido para crescimento do microrganismo e produção da substância básica não é particularmente limitada, e pode ser apropriadamente determinada, desde que um nível reduzido da fonte de nitrogênio que pode resultar no esgotamento contínuo de amônia durante a cultura não reduza a produtividade da substância objetiva pelo microrganismo. Por exemplo, a concentração de amônia pode ser medida com tempo durante a cultura e, se amônia no meio for esgotada, uma pequena quantidade de amônia pode ser adicionada no meio. Embora a concentração de amônia total depois da adição de amônia não seja particularmente limitada, a concentração de amônia total pode ser, por exemplo, preferivelmente 1 mM ou mais, mais preferivelmente 10 mM ou mais, em particular preferivelmente 20 mM ou mais.

[00282] Além disso, em fermentação de ácido L-glutâmico, a cultura pode ser realizada precipitando ácido L-glutâmico no meio usando um meio líquido ajustado para ter uma condição na qual ácido L-glutâmico é precipitado. A condição na qual ácido L-glutâmico é precipitado é, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, em particular preferivelmente pH 4,0 (Publicação de Patente Europeia No. 1078989 A).[Exemplo]

Produção de L-arginina usando o aparelho da presente invenção

[00283] Este exemplo mostra um exemplo de aplicação de cultura de controle de amônia usando o aparelho da presente invenção para produção de L-arginina por uma bactéria corineforme. Como uma cepa de produção de L- arginina, AJ12092 de Corynebacterium glutamicum (FERM BP-6906) foi usada.

[00284] O aparelho da presente invenção usado neste exemplo teve a configuração descrita a seguir.

[00285] Sensor de amônia 10:

[00286] Sensor de amônia 10 compreende um eletrodo interno tipo sensor usando uma membrana permeável a amônia, e mostra mudança de tensão em respostas a amônia não ionizada. Ele foi inserido no tanque de cultura 200.

[00287] Aparelho para controle de amônia 100:

[00288] Foi usado um computador tendo a parte de armazenamento 106, parte de controle 103, parte de entrada de sinal 108 conectada com o sensor de amônia 10, e parte de saída de controle 104 conectada no alimentador de amônia 300. A parte de armazenamento 106 armazena uma curva de calibração representando a relação entre a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200, e a tensão medida com o sensor de amônia 10. A parte de controle 102 realiza a etapa de cálculo da concentração de amônia de medir a tensão com o sensor de amônia 10, e calcular a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura 200 a partir da tensão usando a curva de calibração, e a etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração de controle estabelecida, de direcionar o alimentador de amônia 300 para fornecer amônia no tanque de cultura 200.

[00289] Alimentador de amônia 300:

[00290] Alimentador de amônia 300 tem um recipiente contendo uma solução aquosa de sulfato de amônio, e é disposto de forma que a solução aquosa de sulfato de amônio possa ser gotejada do recipiente no tanque de cultura com uma bomba de rolo, e gotejar a solução a uma taxa de gotejamento estabelecida baseada em um sinal enviado do aparelho para controle de amônia 100.Controle de concentração de amônia em fermentação de Arg usando o aparelho da presente invenção

[00291] L-Arginina foi produzida com controle da concentração deamônia total, que diminui essencialmente com avanço da cultura, para ser constante usando o aparelho da presente invenção. Nesta produção, três tipos de condições de 20 mM, 100 mM, e 300 mM foram estabelecidos como uma concentração na qual a concentração de amônia total no meio deve ser controlada. KOH 1N foi gotejado a 300 mL do meio de produção de L- arginina mostrados na Tabela 1 contidos em um fermentador de jarro para ajustar pH do meio em 6,9. Sulfato de amônio foi misturado no meio de produção de L-arginina de forma que a concentração de amônia total inicial ficou 20 mM, 100 mM, ou 300 mM. A cepa AJ12092 de Corynebacterium glutamicum foi aplicada em toda a superfície de uma placa do meio ágar CM- Dex mostrada na Tabela 2, e cultivada a 31,5°C por 24 horas, e as células crescidas no meio ágar de uma placa foram inoculadas no fermentador de jarro. A cultura foi realizada a uma taxa de agitação de 700 rpm com manutenção da temperatura em 31,5°C e com aeração de 300 mL/minuto de ar desinfetado com um filtro. O pH do meio, que diminui essencialmente com avanço da cultura, foi mantido em 6,9 adicionando KOH 6N. Adicionalmente, uma solução de glicose de 692 g/L separadamente esterilizada (contendo 0,05 mL/L de antiespuma GD-113) foi apropriadamente adicionada de forma que a concentração de glicose no meio, que diminui essencialmente com avanço da cultura, foi mantida em cerca de 40 g/L. A cultura foi realizada por 52 horas. Quando a concentração de amônia não ionizada fica menor que o valor estabelecido, a solução aquosa de sulfato de amônio foi automaticamente gotejada pelo aparelho da presente invenção de forma que a concentração de amônia total estabelecida deve ser mantida, e a concentração de amônia total foi por meio disso controlada para ser constante durante a cultura. Especificamente, a concentração de amônia não ionizada no meio foi medida em tempo real com o sensor de amônia inserido no fermentador de jarro, e um 450 g/L de solução aquosa de sulfato de amônio separadamente esterilizada foi automaticamente gotejada do alimentador de amônia no meio de forma que a concentração de amônia total alvo foi mantida. Em decorrência disso, a fermentação de Arg pôde ser realizada mantendo automaticamente a concentração de amônia não ionizada alvo e concentração de amônia total como mostrado na Fig. 7 de uma maneira simples usando o aparelho da presente invenção. Para controlar a concentração de amônia total em 20 mM, 100 mM e 300 mM, os 450 g/L de solução aquosa de sulfato de amônio foram gotejados a taxas de 0,77 mL/hora, 0,90 mL/hora, e 1,30 mL/hora (taxas médias em todo o período de cultura), respectivamente. Quando a concentração de amônia total foi controlada em 300 mM, verificação usando um sensor de amônia externo foi realizada usando uma amostra coletada no meio da cultura (8 horas) e suficientemente feita alcalina para converter íon de amônio contido em amônia não ionizada.

[00292] Pelos resultados, demonstrou-se que, na produção de L- aminoácido por fermentação, cultura pode ser realizada controlando automaticamente a concentração de amônia no meio (concentração de amônia não ionizada e concentração de amônia total) para ser constante de uma maneira extremamente simples usando o aparelho da presente invenção.(2) Melhoria na produtividade de Arg provida pelo uso do aparelho da presente invenção

[00293] Então, quantidade de produção de Arg obtida controlando a concentração de amônia total usando o aparelho da presente invenção e a mesma obtida controlando a concentração de amônia total usando um método de controle manual comum foram comparadas. A concentração de amônia total na qual a concentração teve que ser controlada foi estabelecida em 300 mM. KOH 1 N foi gotejado a 300 mL do meio de produção de L-arginina mostrados na Tabela 1 contidos em um fermentador de jarro para ajustar pH do meio em 6,9. Sulfato de amônio foi misturado no meio de produção de L- arginina de forma que a concentração de amônia inicial ficasse 300 mM. A cepa AJ12092 de Corynebacterium glutamicum foi aplicada em toda a superfície de uma placa do meio ágar CM-Dex mostrada na Tabela 2, e cultivada a 31,5°C por 24 horas, e as células crescidas no meio ágar de uma placa foram inoculadas no fermentador de jarro. A cultura foi realizada a uma taxa de agitação de 700 rpm com manutenção da temperatura em 31,5°C e com aeração de 300 mL/minuto de ar desinfetado com um filtro. O pH do meio, que diminui essencialmente com avanço da cultura, foi mantido em 6,9 adicionando KOH 6 N. Adicionalmente, uma solução de glicose de 692 g/L separadamente esterilizada (contendo 0,05 mL/L de antiespuma GD-113) foi apropriadamente adicionada de forma que a concentração de glicose no meio, que diminui essencialmente com avanço da cultura, fosse mantida em cerca de 40 g/L. A cultura foi realizada por 52 horas. A concentração de amônia total foi controlada por dois tipos de métodos, isto é, o método de usar o aparelho da presente invenção como o modo descrito na seção anterior, e um método de adicionar manualmente 3 mL dos 450 g/L de solução aquosa de sulfato de amônio quando a concentração de amônia total fica menor que o valor estabelecido (controle valor). Em decorrência disso, quando o aparelho da presente invenção foi usado, a concentração de amônia total pôde ser automaticamente controlada. Por outro lado, quando a concentração de amônia total foi manualmente controlada, a solução aquosa de sulfato de amônio foi manualmente adicionada 17 vezes durante a cultura de 52 horas. Adicionalmente, como mostrado na Fig. 8, quando o aparelho da presente invenção foi usado, arginina acumulou a uma maior concentração comparada com o caso onde a concentração de amônia total foi manualmente controlada. Além disso, como para a quantidade de produção de arginina total, 11,1 g de arginina foram produzidos no caso de usar o aparelho da presente invenção, enquanto 9,5 g de arginina foram produzidos no caso do controle manual.

[00294] Verificação usando um sensor de amônia externo foi realizada usando um meio de cultura coletado no meio da cultura (8 horas) e suficientemente feita alcalina para converter íon de amônio contido em amônia não ionizada.

[00295] Pelos resultados, demonstrou-se que, na produção de L- aminoácido por fermentação, cultura pode ser realizada controlando automaticamente a concentração de amônia no meio (concentração de amônia não ionizada e concentração de amônia total) para ser constante de uma maneira extremamente simples e, além do mais, a capacidade de produção de L-aminoácido pode também ser melhorada usando o aparelho da presente invenção.

[00296] O meio foi ajustado a pH 6,0 com solução aquosa de KOH, e submetido a autoclave a 120°C por 20 minutos.

[00297] O meio foi ajustado a pH 7,5 com solução aquosa de KOH, e submetido a autoclave a 120°C por 20 minutos. Depois de ser submetido a autoclave, o meio foi vertido em uma placa de petri e geleificado.

[00298] Pelos resultados, demonstrou-se que, na produção de L- aminoácido por fermentação, cultura pode ser realizada controlando a concentração de amônia no meio para ser constante de uma maneira extremamente simples usando o aparelho da presente invenção.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00299] Como explicado anteriormente com detalhes, de acordo com a presente invenção, cultura pode ser realizada com controle contínuo e arbitrário da concentração de amônia no meio de cultura e, portanto, ela pode ser usada nos campos de indústrias químicas incluindo indústria microbiana e assim por diante.DESCRIÇÃO DE NOTAÇÕES NUMÉRICAS100 Aparelho para controle de amônia102 Parte de controle102a Parte de criação de curva de calibração102b Parte de cálculo da concentração de amônia não ionizada 102c Parte de medição do valor de pH102d Parte de cálculo da concentração de amônia total102e Parte de direcionamento do fornecimento de amônia102f Parte de medição da tensão para verificação102g Parte de verificação104 Parte de saída de controle106 Parte de armazenamento106a Arquivo de curva de dissociação de amônia106b Arquivo de curva de calibração106c Concentração de arquivo de amônia não ionizada106d Arquivo de valor de pH106e Arquivo de concentração de amônia total108 Parte de entrada de sinal10 Sensor de amônia11 , 13 Amplificador de NH312 Sensor de amônia externo20 Sensor de pH21. Amplificador de pH200 Tanque de cultura 300 Alimentador de amônia30 Tanque de amônia31 Comutador32 Válvula

Claims

1. Método de controle de amônia para fermentação, o qual é para controlar a concentração de amônia de um meio de cultura contido em um tanque de cultura, em que a concentração de amônia no tanque de cultura é controlada usando um aparelho para controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia no tanque de cultura, um sensor de amônia que responde a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia, caracterizado pelo fato de que o método compreende as etapas seguintes realizadas pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada de calcular a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura substituindo o sinal do sensor de amônia em uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e o sinal do sensor de amônia, euma etapa de direcionamento do fornecimento de amônia de direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada, em que o aparelho de controle de amônia é adicionalmente conectado a um sensor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura,o método compreendendo adicionalmente as etapas seguintes realizadas pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia total de calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada e um valor de pH medido com o sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia representando uma razão de concentração de amônia não ionizada e a concentração de íons de amônia no meio de cultura contido no tanque de cultura em cada valor de pH; eem que, na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, a concentração total de amônia é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.

2. Método de controle de amônia de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de criação da curva de calibração de criar a curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada no meio de cultura e o sinal do sensor de amônia.

3. Método de controle de amônia de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende prover um sensor de amônia externo fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada, eobter um sinal do sensor de amônia externo medindo a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura, que, depois da coleta no tanque de cultura, é tornada suficientemente alcalina para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo, como um sinal para verificação, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de verificação de verificar a curva de calibração de forma que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir do sinal para verificação com base na curva de calibração corresponda à concentração de amônia total calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia total.

4. Método de controle de amônia de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o aparelho para controle de amônia é conectado no sensor de amônia externo, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de entrada de sinal para verificação de entrar com o sinal do sensor de amônia externo como sinal para verificação.

5. Método para produção de uma substância alvo por fermentação compreendendo cultivar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um tanque de cultura contendo um meio de cultura, e coletar a substância alvo da cultura, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é cultivado com controle da concentração de amônia do meio de cultura por um método de controle de amônia, em que a concentração de amônia no tanque de cultura é controlada por um aparelho de controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia para o tanque de cultura, um sensor de amônia que responde à amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura, e uma parte de controle conectada ao alimentador de amônia e ao sensor de amônia,cujo método compreende as seguintes etapas realizadas pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada de calcular a concentração de amônia não ionizada no tanque de cultura substituindo o sinal do sensor de amônia em uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e o sinal do sensor de amônia, euma etapa de direcionamento do fornecimento de amônia de direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada, em que o aparelho de controle de amônia é adicionalmente conectado a um sensor de pH para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura,o método compreendendo adicionalmente as etapas seguintes realizadas pela parte de controle:uma etapa de cálculo da concentração de amônia total de calcular a concentração de amônia total a partir da concentração de amônia não ionizada calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia não ionizada e um valor de pH medido com o sensor de pH com base em uma curva de dissociação de amônia representando uma razão de concentração de amônia não ionizada e a concentração de íons de amônia no meio de cultura contido no tanque de cultura em cada valor de pH; eem que, na etapa de direcionamento do fornecimento de amônia, a concentração total de amônia é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de criação da curva de calibração de criar a curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada no meio de cultura e o sinal do sensor de amônia.

7. Método de controle de amônia de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que compreende prover um sensor de amônia externo fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada, eobter um sinal do sensor de amônia externo medindo a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura, que, depois da coleta no tanque de cultura, é tornada suficientemente alcalina para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo, como um sinal para verificação, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de verificação de verificar a curva de calibração de forma que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir do sinal para verificação com base na curva de calibração corresponda à concentração de amônia total calculada na etapa de cálculo da concentração de amônia total.

8. Método de controle de amônia de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o aparelho para controle de amônia é conectado no sensor de amônia externo, ecujo método compreende adicionalmente a etapa seguinte realizada pela parte de controle:uma etapa de entrada de sinal para verificação de entrar com o sinal do sensor de amônia externo como sinal para verificação.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um L-aminoácido, um ácido orgânico, um ácido nucleico, um álcool ou uma proteína.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um aminoácido básico selecionado do grupo que consiste em L-lisina, L-arginina e L-histidina.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende reduzir a quantidade de íons de sulfato e/ou íons de cloreto usados como contra-íons do aminoácido básico ajustando a concentração de amônia total do meio de cultura em uma certa faixa de concentração durante pelo menos uma parte do processo de cultura total.

12. Aparelho para controle de amônia compreendendo pelo menos um alimentador de amônia que fornece amônia em um tanque de cultura, um sensor de amônia, e uma parte de controle, caracterizado pelo fato de que:o sensor de amônia é adaptado para responder a amônia não ionizada no meio de cultura contido no tanque de cultura,a parte de controle é conectada no alimentador de amônia e no sensor de amônia, a parte de controle é configurada para criar uma curva de calibração representando a relação entre concentração de amônia não ionizada do meio de cultura e um sinal do sensor de amônia,configurada para calcular a concentração de amônia não ionizada do meio de cultura substituindo o sinal do sensor de amônia na curva de calibração, econfigurada para direcionar o alimentador de amônia para fornecer amônia no tanque de cultura quando a concentração de amônia não ionizada calculada for menor que uma concentração predeterminada,a qual é adicionalmente conectada a um sensor de pH adaptado para medir o valor de pH do meio de cultura contido no tanque de cultura, eem que a parte de controle é adicionalmente configurada para calcular a concentração total de amônia a partir da concentração de amônia não ionizada calculada e do valor de pH medido com o sensor de pH, com base em uma curva de dissociação de amônia representando uma razão existente entre a concentração de amônia não ionizada e a concentração de íons de amônia no meio de cultura em cada valor de pH, ea concentração de amônia total é usada em vez da concentração de amônia não ionizada.

13. Aparelho para controle de amônia de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a parte de controle é adicionalmente configurada para verificar a curva de calibração de forma que a concentração de amônia não ionizada calculada a partir de um sinal para verificação com base na curva de calibração corresponda à concentração de amônia total calculada pelo dispositivo de cálculo da concentração de amônia total calculada pela média da concentração de amônia total calculada, eo sinal para verificação é:um sinal obtido com um sensor de amônia externo provido fora do tanque de cultura para medir a concentração de amônia não ionizada preparando o sensor de amônia externo, emedir a concentração de amônia não ionizada de um meio de cultura que, depois da coleta no tanque de cultura, é tornado suficientemente alcalino para converter íon de amônio em amônia não ionizada com o sensor de amônia externo.

14. Aparelho para controle de amônia de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é conectado no sensor de amônia externo, eem que a parte de controle é adicionalmente adaptada para entrar com o sinal do sensor de amônia externo como sinal para verificação.

15. Aparelho para controle de amônia de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que é configurado para controle em tempo real de amônia em um meio de cultura.

16. Método para produção de uma substância alvo por fermentação compreendendo cultivar um microrganismo tendo uma capacidade de produzir a substância alvo em um tanque de cultura contendo um meio de cultura para produzir e acumular a substância alvo no meio de cultura, caracterizado pelo fato de que a concentração de amônia total do meio de cultura é ajustada para ficar em uma certa faixa de concentração durante pelo menos uma parte do processo de cultura total usando o aparelho para controle de amônia como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 15.