KR20160062151A

KR20160062151A - 암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법

Info

Publication number: KR20160062151A
Application number: KR1020167011419A
Authority: KR
Inventors: 료 다케시타
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2014-10-02
Publication date: 2016-06-01
Also published as: US9708577B2; PL3053999T3; KR101783681B1; JP5958653B2; JPWO2015050234A1; ES2761596T3; JP2016106637A; EP3053999A1; WO2015050234A1; BR112016007286A2; US20150337254A1; RU2628696C1; EP3053999B1; CN106459857A; BR112016007286B1; CN106459857B; EP3053999A4

Abstract

배양조 내의 배양액의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서, 당해 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액의 비해리형 암모니아에 응답하는 암모니아 센서와, 당해 암모니아 공급기 및 당해 암모니아 센서에 접속된, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치를 사용하여 당해 배양조 내의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서, 상기 제어부에 있어서 실행되는, 상기 암모니아 센서로부터의 신호를, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선에 대입함으로써, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝과, 산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 방법.

Description

암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법{AMMONIA CONTROL APPARATUS AND AMMONIA CONTROL METHOD}

본 발명은, 암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법에 관한 것이며, 특히, 배양조 내의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법에 관한 것이다.

종래부터, 암모니아는, 발효에 사용하는 필수 영양소인 질소의 공급원으로서 매우 중요하다.

암모니아 농도를 측정하는 기존의 기술로서는, 이온 전극을 사용하는 기술이 있다.

예를 들면, 특허문헌 1의 방법에서는, 발효액 중의 암모니아 농도를 일정 농도 이하로 제어하여, 발효균을 보다 높은 pH 값으로 배양하고 있다. 이것에 의해, 염기성 물질의 발효 생산시에 배지에 첨가하는 대이온을 삭감하고, 결과적으로 제조 공정을 대폭적으로 간략화하고 있다.

국제공개 제2006/038695호 팜플렛

그러나, 상기의 종래 기술에서는, 발효액 중의 암모니아 농도를 직접적으로 제어하는 것, 즉, 배양 중에 있어서 배양조 내의 암모니아 농도를 직접적으로 측정 또는 제어하는 것이 곤란하다는 문제점을 가지고 있었다.

즉, 도 9(종래의 암모니아 농도 제어 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트)에 도시하는 바와 같이, 배양액 중의 총 암모니아 농도(NH₃와 NH₄ ⁺의 합계 농도)를 알기 위해서는, 배양조 내로부터 배양액을 샘플링하고(스텝 SA-1), 그 샘플링한 배양액을 강알칼리성의 반응액(예를 들면, NaOH)에 혼합하고(스텝 SA-2), 존재하는 암모니아를 비이온화 암모니아(NH₃)로 되게 한 상태에서, 배양조 외부에서 연속적으로 측정한다(스텝 SA-3)라는 일련의 작업이 필요해지는 문제점이 있다. 즉, 배양조 외부에서 이 샘플링한 배양액을 측정하는 일련의 작업을 무균적으로 실시하는 것은 곤란하며, 또한 측정에 사용한 배양액은 강알칼리성의 반응액(예를 들면, NaOH)에 혼합되어 있기 때문에 배양조 내로 되돌릴 수 없어 폐기해야 하며, 측정 빈도를 높일수록 배양액을 낭비하는 것이 되기 때문에, 실제로 측정할 수 있는 횟수가 제한되어 버렸다(스텝 SA-4).

또한, 배양조 내에서는 암모니아는 연속적으로 소비되고 있으며, 또한 암모니아 소비 속도가 일정하지 않기 때문에, 도 9에 도시하는 바와 같이, 상기의 샘플링 작업에 의해 간격을 두고 암모니아 농도를 측정해도(스텝 SA-5), 짧은 시간에 있어서의 경향(트렌드)을 알 수 없기 때문에, 배양액 중의 암모니아 농도를 일정하게 컨트롤할 수 없다(스텝 SA-6)고 하는 문제점이 있다.

또한, 상기 종래의 문제점을 감안하여, 이온 전극에 의해 배양액 중에 일부 존재하는 비이온화 암모니아(NH₃)를 측정한다고 해도, 배양 중에 발생하는 오차를 수정하기 위해 교정하는 것이 용이하지 않다는 문제가 있다. 이것은, 교정하기 위해 현재의 정확한 암모니아 농도를 알기 위해서는 배양액을 샘플링하여 강알칼리성의 반응액에 혼합하여, 배양액 중의 암모니아를 비이온화 암모니아(NH₃)로 되게 한 상태에서, 총 암모니아 농도를 측정할 필요가 있기 때문이다.

즉, 일반적인 발효에 있어서, 배양액 중의 pH 값은, 약산성에서부터 약알칼리성(pH 5 내지 9 정도)이며, 배양액 중에 존재하는 암모니아 중 일부 또는 거의 전부가 이온화된 상태의 암모늄 이온(NH₄ ⁺)으로서 존재하고 있기 때문에, 상기 이온 전극에 의한 비이온화 암모니아(NH₃)의 농도의 측정만으로는, 배양액 중의 총 암모니아 농도(NH₃와 NH₄ ⁺의 합계 농도)를 구하는 것이 곤란하기 때문이다. 이로 인해, 총 암모니아 농도를 정확하게 제어할 수 없다.

본 발명은, 상기를 감안하여 이루어진 것으로, 배양액 중의 암모니아 농도를 연속적으로 임의로 컨트롤하면서 배양할 수 있는 암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 하기의 방법 및 장치를 제공한다.

(1) 배양조 내의 배양액의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서, 당해 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서와, 당해 암모니아 공급기 및 당해 암모니아 센서에 접속된, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치를 사용하여 당해 배양조 내의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서,

상기 제어부에 있어서 실행되는,

상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 스텝과,

상기 암모니아 센서로부터의 신호를 상기 검량선에 대입함으로써, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝과,

산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 스텝

을 포함하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 방법.

(2) 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 스텝을 추가로 포함하는, 상기 암모니아 제어 방법.

(3) 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 배양조 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 센서에 추가로 접속되고,

상기 제어부에 있어서 실행되는,

상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도 및 해리형 암모니아 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 상기 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝에 의해 산출된 상기 비이온화 암모니아 농도 및 상기 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하는 총 암모니아 농도 계산 스텝

을 추가로 포함하고,

상기 암모니아 공급 지시 스텝에 있어서, 상기 비이온화 암모니아 농도 대신 상기 총 암모니아 농도가 사용되는 것을 특징으로 하는, 상기 암모니아 제어 방법.

(4) 상기 배양조 외부에 설치된 외부 장착 암모니아 센서로서, 비해리형의 암모니아 농도를 측정하는 암모니아 센서를 준비하고,

상기 배양조에서 채취한 후, 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되도록 하기에 충분하게 알칼리성으로 되게 한 배양액의 비해리형의 암모니아 농도를 상기 외부 장착 암모니아 센서로 측정했을 때의, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로서 취득하는 것을 포함하고,

상기 제어부에 있어서 실행되는,

상기 교정용 신호로부터 상기 검량선에 기초하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 상기 총 암모니아 농도 계산 스텝에서 산출된 총 암모니아 농도가 되도록, 상기 검량선을 교정하는 교정 스텝

을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 암모니아 제어 방법.

(5) 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 외부 장착 암모니아 센서에 접속되고,

상기 제어부에 있어서 실행되는,

상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로서 입력하는 교정용 신호 입력 스텝

을 추가로 포함하는, 상기 암모니아 제어 방법.

(6) 목적 물질의 생산능을 갖는 미생물을 배양액을 함유하는 배양조 중에서 배양하고, 배양물로부터 목적 물질을 채취하는 것을 포함하는, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법으로서, 상기의 암모니아 제어 방법에 의해 상기 배양액 중의 암모니아 농도를 제어하면서 배양하는, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(7) 상기 목적 물질이, L-아미노산, 유기산, 핵산, 알코올 또는 단백질인, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(8) 상기 목적 물질이, L-리신, L-아르기닌, L-히스티딘으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 염기성 아미노산인, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(9) 전(全) 배양 공정 중 적어도 일부의 기간 동안, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 조정함으로써, 상기 염기성 아미노산의 카운터 이온으로서 사용하는 황산 이온, 및/또는 염화물 이온의 사용량을 삭감하는 것을 포함하는, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(10) 상기 일정 농도의 범위가, 300mM 이하인, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(11) 상기 일정 농도의 범위가, 200mM 이하인, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(12) 상기 일정 농도의 범위가, 100mM 이하인, 상기 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.

(13) 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 암모니아 센서와, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치로서,

상기 암모니아 센서는, 당해 배양조 내의 배양액 중의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서이며,

상기 제어부는, 상기 암모니아 공급기 및 상기 암모니아 센서에 접속되고,

상기 제어부는,

상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하고,

상기 암모니아 센서로부터의 신호를 상기 검량선에 대입함으로써, 상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하고,

산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 장치.

(14) 상기 배양조 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 센서에 추가로 접속되고,

상기 제어부는, 또한,

상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도 및 해리형 암모니아 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 상기 비이온화 암모니아 농도 산출 수단에 의해 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 상기 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하고,

상기 비해리형 암모늄 농도 대신 상기 총 암모니아 농도를 사용하는 것을 특징으로 하는, 상기 암모니아 제어 장치.

(15) 상기 제어부는, 또한,

교정용 신호로부터 상기 검량선에 기초하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 상기 총 암모니아 농도 계산 수단에 의해 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정하고,

상기 교정용 신호는,

상기 배양조 외부에 설치된 외부 장착 암모니아 센서로서, 비해리형의 암모니아 농도를 측정하는 암모니아 센서를 준비하고,

상기 배양조에서 채취한 후, 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되도록 하기에 충분하게 알칼리성으로 되게 한 배양액의 비해리형의 암모니아 농도를 상기 외부 장착 암모니아 센서로 측정했을 때의, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터 취득된 신호인 것을 특징으로 하는, 상기 암모니아 제어 장치.

(16) 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 외부 장착 암모니아 센서에 접속되고,

상기 제어부는, 또한,

상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정 신호로서 입력하는, 상기 암모니아 제어 장치.

(17) 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 유지하도록 구성되는, 상기 암모니아 제어 장치.

(18) 유저 인터페이스(user interface)를 추가로 구비하는, 상기 암모니아 제어 장치.

(19) 배양액 중의 암모니아를 리얼 타임(real-time), 바람직하게는 in situ 리얼 타임으로 제어하도록 구성되는, 상기 암모니아의 제어 장치.

(20) 1개 이상의 배양조, 바람직하게는 1 내지 10개의 배양조의 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되는, 상기 암모니아 제어 장치.

(21) 5분 이내, 바람직하게는 1초 이내의 간격으로, 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되는, 상기 암모니아 제어 장치.

(22) 12시간 이내, 바람직하게는 8시간 이내의 간격으로, 검량선을 교정하도록 구성되는, 상기 암모니아 제어 장치.

(23) 배양 기간의 적어도 일부 또는 전체에 있어서 암모니아를 제어하도록 구성되는, 상기 암모니아 제어 장치.

(24) 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양액을 함유하는 발효조 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 상기 목적 물질을 생성, 축적시키는, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법으로서, 상기의 암모니아 제어 장치를 사용하여, 전 배양 공정 중 적어도 일부의 기간 동안, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 조정하는 것을 포함하는, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.

(25) 상기 일정 농도의 범위가, 300mM 이하인 상기 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.

(26) 상기 일정 농도의 범위가, 200mM 이하인 상기의 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.

(27) 상기 일정 농도의 범위가, 100mM 이하인 상기의 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.

본 발명에 의하면, 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서의 신호(예를 들면, 전압)의 관계를 나타내는 검량선을 작성하고, 암모니아 센서의 신호로부터 검량선에 기초하여 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하고, 산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하기 때문에, 배양조 내에서 일련의 측정 작업을 무균적으로 실시하는 것이 가능해지고, 또한, 배양액을 낭비하지 않고, 배양액 중의 암모니아 농도를 연속적으로 임의로 컨트롤하면서 배양할 수 있다는 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 일 실시형태에 의하면, 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하고, pH 센서에 의해 배양조 내의 pH 값을 측정하고, 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 측정된 pH 값으로부터, 기억부에 기억된 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 총 암모니아 농도를 산출하고, 산출된 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하기 때문에, pH 값과 비이온화 암모니아(NH₃) 농도로부터 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 직접 배양액 중의 총 암모니아 농도(NH₃와 NH₄ ⁺의 합계 농도)를 측정할 수 있으며, 이것에 의해, 한층 정확하게 암모니아 농도를 컨트롤하면서 배양할 수 있다는 효과를 나타낸다.

또한, 이 발명에 의하면, 상기 배양조에서 채취하고 강알칼리 반응액에 현탁하여 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되게 한 배양액의 총 암모니아 농도를 외부의 일반적인 암모니아 측정기를 이용하여 조사하고, 그 값을 상기 암모니아 해리식에 대입하고, 상기 pH 값 측정 스텝에서 기억된 배양액 중의 pH 값을 사용하여 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하고, 이것을 가지고 비이온화 암모니아 농도와 센서 출력(전압)의 관계식을 나타내는 검량선을 교정하는 것이 가능하며, 배양 중에 발생하는 오차를 수정할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 암모니아 농도 제어 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트이다.
도 1b는 본 발명의 암모니아 농도 제어 처리의 다른 일례를 도시하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 기본 구성을 도시하는 원리 구성도이다.
도 3은 본 발명에 사용되는 암모니아 해리 곡선의 일례를 도시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명이 적용되는 본 암모니아 제어 장치(100)의 구성의 일례를 도시하는 논리 블록도이다.
도 5는 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 기본 동작 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트이다.
도 6은 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 처리의 일례를 상세하게 도시하는 플로우챠트이다.
도 7은 실시예의 장치를 사용한 아르기닌(Arg) 생산에 있어서의 암모니아 농도의 제어 결과를 도시한다.
도 8은 실시예의 장치를 사용한 Arg 생산에 있어서의 Arg 축적을 도시한다.
도 9는 종래의 암모니아 농도 제어 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트이다.

이하에, 본 발명에 따르는 암모니아 제어 장치 및 암모니아 제어 방법의 실시형태를 도면에 기초하여 상세하게 설명한다. 또한, 이 실시형태에 의해 이 발명이 한정되는 것은 아니다.

[본 발명의 개요]

이하, 본 발명의 개요에 관해서, 도 1a, 도 1b, 도 2 및 도 3을 참조하여 설명하고, 그 후, 본 발명의 구성 및 처리 등에 관해서 상세하게 설명한다. 여기서, 도 1a는 본 발명의 암모니아 농도 제어 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트이고, 도 1b는 본 발명의 암모니아 농도 제어 처리의 다른 예를 도시하는 플로우챠트이고, 도 2는 본 발명 장치의 기본 구성을 도시하는 원리 구성도이고, 도 3은 본 발명에 사용되는 암모니아 해리 곡선의 일례를 도시하는 그래프이다.

본 발명의 방법은, 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액 중의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서와, 당해 암모니아 공급기 및 당해 암모니아 센서에 접속된, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치를 사용하여 당해 배양조 내의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법이다. 본 발명의 방법은, 도 1a에 도시하는 바와 같이, 배양조 내의 배양액 중의 비이온화 암모니아에 응답하는 암모니아 센서로부터의 신호의 입력에 기초하여, 암모니아 제어 장치에 의한 처리를 실시하여, 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기에 지시 출력하는 것을 포함한다. 「접속」은 기능적으로 접속되어 있으면 좋으며, 유선 및 무선 중 어느 것에 의한 것이라도 좋다.

본 발명의 방법은,

제어부에 있어서 실행되는,

암모니아 센서로부터의 신호를, 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선에 대입하여, 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝과,

산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 스텝

을 포함한다.

배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 스텝을 추가로 포함해도 좋다. 검량선은, 알려진 농도의 암모니아 용액을 준비하고, 그 용액에 전극을 침지하여 전극이 나타내는 전압을 플롯함으로써 검량선을 작성할 수 있다.

검량선 작성 스텝에서는, 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다. 작성에는, 암모니아 제어 장치에 제공된 기억부로부터 검량선을 판독하는 것이나, 외부로부터 입력하는 것도 포함된다.

암모니아 센서는 비해리형의 암모니아에 응답하는 것이며, 통상적으로는, 암모니아 선택막과 내부 전극으로 이루어진 센서이다. 암모니아 센서로부터의 신호는, 비이온화 암모니아에 응답하여 발생하는 신호이면 특별히 제한되지 않으며, 통상적으로는, 내부 전극의 전압이 사용되지만, 전기 회로에 의해 다른 전기 특성으로 변환해도 좋다. 또한, 전압 등의 전기 특성을 아날로그 신호 그대로 사용해도 좋고, 아날로그-디지털 변환에 의해 수치화된 신호로서 사용해도 좋다.

이러한 신호와, 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도의 관계를 미리 조사함으로써 검량선을 작성할 수 있다. 이와 같이 작성한 검량선을 기억부에 기억시킬 수 있다. 기억의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 테이블 형식으로 기억해도 좋고, 검량선을 연산식으로 나타내어, 그 연산식을 기억해도 좋다.

비이온화 암모니아 농도 산출 스텝에서는, 암모니아 센서로부터의 신호를 검량선에 대입하여, 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출한다. 검량선에 대입하는 것에 의한 산출은, 테이블 형식으로 기억한 경우에는, 대입하는 신호의 값에 대응하는 위치에 기록된 수치를 판독함으로써, 연산식을 기억한 경우에는, 입력된 신호의 값을 연산식에 대입하여 연산함으로써, 실시할 수 있다.

암모니아 공급 지시 스텝에서는, 산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시한다.

암모니아 공급기는, 암모니아 공급 지시 스텝으로부터의 지시에 기초하여 배양조로의 암모니아의 공급을 제어할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 암모니아 공급 지시 스텝으로부터 지시에 의해, 암모니아 가스 라인의 전자 밸브를 해방하여 암모니아를 첨가하도록 구성된다.

암모니아는 가스라도 좋고, 수용액이라도 좋다. 또한, 황산암모늄 등의, 용해되었을 때에 암모니아 이온을 발생하는 화합물의 수용액이라도 좋다. 암모니아 공급기에 의한 암모니아 공급 속도는, 배양조의 크기와 암모니아 공급 지시 스텝으로부터의 지시 빈도 등을 고려하여, 암모니아 농도가 급격히 변화되지 않도록 선택된다. 총 암모니아 농도는, 통상적으로는, 암모니아 환산으로 배양액당 1mM 내지 350mM, 더욱 바람직하게는 2.5mM 내지 300mM, 더욱 바람직하게는 2.5mM 내지 200mM, 더욱 바람직하게는 3 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 3 내지 50mM의 범위에서 제어된다.

지시의 형태는, 암모니아 공급기에 있어서의 암모니아 공급의 제어에 관계하는 밸브 등의 수단을 직접적으로 작동시키는 전기 신호의 출력이라도 좋고, 암모니아 공급기가 통신 기능을 갖는 경우에는, 그 통신 기능에 의해 밸브 등의 수단을 제어하는 통신 신호의 출력이면 된다.

본 발명의 암모니아 제어 장치는, 배양조 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 센서에 추가로 접속되어 있어도 좋다. 이 형태에서는, 본 발명 방법은, 제어부에 있어서 실행되는,

배양액 중의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝에 의해 산출된 상기 비이온화 암모니아 농도 및 상기 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 산출하는 총 암모니아 농도 계산 스텝

을 추가로 포함하고,

암모니아 공급 지시 스텝에 있어서, 비이온화 암모니아 농도 대신에 상기 총 암모니아 농도가 사용된다.

배양액 중의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율의 관계는, 이론적으로 계산한 것이라도 좋고, 실측한 것이라도 좋다. 이 관계에 기초하여 해리 곡선을 작성할 수 있다.

이와 같이 작성한 해리 곡선을 기억부에 기억한다. 기억의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 이차원 테이블 형식으로 기억해도 좋고, 해리 곡선을 연산식으로 나타내고, 그 연산식을 기억해도 좋다. 또한, 검량선 기억 스텝에서 기억되는 검량선과 조합하여, 테이블 형식으로 기억해도 좋고, 동 검량선과 함께 연산식을 작성하여, 그 연산식을 기억해도 좋다.

도 3을 참조하여, 암모니아 해리 곡선에 관해서 설명한다. 도 3에 있어서, 세로축은 배양조 내의 비이온화 암모니아(NH₃) 및 암모늄 이온(NH₄ ⁺)의 존재율(%)을 나타내고, 가로축은 배양조 내의 pH 값을 나타낸다. 그리고, 도 3의 그래프 내의 곡선은, 각각 비이온화 암모니아(NH₃) 및 암모늄 이온(NH₄ ⁺)의 각 pH에 있어서의 해리 곡선을 나타내고 있다. 도 3에 도시하는 바와 같이, 비이온화 암모니아(NH₃) 및 암모늄 이온(NH₄ ⁺)이 거의 균등하게 존재하는 것은 pH 9 부근이며, pH 값이 높을수록 비이온화 암모니아(NH₃)는 증가하고, 한편, 암모늄 이온(NH₄ ⁺)은 감소된다. 비이온화 암모니아 및 암모늄 이온은, 각각 비해리형 암모니아(NH₃) 및 해리형 암모니아(NH₄ ⁺)와 동의어이다.

상기한 바와 같이, 일반적인 발효에 있어서, 배양액의 pH는, 약산성에서부터 약알칼리성(pH 5 내지 9 정도)이며, 배양액 중에 존재하는 대부분의 암모니아의 암모늄 이온(NH₄ ⁺)으로서 존재하고 있기 때문에, 종래에는, 비이온화 암모니아(NH₃)의 농도 측정만으로는, 직접 배양액 중의 총 암모니아 농도(NH₃와 NH₄ ⁺의 합계 농도)를 측정하는 것은 불가능했지만, 본 발명에 있어서는, 전처리로서, 사용하는 배양액 중의 암모니아 해리 곡선을 미리 작성해 둠으로써, 당해 암모니아 해리 곡선에 기초하여 비이온화 암모니아(NH₃) 농도로부터 총 암모니아 농도(NH₃와 NH₄ ⁺의 합계 농도)를 계산할 수 있다.

총 암모니아 농도 계산 스텝에서는, 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝에 의해 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 총 암모니아 농도를 산출한다. 비이온화 암모니아 농도 및 pH 값으로부터의 해리 곡선에 기초하는 산출은, 테이블 형식으로 기억한 경우에는, 입력된 비이온화 암모니아 농도 및 pH의 값에 대응하는 어드레스에 기록된 수치를 판독함으로써, 연산식을 기억한 경우에는, 입력된 값을 연산식에 대입하여 연산함으로써, 실시할 수 있다.

총 암모니아 농도 계산의 일례에 관해서, 이하 (1) 내지 (3)에 예시한다.

(1) 우선, 배양조 내의 암모니아 센서의 전압(예를 들면, 0.5V)을, 검량선을 나타내는 연산식에 대입하여, 비이온화 암모니아 농도(예를 들면, 30mM)를 산출한다.

(2) 그리고, pH 센서로 측정된 배양조 내의 pH 값(예를 들면, pH 6)을, 암모니아 해리 곡선을 나타내는 연산식에 대입하여, 비이온화 암모니아의 존재율(예를 들면, 40%)을 추정한다.

(3) 추정된 비이온화 암모니아의 존재율(예를 들면, 40%)과, (1)에서 산출한 비이온화 암모니아 농도(예를 들면, 30mM)로부터, 예를 들면,「30mM* (100/40)=75mM」과 같이 계산함으로써, 총 암모니아 농도(이 경우, 75mM)를 산출한다.

암모니아 공급 지시 스텝에서는, 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시한다. 또는, 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기에 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시해도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 배양조 외부에 설치된 외부 장착 암모니아 센서에 추가로 접속되어 있어도 좋고, 당해 외부 장착 암모니아 센서에 의해, 미리 배양조로부터 채취하고 강알칼리 반응액에 현탁하여 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되게 한 배양액으로부터, 외부 장착 암모니아 센서의 전압을 측정하고, 측정된 전압을 작성된 검량선에 대입하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정해도 좋다.

배양조 내의 배양액의 pH의 실측값을 이용하여, 암모니아 해리 곡선에 기초하여 총 암모니아 농도를 자동 계산하는 기능은 교정할 때에만 사용하고, 실제 배양조 내의 암모니아 농도의 제어는, 비이온화 암모니아(NH₃) 농도에 기초하여 제어해도 좋다.

또한, 본 발명에 있어서는, 교정을 실시할 때에는, 배양액을 샘플링하여, 강알칼리 반응액(예를 들면, NaOH)에 현탁하고, 당해 배양액 중의 암모니아를 비이온화 암모니아로 되게 한 후, 외부 장착 암모니아 센서로 측정한 전압을 검량선에 대입하여 산출한 비이온화 암모니아 농도가, 총 암모니아 농도 계산으로 계산된 총 암모니아 농도와 일치하도록, 검량선을 교정할 수 있다.

본 발명 장치는, 개략적으로, 이하의 기본적 특징을 가진다. 즉, 본 발명 장치는, 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서와, 당해 암모니아 공급기 및 당해 암모니아 센서에 접속된 제어부를 적어도 구비하여 구성된다. 암모니아 공급기는, 배양조에 암모니아를 공급하기에 적합한 것이면 좋다. 암모니아 센서는, 배양조 내의 배양액의 비해리형의 암모니아에 응답하기에 적합한 것이면 좋다. 본 발명의 암모니아 제어 장치는, 도 2에 도시하는 바와 같이, 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서에 접속되어, 기억부 및 제어부를 적어도 구비하여 구성될 수 있다. 「접속」은 기능적으로 접속되어 있으면 좋고, 유선 및 무선 중 어느 것에 의한 것이라도 좋다.

상기 제어부는,

상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 수단과,

상기 암모니아 센서로부터의 신호를 상기 검량선에 기초하여, 상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 수단과,

상기 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 수단

을 구비한다.

상기 제어부는,

미리 작성한 검량선을 저장하도록 구성한 보존부, 또는, 상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하도록 구성한 검량선 작성 수단과,

상기 암모니아 센서로부터의 신호를 상기 검량선에 기초하여, 상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하도록 구성한 비이온화 암모니아 농도 산출 수단과,

상기 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아 공급을 지시하도록 구성한 암모니아 공급 지시 수단

을 구비해도 좋다.

본 발명 장치는, 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 비이온화 암모니아 농도 산출 수단에 의해 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하는 총 암모니아 농도 계산 수단을 구비해도 좋다.

총 암모니아 농도 계산 수단은, 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 비이온화 암모니아 농도 산출 수단에 의해 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하도록 구성한 총 암모니아 농도 계산 수단이면 좋다.

이러한 수단의 구성 요소에 관해서는, 본 발명 방법에 있어서의 스텝에 관해 설명한 것과 마찬가지이다.

상기 제어부는, 또한,

교정용 신호로부터 상기 검량선에 기초하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 상기 총 암모니아 농도 계산 수단에 의해 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정하도록 구성된 교정 수단을 구비하고,

상기 교정 수단은, 교정용 신호를 사용하도록 구성되고, 상기 교정용 신호는,

상기 배양조 외부에 설치된 외부 장착의, 비해리형의 암모니아 농도를 측정하는 암모니아 센서에 의해 얻어지는 신호로서,

상기 배양조로부터 채취한 후, 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되도록 하기에 충분하게 알칼리성으로 되게 한 배양액의 비해리형의 암모니아 농도를 측정했을 때의, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터 취득된 신호라도 좋다.

상기 제어부는, 또한, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로서 입력하기에 적합한 것이면 좋다.

암모니아 제어 장치는, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 유지하도록 구성되어도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 유저 인터페이스를 추가로 구비해도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 배양액 중의 암모니아를 리얼 타임, 바람직하게는 in situ 리얼 타임으로 제어하도록 구성되어도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 1개 이상의 배양조, 바람직하게는 1 내지 10개의 배양조의 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되어도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 5분 이내, 바람직하게는 1초 이내의 간격으로, 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되어도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 12시간 이내, 바람직하게는 8시간 이내의 간격으로, 검량선을 교정하도록 구성되어도 좋다.

암모니아 제어 장치는, 배양 기간의 적어도 일부 또는 전체에 있어서 암모니아를 제어하도록 구성되어도 좋다.

본 발명에 있어서 리얼 타임 및 in situ 리얼 타임은, 정해진 시간 내에 암모니아의 농도를 제어하는 것, 즉 배양조 내의 암모니아 농도를 측정하고, 설정 시간 내에 배지에 암모니아를 공급하는 것을 의미한다. 예를 들면, 암모니아를 측정하는 시간은 5분 이내, 3분 이내, 1분 이내, 30초 이내의 간격으로 측정하도록 구성하면 좋다. 또한 암모니아를 배지 중에 공급하는 시간은 1분 이내, 30초 이내, 10초 이내, 5초 이내 또는 1초 이내로 공급하도록 구성해도 좋다.

제어 전체의 시간으로서는, 5분 이내, 3분 이내, 1분 이내, 30초 이내, 또는 1초 이내의 간격으로 제어하도록 구성하면 좋다.

이러한 시간과 간격은, 배양조 내의 배양액으로 배양 중에 발생할 수 있는 비이온화 암모니아 농도 또는 총 암모니아 농도의 변화율에 따라 선택하면 좋고, 예를 들면, 배양 중의 배양액의 비이온화 암모니아 농도의 변화가 측정 간격 내에 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 또는 0.1mM 이하가 되도록 해도 좋고, 배양 중의 배양액의 총 암모니아 농도의 변화가 측정 간격 내에서 80mM 이하, 20mM 이하, 또는 10mM 이하가 되도록 해도 좋다.

다음에, 암모니아 제어 장치의 구성예에 관해서 설명한다.

[암모니아 제어 장치(100)의 구성]

도 4는, 본 발명이 적용되는 본 암모니아 제어 장치(100)의 구성의 일례를 도시하는 논리 블록도이고, 당해 구성 중 본 발명에 관계하는 부분만을 개념적으로 도시하고 있다.

본 암모니아 제어 장치(100)는, 도 4에 도시하는 바와 같이, 배양조(200)와, 당해 배양조(200)에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기(300)와, 당해 배양조(200) 내에 삽입되어 출전압(出電壓)을 측정하는 암모니아 센서(10)와, 당해 배양조(200) 내에 삽입되어 pH 값을 측정하는 pH 센서(20)에 접속된다. 또한, 이 암모니아 제어 장치(100)는, 암모니아 제어 장치(100) 전체를 통괄적으로 제어하는 CPU 등의 제어부(102), 암모니아 공급기(300) 등에 접속되는 제어 출력부(104), 암모니아 센서(10)와 외부 장착 암모니아 센서(12)와 pH 센서(20)에 접속되는 신호 입력부(108) 및 각종 데이터 베이스나 테이블 등을 저장하는 기억부(106)를 구비하여 구성되어 있으며, 이들 각 부는 임의의 통신로를 개재하여 통신 가능하게 접속되어 있다.

도 4에 있어서, 암모니아 공급기(300)는, 암모니아를 내부에 포함하는 암모니아 탱크(30)와, 당해 암모니아 탱크(30)로부터 공급되는 암모니아량을 조절하는 밸브(32)와, 당해 밸브(32)의 개폐를 조작하는 스위치(31)를 적어도 구비하여 구성된다. 이 암모니아 공급기(300)는, 암모니아 제어 장치(100)로부터의 지시에 따라, 배양조(200) 내에 암모니아를 공급하는 기능을 가진다.

도 4에 있어서, 배양조(200)는, 배양액을 내부에 포함하고, 당해 배양조(200) 내에 삽입된 암모니아 센서(10) 및 pH 센서(20)를 개재하여 암모니아 제어 장치(100)와 접속된다. 또한, 배양조(200)는, 암모니아 탱크(30)로부터 암모니아를 공급하는 파이프 등을 개재하여 암모니아 공급기(300)와 접속된다. 또한, 배양조(200)는, 도 4에 있어서, 외부 장착 암모니아 센서(12)가 내부에 삽입된 샘플링용 비이커 등에, 배양액의 샘플 채취용의 파이프 등을 개재하여 접속되는 형태를 일례로 도시하고 있지만, 반드시 접속되어 있지 않아도 되며, 이용자가 배양조(200)로부터 샘플을 추출하고, 그 샘플이 옮겨진 비이커 등에 대해, 외부 장착 암모니아 센서(12)를 사용하는 구성이라도 좋다.

도 4에 있어서, 암모니아 제어 장치(100)의 기억부(106)에 저장되는 각종 데이터 베이스나 테이블이나 파일(암모니아 해리 곡선 파일(106a) 내지 총 암모니아 농도 파일(106e))은, 고정 디스크 장치 등의 스토리지(storage) 수단이며, 각종 처리에 사용하는 각종 프로그램이나 테이블이나 파일이나 데이터 베이스 등을 저장한다.

이러한 기억부(106)의 각 구성 요소 중, 암모니아 해리 곡선 파일(106a)은, 제어부(102)의 처리에 의해 작성된, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선을 기억하는 암모니아 해리 곡선 기억 수단이다.

또한, 검량선 파일(106b)은, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서(10)의 전압과의 관계를 나타내는 검량선을 작성하고 기억하는 검량선 기억 수단이다.

또한, 비이온화 암모니아 농도 파일(106c)은, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해, 당해 암모니아 센서(10)의 전압을 측정하고, 당해 전압을 검량선에 대입함으로써, 암모니아 센서(10)로 측정된, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도를 기억하는 비이온화 암모니아 농도 기억 수단이다.

또한, pH 값 파일(106d)은, pH 값 측정부(102c)에 의해, pH 센서(20)로 측정된, 배양조(200) 내의 배양액의 pH 값을 기억하는 pH 값 기억 수단이다.

또한, 총 암모니아 농도 파일(106e)은, 총 암모니아 농도 계산부(102d)가, 비이온화 암모니아 농도(106c)에 기억된 비이온화 암모니아 농도 및 pH 값 파일(106d)에 기억된 pH 값으로부터, 암모니아 해리 곡선(106a)에 기억된 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 배양조(200) 내의 총 암모니아 농도를 계산한 당해 총 암모니아 농도를 기억하는 총 암모니아 농도 기억 수단이다.

또한, 도 4에 있어서, 제어 출력부(104)는, 암모니아 제어 장치(100)와 암모니아 공급기(300) 사이에 있어서의 통신 제어를 실시한다. 즉, 제어 출력부(104)는, 암모니아 제어 장치(100)가 지시한 암모니아량을 암모니아 공급기(300)가 배양조(200)로 공급하도록, 암모니아 공급기(200)의 스위치(31)를 제어하여 밸브(32)의 개폐를 조절하는 신호를 통신하는 통신 기능을 가진다.

또한, 도 4에 있어서, 신호 입력부(108)는, 암모니아 센서(10)와 외부 장착 암모니아 센서(12)와 pH 센서(20)의 제어를 실시한다. 여기에서, 암모니아 센서(10)는, 배양조(200) 내의 배양액 중에 함유되는 암모니아 중 비이온화 암모니아(NH₃) 농도를 측정하는 센서이며, 예를 들면, 이온 전극 등으로 구성된다. 또한, 암모니아 센서(10)는, 배양조(200) 내에서 측정된 비이온화 암모니아(NH₃) 농도를 나타내는 신호를 증폭시켜 신호 입력부(108)로 전송하는 NH₃ 앰프(11)에 접속되어 구성되어도 좋다. 또한, 외부 장착 암모니아 센서(12) 및 NH₃ 앰프(13)에 대한 설명은 동일하기 때문에 생략한다. 또한, pH 센서(20)는, 배양조(200) 내의 배양액 중의 pH 값을 측정하는 센서이며, 예를 들면, pH 전극 등으로 구성된다. 또한, 이 pH 센서(20)는, 배양조(200) 내에서 측정된 pH 값을 나타내는 신호를 증폭시켜 신호 입력부(108)로 송신하는 pH 앰프(21)에 접속되어 구성되어도 좋다.

또한, 도 4에 있어서, 제어부(102)는, OS(Operating System) 등의 제어 프로그램, 각종 처리 수순 등을 규정한 프로그램, 및 소요 데이터를 저장하기 위한 내부 메모리를 가지며, 이러한 프로그램 등에 의해, 다양한 처리를 실행하기 위한 정보 처리를 실시한다. 제어부(102)는, 기능 개념적으로, 검량선 작성부(102a), 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b), pH 값 측정부(102c), 총 암모니아 농도 계산부(102d), 암모니아 공급 지시부(102e), 교정용 전압 측정부(102f), 및 교정부(102g)를 구비하여 구성되어 있다.

이 중, 검량선 작성부(102a)는, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서(10)의 전압과의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 수단이다.

또한, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 암모니아 센서(10)의 전압을 검량선에 대입함으로써, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 수단이다.

또한, pH 값 측정부(102c)는, pH 센서(20)로 배양조(200) 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 값 측정 수단이다.

또한, 총 암모니아 농도 계산부(102d)는, 비이온화 암모니아 파일(106c)에 기억된 비이온화 암모니아 농도 및 pH 값 파일(106d)에 기억된 pH 값으로부터, 암모니아 해리 곡선 파일(106a)에 기억된 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 배양조(200) 내의 총 암모니아 농도를 계산하는 총 암모니아 농도 계산 수단이다.

또한, 암모니아 공급 지시부(102e)는, 비해리 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해 계산된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기(300)에 배양조(200) 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 수단이다. 또한, 암모니아 공급 지시부(102e)는, 총 암모니아 농도 계산부(102d)에 의해 계산된 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기(300)에 배양조(200) 내로 암모니아를 공급하도록 지시해도 좋다.

또한, 교정용 전압 측정부(102f)는, 미리 배양조(200)로부터 채취하고 강알칼리 반응액(예를 들면, NaOH)에 현탁하여 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되게 한 배양액으로부터, 외부 장착 암모니아 센서(12)의 전압을 측정하는 교정용 전압 측정 수단이다.

또한, 교정부(102g)는, 교정용 전압 측정부(102f)에 의해 측정된 전압을, 검량선 파일(106b)에 기억된 검량선에 대입하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 총 암모니아 농도 계산으로 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정하는 교정 수단이다.

[암모니아 제어 장치(100)의 처리]

다음에, 이와 같이 구성된 본 암모니아 제어 장치(100)의 처리의 일례에 관해서, 이하에 도 5 및 도 6을 참조하여 상세하게 설명한다. 여기서, 도 5는, 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 기본 동작 처리의 일례를 도시하는 플로우챠트이고, 도 6은 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 처리의 일례를 상세하게 도시하는 플로우챠트이다.

[기본 동작 처리]

우선, 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 기본 동작 처리의 일례에 관해서, 도 5를 참조하여 설명한다.

(전처리)

도 5에 도시하는 바와 같이, 전처리로서, 제어부(102)는, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선(도 3 참조)을 작성하고 암모니아 해리 곡선 파일(106a)에 저장해도 좋다(스텝 SB-1). 즉, 제어부(102)는, 암모니아 해리 상수에 기초하여 각 pH에 있어서의 비이온화 암모니아 및 암모늄 이온의 존재율을 산출하고, 산출한 각 값을 그래프에 플롯함으로써, 암모니아 해리 곡선을 작성해도 좋다.

(본 처리)

그리고, 검량선 작성부(102a)는, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서(10)의 전압의 관계를 나타내는 검량선을 작성한다(스텝 SB-2).

그리고, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 암모니아 센서(10)의 전압을 검량선에 대입함으로써, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출한다(스텝 SB-3). 그 후, 스텝 SB-6의 처리로 진행된다.

여기서, 스텝 SB-3에서, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)의 처리에 의해, 비이온화 암모니아 농도를 산출한 후, 스텝 SB-4 내지 스텝 SB-5의 처리를 실시해도 좋다.

여기에서, pH 값 측정부(102c)는, pH 센서(20)로 배양조(200) 내의 배양액의 pH 값을 측정해도 좋다(스텝 SB-4). 또한, 총 암모니아 농도 계산부(102d)는, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해 산출된 비이온화 암모니아 농도, 및 pH 값 측정부(102c)에 의해 측정된 pH 값으로부터, 암모니아 해리 곡선 파일(106a)에 기억된 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 총 암모니아 농도를 계산해도 좋다(스텝 SB-5).

그리고, 제어부(102)는 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해 측정된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는지 여부를 판단한다(스텝 SB-6). 여기서, 제어부(102)는 총 암모니아 측정부(102d)에 의해 측정된 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는지 여부를 판단해도 좋다(스텝 SB-6).

그리고, 제어부(102)가, 스텝 SB-3에서 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해 측정된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 것으로 판단한 경우(스텝 SB-6: Yes), 암모니아 공급 지시부(102e)는, 암모니아 공급기(300)에 배양조(200) 내로 암모니아를 공급하도록 지시한다(스텝 SB-7). 여기서, 제어부(102)가, 총 암모니아 측정부(102d)에 의해 측정된 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 것으로 판단한 경우(스텝 SB-6: Yes), 암모니아 공급 지시부(102e)는, 암모니아 공급기(300)에 배양조(200) 내로 암모니아를 공급하도록 지시해도 좋다(스텝 SB-7).

한편, 제어부(102)가, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)에 의해 측정된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도 이상인 것으로 판단한 경우(스텝 SB-6: No), 스텝 SB-3의 처리로 되돌아간다.

또한, 제어부(102)가, 총 암모니아 측정부(102d)에 의해 측정된 총 암모니아 농도가 소정의 농도 이상인 것으로 판단한 경우(스텝 SB-6: No), 스텝 SB-8 내지 스텝 SB-10의 처리를 실시해도 좋다.

여기서, 제어부(102)는, 스텝 SB-2에서 작성된 검량선을 교정할지 여부를 판단해도 좋다(스텝 SB-8). 또한, 도 5에 있어서, 암모니아 공급 지시(스텝 SB-6)의 후에 보정 처리의 개시를 판단하는 일례에 관해서 도시했지만, 이용자의 입력에 따라 수시로 실시되어도 좋고, 미리 설정된 주기마다 자동으로 실시되어도 좋다.

또한, 제어부(102)가 교정한다고 판단한 경우(스텝 SB-8: Yes), 교정용 전압 측정부(102f)는, 미리 배양조(200)로부터 채취하고 강알칼리 반응액(예를 들면, NaOH)에 현탁하여 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되게 한 배양액에 관해서, 외부 장착 암모니아 센서(12)의 전압을 측정해도 좋다(스텝 SB-9).

또한, 교정부(102g)는, 교정용 전압 측정부(102f)에 의해 측정된 전압을, 검량선 파일(106b)에 기억된 검량선에 대입하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 총 암모니아 농도 계산으로 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정해도 좋다(스텝 SB-10).

한편, 제어부(102)가 교정되지 않는다고 판단한 경우(스텝 SB-8: No) 스텝 SB-3의 처리로 되돌아간다.

이 기본 동작 처리(스텝 SB-2 내지 스텝 SB-10)는, 배양 중에 반복하여 실시된다. 이것에 의해, 배양조(200) 내의 암모니아 농도를 제어하여, 배양액 중의 암모니아 농도를 연속적으로 임의로 컨트롤하면서 배양할 수 있다. 이상으로, 본 암모니아 제어 장치(100)의 기본 동작 처리에 대한 설명을 끝낸다.

[암모니아 제어 처리의 상세]

이어서, 본 실시형태에 있어서의 본 암모니아 제어 장치(100)의 처리의 일례의 상세에 관해서, 도 6을 참조하여 설명한다.

도 6에 도시하는 바와 같이, 제어부(102)는, 작성된 암모니아 해리 곡선 및/또는, 계산된 총 암모니아 농도를 교정할지 여부를 판단한다(스텝 SC-1). 이 스텝 SC-1의 처리 내용은, 도 5의 스텝 SB-7의 내용과 같다. 또한, 상기한 바와 같이, 이 교정 처리의 개시는 이용자의 입력에 따라 수시로 실시되어도 좋고, 미리 설정된 주기마다 자동으로 실시되어도 좋다.

그리고, 제어부(102)가 교정한다고 판단한 경우(스텝 SC-1: Yes), 배양조(200) 내의 배양액에 관한 검량선을 작성한다(스텝 SC-2).

여기에서,「검량선」은, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서(10)의 전압의 관계를 나타내는 관계식이며, 본 실시형태에서는, 후술하는 스텝 SC-7 및 SC-10에 있어서, 암모니아 센서(10)가 측정한 전압을 이 검량선에 대입함으로써, 비이온화 암모니아 농도(C)를 측정하기 위해 사용된다.

한편, 제어부(102)가 교정하지 않는다고 판단한 경우(스텝 SC-1: No), 스텝 SC-3의 처리로 진행된다.

그리고, 제어부(102)는 배양조(200)에 대한 제어 파라미터를 변경할지 여부를 판단한다(스텝 SC-3).

여기서, 제어 파라미터는, 예를 들면, SV(Set Value)값, TC(Time Cycle)값, ON(On Time)값 등이다. 여기서, SV값은, 제어하는 총 암모니아 농도, 또는 비해리형의 암모니아 농도(mM)의 설정값이다. 또한, TC값은, 암모니아 공급을 판단하는 사이클(초)을 나타낸다. 또한, ON값은 1 사이클 내에 암모니아 공급을 실시하는 시간(초)을 나타낸다. 구체적으로는, 제어 파라미터를, 예를 들면, SV값: 50mM, TC값: 10sec, ON값: 1sec로 설정한 경우, 10초에 한번 암모니아 공급 여부를 판단하고, 암모니아의 실측값이 50mM보다도 높으면 공급하지 않는다. 즉, 암모니아 가스의 인렛의 전자 밸브가 계속 닫힌 상태가 된다. 또한, 실측값이 50mM을 하회한 경우에는, 1초간 암모니아를 공급한다. 즉, 전자 밸브가 열리게 된다.

그리고, 제어부(102)는, 제어 파라미터를 변경하는 것으로 판단한 경우(스텝 SC-3: Yes), 제어 파라미터를 입력한다(스텝 SC-4).

한편, 제어부(102)가 제어 파라미터를 변경하지 않는다고 판단한 경우(스텝 SC-3: No), 스텝 SC-5의 처리로 진행된다.

그리고, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 배양조(200) 내에 삽입된 암모니아 센서(10)(예를 들면, 이온 전극)의 전압(A)을 입수한다(스텝 SC-5). 즉, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 암모니아 센서(10)의 전압을 측정한다.

그리고, pH 값 측정부(102c)는, 배양조(200) 내에 삽입된 pH 센서(20)의 pH 전극으로부터 pH 값(B)을 입수한다(스텝 SC-6). 즉, pH 값 측정부(102c)는, pH 센서(20)로, 배양조(200) 내의 배양액의 pH 값(B)을 측정한다.

그리고, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 스텝 SC-2에서 작성된 검량선에, 스텝 SC-5에서 입수한 전압(A)을 대입하고, 비이온화 암모니아 농도(C)를 산출한다(스텝 SC-7). 즉, 비이온화 암모니아 농도 산출부(102b)는, 암모니아 센서(10)의 전압을 검량선에 대입함으로써, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도(C)를 산출한다.

그리고, 총 암모니아 농도 계산부(102d)는, 스텝 SC-6에서 입수한 pH 값(B), 스텝 SC-7에서 산출한 암모니아 농도(C), 및, 전처리로서 제어부(102)에 의해 작성된 암모니아 해리 곡선(도 3 참조)에 기초하여, 총 암모니아 농도(D)를 산출한다(스텝 SC-8). 즉, 총 암모니아 농도 계산부(102d)는, 비이온화 암모니아 파일(106c)에 기억된 비이온화 암모니아 농도(C) 및 pH 값 파일(106d)에 기억된 pH 값(B)으로부터, 암모니아 해리 곡선 파일(106a)에 기억된 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 배양조(200) 내의 총 암모니아 농도(D)를 계산한다.

그리고, 제어부(102)는, 1점 보정을 실시할지 여부를 판단한다(스텝 SC-9).

여기에서,「1점 보정」이란, 표준화 방법 중 하나이며, 1점의 표준화 시료를 사용하여 대상을 표준화하는 것이다. 본 실시형태에 있어서는, 1점의 표준화 시료란, 외부 계측기의 계측 데이터(전압(A'))이며, 표준화는 교정과 같은 의미로 사용하고 있다.

그리고, 제어부(102)가 1점 보정을 실시한다고 판단한 경우(스텝 SC-9: Yes), 교정용 암모니아 농도 측정부(102f) 및 교정부(102g)는, 외부 계측기(외부 장착 암모니아 센서(12) 등)의 계측 데이터(전압(A'))를 입수하고, 이 계측 데이터(전압(A'))를 검량선에 대입하여 수득되는 비이온화 암모니아 농도(C')가, 스텝 SC-8에서 계산된 총 암모니아 농도(D)가 되도록 검량선을 1점 보정한다(스텝 SC-10). 즉, 교정용 전압 측정부(102f)는, 미리 배양조(200)로부터 채취하여 강알칼리 반응액(예를 들면, NaOH)에 현탁하여 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되게 한 배양액에 관해서, 외부 장착 암모니아 센서(12)의 전압(A')을 측정하고, 그리고, 교정부(102g)는, 교정용 전압 측정부(102f)에 의해 측정된 전압(A')을, 검량선 파일(106b)에 기억된 검량선에 대입하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도(C')가, 총 암모니아 농도 계산으로 계산된 총 암모니아 농도(D)가 되도록, 당해 검량선 교정한다.

한편, 제어부(102)가 1점 보정하지 않는다고 판단한 경우(스텝 SC-9: No), 스텝 SC-11의 처리로 진행된다.

그리고, 제어부(102)는 어떤 암모니아 제어 모드를 선택할지를 판단한다(스텝 SC-11).

여기에서, 암모니아 제어 모드란, 예를 들면, 총 암모니아 농도로 제어하는 모드, 및, 비해리형의 암모니아 농도로 제어 모드 등이며, 스텝 SC-11에 있어서, 제어부(102)는, 암모니아 제어 모드를, 총 암모니아 농도 제어 모드, 또는 비이온화 암모니아 농도 제어 모드를 선택할 수 있다.

그리고, 제어부(102)는, 암모니아 제어 모드를 총 암모니아 농도 제어 모드로 선택한 경우(스텝 SC-11: 총 암모니아 농도 제어 모드), 배양조(200) 내의 총 암모니아 농도에 기초하여 제어하는 모드로 설정한다. 계속해서, 제어부(102)는 스텝 SC-8에서 산출한 총 암모니아 농도(D) 또는 스텝 SC-10에서 교정한 총 암모니아 농도(D')와, 암모니아 제어 장치(100)에 설정된 설정값 및 제어 파라미터(예를 들면, 암모니아 농도 제어의 지표가 되는 SV값)를 사용하여, 배양조(200)에 접속된 암모니아 공급기(300) 등을 포함하는 배양기로의 제어 지시를 산출한다(스텝 SC-12).

그리고, 제어부(102)는 스텝 SC-12에서 산출된 제어가 필요한지 여부를 판단한다(스텝 SC-13). 예를 들면, 제어부(102)는 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는지 여부를 판단한다.

그리고, 제어부(102)가 제어 지시는 필요하다(예를 들면, 총 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회한다)고 판단한 경우(스텝 SC-13: Yes), 암모니아 공급 지시부(102e)는, 암모니아 공급기(300)에 대해, 암모니아 탱크(30)로부터 배양조(200) 내에 지시된 양의 암모니아를 첨가하는 것과 같은, 제어 지시를 출력한다. 즉, 암모니아 공급 지시부(102e)는, 제어 출력부(104)를 개재하여, 밸브(32)의 개폐를 조작하는 스위치(31)를 조작함으로써, 제어 지시에 따른 양의 암모니아를 암모니아 탱크(30)로부터 배양조(200) 내로 공급하도록 스위치(31)의 개폐를 조절한다.

한편, 제어부(102)가 제어 지시는 불필요하다(예를 들면, 총 암모니아 농도가 소정의 농도 이상이다)고 판단한 경우(스텝 SC-13: No), 스텝 SC-5의 처리로 되돌아간다.

스텝 SC-11로 되돌아가서, 제어부(102)는, 암모니아 제어 모드를 비이온화 암모니아 농도 제어 모드로 선택한 경우(스텝 SC-11: 비이온화 암모니아 농도 제어 모드), 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도에 기초하여 제어하는 모드로 설정한다. 이어서, 제어부(102)는, 스텝 SC-7에서 산출한 비이온화 암모니아 농도(C)와, 암모니아 제어 장치(100)에 설정된 설정값이나 제어 파라미터(예를 들면, 암모니아 농도 제어의 지표가 되는 SV값)를 사용하여, 배양조(200)에 접속된 암모니아 공급기(300) 등을 포함하는 배양기로의 제어 지시를 산출한다(스텝 SC-15).

그리고, 제어부(102)는, 스텝 SC-15에서 산출된 제어가 필요한지 여부를 판단한다(스텝 SC-16). 예를 들면, 제어부(102)는 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는지 여부를 판단한다.

그리고, 제어부(102)가 제어 지시는 필요하다(예를 들면, 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회한다)고 판단한 경우(스텝 SC-16: Yes), 암모니아 공급 지시부(102e)는, 암모니아 공급기(300)에 대해, 암모니아 탱크(30)로부터 배양조(200) 내에 지시된 양의 암모니아를 첨가하는 것과 같은, 제어 지시를 출력한다. 즉, 암모니아 공급 지시부(102e)는, 제어 출력부(104)를 개재하여, 밸브(32)의 개폐를 조작하는 스위치(31)를 조작함으로써, 제어 지시에 따른 양의 암모니아를 암모니아 탱크(30)로부터 배양조(200) 내로 공급되도록 스위치(31)의 개폐를 조절한다.

한편, 제어부(102)가 제어 지시는 불필요하다(예를 들면, 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도 이상이다)고 판단한 경우(스텝 SC-16: No), 스텝 SC-5의 처리로 되돌아간다.

이상으로, 본 암모니아 제어 장치(100) 처리의 일례의 상세한 설명을 끝낸다.

이것으로, 본 실시형태에 대한 설명을 끝낸다.

[다른 실시형태]

지금까지 본 발명의 실시형태에 관해서 설명했지만, 본 발명은, 상기한 실시형태 이외에도, 특허청구의 범위에 기재된 기술적 사상의 범위 내에 있어서 다양한 상이한 실시형태로 실시되면 좋은 것이다.

예를 들면, 암모니아 제어 장치(100)가 배양조(200) 내에서 발효를 실시하는 경우에 관해서 설명했지만, 발효법으로 한정되지 않으며, 화학 공업의 반응조 등과 같은 다른 용도로 사용해도 좋다.

또한, 실시형태에 있어서 설명한 각 처리 중, 자동적으로 실시되는 것으로서 설명한 처리의 전부 또는 일부를 수동적으로 실시할 수도 있고, 또는, 수동적으로 실시되는 것으로서 설명한 처리의 전부 또는 일부를 공지의 방법으로 자동적으로 실시할 수도 있다.

이 밖에, 상기 문헌 중이나 도면 중에서 나타낸 처리 수순, 제어 수순, 구체적인 명칭, 각 처리의 등록 데이터와 검색 조건 등의 파라미터를 포함하는 정보, 데이터 베이스 구성에 관해서는, 특기하는 경우를 제외하고 임의로 변경할 수 있다.

또한, 암모니아 제어 장치(100)에 관해서, 도시한 각 구성 요소는 기능 개략적인 것이며, 반드시 물리적으로 도시하는 바와 같이 구성되어 있는 것을 요하지 않는다.

예를 들면, 암모니아 제어 장치(100)의 각 장치가 구비하는 처리 기능, 특히 제어부(102)에서 실시되는 각 처리 기능에 관해서는, 그 전부 또는 임의의 일부를 CPU(Central Processing Unit) 및 당해 CPU에서 해석 실행되는 프로그램으로 실현할 수 있고, 또는, 와이어드 로직에 의한 하드웨어로서 실현하는 것도 가능하다. 또한, 프로그램은, 후술하는 기록 매체에 기록되어 있으며, 필요에 따라 암모니아 제어 장치(100)에 기계적으로 판독된다. 즉, ROM 또는 HD 등의 기억부(106) 등은, OS(Operating System)로서 협동하여 CPU에 명령을 주고, 각종 처리를 실시하기 위한 컴퓨터 프로그램이 기록되어 있다. 이 컴퓨터 프로그램은 RAM에 로드됨으로써 실행되고, CPU와 협동하여 제어부(102)를 구성한다.

또한, 이 컴퓨터 프로그램은, 암모니아 제어 장치(100)에 대해 임의의 네트워크를 개재하여 접속된 어플리케이션 프로그램 서버에 기억되어 있어도 좋고, 필요에 따라 그 전부 또는 일부를 다운로드하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명에 따르는 프로그램을, 컴퓨터 판독 가능한 기록 매체에 저장할 수도 있다. 여기서, 이 「기록 매체」란, 플렉시블 디스크, 광 자기 디스크, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD 등의 임의의 「가반용(可搬用) 물리 매체」, 또는, LAN, WAN, 인터넷으로 대표되는 네트워크를 개재하여 프로그램을 송신하는 경우의 통신 회선이나 반송파와 같이, 단기간에 프로그램을 유지하는「통신 매체」를 포함하는 것으로 한다.

또한, 「프로그램」이란, 임의의 언어와 기술 방법으로 기술된 데이터 처리 방법이며, 소스 코딩이나 바이너리 코딩 등의 형식을 묻지 않는다. 또한, 「프로그램」은 반드시 단일적으로 구성되는 것으로 한정되지 않으며, 복수의 모듈이나 라이브러리로서 분산 구성되는 것이나, OS(Operating System)로 대표되는 별개의 프로그램과 협동하여 그 기능을 달성하는 것도 포함한다. 또한, 실시형태에 나타낸 각 장치에 있어서 기록 매체를 판독하기 위한 구체적인 구성, 판독 수순, 또는, 판독 후의 인스톨 수순 등에 관해서는, 주지의 구성이나 수순을 사용할 수 있다.

기억부(106)에 저장되는 각종 데이터 베이스 등(암모니아 해리 곡선 파일(106a) 내지 총 암모니아 농도 파일(106e))은, RAM, ROM 등의 메모리 장치, 하드 디스크 등의 고정 디스크 장치, 플렉시블 디스크, 광디스크 등의 스토리지 수단이며, 각종 처리나 웹사이트 제공에 사용하는 각종 프로그램이나 테이블이나 데이터 베이스나 웹 페이지용 파일 등을 저장한다.

또한, 암모니아 제어 장치(100)는, 이미 알고 있는 퍼스널 컴퓨터, 워크 스테이션 등의 정보 처리 장치를 접속하고, 당해 정보 처리 장치에 본 발명의 방법을 실현시키는 소프트웨어(프로그램, 데이터 등을 포함한다)를 실장함으로써 실현해도 좋다.

또한, 장치의 분산·통합의 구체적 형태는 도시하는 것으로 한정되지 않으며, 그 전부 또는 일부를, 각종 부가 등에 따른 임의의 단위로, 기능적 또는 물리적으로 분산·통합하여 구성할 수 있다.

또한, 상기 암모니아 제어 방법 및 암모니아 제어 장치는 이하와 같은 방법에 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 발효법에 의한 미생물을 사용한 목적 물질의 제조 방법에 이용 가능하다. 구체적으로는, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 액체 배지를 포함하는 발효조 내에서 배양하고, 동 배지 중에 상기 목적 물질을 생성, 축적시키는 방법이다.

본 발명에 있어서의 목적 물질이란, L-아미노산 또는 핵산, 유기산, 알코올, 단백질 등을 들 수 있다. 발명에 있어서,「L-아미노산」은, 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지 중에 축적되는 것이면 특별히 제한되지 않는다. L-아미노산의 종류는 특별히 제한되지 않지만, L-리신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시트룰린의 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, 글리신의 지방족 아미노산, L-스레오닌, L-세린의 하이드록시모노아미노카르복실산인 아미노산, L-프롤린의 환식 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판의 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌의 함황 아미노산, L-글루탐산, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-아스파라긴 등의 산성 아미노산과 이의 아미드체를 들 수 있다.

본 발명에 사용하는 미생물은 2종류 이상의 아미노산 생산능을 갖는 것이라도 좋다. 또한, 본 발명에 있어서 L-아미노산이란, 프리체(體)의 L-아미노산과 L-아미노산염, 예를 들면, 황산염, 염산염, 탄산염을 포함한다.

본 발명에 있어서,「핵산」이란 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지 중에 축적되는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 핵산이란, 푸린 뉴클레오시드, 푸린 뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 푸린 뉴클레오시드에는, 이노신, 크산토신, 구아노신, 아데노신 등이 포함되고, 푸린 뉴클레오티드에는, 푸린 뉴클레오시드의 5'-인산 에스테르, 예를 들면, 이노신산(이노신-5'-인산. 이하 「IMP」라고도 한다), 크산틸산(크산토신-5'-인산. 이하 「XMP」라고도 한다), 구아닐산(구아노신-5'-모노인산. 이하 「GMP」라고도 한다), 아데닐산(아데노신-5'-모노인산. 이하「AMP」라고도 한다) 등이 포함된다.

본 발명에 있어서,「유기산」이란, 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지 중에 축적되는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 유기산이란 락트산, 아세트산, 시트르산, 글루콘산, 석신산, 푸말산, 말산 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「알코올」이란, 미생물을 사용한 발효법에 있어서 배지 중에 축적되는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 알코올이란, 예를 들면, 에탄올, 이소부탄올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,3-프로판디올, 1,4-부탄디올, 글리세롤, 2,3-부탄디올 등을 들 수 있다.

본 발명에 사용할 수 있는 미생물로서 구체적으로는, 에세리키아속, 엔테로박터 속, 클레브시엘라속, 판토에아속, 세라티아속, 에르위니아속, 살모넬라속, 모르가넬라속에 속하는 장내 세균, 코리네포름형 세균, 바실러스속 세균, 스트렙토코커스속 세균, 사카로미세스속 효모 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 유전자 치환이 가능한 미생물이다.

에세리키아속 세균으로서는, 에세리키아·콜리(Escherichia coli) 등을 들 수 있다. 에세리키아·콜리를, 유전자 공학적 수법을 사용하여 육종하는 경우에는, 에세리키아·콜리 K-12주 및 이의 유도체인 에세리키아·콜리 MG1655주(ATCC 47076) 및 W3110주(ATCC 27325)를 사용할 수 있다. 에세리키아·콜리 K-12주나, 유도주를 입수하기 위해서는, 예를 들면, 아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션(ATCC)으로부터 분양을 받을 수 있다(주소 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America).

에세리키아속 세균으로서는, 나이트하르트 외의 저서(Neidhardt, F. C. et. al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1)에 열거되는 것, 예를 들면, 에세리키아·콜리 등을 이용할 수 있다. 에세리키아·콜리의 야생주로서는, 예를 들면, K12주 또는 이의 유도체, 에세리키아·콜리 MG1655주(ATCC No.47076) 및 W3110주(ATCC No.27325) 등을 들 수 있다. 이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면, 아메리칸·타입 컬쳐·컬렉션(ATCC)으로부터 분양을 받을 수 있다(ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

또한, 엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터·아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터·아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등, 판토에아속 세균으로서는 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis)를 들 수 있다. 또한, 최근, 엔테로박터·아글로메란스는, 16S rRNA의 염기 배열 해석 등에 의해, 판토에아·아글로메란스(Pantoea agglomerans) 또는 판토에아·아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아·스튜알티(Pantoea stewartii) 등으로 재분류되어 있는 것이 있다. 본 발명에 있어서는, 장내 세균과로 분류되는 것이라면, 엔테로박터속 또는 판토에아속 중 어느 것에 속하는 것이라도 좋다. 판토에아·아나나티스를, 유전자 공학적 수법을 사용하여 육종하는 경우에는, 판토에아·아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614), AJ13356주(FERM BP-6615), AJ13601주(FERM BP-7207) 및 이들의 유도체를 사용할 수 있다. 이들 주는, 분리된 당시는 엔테로박터·아글로메란스라고 동정되고, 엔테로박터·아글로메란스로서 기탁되었지만, 상기와 같이, 16S rRNA의 염기 배열 해석 등에 의해, 판토에아·아나나티스로 재분류되어 있다.

코리네형 세균으로서는, 버지즈·매뉴얼·오브·디터미네이티브·박테리올로지(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology) 제8판 599페이지(1974)에 정의되어 있는 일군의 미생물이며, 호기성, 그램 양성, 비항산성, 포자 형성능을 갖지 않는 간균으로 분류되는 미생물을 이용할 수 있다. 또한, 코리네형 세균은, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만 현재는 코리네박테리움속 세균으로서 통합된 세균(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)) 및 코리네박테리움속과 매우 근연(近緣)한 브레비박테리움속 세균 및 미크로박테리움속 세균을 포함한다.

이러한 코리네형 세균의 예로서 이하의 것을 들 수 있다.

코리네박테리움·아세토아시도필룸

코리네박테리움·아세토글루타미쿰

코리네박테리움·알카놀리티쿰

코리네박테리움·칼루나에

코리네박테리움·글루타미쿰

코리네박테리움·릴리움

코리네박테리움·멜라세콜라

코리네박테리움·서모아미노게네스(코리네박테리움·에피시엔스)

코리네박테리움·헤르쿨리스

브레비박테리움·디바리카툼

브레비박테리움·플라붐

브레비박테리움·임마리오필룸

브레비박테리움·락토페르멘툼

브레비박테리움·로제움

브레비박테리움·사카롤리티쿰

브레비박테리움·티오게니탈리스

코리네박테리움·암모니아게네스

브레비박테리움·알붐

브레비박테리움·세리눔

미크로박테리움·암모니아필룸

구체적으로는, 하기와 같은 균주를 예시할 수 있다.

코리네박테리움·아세토아시도필룸 ATCC13870

코리네박테리움·아세토글루타미쿰 ATCC15806

코리네박테리움·알카놀리티쿰 ATCC21511

코리네박테리움·칼루나에 ATCC15991

코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060

코리네박테리움·릴리움 ATCC15990

코리네박테리움·멜라세콜라 ATCC17965

코리네박테리움·에피시엔스 AJ12340(FERM BP-1539)

코리네박테리움·헤르쿨리스 ATCC13868

브레비박테리움·디바리카툼 ATCC14020

브레비박테리움·플라붐 ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)

브레비박테리움·임마리오필룸 ATCC14068

브레비박테리움·락토페르멘툼 ATCC13869(코리네박테리움·글루타미쿰 ATCC13869)

브레비박테리움·로제움 ATCC13825

브레비박테리움·사카롤리티쿰 ATCC14066

브레비박테리움·티오게니탈리스 ATCC19240

코리네박테리움·암모니아게네스 ATCC6871, ATCC6872

브레비박테리움·알붐 ATCC15111

브레비박테리움·세리눔 ATCC15112

미크로박테리움·암모니아필룸 ATCC15354

이들을 입수하기 위해서는, 예를 들면, 아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션으로부터 분양을 받을 수 있다(주소 P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America). 즉, 균주별로 대응하는 등록 번호가 부여되어 있으며, 이 등록 번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다. 각 균주에 대응하는 등록 번호는 아메리칸·타입·컬쳐·컬렉션의 카탈로그에 기재되어 있다(http://www.atcc.org/ 참조). 또한, AJ12340주는, 1987년 10월 27일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터)(우292-0818 일본국 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8-120호실)에 FERM BP-1539의 수탁 번호로 부다페스트 조약에 기초하여 기탁되어 있다. 또한, AJ12418주는, 1989년 1월 5일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터)에 FERM BP-2205의 수탁 번호로 부다페스트 조약에 기초하여 기탁되어 있다.

바실러스속 세균을 사용할 때는, 바실러스속 세균으로서는, 바실러스·서브틸리스, 바실러스·아밀로리케파시엔스, 바실러스·푸밀러스 등을 들 수 있다.

바실러스·서브틸리스로서는, 바실러스·서브틸리스 168 Marburg(ATCC 6051), 바실러스·서브틸리스 PY79(Plasmid, 1984, 12, 1-9) 등을, 바실러스·아밀로리케파시엔스로서는, 바실러스·아밀로리케파시엔스T(ATCC23842), 및 바실러스·아밀로리케파시엔스N(ATCC23845) 등을 들 수 있다. 또한, 바실러스·푸밀러스로서는, 바실러스·푸밀러스 Gottheil No. 3218(ATCC No.21005)(미국 특허 제3,616,206호) 등을 들 수 있다.

이하, 상기한 바와 같이 친주(親株)에 L-아미노산 또는 핵산 생산능을 부여하는 방법에 관해서 서술한다.

L-아미노산 또는 핵산 생산능을 부여하기 위해서는, 영양 요구성 변이주, 아날로그 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, L-아미노산 또는 핵산의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제(創製) 등, 종래 코리네형 세균 또는 에세리키아속 세균 등의 육종에 채용되어 온 방법을 적용할 수 있다(아미노산 발효, (주) 학회출판센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77 내지 100페이지 참조). 여기서, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은, 단독이라도 좋고, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, 발현이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 좋다.

L-아미노산 또는 핵산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, L-아미노산 또는 핵산의 아날로그 내성주, 또는 대사 제어 변이주를 취득하기 위해서는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서, 영양 요구성, 아날로그 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, 또한 L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.

L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, L-아미노산의 아날로그 내성주, 또는 대사 제어 변이주는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 에틸메탄설포네이트(EMS) 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서, 영양 요구성, 아날로그 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, 또한 L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.

이하, 구체적으로 미생물에 아미노산 생산능을 부여하는 방법과 아미노산 생산균에 관해서 예시한다.

(L-리신 생산균)

이하, L-리신 생산균 또는/및 그 구축 방법을 예로서 나타낸다.

예를 들면, L-리신 생산능을 갖는 주로서는, L-리신 아날로그 내성주 또는 대사 제어 변이주를 들 수 있다. L-리신 아날로그의 예로서는, 옥살리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸 리신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 리신 아날로그에 대해 내성을 갖는 변이주는, 장내 세균과에 속하는 세균을 통상의 인공 변이 처리함으로써 수득할 수 있다. L-리신 생산균으로서 구체적으로는, 에세리키아·콜리 AJ11442주(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 일본 공개특허공보 제(소)56-18596호 및 미국 특허 제4246170호 명세서 참조), 에세리키아·콜리 VL611주(일본 공개특허공보 제2000-189180호) 등을 들 수 있다. 또한, 에세리키아·콜리의 L-리신 생산균으로서, WC196주(국제공개 제96/17930호 팜플렛 참조)를 사용할 수도 있다.

또한, L-리신 생합성계의 효소 활성을 상승시킴으로써도, L-리신 생산균을 구축할 수 있다. 이들 효소 활성의 상승은, 효소를 코딩하는 유전자의 카피수를 세포 내에서 상승시키는 것, 또는 발현 조절 배열을 개변(改變)함으로써 달성할 수 있다. L-리신 생합성계의 효소를 코딩하는 유전자의 카피수를 세포 내에서 상승시키는 것, 및 발현 조절 배열을 개변하는 것은, 후술하는 gltP, gltS 유전자의 경우와 같은 방법에 의해 달성할 수 있다.

L-리신 생합성계 효소를 코딩하는 유전자로서는, 디하이드로디피콜린산 합성 효소 유전자(dapA), 아스파르토키나제 유전자(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디아미노피멜린산 탈탄산 효소 유전자(lysA), 디아미노피멜린산 데하이드로게나제 유전자(ddh)(이상, 국제공개 제96/40934호 팜플렛), 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)(일본 공개특허공보 제(소)60-87788호), 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제 유전자(aspC)(일본 특허공보 제(평)6-102028호), 디아미노피멜린산 에피머라제 유전자(dapF)(일본 공개특허공보 제2003-135066호), 아스파라긴산 세미알데히드 탈수소 효소 유전자(asd)(국제공개 제00/61723호 팜플렛) 등의 디아미노피멜린산 경로의 효소의 유전자, 또는 호모아코니트산 하이드라타제 유전자(일본 공개특허공보 제2000-157276호) 등의 아미노아디프산 경로의 효소 등의 유전자를 들 수 있다. 또한, 친주는, 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)(EP 1170376 A), 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제를 코딩하는 유전자(pntAB)(미국 특허 제5,830,716호), L-리신 배출 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 ybjE 유전자(WO2005/073390), 글루탐산 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자(gdhA)(Gene23: 199-209(1983)), 또는, 이들의 임의의 조합의 유전자의 발현 레벨이 증대되고 있어도 좋다. 괄호 안은, 이들 유전자의 약기호이다. 상기 유전자 중에서는 ybjE 유전자가 바람직하다.

에세리키아·콜리 유래의 야생형 디하이드로디피콜린산 합성 효소는 L-리신에 의한 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있으며, 에세리키아·콜리 유래의 야생형 A 아스파르토 키나제는 L-리신에 의한 억제 및 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있다. 따라서, dapA 유전자 및 lysC 유전자를 사용하는 경우, 이들 유전자는, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 돌연변이 유전자인 것이 바람직하다.

L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 디하이드로디피콜린산 합성 효소를 코딩하는 DNA로서는, 118 위치의 히스티딘 잔기가 티로신 잔기로 치환된 배열을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 들 수 있다. 또한, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 아스파르토 키나제를 코딩하는 DNA로서는, 352 위치의 스레오닌 잔기가 이소류신 잔기로 치환, 323 위치의 글리신 잔기가 아스파라긴 잔기로 치환, 318 위치의 메티오닌이 이소류신으로 치환된 배열을 갖는 AKIII을 코딩하는 DNA를 들 수 있다(이들 변이체에 관해서는 미국 특허 제5661012호 및 제6040160호 명세서 참조). 변이형 DNA는 PCR 등에 의한 부위 특이적 변이법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 변이형 디하이드로디피콜린산 합성 효소를 코딩하는 변이형 dapA 및 변이형 아스파르토 키나제를 코딩하는 변이형 lysC를 함유하는 플라스미드로서, 광 숙주역 플라스미드 RSFD80, pCAB1, pCABD2가 알려져 있다(미국 특허 제6040160호 명세서). RSFD80으로 형질 전환된 에세리키아·콜리 JM109주(미국 특허 제6040160호 명세서)는, AJ12396으로 명명되고, 동일 주는 1993년 10월 28일에 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터)에 수탁 번호 FERM P-13936으로서 기탁되고, 1994년 11월 1일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, FERM BP-4859의 수탁 번호하에 기탁되어 있다. RSFD80은 AJ12396주로부터, 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다.

또한, L-아미노산 생산균은, L-아미노산의 생합성 경로에서 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성과, L-아미노산의 합성 또는 축적에 음으로 기능하는 효소 활성이 저하 또는 결손되어 있어도 좋다. L-리신 생산에 있어서, 이러한 효소로서는, 호모세린 데하이드로게나제, 리신 데카르복실라제(cadA, ldcC), 말릭 엔자임 등이 있으며, 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손된 주는 국제공개 제WO95/23864호, 제WO96/17930호 팜플렛, 제WO2005/010175호 팜플렛 등에 기재되어 있다.

리신 데카르복실라제 활성을 저하 또는 결손시키기 위해서는, 리신 데카르복실라제를 코딩하는 cadA 유전자와 ldcC 유전자 모두의 발현을 저하시키는 것이 바람직하다. 양 유전자의 발현 저하는, WO2006/078039호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

이러한 효소 활성을 저하 또는 결손시키는 방법으로서는, 통상의 변이 처리법 또는 유전자 재조합 기술에 의해, 게놈 위의 상기 효소의 유전자에, 세포 중의 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손되는 변이를 도입하면 좋다. 이러한 변이의 도입은, 예를 들면, 유전자 재조합에 의해, 게놈 위의 효소를 코딩하는 유전자를 결손시키거나, 프로모터나 샤인달가노(SD) 배열 등의 발현 조절 배열을 개변시키거나 하는 것 등에 의해 달성된다. 또한, 게놈 위의 효소를 코딩하는 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 또한 종결 코돈을 도입하는 것(넌센스 변이), 1 내지 2염기 부가·결실(缺失)하는 프레임 시프트 변이를 도입하는 것, 유전자의 일부분, 또는 전 영역을 결실시킴으로써도 달성할 수 있다(J. Biol. Chem. 272: 8611-8617(1997)). 또한, 코딩 영역의 전체 또는 일부가 결실된 변이 효소를 코딩하는 유전자를 구축하고, 상동 재조합 등에 의해, 당해 유전자로 게놈 위의 정상 유전자를 치환하는 것, 또는 트랜스포존, IS 인자를 당해 유전자에 도입함으로써 효소 활성을 저하 또는 결손시킬 수 있다.

예를 들면, 상기의 효소의 활성을 저하 또는 결손시키는 변이를 유전자 재조합에 의해 도입하기 위해서는, 이하와 같은 방법이 사용된다. 목적 유전자의 부분 배열을 개변하고, 정상적으로 기능하는 효소를 산생(産生)하지 않도록 한 변이형 유전자를 제작하고, 당해 유전자를 포함하는 DNA로 장내 세균과에 속하는 세균으로 형질 전환하여, 변이형 유전자와 게놈 위의 유전자로 재조합을 일으키게 함으로써, 게놈 위의 목적 유전자를 변이형으로 치환할 수 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환은, 「Red 드리븐 인테그레이션(Red-driven integration)이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)), Red 드리븐 인테그레이션법과 λ 파지 유래 절취 시스템(Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제6303383호; 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호). 또한, 상기한 바와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 변이 도입은, 숙주 위에서 복제 능력을 갖지 않는 플라스미드를 사용해도 실시할 수 있다.

바람직한 L-리신 생산균으로서, 에세리키아·콜리 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를 들 수 있다(WO2006/078039). 이 균주는, WC196주로부터, 리신 데카르복실라제를 코딩하는 cadA 및 ldcC 유전자를 파괴하고, 리신 생합성계 유전자를 포함하는 플라스미드 pCABD2(미국 특허 제6,040,160호)를 도입함으로써 구축한 주이다. WC196주는, E. coli K-12에 유래하는 W3110주로부터 취득된 주이고, 352번째 스레오닌을 이소류신으로 치환함으로써 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토 키나제 III를 코딩하는 변이형 lysC 유전자(미국 특허 제5,661,012호)로 W3110주의 염색체 위의 야생형 lysC 유전자를 치환한 후, AEC 내성을 부여함으로써 육종되었다(미국 특허 제5,827,698호). WC196주는, Escherichia coli AJ13069라고 명명되고, 1994년 12월 6일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우292-0818 일본국 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8-120호실)에 수탁 번호 FERM P-14690으로서 기탁되고, 1995년 9월 29일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 수탁 번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다(미국 특허 제5,827,698호). WC196ΔcadAΔldcC 자체도, 바람직한 L-리신 생산균이다. WC196ΔcadAΔldcC는, AJ110692라고 명명되고, 2008년 10월 7일 공업 기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우292-0818 일본국 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8-120호실)에 국제 기탁되어, 수탁 번호 FERM BP-11027이 부여되어 있다.

pCABD2는, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에세리키아·콜리 유래의 디하이드로디피콜린산 합성 효소(DDPS)를 코딩하는 변이형 dapA 유전자와, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에세리키아·콜리 유래의 아스파르토 키나제 III를 코딩하는 변이형 lysC 유전자와, 에세리키아·콜리 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 코딩하는 dapB 유전자와, 브레비박테리움·락토퍼멘툼 유래 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자를 포함하고 있다.

상기와 같은 L-리신 생합성에 관여하는 효소의 유전자 발현을 증강시키는 방법, 효소 활성을 저하시키는 방법은, 그 밖의 L-아미노산 생합성 효소를 코딩하는 유전자에 관해서도 마찬가지로 적용할 수 있다.

(L-트립토판 생산균)

L-트립토판 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 변이 trpS 유전자에 의해 코딩되는 트립토페닐-tRNA 신테타제가 결손된 E. coli JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)(미국 특허 제5,756,345호), 세린에 의한 피드백 저해를 받지 않는 포스포글리세릴레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 serA 아렐 및 트립토판에 의한 피드백 저해를 받지 않는 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 trpE 아렐을 갖는 E. coli SV164(pGH5)(미국 특허 제6,180,373호), 트립토파나제가 결손된 E. coli AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(미국 특허 제4,371,614호), 포스포에놀피루브산 생산능이 증대된 E. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps(WO9708333, 미국 특허 제6,319,696호) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 코딩되는 단백질의 활성이 증가된 에세리키아속에 속하는 L-트립토판 생산균도 사용할 수 있다(미국 특허출원공개 제2003/0148473 A1호 및 제2003/0157667 A1호).

L-트립토판 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세릴레이트 데하이드로게나제(serA) 및 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 효소의 활성의 1종 이상이 증대된 주도 들 수 있다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세릴레이트 데하이드로게나제는 모두 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 해제하는 변이를 이들 효소에 도입해도 좋다. 이러한 변이를 갖는 주의 구체예로서는, 탈감작형 안트라닐레이트 신타제를 유지하는 E. coli SV164, 및, 피드백 저해가 해제된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 코딩하는 변이 serA 유전자를 포함하는 플라스미드 pGH5(WO94/08031)를 E. coli SV164에 도입함으로써 수득된 형질 전환주를 들 수 있다.

또한, L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서, 3-포스포세린 포스파타제(serB) 활성을 증대시킨 주(US4,371,614), 포스포에놀피루브산 카르복시 키나제(pckA)를 증대시킨 주(WO2004/090125), 글리옥실산 경로의 효소가 구성화된 발현하는 주(WO2005/103275)를 들 수 있다.

L-트립토판, L-페닐알라닌, L-티로신은 모두 방향족 아미노산 생합성계가 공통되고 있으며, 방향족 아미노산의 생합성계 효소를 코딩하는 유전자로서는, 데옥시아라비노-헵툴론산인산 신타제(aroG), 3-데하이드록시네이트 신타제(aroB), 시킴산 데하이드라타제, 시킴산 키나제(aroL), 5-에놀산피루빈시킴산 3-인산 신타제(aroA), 코리스믹산 신타제(aroC)를 들 수 있다(유럽 출원 공개 763127호 명세서). 또한, 이들 유전자는 티로신 리프레서(tyrR)에 의해 제어되는 것이 알려져 있으며, tyrR 유전자를 결손시킴으로써, 방향족 아미노산의 생합성계 효소 활성을 상승시켜도 좋다(유럽 특허 제763127호 명세서 참조). 또한, 효소명 뒤의 괄호 안은, 유전자명이다(이하의 기재에 있어서도 동일).

또한, 각각의 아미노산 생산능을 강화하는 경우, 목적으로 하는 방향족 아미노산 이외의 생합성계를 약화시켜도 좋다. 예를 들면, 목적 아미노산 L-트립토판의 경우, L-페닐알라닌 생합성계, L-티로신 생합성계를 약화시켜도 좋다(US 4,371,614).

본 발명에 있어서,「효소 활성의 상승」이란, 예를 들면, 세포당 효소 분자의 수가 증가된 경우나, 효소 분자당 비활성이 상승된 경우 등이 해당된다. 예를 들면, 효소의 유전자의 발현량을 상승시킴으로써 활성을 상승시킬 수 있다. 효소의 세포 내에서 활성은, 미생물의 비개변주(非改變株), 예를 들면, 야생형 균주보다도 상승시키는 것이 바람직하다.

또한, 3-데옥시-D-아라비노헵툴론산-7-인산 신타제(aroF, aroG)는, 방향족 아미노산에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 받지 않도록 개변해도 좋다. 예를 들면, aroF의 경우, N 말단으로부터 147 위치의 L-아스파라긴산 또는 181 위치의 L-세린이 다른 아미노산 잔기에, aroG의 경우, N 말단으로부터 146 위치의 L-아스파라긴산, 147 위치의 L-메티오닌, 150 위치의 L-프롤린 또는 202 위치의 L-알라닌의 1 아미노산 잔기, 또는 157 위치의 L-메티오닌 및 219 위치의 L-알라닌의 2 아미노산 잔기를 다른 아미노산으로 치환한 변이형 aroF, aroG 유전자를 숙주에 도입함으로써, 방향족 생산 아미노산 생산균을 수득할 수 있다(EP0488424).

L-트립토판 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 저해 해제 형 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 유전자를 포함하는 트립토판 오페론이 도입된 주(일본 공개특허공보 제(소)57-71397호, 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호, 미국 특허 제4,371,614호)도 들 수 있다. 또한, 트립토판 오페론(trpBA) 중의 트립토판 신타제를 코딩하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여해도 좋다. 트립토판 신타제는, 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 코딩되는 α 및 β 서브유닛으로 이루어진다. 또한, 이소시트레이 트리아제-말레이트 신타제 오페론의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 개량해도 좋다(WO2005/103275).

코리네형 세균으로서는, 설파구아니딘에 내성주인 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12118(FERM BP-478 일본 특허공보 제01681002호), 트립토판 오페론이 도입된 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제S63240794호), 코리네형 세균 유래의 시킴산 키나제를 코딩하는 유전자를 도입한 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제01994749호)을 사용할 수 있다.

(L-페닐알라닌 생산균)

L-페닐알라닌 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, E. coli AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197), 변이형 pheA34 유전자를 유지하는 E. coli HW1089(ATCC 55371)(미국 특허 제5,354,672호), E. coli MWEC101-b(KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147(미국 특허 제4,407,952호) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 친주로서, E. coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), E. coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), E. coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)와 AJ 12604라고 명명된 E. coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB(FERM BP-3579)도 사용할 수 있다(EP 488424 B1). 또한, yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 코딩되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균도 사용할 수 있다(미국 특허출원공개 제2003/0148473 A1호 및 제2003/0157667 A1호).

코리네형 세균의 페닐알라닌 생산균으로서는, 포스포에놀피루브산 카르복실라제 또는 피루브산 키나아제 활성이 저하된 Corynebacterium glutamicum BPS-13주(FERM BP-1777, K77(FERM BP-2062) 및 K78(FERM BP-2063)(유럽 특허공개공보 제33145호, JP 제02303495호), 티로신 요구성 주(JP 05049489) 등을 사용할 수 있다.

또한, 페닐알라닌 생산균으로서는, 부생물을 세포 내로 도입하도록 개변하는 것, 예를 들면, L-트립토판 흡수 유전자 tnaB, mtr이나, L-티로신 흡수 유전자인 tyrP의 발현량을 향상시킴으로써도, 효율적으로 L-페닐알라닌을 생산하는 균주를 취득할 수 있다(EP1484410).

(L-티로신 생산균)

티로신 생산균으로서는, 티로신에 의한 저해를 받지 않는 탈감작형의 프레펜산 데하이드라타제 유전자(tyrA)를 갖는 에세리키아속 세균(유럽 특허출원공개 제1616940호 공보)을 들 수 있다.

(L-발린 생산균)

L-발린 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로는 ilvGMEDA 오페론을 과잉 발현하도록 개변된 주(미국 특허 제5,998,178호)를 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 아테뉴에이션에 필요한 ilvGMEDA 오페론의 아테뉴에이션에 필요한 영역을 제거하고, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 감쇠되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 오페론의 ilvA 유전자가 파괴되고, 스레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.

L-발린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 아미노아실 t-RNA 신테타제에 변이를 갖는 변이주(미국 특허 제5,658,766호)도 들 수 있다. 예를 들면, 이소류신 tRNA 신테타제를 코딩하는 ileS 유전자에 변이를 갖는 E. coli VL1970을 사용할 수 있다. E. coli VL1970은, 1988년 6월 24일, 러시안·내셔널·컬렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오르가니즘즈(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)에, 수탁 번호 VKPM B-4411로 기탁되어 있다.

또한, 생육에 리포산을 요구하고/하거나 H⁺-ATPase를 결실하고 있는 변이주(WO96/06926)를 친주로서 사용할 수 있다.

코리네형 세균의 L-발린 생산균으로서는, 예를 들면, L-발린산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증강되도록 개변한 균주를 들 수 있다. L-발린산 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, ilvBNC 오페론에 의해 코딩되는 효소, 즉 ilvBN에 의해 코딩되는 아세토하이드록시산 신타제나 ilvC에 의해 코딩되는 이소메로 리덕타제(ilvC)(국제공개 팜플렛 WO 00-/50624호)가 있다. 또한, ilvBNC 오페론은, L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-류신에 의한 오페론의 발현 조절을 받기 때문에, 생성되는 L-발린에 의한 발현 억제를 해제하기 위해 아테뉴에이션을 해제하는 것이 바람직하다.

코리네형 세균으로의 L-발린 생산능의 부여 또는 향상은, L-발린 산생을 감소시키는 물질 대사 경로에 관여하는, 적어도 1종의 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 좋다. 예를 들면, L-류신 합성에 관여하는 스레오닌 데하이드라타제나 D-판토세네이트 합성에 관여하는 효소의 활성을 저하시키는 것을 생각할 수 있다(국제공개 팜플렛 WO 0050624호).

L-발린 생산능을 부여하는 다른 방법으로서, 아미노산 아날로그 등으로의 내성을 부여하는 방법도 들 수 있다.

예를 들면, L-이소류신 및 L-메티오닌 요구성, 및 D-리보스, 푸린 리보뉴클레오시드 또는 피리미딘 리보뉴클레오시드에 내성을 가지며, 또한 L-발린 생산능을 갖는 변이주(FERM P-1841, FERM P-29, 일본 특허공보 제(소)53-025034호)나 폴리케토이드류에 내성을 갖는 변이주(FERM P-1763, FERM P-1764, 일본 특허공보 제(평)06-065314호), 또한 아세트산을 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 L-발린 내성을 나타내고, 또한 글루코스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 아날로그(β-플루오로피루브산 등)에 감수성을 갖는 변이체(FERM BP-3006, FERM BP-3007, 일본 특허공보 제3006929호)를 들 수 있다.

또한, 분기쇄 아미노산의 합성에 관여하는 유전자로서, ilvGMEDA 오페론을 들 수 있지만, 동 오페론은 L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-류신에 의한 오페론의 발현 조절(아테뉴에이션)을 받기 때문에, 아테뉴에이션에 필요한 영역이 제거 또는 변이된 ilvGMEDA 오페론을 미생물에 유지시킴으로써, 이러한 L-아미노산의 생산성을 향상시킬 수 있다.

(L-이소류신 생산균)

L-이소류신 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 6-디메틸아미노푸린에 내성을 갖는 변이주(일본 공개특허공보 제(평)5-304969호), 티아이소류신, 이소류신 하이드록사메이트 등의 이소류신 아날로그에 내성을 갖는 변이주, 또한 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주(일본 공개특허공보 제(평)5-130882호)를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 또한, 스레오닌 데아미나제, 아세토하이드록시산 신타제 등의 L-이소류신 생합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자로 형질 전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다(일본 공개특허공보 제(평)2-458호, FR 제0356739호 및 미국 특허 제5,998,178호).

코리네형 세균의 L-이소류신 생산균으로서는, 분기쇄 아미노산 배출 단백질을 코딩하는 brnE 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제2001-169788호), L-리신 생산균과의 프로토플라스트 융합에 의해 L-이소류신 생산능을 부여한 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)62-74293호), 호모세린 데하이드로게나제를 강화한 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)62-91193호), 스레오닌 하이드록사메이트 내성주(일본 공개특허공보 제(소)62-195293호), α-케토마론 내성주(일본 공개특허공보 제(소)61-15695호), 메틸 리신 내성주(일본 공개특허공보 제(소)61-15696호)를 들 수 있다.

(L-류신 생산균)

L-류신 생산균 또는 이것을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 류신 내성의 E. coil주(예를 들면, 57주(VKPM B-7386, 미국 특허 제6,124,121호)) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신 등의 류신 아날로그 내성 E. coli주(일본 공보특허 제(소)62-34397호 및 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호), 제WO 96/06926호에 기재된 유전자 공학적 방법으로 수득된 E. coli주, E. coli H-9068(일본 공개특허공보 제(평)8-70879호) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

L-류신 생산균은, L-류신 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 좋다. 이러한 유전자의 예로는, 바람직하게는 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필말레이트 신타제를 코딩하는 변이 leuA 유전자(미국 특허 제6,403,342호)로 대표되는, leuABCD 오페론의 유전자를 들 수 있다. 또한, L-류신 생산균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 코딩하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 좋다. 이러한 유전자의 예로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)(EP 1239041 A2)를 들 수 있다.

코리네형 세균의 L-류신 생산균으로서는, 2-티아졸알라닌 또한 β-하이드록시류신 내성주(일본 공개특허공보 제(평)8-266295호), 발린 아날로그 내성주(일본 공개특허공보 제(소)63-248392호), 발린 요구성 주(일본 특허공보 제(소)38-4395호), S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC) 내성주(일본 특허공보 제(소)51-37347호), 페닐알라닌, 발린, 이소류신 요구성 주(일본 특허공보 제(소)54-36233호)를 들 수 있다.

(L-글루탐산 생산균)

L-글루탐산 생산균으로서 적합한 균주는, 예를 들면, L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증대되도록 개변하는 방법을 들 수 있다. L-글루탐산 생합성에 관여하는 효소로서는, 이러한 유전자의 예로서는, 글루타메이트 데하이드로게나제(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루타메이트 신테타제(gltAB), 이소시트레이트 데하이드로게나제(icdA), 아코니테이트 하이드라타제(acnA, acnB), 시트레이트 신타제(gltA), 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(ppc), 피루베이트 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루베이트 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루베이트 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세로 뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세레이트 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gapA), 트리오스 포스페이트 이소머라제(tpiA), 프룩토스 비스포스페이트 알도라제(fbp), 포스포프룩토 키나제(pfkA, pfkB), 글루코스 포스페이트 이소머라제(pgi) 등을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않는다.

시트레이트 신테타제 유전자, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 유전자, 이소시트르산 데하이드로게나제, 피루베이트 데하이드로게나제 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증대하도록 개변된 주의 예로서는, EP 1078989 A, EP 955368 A 및 EP 952221 A, EP 1033407 A에 공개된 것을 들 수 있다.

L-글루탐산 생산능을 부여하기 위한 개변은, L-글루탐산의 생합성 경로에서 분기하여 다른 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 좋다. L-글루탐산의 생합성 경로에서 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서는, 이소시트르산 리아제, α-케토글루타르산 데하이드로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 아세트락트산 신타제, 포름산아세틸 트랜스퍼라제, 락트산 데하이드로게나제, 글루탐산 데카르복실라제, 1-피롤린-5-카르복실산 데하이드로게나제 등을 들 수 있다.

예를 들면, α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성을 저하시키기 위해서는 당해 효소의 E1o 서브유닛을 코딩하는 sucA(odhA) 유전자를 사용하여 개변하면 좋다. α-케토글루타르산 데하이드로게나제 활성이 저하된 주로서, 예를 들면, 이하의 주를 들 수 있다.

브레비박테리움·락토퍼멘툼 ΔS주(국제공개 95/34672호 팜플렛)

브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ12821(FERM BP-4172; 프랑스 특허공보 제9401748호 명세서 참조)

브레비박테리움·플라붐 AJ12822(FERM BP-4173; 프랑스 특허공보 제9401748호 명세서 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12823(FERM BP-4174; 프랑스 특허공보 제9401748호 명세서 참조)

판토에아·아나나티스 AJ13601(FERM BP-7207)

클레브시엘라·플란티콜라 AJ13410 주(FERM BP-6617)

판토에아·아나나티스 AJ13355(FERM BP-6614)

를 들 수 있다.

여기에서, Pantoea ananatis 판토에아·아나나티스 AJ13356은, αKGDH-E1 서브유닛 유전자(sucA)의 파괴에 의해 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결손되어 있다. 이 주는, 단리되었을 때에는, Enterobacter agglomerans 엔테로박터·아글로메란스로 동정되고, Enterobacter agglomerans 엔테로박터·아글로메란스 AJ13356으로서 기탁되었다. 그러나, 16S rRNA의 염기 배열 등에 기초하여, Pantoea ananatis 판토에아·아나나티스로 재분류되었다. AJ13356은, 상기 기탁 기관에 Enterobacter agglomerans 엔테로박터·아글로메란스로서 기탁되어 있지만, 본 명세서에서는, Pantoea ananatis 판토에아·아나나티스로서 기재한다.

또한 코리네형 세균에 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법으로서, yggB 유전자(NCgl 1221; NP_600492. Reports small-conductance...[gi: 19552490]; WO2006/070944)를 증폭시키는 방법, 코딩 영역 내로 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법을 사용하는 것도 가능하다.

L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 다른 방법으로서, 유기산 아날로그나 호흡 저해제 등에 대한 내성을 부여하는 방법이나 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 들 수 있다. 예를 들면, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)50-113209호), 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)57-065198호), 우레아제를 약화시키는 방법(일본 공개특허공보 제(소)52-038088호), 말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)52-038088호), 벤조피론 또는 나프토퀴논류에 대한 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)56-1889호), HOQNO 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)56-140895호), α-케토말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)57-2689호), 구아니딘 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(소)56-35981호), 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 제(평)4-88994호) 등을 들 수 있다.

이러한 내성균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.

브레비박테리움·플라붐 AJ3949(FERM BP-2632: 일본 공개특허공보 제(소)50-113209호 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11628(FERM P-5736; 일본 공개특허공보 제(소)57-065198호 참조)

브레비박테리움·플라붐 AJ11355(FERM P-5007; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11368(FERM P-5020; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호 참조)

브레비박테리움·플라붐 AJ11217(FERM P-4318; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11218(FERM P-4319; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호 참조)

브레비박테리움·플라붐 AJ11564(FERM P-5472; 일본 공개특허공보 제(소)56-140895호 참조)

브레비박테리움·플라붐 AJ11439(FERM P-5136; 일본 공개특허공보 제(소)56-35981호 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 H7684(FERM BP-3004; 일본 공개특허공보 제(평)04-88994호 참조)

브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ11426(FERM P-5123; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호 참조)

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ11440(FERM P-5137; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호 참조)

브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ11796(FERM P-6402; 일본 공개특허공보 제(평)58-158192호 참조)

(L-스레오닌 생산균)

L-스레오닌 생산균으로서 바람직한 것으로서는, L-스레오닌 생합성계 효소를 강화한 장내 세균과에 속하는 세균을 들 수 있다. L-스레오닌 생합성계 효소를 코딩하는 유전자로서는, 아스파르토 키나제 III 유전자(lysC), 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), thr 오페론에 포함되는 아스파르토 키나제 I 유전자(thrA), 호모세린 키나제 유전자(thrB), 스레오닌 신타제 유전자(thrC)를 들 수 있다. 이들 유전자는 2종류 이상 도입해도 좋다. L-스레오닌 생합성계 유전자는, 스레오닌 분해가 억제된 장내 세균과에 속하는 세균에 도입해도 좋다. 스레오닌 분해가 억제된 에세리키아속 세균으로서는, 예를 들면, 스레오닌 데하이드로게나제 활성이 결손된 TDH6주(일본 공개특허공보 제2001-346578호) 등을 들 수 있다.

L-스레오닌 생합성계 효소는, 최종 산물인 L-스레오닌에 의해 효소 활성이 억제된다. 따라서, L-스레오닌 생산균을 구축하기 위해서는, L-스레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 L-스레오닌 생합성계 유전자를 개변하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 thrA, thrB, thrC 유전자는, 스레오닌 오페론을 구성하고 있지만, 스레오닌 오페론은 아테뉴에이터 구조를 형성하고 있으며, 스레오닌 오페론의 발현은, 배양액 중의 이소류신, 스레오닌에 의해 저해를 받고, 또한, 아테뉴에이션에 의해 발현이 억제된다. 이 아테뉴에이션의 해제 또는 저감 개변은, 아테뉴에이션 영역의 리더 배열 또는 아테뉴에이터를 제거함으로써 달성할 수 있다(Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194: 59-69(1987); 국제공개 제02/26993호 팜플렛; 국제공개 제 2005/049808호 팜플렛 참조).

스레오닌 오페론의 상류에는, 고유의 프로모터가 존재하지만, 비고유(non-native)의 프로모터로 치환해도 좋고(WO98/04715호 팜플렛 참조), 스레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되는 스레오닌 오페론을 구축해도 좋다(유럽 특허 제0593792호 명세서 참조). 또한, L-스레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 에세리키아속 세균을 개변하기 위해, α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV)에 내성인 균주를 선발함으로써도 수득된다.

이와 같이 L-스레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 스레오닌 오페론은, 숙주 내에서 카피수가 상승하고 있거나, 또는 강력한 프로모터에 연결하여, 발현량이 증대되고 있는 것이 바람직하다. 카피수의 상승은, 플라스미드에 의한 증폭 외에, 트랜스포존, Mu-파지 등으로 게놈 위에 스레오닌 오페론을 전이시킴으로써도 달성할 수 있다.

또한, 아스파르토 키나제 III 유전자(lysC)는, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변한 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 피드백 저해를 받지 않도록 개변한 lysC 유전자는, 미국 특허 제5,932,453호 명세서에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있다.

L-스레오닌 생합성계 효소 이외에도, 해당계, TCA 회로, 호흡쇄에 관한 유전자나 유전자의 발현을 제어하는 유전자, 당 흡수 유전자를 강화하는 것도 적합하다. 이러한 L-스레오닌 생산에 효과가 있는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB)(유럽 특허 제733712호 명세서), 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(pepC)(국제공개 제95/06114호 팜플렛), 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps)(유럽 특허 제877090호 명세서), 코리네형 세균 또는 바실러스속 세균의 피루브산 카르복실라제 유전자(국제공개 제99/18228호 팜플렛, 유럽 출원공개 제1092776호 명세서)를 들 수 있다.

또한, L-스레오닌에 내성을 부여하는 유전자, 및/또는 L-호모세린에 내성을 부여하는 유전자의 발현을 증강시키는 것과, 숙주에 L-스레오닌 내성, 및/또는 L-호모세린 내성을 부여하는 것도 적합하다. 내성을 부여하는 유전자로서는, rhtA 유전자(Res. Microbiol. 154: 123-135(2003)), rhtB 유전자(유럽 특허출원공개 제 0994190호 명세서), rhtC 유전자(유럽 특허출원공개 제1013765호 명세서), yfiK, yeaS 유전자(유럽 특허출원공개 제1016710호 명세서)를 들 수 있다. 또한 숙주에 L-스레오닌 내성을 부여하는 방법은, 유럽 특허출원공개 제0994190호 명세서나, 국제공개 제90/04636호 팜플렛에 기재된 방법을 참조할 수 있다.

L-스레오닌 생산균으로서, 에세리키아·콜리 VKPM B-3996주(미국 특허 제5,175,107호 명세서 참조)를 예시할 수 있다. 이 VKPM B-3996주는, 1987년 11월 19일에 러시안·내셔널·컬렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오가니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika) (주소: Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)에 등록 번호 VKPM B-3996하에 기탁되어 있다. 또한, 이 VKPM B-3996주는, 스트렙토마이신 내성 마커를 갖는 광역 벡터 플라스미드 pAYC32(Chistorerdov, A. Y., and Tsygankov, Y. D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)를 참조)에 스레오닌 생합성계 유전자(스레오닌 오페론: thrABC)를 삽입하여 수득된 플라스미드 pVIC40(국제공개 제90/04636호 팜플렛)을 유지하고 있다. 이 pVIC40에 있어서는, 스레오닌 오페론 중의 thrA가 코딩하는 아스파르토 키나제 I-호모세린 데하이드로게나제 I의 L-스레오닌에 의한 피드백 저해가 해제되어 있다.

또한, 에세리키아·콜리 VKPM B-5318주(유럽 특허 제0593792호 명세서 참조)도 적합한 L-스레오닌 생산균으로서 예시할 수 있다. VKPM B-5318주는, 1990년 5월 3일에 러시안·내셔널·컬렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오가니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)에 등록 번호 VKPM B-5318하에 기탁되어 있다. 또한, 이 VKPM B-5318주는, 이소류신 비요구성 균주이며, 람다파지의 온도 감수성 C1 리프레서, PR 프로모터 및 Cro 단백질의 N 말단 부분의 하류에, 본래 갖는 전사 조절 영역인 아테뉴에이터 영역을 결실한 스레오닌 오페론 즉 스레오닌 생합성 관여 유전자가 위치하며, 스레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되도록 구축된 재조합 플라스미드 DNA를 유지하고 있다.

(L-아르기닌 생산균)

L-아르기닌 생산균 및 L-아르기닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, E. coli 237주(VKPM B-7925)(미국 특허출원공개 2002/058315 A1) 및 변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 유지하는 이의 유도주(러시아 특허출원 제2001112869호), E. coli 382주(VKPM B-7926)(EP 1170358 A1), N-아세틸글루타메이트 신테타제를 코딩하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산주(EP 1170361 A1) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

L-아르기닌 생산균 및 L-아르기닌 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-아르기닌 생합성계 효소를 코딩하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 유전자(argC), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제 유전자(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 유전자(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자(argD), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 유전자(argF), 아르기노석신산 신테타제 유전자(argG), 아르기노석신산 리아제 유전자(argH), 카바모일 포스페이트 신테타제 유전자(carAB)를 들 수 있다.

L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, 코리네형 세균 야생주; 설파제, 2-티아졸알라닌 또는 α-아미노-β-하이드록시발레르산 등의 약제에 내성을 갖는 코리네형 세균; 2-티아졸알라닌 내성에 더하여, L-히스티딘, L-프롤린, L-스레오닌, L-이소류신, L-메티오닌 또는 L-트립토판 요구성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)54-44096호); 케토말론산, 플루오로말론산 또는 모노플루오로아세트산에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)57-18989호); 아르기니놀에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(소)62-24075호); X-구아니딘(X는 지방산 또는 지방쇄의 유도체)에 내성을 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(평)2-186995호) 등을 들 수 있다. 또한, L-아르기닌의 리프레서를 결손한 코리네형 세균(미국 특허출원공개 제2002-0045233호 명세서) 및, 글루탐산 데하이드로게나제 활성을 상승시킨 코리네형 세균(유럽 특허출원공개 제1057893호 명세서)도, L-아르기닌 생산에 적합한 균주이다.

구체적으로는, 브레비박테리움·플라붐 AJ11169(FERM BP-6892), 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092(FERM BP-6906), 브레비박테리움·플라붐 AJ11336(FERM BP-6893), 브레비박테리움·플라붐 AJ11345(FERM BP-6894), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ12430(FERM BP-2228)을 들 수 있다. AJ11169주 및 AJ12092주는 일본 공개특허공보 제(소)54-44096호에 기재된 2-티아졸알라닌 내성주, AJ11336주는 일본 특허공보 제(소)62-24075호에 기재된 아르기니놀 내성 및 설파다이아진 내성을 갖는 주, AJ11345주는 일본 특허공보 제(소)62-24075호에 기재된 아르기니놀 내성, 2-티아졸알라닌 내성, 설파구아니딘 내성, 및 히스티딘 요구성을 갖는 주 및 AJ12430주는 일본 공개특허공보 제(평)2-186995호에 기재된 옥틸구아니딘 내성 및 2-티아졸알라닌 내성을 갖는 주이다.

코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092(FERM BP-6906)는, 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092주라고 명명되고, 1983년 09월 29일자로 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허생물기탁센터, 우292-0818 일본국 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 120호실)에 수탁 번호 FERM P-7273으로서 기탁되고, 1999년 10월 01일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 수탁 번호 FERM BP-6906이 부여되어 있다.

L-아르기닌 생산능을 갖는 에세리키아속 세균으로서는, argA 유전자가 도입된 에세리키아·콜리(일본 공개특허공보 제(소)57-5693호 참조)나 아세트산 자화성 변이주의 L-아르기닌 생산성 유도체인 에세리키아·콜리 237주(러시아 특허출원 공보 제2000117677호)를 들 수 있다. 237주는, 2000년 4월 10일에 러시안·내셔널·컬렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오가니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika, 주소: Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhnyproezd 1)에 VKPM B-7925의 번호로 기탁되고, 2001년 5월 18일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되었다. 237주의 유도체인 L-아르기닌에 의한 피드백 저해에 내성인 변이를 갖는 주인 382주(일본 공개특허공보 제2002-017342호)를 사용할 수도 있다. 에세리키아·콜리 382주는, 2000년 4월 10일에 러시안·내셔널·컬렉션·오브·인더스트리얼·마이크로오가니즘즈에 VKPM B-7926의 번호로 기탁되고, 2001년 5월 18일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되었다.

L-아르기닌 생산능을 갖는 세라티아속 세균으로서는, L-아르기닌 분해능을 결손하고, 아르기닌의 안타고니스트 및 카나바닌에 내성을 가지며, 리신을 요구하는 세라티아·마르세센스(일본 공개특허공보 제(소)52-8729호 참조)를 들 수 있다.

(L-히스티딘 생산균)

L-히스티딘 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, E. coli 24주(VKPM B-5945, RU2003677), E. coli 80주(VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 내지 B-12121(미국 특허 제4,388,405호), E. coli H-9342(FERM BP-6675) 및 H-9343(FERM BP-6676)(미국 특허 제6,344,347호), E. coli H-9341(FERM BP-6674) (EP1085087), E. coli AI80/pFM201(미국 특허 제6,258,554호) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

L-히스티딘 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-히스티딘 생합성계 효소를 코딩하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, ATP 포스포리보신 트랜스퍼라제(hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로 하이드롤라제 유전자(hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제 유전자(hisIE), 포스포리보실포르미미노-5-아미노이미다졸 카르복사미드 리보타이드 이소머라제 유전자(hisA), 아미드 트랜스퍼라제 유전자(hisH), 히스티디놀 포스페라이트아미노 트랜스퍼라제 유전자(hisC), 히스티디놀 포스파타제 유전자(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자(hisD) 등을 들 수 있다.

hisG 및 hisBHAFI로 코딩되는 L-히스티딘 생합성계 효소는 L-히스티딘에 의해 저해되는 것이 알려져 있으며, 따라서, L-히스티딘 생산능은, ATP 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(hisG)에 피드백 저해에 대한 내성을 부여하는 변이를 도입함으로써 효율적으로 증대시킬 수 있다(러시아 특허 제2003677호 및 제2119536호).

L-히스티딘 생산능을 갖는 주의 구체예로서는, L-히스티딘 생합성계 효소를 코딩하는 DNA를 유지하는 벡터를 도입한 E. coli FERM-P 5038 및 5048(일본 공개특허공보 제(소)56-005099호), 아미노산 수송 유전자인 rht를 도입한 E. coli주(EP1016710A), 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 E. coli 80주(VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호) 등을 들 수 있다.

(L-시스테인 생산균)

L-시스테인 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는, 피드백 저해 내성의 세린아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 상이한 cysE 알레르기로 형질 전환된 E. coli JM15(미국 특허 제6,218,168호, 러시아 특허출원 제2003121601호), 세포로 독성 물질을 배출하기에 적합한 단백질을 코딩하는 과잉 발현 유전자를 갖는 E. coli W3110(미국 특허 제5,972,663호), 시스테인 데설포하이드라제 활성이 저하된 E. coli주(JP11155571A2), cysB 유전자에 의해 코딩되는 양의 시스테인레귤론의 전사 조절 인자의 활성이 상승된 E. coli W3110(WO0127307A1) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

(L-세린 생산균)

L-세린 생산균을 유도하기 위한 친주의 예로서는 포스포세린 포스파타제 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제2001-275689호, 일본 공개특허공보 제(평)11-253187호), 아자세린 또는 β-(2-티에닐)-DL-알라닌에 내성을 갖는 L-세린 생산능을 갖는 코리네형 세균에 유래하는 저해 해제된 D-3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 갖는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(평)11-266881호), 아자세린 또는 티에닐알라닌에 내성을 나타내고, 또한 세린 분해능을 결실하고 세린을 생산하는 코리네형 세균(일본 공개특허공보 제(평)10-248588호)을 들 수 있다.

다음에, 미생물에 핵산 생산능을 부여하는 방법과 핵산 생산균에 관해서 예시한다.

핵산 생산능을 갖는 미생물은, 상기와 같은 미생물에, 예를 들면, 푸린 뉴클레오시드 요구성, 또는 푸린 아날로그 등의 약제에 대한 내성을 부여함으로써, 취득할 수 있다(일본 특허공보 제(소)38-23099호, 일본 특허공보 제(소)54-17033호, 일본 특허공보 제(소)55-45199호, 일본 특허공보 제(소)57-14160호, 일본 특허공보 제(소)57-41915호, 일본 특허공보 제(소)59-42895호 참조). 예를 들면, 영양 요구 성 및 약제 내성을 갖는 바실러스속 세균은, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG), 또는 EMS(에틸메탄설포네이트) 등의 통상의 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 취득할 수 있다.

푸린 뉴클레오시드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 들 수 있다.

바실러스속에 속하는 이노신 생산주의 구체예로서, 바실러스·서브틸리스 KMBS16주를 사용할 수 있다. 동 균주는 푸린 오페론 리프레서를 코딩하는 purR 유전자의 결손(purR::spc), 석시닐-AMP 신타제를 코딩하는 purA 유전자의 결손(purA::erm) 및 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제를 코딩하는 deoD 유전자 결손(deoD::kan)이 도입된, 이미 알려진 바실러스·서브틸리스 trpC2주(168 Marburg)의 유도체이다(일본 공개특허공보 제2004-242610호, US 2004166575 A1). 또한, 바실러스·서브틸리스 균주 AJ3772(FERM P-2555)(일본 공개특허공보 제(소)62-014794호) 등을 사용할 수도 있다.

구아노신 생산능을 갖는 바실러스속 세균으로서는, IMP 탈수소 효소의 활성이 상승된 바실러스속 세균(일본 공개특허공보 제(평)3-58787호), 푸린 아날로그 내성 또는 데코이닌 내성 유전자가 편입되어 있는 벡터를 아데닌 요구성 변이주에 도입한 바실러스속 세균(일본 특허공보 제(평)4-28357호) 등을 들 수 있다.

또한, 푸린 뉴클레오티드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 들 수 있다.

이노신산 생산균으로서는, 바실러스·서브틸리스의 포스파타제 활성이 약화된 이노신 생산주가 보고되어 있다(Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805, Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). 구아닐산 생산균으로서는, 아데닌 요구성을 가지며 또한 데코이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 내성을 가지며, 또한 5'-구아닐산(구아노신-5'-모노인산, 이하 「GMP」라고도 한다) 생산능을 갖는 바실러스속의 변이주를 들 수 있다(일본 특허공보 제(소)56-12438호).

또한, 크산틸산 생산균은, 코리네박테리움·암모니아게네스(Corynebacterium ammmoniagenes)를 중심으로 하는 코리네형 세균의 육종에 사용되는 방법을 사용하여 구축할 수 있다. 예를 들면, PRPP amidotransferase를 강화주(일본 공개특허공보 제(평)8-168383호), 지방족 아미노산 내성주(일본 공개특허공보 제(평)4-262790호), 데하이드로프롤린 내성주(한국 특허공개공보 제2003-56490호)를 취득함으로써, 크산틸산 생산균을 구축할 수 있다.

또한, 푸린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균을 육종하는 방법으로서, 이하의 방법을 들 수 있다. 푸린 뉴클레오시드 및 푸린 뉴클레오티드에 공통의 푸린 생합성에 관여하는 효소, 즉 푸린 생합성 효소의 세포 내에서의 활성을 상승시키는 방법을 들 수 있다.

상기 푸린 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, 포스포리보실 피로인산아미드 트랜스퍼라제, 포스포리보실 피로인산 신테타제(PRPP synthetase [EC: 2.7.6.1]) 등을 들 수 있다.

펜토스인산계로 도입되는 글루코스 등의 당원이 대사에 의해 생성된 카타볼라이트의 일부는, 리블로스-5-인산을 경유하여, 리보스-5-인산이 된다. 생합성된 리보스-5-인산으로부터, 푸린 뉴클레오시드, 히스티딘, 및 트립토판 생합성의 불가결한 전구 물질인 포스포리보실 피로인산(PRPP)이 생성된다. 구체적으로는, 리보스-5-인산은, 포스포리보실 피로인산 신테타제에 의해 PRPP로 전환된다. 따라서, 포스포리보실 피로인산 신테타제의 활성이 상승하도록 개변함으로써, 바실러스속 세균에 푸린계 물질 생산능을 부여 또는 증강시킬 수 있다.

포스포리보실 피로인산 신테타제의 활성은 예를 들면, Switzer 등의 방법(Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11), Roth 등의 방법(Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17)에 의해, 측정할 수 있다. 포스포리보실 피로인산 신테타제의 활성이 상승된 바실러스속 세균은, 예를 들면, 일본 공개특허공보 제2004-242610호에 기재된 방법과 같이 하여, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 포스포리보실 피로인산 신테타제를 코딩하는 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시킴으로써 제작할 수 있다.

한편, 푸린 뉴클레오시드, 히스티딘 및 트립토판 생합성에 불가결한 전구 물질인 PRPP가 생성되면, 그 일부는, 푸린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 푸린 뉴클레오티드, 푸린 뉴클레오시드로 변환된다. 그러한 효소군을 코딩하는 유전자로서는, 바실러스·서브틸리스의 푸린 오페론, 구체적으로는 purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD 오페론의 유전자(Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem. 1987, 262, 17, 8274-87)(현재는, purEKBCSQLFMNHD라고도 불린다: Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002. GenBank Accession No. NC_000964), 및 에세리키아·콜리의 pur 레귤론의 유전자(Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996)가 예시된다.

따라서, 이들 유전자의 발현을 증강시킴으로써, 푸린계 물질 생산능을 부여 또는 증강시킬 수도 있다. 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 푸린 오페론 유전자는 이러한 것으로는 한정되지 않으며, 다른 미생물이나 동식물 유래의 유전자도 이용할 수도 있다.

푸린 오페론의 발현량을 증대시키는 방법으로서는, 플라스미드를 사용하는 방법과 염색체 위에 편입하는 방법 등에 의해, 푸린 오페론 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시키는 방법을 들 수 있다.

푸린 오페론의 발현량을 증대시키는 제2 방법으로서, 푸린 오페론 고유의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환하는 것이나, 고유의 프로모터의 -35, -10 영역을 콘센서스 배열로 치환하는 것을 들 수 있다.

예를 들면, 바실러스·서브틸리스(B. subtilis 168 Marburg 주; ATCC6051)는, 푸린 오페론의 -35 배열은 콘센서스 배열(TTGACA)이지만, -10 배열은 TAAGAT이며, 콘센서스 배열 TATAAT와는 상이하다(Ebbole, D.J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287). 따라서, -10 배열(TAAGAT)을 콘센서스 배열 또는 콘센서스 배열에 근접시킴으로써, TATAAT 또는 TATGAT 또는 TAAAAT가 되도록 개변함으로써, 푸린 오페론의 전사 활성을 상승시킬 수 있다. 또한, 프로모터 배열의 치환은, 하기의 유전자 치환과 같은 방법으로 실시할 수 있다.

푸린 오페론의 발현량을 증대시키는 제3 방법으로서, 푸린 오페론의 리프레서의 발현량을 저하시키는 방법도 들 수 있다(USP 제6,284,495호).

푸린 오페론의 리프레서(푸린 리프레서)의 발현량을 저하시키기 위해서는, 예를 들면, 바실러스속 세균을 자외선 조사 또는 NTG 또는 EMS 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 처리하고, 푸린 리프레서의 발현량이 저하된 변이주를 선택하는 방법을 채용할 수 있다.

또한, 푸린 리프레서의 발현량이 저하된 바실러스속 세균은, 변이 처리 외에, 예를 들면, 유전자 재조합법을 사용한 상동 재조합법(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202)에 의해, 염색체 위의 푸린 리프레서를 코딩하는 유전자(purR; GenBank Accession NC_000964)를, 정상적으로 기능하지 않는 유전자(이하,「파괴형 유전자」라고 하는 경우가 있다)로 치환함으로써 수득할 수 있다.

또한, 푸린계 물질의 세포 내로의 흡수를 약화함으로써도, 푸린계 물질 생산능을 강화할 수 있다. 예를 들면, 푸린 뉴클레오시드의 세포 내로의 흡수는, 푸린 뉴클레오시드의 세포 내로의 흡수에 관여하는 반응을 차단함으로써 약화시킬 수 있다. 상기 푸린 뉴클레오시드 세포 내로의 흡수에 관여하는 반응은, 예를 들면, 뉴클레오시드 퍼미아제로 촉매되는 반응이다.

또한, 푸린 뉴클레오시드를 제조하는 경우에는, 푸린 뉴클레오시드 생산능을 증강시키기 위해 푸린계 물질을 분해하는 효소의 활성을 저하시켜도 좋다. 이러한 효소로서, 예를 들면, 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제를 들 수 있다.

PRPP로부터, 푸린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 생합성된 푸린 뉴클레오티드는, 탈인산화되어, 푸린 뉴클레오시드로 변환된다. 푸린 뉴클레오시드를 효율적으로 축적시키기 위해서는, 푸린 뉴클레오시드를 다시 분해하여 히포크산틴 등으로 하는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제의 활성을 저하시키는 것이 바람직하다. 즉, 이노신을 비롯한 푸린 뉴클레오시드를 기질로 하는 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제를 약화, 또는 결손시키도록 개변하는 것이 바람직하다.

푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제 활성의 저하는, 구체적으로는, 바실러스속 세균으로 푸린 뉴클레오시드 포스포릴라제를 코딩하는 deoD 유전자와 pupG 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 바실러스속 세균은, 상기와 같은 deoD 유전자와 pupG 유전자를 단독, 또는 동시에 파괴하도록 개변된 것이라도 좋다. deoD 유전자, pupG 유전자, 예를 들면, 바실러스속 유래의 유전자(deoD; GenBank Accession No. NC_000964, pupG; GenBank Accession No. NC_000964)를 이용할 수 있다.

또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키기 위해, 석시닐-AMP 신타제의 활성을 저하시켜도 좋다. 석시닐-AMP 신타제를 코딩하는 유전자로서는, purA 유전자를 들 수 있다. purA 유전자로서는, 예를 들면, GenBank Accession No. NC_000964(코딩 영역은 상보쇄의 염기 번호 4153460-4155749)로 등록되어 있는 염기 배열을 갖는 것을 들 수 있다.

또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키기 위해, 이노신모노인산(IMP) 탈수소 효소의 활성을 저하시켜도 있다. IMP 탈수소 효소를 코딩하는 유전자로서는, guaB 유전자를 들 수 있다. guaB 유전자로서는, 예를 들면, GenBank Accession No.NC_000964(코딩 영역은 15913-17376)로 등록된 염기 배열을 갖는 것을 들 수 있다.

또한, 푸린계 물질 생산능을 증강시키는 방법으로서, 푸린계 물질을 배출하는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키는 것을 생각할 수 있다. 이와 같은 유전자가 증폭된 세균으로서는, 예를 들면, rhtA 유전자를 증폭시킨 바실러스속 세균을 들 수 있다(일본 공개특허공보 제2003-219876호).

본 발명에 사용할 수 있는 미생물로서 보다 구체적인 예로는, 예를 들면, 목적 물질이 L-리신인 경우에는 에세리키아·콜리 AJ11442(NRRL B-12185, FERM BP-1543)(미국 특허 제4,346,170호 참조), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ3990(ATCC31269)(미국 특허 제4,066,501호 참조) 등이, L-스레오닌인 경우에는 에세리키아·콜리 VKPM B-3996(RIA 1867, VKPM B-3996)(미국 특허 제5,175,107호 참조), 코리네박테리움·아세토아시도필룸 AJ12318(FERM BP-1172)(미국 특허 제5,188,949호 참조) 등이, L-페닐알라닌인 경우에는, 에세리키아·콜리 AJ12604(FERM BP-3579)(유럽 특허출원공개 제488,424호 참조), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ12637(FERM BP-4160)(프랑스 특허출원공개 제2,686,898호 참조) 등이, L-글루탐산인 경우에는, 에세리키아·콜리 AJ12624(FERM BP-3853)(프랑스 특허출원공개 제2,680,178호 참조), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ12475(FERM BP-2922)(미국 특허 제5,272,067호 참조) 등이, L-류신인 경우에는, 에세리키아·콜리 AJ11478(FERM P-5274)(일본 특허공보 제(소)62-34397호 참조), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ3718(FERM P-2516)(미국 특허 제3,970,519호 참조) 등이, L-이소류신인 경우에는, 에세리키아·콜리 KX141(VKPM B-4781)(유럽 특허출원공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움·플라붐 AJ12149(FERM BP-759)(미국 특허 제4,656,135호 참조) 등이, L-발린인 경우에는, 에세리키아·콜리 VL1970(VKPM B-4411))(유럽 특허출원공개 제519,113호 참조), 브레비박테리움·락토퍼멘툼 AJ12341(FERM BP-1763)(미국 특허 제5,188,948호 참조) 등이, L-아르기닌인 경우에는, 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092(FERM BP-6906)가 포함된다.

본 발명을 사용한 목적 물질의 생산은, 발효 중의 전 배양 공정 중 적어도 필요한 시간, 즉 적어도 일부의 기간 동안, 암모니아의 농도를 일정 농도의 범위로 제어함으로써 배양할 수 있다.

발효 중의 전 배양 공정 중 적어도 필요한 시간이란, 암모니아 농도를 일정 농도로 제어하여 배양해야 하는 시간을 의미하지만, 특히 바람직하게는 물질의 생산을 실시하고 있는 시간으로 제어하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 방법이, 물질 생산능을 갖는 미생물을 증식시키는 단계(성장기)와 물질을 산생시키는 단계(물질 생산기)를 포함하는 경우, 물질 생산기에 암모니아 농도를 일정 농도로 제어해도 좋고, 미생물을 증식시키는 증식기에 있어서는, 암모니아 농도를 일정 이하로 제어하여 배양해도 좋고, 제어하지 않아도 좋다.

본 발명에 있어서의 「증식기」란, 배양 개시로부터 3시간, 바람직하게는 6시간, 특히 바람직하게는 10시간 이내의, 탄소원이 주로 균체 생육에 사용되고 있는 시기, 즉 미생물이 대수적 증식되고 있는 시기를 의미하며, 본 발명에 있어서의 「생산기」란, 배양 개시로부터 3시간 이후, 바람직하게는 6시간 이후, 특히 바람직하게는 10시간 이후 탄소원이 주로 물질 생산에 사용되고 있는 시기를 의미한다.

일정 농도의 범위란, 암모니아의 농도를 일정 범위로 제어하여 배양하는 방법, 어떤 농도 이하로 설정하여 배양하는 방법, 어느 것에 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 중탄산 이온 및 또는 탄산 이온을 아미노산의 카운터 이온이 되도록 배양하는 방법에도 적용할 수 있다(이하 탄산염 발효라고 기재한다). 또한, L-리신 등의 염기성 아미노산을 제조할 때에는, 발효 중의 발효조 내 압력이 양이 되도록 제어하거나, 또는 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하여, 배지 중의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 적어도 20mM 이상 존재하는 배양기가 있도록 하고, 상기 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을, 염기성 아미노산을 주로 하는 양이온의 카운터 이온으로 하는 방법으로 발효하여, 목적의 염기성 아미노산을 회수하는 방법으로 제조해도 좋다(일본 공개특허공보 제2002-65287호, US 2002-0025564 A, EP 1813677 A).

상기 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을, 염기성 아미노산의 카운터 이온으로 하는 방법으로 발효하고, 목적의 염기성 아미노산을 회수하는 방법으로 제조하는 방법에 있어서의, 발효 중의 전 배양 공정 중 적어도 필요한 시간이란, 원하는 생산성이 수득되는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는, 예를 들면, 본 배양에 있어서의 전 배양 공정의 1/10 이상, 바람직하게는 1/5 이상을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 목적의 염기성 물질의 축적에 대해, 배지에 사용되는 황산 및 염화물 이온 등의 카운터 이온이 부족해짐으로써 배지의 pH가 상승하는 기간이 포함된다.

탄산염 발효에 있어서는, 발효 중의 발효조 내의 압력이 양이 되도록 제어하는 것, 및/또는 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하는 것을 모두 실시해도 좋다. 어떠한 경우에도, 배지 중의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이, 바람직하게는 20mM 이상, 보다 바람직하게는 30mM 이상, 특히 바람직하게는 40mM 이상 존재하는 배양기가 있도록 하는 것이 바람직하다. 발효조 내 압력, 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스의 공급량, 또는 제한된 급기량(給氣量)은, 예를 들면, 배지 중의 중탄산 이온 또는 탄산 이온을 측정하는 것이나, pH 및 암모니아 농도를 측정함으로써, 결정할 수 있다.

탄산염 발효에 의하면, 종래의 방법에 비해, 카운터 이온으로서 필요한 양의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 배지 중에 존재시키기 위한 배지의 pH를 낮게 억제하는 것이 가능해진다. 암모니아로 pH를 제어하는 경우, pH를 높이기 위해 암모니아가 공급되고, 염기성 아미노산의 N원이 될 수 있다. 배지에 포함되는 염기성 아미노산 이외의 양이온으로서는, 배지 성분 유래의 K, Na, Mg, Ca 등을 들 수 있다. 이들은 바람직하게는 총 양이온의 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하인 것이 바람직하다.

또한, 발효 중의 발효조 내 압력이 양이 되도록 하기 위해서는, 예를 들면, 급기압(給氣壓)을 배기압보다 높게 하면 좋다. 발효조 내 압력을 양으로 함으로써, 발효에 의해 생성되는 탄산 가스가 배양액에 용해되어, 중탄산 이온 또는 탄산 이온을 생성하고, 이들은 염기성 아미노산의 카운터 이온이 될 수 있다. 발효조 내 압력으로서 구체적으로는, 게이지압(대기압에 대한 차압)으로, 0.03 내지 0.2MPa, 바람직하게는 0.05 내지 0.15MPa, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.3MPa를 들 수 있다. 또한, 배양액에 탄산 가스, 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 공급함으로써, 배양액에 탄산 가스를 용해시켜도 좋다. 또한, 배양액에 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 공급하면서, 발효조 내 압력이 양이 되도록 조절해도 좋다.

발효조 내 압력을 양으로 조절하기 위해서는, 예를 들면, 급기압을 배기압보다도 높게 하도록 설정하면 좋다. 구체적으로는 산소 분압을 이산화탄소 분압보다 높게 설정하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 배양액에 탄산 가스를 공급하는 경우에는, 예를 들면, 순탄산 가스, 또는 탄산 가스를 5체적% 이상 포함하는 혼합 가스를 불어 넣으면 좋다.

또한, 배지에 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 용해시키는 상기의 방법은, 단독이라도 좋고, 복수를 조합해도 좋다.

종래법에서는, 통상, 생성되는 염기성 아미노산의 카운터 음이온으로 하기 위해, 충분량의 황산암모늄이나 염화암모늄이, 또는, 영양 성분으로 단백 등의 황산 분해물 또는 염산 분해물이 배지에 첨가되고, 이들로부터 주어지는 황산 이온, 염화물 이온이 배지에 포함된다. 따라서, 약산성인 탄산 이온 농도는 배양 중 매우 낮고, ppm 단위이다. 본 발명의 상기 형태에서는, 이들 황산 이온, 염화물 이온을 감소시키고, 미생물이 발효 중에 방출하는 탄산 가스를 상기 발효 환경에서 배지 중에 용해시켜, 카운터 이온으로 하는 것에 특징이 있다. 따라서, 본 발명의 상기 형태에 있어서는, 황산 이온이나 염화물 이온을 생육에 필요한 양 이상 배지에 첨가할 필요는 없다. 바람직하게는, 배양 당초에는 황산암모늄 등을 배지에 적당량 피드하고, 배양 도중에 피드를 중지한다. 또는, 배지 중의 탄산 이온 또는 중탄산 이온의 용존량과의 균형을 유지하면서, 황산암모늄 등을 피드해도 좋다. 또한, 염기성 아미노산의 질소원으로서, 암모니아를 배지에 피드해도 좋다. 암모니아는, 단독으로, 또는 상기 다른 기체의 일부로서 함께 배지에 공급할 수 있다.

배지에 포함되는 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온 이외의 다른 음이온의 농도는, 미생물의 생육에 필요한 양이면, 낮은 것이 바람직하다. 이러한 음이온에는, 염화물 이온, 황산 이온, 인산 이온, 이온화된 유기산 및 수산화물 이온 등을 들 수 있다. 이러한 다른 이온의 몰 농도의 합계는, 바람직하게는 통상적으로 900mM 이하, 보다 바람직하게는 700mM 이하, 특히 바람직하게는 500mM 이하, 더욱 바람직하게는 300mM 이하, 특히 바람직하게는 200mM 이하이다.

본 발명의 상기 형태에 있어서는, 황산 이온, 및/또는 염화물 이온의 사용량을 삭감하는 것이 목적의 하나이며, 배지에 포함되는 황산 이온 또는 염화물 이온, 또는 이들의 합계는, 통상, 700mM 이하, 바람직하게는 500mM 이하, 보다 바람직하게는 300mM 이하, 더욱 바람직하게는 200mM 이하, 특히 바람직하게는 100mM 이하이다.

통상적으로는, 염기성 아미노산의 카운터 이온원으로서 배지에 황산암모늄을 첨가하면, 황산 이온에 의해 배양액 중의 탄산 가스가 방출되어 버린다. 이것에 대해, 본 발명의 상기 형태에 있어서는, 과잉량의 황산암모늄을 배지에 첨가할 필요가 없기 때문에, 탄산 가스를 발효액 중에 용이하게 용해시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 형태에 있어서는, 「염기성 아미노산의 생산을 저해하지 않을」정도로 배지 중의 총 암모니아 농도를 제어하는 것이 바람직하다. 그러한 조건으로서는, 예를 들면, 최적의 조건에 있어서 염기성 아미노산을 생산하는 경우의 수율 및/또는 생산성의 양에 비해, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상의 염기성 아미노산이 축적되는 경우와 같은 수율 및/또는 생산성이 수득되는 조건이 포함된다. 구체적으로는, 배지 중의 총 암모니아 농도로서는, 예를 들면, 300mM 이하, 250mM 이하, 200mM 이하, 100mM 이하, 또는 50mM 이하의 농도를 들 수 있다. 암모니아의 해리도는 pH가 높아지면 저하된다. 해리되지 않는 암모니아는, 암모늄 이온보다도 균에 대해 독성이 강하다. 이로 인해, 총 암모니아 농도의 상한은, 배양액의 pH에도 의존한다. 즉, 배양액의 pH가 높을수록, 허용되는 총 암모니아 농도는 낮아진다. 따라서, 상기 「염기성 아미노산의 생산을 저해하지 않는」 총 암모니아 농도는, pH별로 설정하는 것이 바람직하다. 그러나, 배양 중의 가장 높은 pH에 있어서 허용되는 총 암모니아 농도 범위를, 배양 기간을 통한 총 암모니아 농도의 상한값 범위로 해도 좋다.

한편, 미생물의 생육 및 염기성 물질의 생산에 필요한 질소원으로서의 총 암모니아 농도로서는, 배양 중에 암모니아가 계속 고갈되지 않는 질소원이 부족함으로써 미생물에 의한 목적 물질의 생산성을 저하시키지 않는 한 특별히 제한되지 않으며, 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면, 배양 중에 암모니아 농도를 경시적으로 측정하고, 배지 중의 암모니아가 고갈되면 소량의 암모니아를 배지에 첨가해도 좋다. 암모니아를 첨가했을 때의 농도로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 총 암모니아 농도로서 바람직하게는 1mM 이상, 보다 바람직하게는 10mM 이상, 특히 바람직하게는 20mM 이상의 농도를 들 수 있다.

또한, L-글루탐산 발효에 있어서는, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여, 배지 중에 L-글루탐산을 석출시키면서 배양을 실시할 수도 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0을 들 수 있다(유럽 특허출원공개 제1078989호 명세서).

실시예

본 발명 장치를 사용한 L-아르기닌의 생산

본 실시예에서는 코리네형 세균에 의한 L-아르기닌의 생산에 본 발명 장치를 사용한 암모니아 제어 배양을 응용하는 예를 나타낸다. L-아르기닌 생산주로서는 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092(FERM BP-6906)를 사용하였다.

본 실시예의 본 발명 장치는, 다음의 구성을 가진다.

암모니아 센서(10):

암모니아 투과막을 사용하는 내부 전극형 센서이며, 비이온화 암모니아에 응답하여 전압 변화를 일으킨다. 배양조(200)에 삽입된다.

암모니아 제어 장치(100):

기억부(106), 제어부(103), 암모니아 센서(10)와 접속된 신호 입력부(108) 및 암모니아 공급기(300)에 접속된 제어 출력부(104)를 갖는 컴퓨터를 사용한다. 기억부(106)는, 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도와 암모니아 센서(10)로부터의 전압의 관계를 나타내는 검량선을 기억한다. 제어부(102)는, 암모니아 센서(10)의 전압을 측정하고, 그 전압으로부터 검량선에 기초하여 배양조(200) 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 암모니아 농도 산출 스텝과, 산출된 비이온화 암모니아 농도가, 설정된 제어 농도를 하회하는 경우, 암모니아 공급기(300)에 배양조(200) 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 스텝을 실시한다.

암모니아 공급기(300):

황산암모늄 수용액을 수용한 용기를 가지고, 그 용기로부터 배양조로 황산암모늄 수용액을 롤러 펌프를 개재하여 적하할 수 있도록 설치하고, 암모니아 제어 장치(100)로부터의 신호에 기초하여, 설정된 적하 속도로 적하를 실시한다.

(1) 본 발명 장치의 이용에 의한 Arg 발효에 있어서의 암모니아 농도의 제어

배양의 진행과 함께 저하되는 배지 중의 총 암모니아 농도를, 본 발명 장치를 사용하여 일정하게 제어하여 L-아르기닌의 생산을 실시하였다. 그때, 제어하는 배지 중의 총 암모니아 농도로서 20mM, 100mM 및 300mM의 3조건을 설정하였다. 표 1에 기재한 L-아르기닌 생산 배지 300mL를 넣은 자 퍼멘터(jar fermenter)에 1N KOH를 적하하고, pH를 6.9로 조정하였다. L-아르기닌 생산 배지는 초발(初發)의 총 암모니아 농도가 각각 20mM, 100mM 및 300mM이 되도록 황산암모늄을 혼합하였다. 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092주를 표 2에 기재한 CM-Dex 한천 배지 전면에 도포하고, 31.5℃에서 24시간 배양한 후, 자 퍼멘터에 한천 배지 1장분에 생육한 균체를 식균하였다. 배양 온도를 31.5℃로 유지하고, 필터로 제균한 공기를 1분에 300mL 통기하고, 교반 속도는 700rpm으로 하여 실시하였다. 배양의 진행과 함께 저하되는 pH는 6N KOH를 첨가함으로써 6.9를 유지하였다. 또한, 배양의 진행과 함께, 저하되는 배지 중의 글루코스 농도는 40g/L 정도를 유지하도록, 별도로 살균한 692g/L의 글루코스 용액(0.05mL/L 소포제 GD-113을 포함)을 적절히 첨가하였다. 배양은 52시간 실시하였다. 비이온화 암모니아 농도가 설정값을 하회한 경우에는, 본 발명 장치에 의해 설정한 총 암모니아 농도가 되도록 황산암모늄 수용액의 적하가 자동으로 실시되고, 배양 중의 총 암모니아 농도를 일정하게 제어하였다. 구체적으로는, 자 퍼멘터에 삽입된 암모니아 센서에 의해 배지 중의 비이온화 암모니아 농도가 리얼 타임으로 계측되며, 별도로 살균한 450g/L의 황산암모늄 수용액이, 목적의 총 암모니아 농도를 유지하도록 암모니아 공급기로부터 자동으로 배지에 적하되었다. 그 결과, 본 발명 장치를 사용함으로써 도 7에 도시하는 바와 같이 목적으로 하는 비이온화 암모니아 농도와 총 암모니아 농도를 간편하고 자동으로 유지하여 Arg 발효를 실시할 수 있었다. 이때, 총 암모니아 농도 20mM 제어의 경우에는 0.77mL/hr, 100mM 제어의 경우에는 0.90mL/hr, 300mM 제어의 경우에는 1.30mL/hr의 속도로 450g/L의 황산암모늄 수용액이 적하되었다(배양 전체의 평균 속도). 300mM 제어의 경우에는, 배양 도중(8시간)에 배양액을 채취하고, 포함되는 암모늄 이온을 비해리형으로 하기에 충분한 알칼리성으로 되게 한 것을 사용하여, 외부 암모니아 센서에 의한 교정을 실시하였다.

본 결과로부터 L-아미노산의 발효 생산에 있어서, 본 발명 장치를 사용함으로써 매우 간편하고 자동적으로 배지 중의 암모니아 농도(비이온화 암모니아 농도 및 총 암모니아 농도)를 일정하게 제어하여 배양 가능한 것이 나타났다.

(2) 본 발명 장치의 이용에 의한 Arg 생산능의 향상

다음에, 본 발명 장치를 사용하여 총 암모니아 농도를 제어한 경우와 일반적인 인적 관리 방법으로 총 암모니아 농도를 제어한 경우의 Arg 생산량을 비교하였다. 이때, 제어하는 총 암모니아 농도로서 300mM을 설정하였다. 표 1에 기재한 L-아르기닌 생산 배지 300mL를 넣은 자 퍼멘터에 1N KOH를 적하하고, pH를 6.9로 조정하였다. L-아르기닌 생산 배지는 초발의 암모니아 농도가 300mM이 되도록 황산암모늄을 혼합한 것을 사용하였다. 코리네박테리움·글루타미쿰 AJ12092주를 표 2에 기재한 CM-Dex 한천 배지 전면에 도포하고, 31.5℃에서 24시간 배양한 후, 자 퍼멘터에 한천 배지 1장분에 생육한 균체를 식균하였다. 배양은, 온도를 31.5℃로 유지하고, 필터로 제균한 공기를 1분에 300mL 통기하고, 교반 속도는 700rpm으로 하여 실시하였다. 배양의 진행과 함께 저하되는 pH는 6N KOH를 첨가함으로써 6.9를 유지하였다. 또한, 배양의 진행과 함께, 저하되는 배지 중의 글루코스 농도는 40g/L 정도를 유지하도록, 별도로 살균한 692g/L의 글루코스 용액(0.05mL/L의 소포제 GD-113을 포함)을 적절히 첨가하였다. 배양은 52시간 실시하였다. 전항과 마찬가지로 본 발명 장치를 사용하여 총 암모니아 농도를 제어하는 방법과, 제어값(관리값)을 하회한 경우에는 수동으로 450g/L 황산암모늄을 3mL 첨가하는 인적 관리 방법의 두 가지 방법으로 총 암모니아 농도를 제어하였다. 그 결과, 본 발명 장치를 사용한 경우에는 자동으로 총 암모니아 농도를 제어할 수 있었던 반면, 인적 관리를 실시한 경우에는 배양 52시간에 17회 수동으로 황산암모늄 수용액을 첨가하였다. 또한, 도 8에 도시하는 바와 같이 인적 관리를 실시한 경우와 비교하여 본 발명 장치를 사용한 경우에는 보다 높게 아르기닌이 축적되었다. 또한, 총 아르기닌 생산량으로서도 인적 관리를 실시한 경우에는 9.5g이었던데 대해, 본 발명 장치를 사용한 경우는 11.1g의 아르기닌이 생성되었다.

또한, 배양 도중(8시간)에, 배양액을 채취하고, 포함되는 암모늄 이온을 비해리형으로 하기에 충분한 알칼리성으로 되게 한 것을 사용하여, 외부 암모니아 센서에 의한 교정을 실시하였다.

본 결과로부터 L-아미노산의 발효 생산에 있어서, 본 발명 장치를 사용함으로써 매우 간편하고 자동적으로 배지 중의 암모니아 농도(비이온화 암모니아 농도 및 총 암모니아 농도)를 일정하게 제어하여 배양을 실시하는 것이 가능한 것에 더하여, L-아미노산 생산능도 향상되는 것이 나타났다.

배지를 KOH 수용액으로 pH 6.0으로 조정하고, 120℃에서 20분 오토클레이브를 실시하였다.

배지를 KOH 수용액으로 pH 7.5로 조정하고, 120℃에서 20분 오토클레이브를 실시하였다. 오토클레이브 후, 샤레에 배지를 붓고, 한천상으로 하였다.

본 결과로부터 L-아미노산의 발효 생산에 있어서, 본 발명 장치를 사용함으로써 매우 간편하게 배지 중의 암모니아 농도를 일정하게 제어하면서 배양을 실시하는 것이 가능하다.

이상 상세하게 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 배양액 중의 암모니아 농도를 연속적으로 임의로 컨트롤하면서 배양할 수 있기 때문에, 미생물 공업 등을 포함하는 화학 공업 분야에 있어서 활용할 수 있다.

100 암모니아 제어 장치
102 제어부
102a 검량선 작성부
102b 비이온화 암모니아 농도 산출부
102c pH 값 측정부
102d 총 암모니아 농도 계산부
102e 암모니아 공급 지시부
102f 교정용 전압 측정부
102g 교정부
104 제어 출력부
106 기억부
106a 암모니아 해리 곡선 파일
106b 검량선 파일
106c 비이온화 암모니아 농도 파일
106d pH 값 파일
106e 총 암모니아 농도 파일
108 신호 입력부
10 암모니아 센서
11, 13 NH₃ 앰프
12 외부 장착 암모니아 센서
20 pH 센서
21 pH 앰프
200 배양조
300 암모니아 공급기
30 암모니아 탱크
31 스위치
32 밸브

통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소

FERMBP-6906

19830929

Claims

배양조 내의 배양액의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서, 당해 배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 당해 배양조 내의 배양액의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서와, 당해 암모니아 공급기 및 당해 암모니아 센서에 접속된, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치를 사용하여 당해 배양조 내의 암모니아 농도를 제어하는 암모니아 제어 방법으로서,
상기 제어부에 있어서 실행되는,
상기 암모니아 센서로부터의 신호를, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선에 대입함으로써, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도를 산출하는 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝과,
산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 암모니아 공급 지시 스텝
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하는 검량선 작성 스텝을 추가로 포함하는, 암모니아 제어 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 배양조 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 센서에 추가로 접속되고,
상기 제어부에 있어서 실행되는,
상기 배양조 내의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여, 상기 비이온화 암모니아 농도 산출 스텝에 의해 산출된 상기 비이온화 암모니아 농도 및 상기 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하는 총 암모니아 농도 계산 스텝
을 추가로 포함하고,
상기 암모니아 공급 지시 스텝에 있어서, 상기 비이온화 암모니아 농도 대신 상기 총 암모니아 농도가 사용되는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 방법.
제3항에 있어서, 상기 배양조 외부에 설치된 외부 장착 암모니아 센서로서, 비해리형의 암모니아 농도를 측정하는 암모니아 센서를 준비하고,
상기 배양조로부터 채취한 후, 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되도록 하기에 충분하게 알칼리성으로 되게 한 배양액의 비해리형의 암모니아 농도를 상기 외부 장착 암모니아 센서로 측정했을 때의, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로서 취득하는 것을 포함하고,
상기 제어부에 있어서 실행되는,
상기 교정용 신호로부터 상기 검량선에 기초하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 상기 총 암모니아 농도 계산 스텝에서 산출된 총 암모니아 농도가 되도록, 상기 검량선을 교정하는 교정 스텝
을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 방법.
제4항에 있어서, 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 외부 장착 암모니아 센서에 접속되고,
상기 제어부에 있어서 실행되는,
상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로 입력하는 교정용 신호 입력 스텝
을 추가로 포함하는, 암모니아 제어 방법.
목적 물질의 생산능을 갖는 미생물을 배양액을 함유하는 배양조 중에서 배양하고, 배양물로부터 목적 물질을 채취하는 것을 포함하는, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법으로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 암모니아 제어 방법에 의해 상기 배양액 중의 암모니아 농도를 제어하면서 배양하는, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 목적 물질이, L-아미노산, 유기산, 핵산, 알코올 또는 단백질인, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 목적 물질이 L-리신, L-아르기닌, L-히스티딘으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 염기성 아미노산인, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제8항에 있어서, 전(全) 배양 공정 중 적어도 일부의 기간 동안, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 조정함으로써, 상기 염기성 아미노산의 카운터 이온으로서 사용하는 황산 이온, 및/또는 염화물 이온의 사용량을 삭감하는 것을 포함하는, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가 300mM 이하인, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가 200mM 이하인, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가 100mM 이하인, 발효법에 의해 목적 물질을 제조하는 방법.
배양조에 암모니아를 공급하는 암모니아 공급기와, 암모니아 센서와, 제어부를 적어도 구비한 암모니아 제어 장치로서,
상기 암모니아 센서는, 당해 배양조 내의 배양액 중의 비해리형의 암모니아에 응답하는 암모니아 센서이며,
상기 제어부는, 상기 암모니아 공급기 및 상기 암모니아 센서에 접속되고,
상기 제어부는,
상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도와 상기 암모니아 센서로부터의 신호의 관계를 나타내는 검량선을 작성하고,
상기 암모니아 센서로부터의 신호를 상기 검량선에 대입함으로써, 상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도를 산출하고,
산출된 비이온화 암모니아 농도가 소정의 농도를 하회하는 경우, 상기 암모니아 공급기에 상기 배양조 내로 암모니아를 공급하도록 지시하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 장치.
제13항에 있어서, 상기 배양조 내의 배양액의 pH 값을 측정하는 pH 센서에 추가로 접속되고,
상기 제어부는, 또한,
상기 배양액 중의 비이온화 암모니아 농도 및 암모늄 이온 농도의 각 pH 값에 있어서의 존재율을 나타내는 암모니아 해리 곡선에 기초하여 산출된 비이온화 암모니아 농도 및 상기 pH 센서로부터의 pH 값으로부터, 총 암모니아 농도를 계산하고,
상기 비해리형 암모늄 농도 대신 상기 총 암모니아 농도를 사용하는 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 장치.
제14항에 있어서, 상기 제어부는, 또한,
교정용 신호로부터 상기 검량선에 기초하여 산출되는 비이온화 암모니아 농도가, 상기 총 암모니아 농도 계산 수단에 의해 계산된 총 암모니아 농도가 되도록, 당해 검량선을 교정하고,
상기 교정용 신호는,
상기 배양조 외부에 설치된 외부 장착 암모니아 센서로서, 비해리형의 암모니아 농도를 측정하는 암모니아 센서를 준비하고,
상기 배양조로부터 채취한 후, 암모늄 이온을 비이온화 암모니아로 되도록 하기에 충분하게 알칼리성으로 되게 한 배양액의 비해리형의 암모니아 농도를 상기 외부 장착 암모니아 센서로 측정했을 때의, 상기 외부 장착 암모니아 센서로부터 취득된 신호인 것을 특징으로 하는, 암모니아 제어 장치.
제15항에 있어서, 상기 암모니아 제어 장치는, 상기 외부 장착 암모니아 센서에 접속되고,
상기 제어부는, 또한,
상기 외부 장착 암모니아 센서로부터의 신호를 교정용 신호로서 입력하는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 유지하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 유저 인터페이스(user interface)를 추가로 구비하는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 배양액 중의 암모니아를 리얼 타임(real-time)으로 제어하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 배양조의 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 5분 이내의 간격으로, 배양액 중의 암모니아를 제어하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 12시간 이내의 간격으로, 검량선을 교정하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 기간의 적어도 일부 또는 전체에 있어서 암모니아를 제어하도록 구성되는, 암모니아 제어 장치.
목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물을 배양액을 함유하는 발효조 중에서 배양하고, 상기 배양액 중에 상기 목적 물질을 생성, 축적시키는, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법으로서, 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 암모니아 제어 장치를 사용하여, 전 배양 공정 중 적어도 일부의 기간 동안, 배양액 중의 총 암모니아 농도를 일정 농도의 범위로 조정하는 것을 포함하는, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.
제24항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가, 300mM 이하인, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.
제24항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가, 200mM 이하인, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.
제24항에 있어서, 상기 일정 농도의 범위가, 100mM 이하인, 발효법에 의한 목적 물질의 제조법.