DE60034843T2

DE60034843T2 - Verfahren zur Herstellung von L-arginin

Info

Publication number: DE60034843T2
Application number: DE60034843T
Authority: DE
Inventors: Yoko Kawasaki-shi Kuwabara; Osamu c/o Ajinomoto Co. Kawasaki-shi Kurahashi; Tsuyoshi Kawasaki-shi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-06-03
Filing date: 2000-05-30
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: DE60034843D1; EP1057893A1; EP1057893B1; CN1276421A; CN1262640C; US20030153058A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein L-Argininproduzierendes Bakterium und ein Verfahren für die Produktion von L-Arginin. L-Arginin ist eine industriell nützliche Aminosäure als Inhaltsstoff von Leberfunktions-begünstigenden Agenzien, Aminosäuretransfusionen, umfassenden Aminosäurezubereitungen usw.
Verwandter Stand der Technik
Konventionelle L-Argininproduktion durch Fermentation wurde unter Verwendung von Wildtypstämmen von coryneformen Bakterien; von coryneformen Bakterien, die gegenüber gewissen Reagenzien, inklusive Sulfonamiden, 2-Thiazolalanin, α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und ähnliche resistent sind; von coryneformen Bakterien, die eine L-Histidin-, L-Prolin-, L-Threonin-, L-Isoleucin-, L-Methionin- oder L-Tryptophanauxotrophie aufweisen, zusätzlich zur Resistenz gegenüber 2-Thiazolalanin ( japanische Offenlegungsschrift (Kokai) Nr. 54-44096 ); von coryneformen Bakterien, die gegenüber Ketomalonsäure, Fluormalonsäure oder Monofluoressigsäure ( japanische Offenlegungsschrift Nr. 57-18989 ) resistent sind; von coryneformen Bakterien, die gegenüber Argininol ( japanische Offenlegungsschrift Nr. 62-24075 ) resistent sind; von coryneformen Bakterien, die gegenüber X-Guanidin (X steht für ein Derivat einer Fettsäure oder eine aliphatische Kette, japanische Offenlegungsschrift Nr. 2-186995 ) oder dergleichen resistent sind, durchgeführt.
Andererseits wurden auch Verfahren für die Erhöhung der L-Argininproduktionskapazität durch Verstärkung der L-Arginin-Biosyntheseenzyme durch Benutzung von rekombinanten DNA-Techniken offenbart. Das heißt, Verfahren für die Produktion von L-Arginin durch Benutzung eines Mikroorganismus, der dem Genus Corynebacterium oder Brevibacterium angehört, und eine rekombinante DNA enthält, die eine Vektor-DNA und ein DNA-Fragment umfasst, wobei das DNA-Fragment Gene für Acetylornithindeacetylase, N-Acetylglutaminsäure-γ-semialdehyd-Dehydrogenase, N-Acetylglutamatkinase und Argininosuccinase umfasst, die von einem Mikroorganismus stammen, der dem Stamm Escherichia angehört ( japanische Patentpublikation (Kokoku) Nr. 5-23750 ) wurden offenbart.
Übrigens ist L-Glutamatdehydrogenase ein Enzym, das die Reaktion der reduktiven Aminierung von α-Ketoglutarsäure katalysiert, um L-Glutaminsäure zu erzeugen. Während es bekannt war, dass die Produktionsmenge an L-Glutaminsäure durch Erhöhung der Aktivität dieses Enzyms erhöht wird ( japanische Offenlegungsschriften Nrn. 61-268185 und 63-214189 ), war die Verbindung zwischen der Aktivität dieses Enzyms und der L-Argininproduktionsfähigkeit nicht bekannt.
Aus dem Artikel von Börmann et al. "Molecular analysis of the Corynebacterium glutamicum GDH gene encoding glutamate dehydrogenase", Molecular Microbiology, GB, Blackwell, Scientific, Oxford, Band 6, Nr. 3, Februar 1992, S. 317 bis 326 war die Rolle von GDH bei der Glutamatbiosynthese bekannt. Darüber hinaus war die Sequenz der gdh von coryneformen Bakterien bekannt.
FR-A 2 575 492 offenbart Mikroorganismen mit verstärkter intrazellulärer GDH-Aktivität.
Weiterhin erwähnt EP-A 0 261 627 , dass die erhöhte Produktivität von L-Gutaminsäure zu einem Anstieg an anderen Aminosäuren führen würde.
Aus Dokument EP 1 158 043 war ein coryneformes Bakterium, bei dem die Aktivität der intrazellulären GDH verstärkt war, bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein im Vergleich mit konventionellen Verfahren weiter verbessertes Verfahren zur Produktion von L-Arginin und einen Mikroorganismus, der für solch ein Verfahren benutzt wird, zur Verfügung zu stellen.
Während des Herangehens der Erfinder der vorliegenden Erfindung an die Zucht von coryneformen Bakterien, die L-Glutaminsäure produzieren, fanden die Erfinder, dass durch Verstärkung der Aktivität von Glutamatdehydrogenase (von hierab auch als "GDH" bezeichnet) in Bakterien nicht nur die Glutaminsäureproduktionsfähigkeit, sondern auch die L-Asparaginsäureproduktionsfähigkeit vergrößert wurde. Es wurde in Betracht gezogen, dass dies von der Tatsache herrührte, dass die Reaktion, die Asparaginsäure aus Oxalessigsäure generiert und durch Aspartataminotransferase katalysiert wird, an die GDH-Reaktion gekoppelt war und der Vorgang der GDH-Reaktion die Reaktion, die durch Aspartataminotransferase katalysiert wird, begünstigt. Deshalb, auf diesen Befunden beruhend, richteten sie ihre auf Aufmerksamkeit auf den Einbau von Aspartat in der Reaktion, die Argininosuccinat aus Citrullin im L-Argininbiosyntheseweg generiert, und erhöhten die GDH-Aktivität von L-Argininproduzierenden Bakterien. Als Ergebnis fanden sie, dass die L-Argininproduktionsfähigkeit durch die Erhöhung verbessert war. So wurde die vorliegende Erfindung vollbracht.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt das Folgende zur Verfügung.

(1) Einen Mikroorganismus, der modifiziert ist, um die Aktivität der intrazellulären Glutamatdehydrogenase zu erhöhen und der eine erhöhte Fähigkeit besitzt, L-Arginin in einem Medium zu akkumulieren, im Vergleich mit einem unmodifizierten Mikroorganismus, wenn dieser in einem Medium kultiviert wird, wobei besagter Mikroorganismus aus der Gruppe gewählt wird, die aus einem coryneformen Bakterium besteht.
(2) Der Mikroorganismus gemäß (1), wobei die Aktivität der intrazellulären Glutamatdehydrogenase durch Erhöhung der Kopienzahl eines Gens, das für die intrazelluläre Glutamatdehydrogenase codiert, erhöht wird.
(3) Der Mikroorganismus gemäß (2), wobei das Gen, das für die Glutamatdehydrogenase codiert, von einem coryneformen Bakterium stammt.
(4) Ein Verfahren für die Produktion von L-Arginin, das die Schritte der Kultur des Mikroorganismus aus einem der Punkte (1) bis (3) in einem Medium zur Produktion und Akkumulation von L-Arginin im Medium, und Einsammeln des L-Arginins aus dem Medium, umfasst.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die L-Argininproduktionsfähigkeit von Mikroorganismen, die eine L-Argininproduktionsfähigkeit haben, d.h. coryneformen Bakterien, erhöht werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "L-Argininproduktionsfähigkeit" die Fähigkeit eines Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung, L-Arginin in einem Medium anzureichern, wenn er in dem Medium kultiviert wird.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung im Detail erklärt werden.
<1> Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung
Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroorganismus, der eine L-Argininproduktionsfähigkeit besitzt und der in einer Aktivität der intrazellulären Glutamatdehydrogenase verbessert ist. Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung ist nicht speziell eingeschränkt, solange er ursprünglich die L-Argininproduktionsfähigkeit besitzt oder die L-Argininproduktionsfähigkeit erwerben kann, wenn seine intrazelluläre Glutamatdehydrogenase verstärkt wird. Er wird aus den coryneformen Bakterien ausgewählt.
Coryneforme Bakterien schließen jene Bakterien ein, die bisher im Genus Brevibacterium klassifiziert waren, aber gegenwärtig in dem Genus Corynebacterium vereinigt wurden (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), und schließen Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören und eng mit dem Genus Corynebacterium verwandt sind, ein. Beispiele solcher coryneformen Bakterien sind unten aufgelistet.

Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium
(Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum
(Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum
(Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum
(Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Brevibacterium album
Brevibacterium cerinum
Microbacterium ammoniaphilum

Die coryneformen Bakterien, die L-Argininproduktionskapazität haben, sind nicht speziell limitiert, solange sie L-Argininproduktionsfähigkeit haben. Sie schließen z.B.: Wildtypstämme von coryneformen Bakterien; coryneforme Bakterien, resistent gegenüber gewissen Agenzien, die Sulfonamide, 2-Thiazolalanin, α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure und ähnliche umfassen; coryneforme Bakterien, die L-Histidin-, L-Prolin-, L-Threonin-, L-Isoleucin-, L-Methionin- oder L-Tryptophanauxotrophie zusätzlich zur Resistenz gegenüber 2-Thiazolalanin aufweisen ( japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 54-44096 ); coryneforme Bakterien, resistent gegenüber Ketomalonsäure, Fluormalonsäure oder Monofluoressigsäure ( japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 57-18989 ); coryneforme Bakterien, resistent gegenüber Argininol ( japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 62-24075 ); coryneforme Bakterien, resistent gegenüber X-Guanidin (X steht für ein Derivat von Fettsäure oder aliphatischer Kette, japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-186995 ) usw., ein.
Spezifisch können die folgenden Bakterienstämme als Beispiel dienen:
Brevibacterium flavum AJ11169 (FERN 2-4161)
Brevibacterium lactofermentum AJ12092 (FERN 2-7273)
Brevibacterium flavum AJ11336 (FERN 2-4939)
Brevibacterium flavum AJ11345 (FERN 2-4948)
Brevibacterium lactofermentum AJ12430 (FERN BP-2228)
Der AJ11169-Stamm und der AJ12092-Stamm sind die 2-Thiazolalanin-resistenten Stämme, die in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr. 54-44096 erwähnt werden, der AJ11336-Stamm ist der Stamm, der die Argininolresistenz und Sulfadiazinresistenz besitzt, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 62-24075 erwähnt wird, der AJ11345-Stamm ist der Stamm, der Argininolresistenz, 2-Thiazolalaninresistenz, Sulfaguanidinresistenz hat und Histidinauxotrophie aufweist, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 62-24075 erwähnt, und der AJ12430-Stamm ist der Stamm, der Octylguanidinresistenz und 2-Thiazolalaninresistenz, wie in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-186995 erwähnt werden, hat.
<2> Ausweitung der GDH-Aktivität
Um die GDH-Aktivität einer Bakterienzelle auszuweiten, kann eine rekombinante DNA hergestellt werden, indem man ein Genfragment, das für GDH codiert, mit einem Vektor, der in dem Mikroorganismus funktioniert, ligiert, vorzugsweise ein Vektor vom Multicopytyp, und sie in die Bakterienzelle, die die L-Argininproduktionskapazität besitzt, einführt, um die Zelle zu transformieren. Die Kopienzahl des Gens, das für GDH in der Zelle des transformierten Stammes codiert, wird dadurch erhöht, und dadurch wird die GDH-Aktivität ausgeweitet.
Als Gen, das für GDH codiert, können jene, die von coryneformen Bakterien abstammen, genauso wie jene, die von anderen Organismen, wie Escherichia-Bakterien, abstammen, benutzt werden.
Die Nukleotidsequenz des Gens, das für GDH (gdh-Gen) von coryneformen Bakterien codiert, wurde bereits aufgeklärt (Molecular Microbiology, 6 (3) 317–326 (1992)). Deshalb kann das GDH-Gen durch PCR (Polymerasekettenreaktion; siehe T.J. White et al.; Trends Genet. 5, 185 (1989)) gewonnen werden, indem man Primer benutzt, die aufgrund der Nukleotidsequenz produziert werden, z.B. die Primer, die im Sequenzprotokoll als Sequenzprotokoll ID-Nummern 1 und 2 angegeben werden, und mit chromosomaler DNA aus coryneformen Bakterien als Matrize. Die Gene, die für GDH, die von anderen Mikroorganismen stammt, codieren, können auf ähnliche Weise erhalten werden.
Die chromosomale DNA kann z.B. gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, herausgegeben von der Gesellschaft für Bioscience und Bioengineering, Japan, S. 97–98, Baifukan, 1992) aus einem Bakterien, das ein DNA-Donor ist, hergestellt werden.
Das gdh-Gen, das durch PCR amplifiziert wurde, wird vorzugsweise mit einer Vektor-DNA ligiert, die in einer Zelle eines Zielmikroorganismus, wie Escherichia coli und/oder coryneformen Bakterien autonom repliziert werden kann, um eine rekombinante DNA herzustellen. Durch Einführung dieser rekombinanten DNA in eine Escherichia coli-Zelle kann die nachfolgende Prozedur einfach gestaltet werden. Der Vektor, der in Escherichia coli-Zellen autonom replizierbar ist, ist vorzugsweise ein Plasmidvektor, der in der Wirtszelle autonom replizierbar ist, und Beispiele davon schließen pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010 usw. ein.
Als Vektor, der autonom in coryneforme Bakterienzellen replizierbar ist, kann man pAM330 (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 58-67699 ), pHM1519 (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 58-77895 ) usw. erwähnen. Darüber hinaus, wenn man ein DNA-Fragment, das die Fähigkeit hat, ein Plasmid in coryneformen Bakterien autonom replizierbar zu machen, aus solchen Vektoren herausnimmt und in die oben erwähnten Vektoren für Escherichia coli einsetzt, können sie als sogenannter Shuttle-Vektor, der sowohl in Escherichia coli als auch in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, eingesetzt werden.
Beispiele für einen solchen Shuttle-Vektoren schließen die unten erwähnten ein. Auch Mikroorganismen, die jeden Vektor beinhalten, sind angegeben und deren Zugangsnummern bei internationalen Hinterlegungsstellen sind jeweils in Klammern angegeben.

pAJ655	Escherichia coli AJ11882 (FERN B2-136)
	Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC39135)
pAJ1844	Escherichia coli AJ11883 (FERM B2-137)
	Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC39136)
pAJ611	Escherichia coli AJ11884 (FERN B2-138)
pAJ3148	Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC39137)
pAJ440	Bacillus subtilis AJ11901 (FERN B2-140)
pHC4	Escherichia coli AJ12617 (FERN B2-3532)

Diese Vektoren können von den hinterlegten Mikroorganismen, wie im Folgenden dargestellt, erhalten werden. Mikrobenzellen, die in ihrer exponentiellen Wachstumsphase geerntet werden, werden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert und bei 30000 × g zentrifugiert. Der Überstand, der aus dem Lysat gewonnen wird, wird mit Polyethylenglykol versetzt, fraktioniert und durch Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifugation gereinigt.
Um rekombinante DNA durch Ligation des Gens, das für GDH codiert, mit einem Vektor, der in einer Zelle der coryneformen Bakterien funktionieren kann, zu präparieren, wird der Vektor mit Restriktionsenzym(en) verdaut, die den Enden des Gens, das das Gen enthält, das für GDH codiert, entsprechen. Die Ligation wird generell unter Benutzung einer Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase durchgeführt.
Um die, wie oben beschrieben präparierte rekombinante DNA in einen Mikroorganismus einzuführen, kann jede bekannte Transformationsmethode, die bisher beschrieben wurde, angewandt werden. Zum Beispiel ist ein Verfahren, die Empfängerzellen mit Calciumchlorid zu behandeln, um die Permeabilität für DNA zu erhöhen, was für Escherichia coli K-12 bereits beschrieben wurde (M. Mandel und A. Higa, J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), und ein Verfahren, kompetente Zellen aus Zellen, die sich in der Wachstumsphase befinden, herzustellen, worauf darin die DNA eingeführt wird, was schon für Bacillus subtilis beschrieben wurde (C.H. Duncan, G.A. Wilson und F.E. Young, Gene, 1, 153 (1977)) anwendbar. Zusätzlich zu diesen, ist auch ein Verfahren anwendbar, die DNA-rezipienten Zellen in Protoplasten oder Spheroplasten, die einfach rekombinante DNAs aufnehmen können, umzuwandeln, gefolgt von der Einführung der rekombinanten DNA in die Zellen, was bekannterweise anwendbar ist für Bacillus subtilis, Actinomyceten und Hefen (S. Chang und S.N. Choen, Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); M.J. Bibb, J.M. Ward und O.A. Hopwood, Nature, 274, 398 (1978); A. Hinnen, J.B. Hicks und G.R. Fink, Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Die Transformation von coryneformen Bakterien kann durch die elektrische Pulsmethode durchgeführt werden (Sugimoto et al., japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-207791 ).
Eine Erhöhung der GDH-Aktivität kann auch dadurch erreicht werden, dass man mehrere Kopien des gdh-Gens in die chromosomale DNA der zuvor erwähnten Wirtszelle einführt. Um mehrere Kopien des gdh-Gens in die chromosomale DNA eines Mikroorganismus einzuführen, wird die homologe Rekombination mit einer Sequenz ausgeführt, von der multiple Kopien in der chromosomalen DNA als Zielstrukturen existieren. Als Sequenzen, von denen multiple Kopien in der chromosomalen DNA existieren, repetitive DNA, können inverted repeats, die am Ende eines Transposons existieren, benutzt werden. Es ist ebenfalls möglich, wie in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-109985 offenbart, das gdh-Gen in ein Transposon zu inkorporieren und ihm zu gestatten übertragen zu werden, um multiple Kopien des gdh-Gens in die chromosomale DNA einzuführen. Durch jedes der erwähnten Verfahren wird die Kopienanzahl des gdh-Gens in Zellen des transformierten Stammes erhöht und als dessen Ergebnis die GDH-Aktivität erhöht.
Die Erhöhung der GDH-Aktivität kann neben dem zuvor erwähnten Genverstärkungsverfahren auch dadurch erreicht werden, dass man eine Expressions-regulierende Sequenz für das gdh-Gen modifiziert, so dass die Expression des gdh-Gens verstärkt sein sollte. Es kann spezifisch dadurch erreicht werden, dass man eine Expressions-regulierende Sequenz des gdh-Gens auf chromosomaler DNA oder Plasmid ersetzt, wie z.B. einen Promotor mit einem Stärkeren (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 1-215280 ). Zum Beispiel können unter den Promotoren, die in coryneformen Bakterien funktionieren können, der lac-Promotor, der tac-Promotor und der trp-Promotor von Escherichia coli usw. als starke Promotoren erwähnt werden (Y. Morinaga, M. Tsuchiya, K. Miwa und K. Sano, J. Biotech., 5, 305–312 (1987)). Darüber hinaus ist der trp-Promotor von Corynebacterium-Bakterien ebenfalls ein geeigneter Promotor ( japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 62-195294 ). Substitution dieser Promotoren verstärkt die Expression des gdh-Gens, und folglich ist die GDH-Aktivität erhöht. Verstärkung von Expressions-regulierenden Sequenzen kann mit der Erhöhung der Kopienanzahl des gdh-Gens kombiniert werden.
Im Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung können Aktivitäten anderer Enzyme, die Reaktionen der L-Argininbiosynthese katalysieren, zusätzlich zur Erhöhung der GDH-Aktivität erhöht werden. Beispiele für solche Enzyme schließen Acetylornithindeacetylase, N-Acetylglutaminsäure-γ-semialdehyddehydrogenase, N-Acetylglutamatkinase, Argininosuccinase, N-Acetylglutamatsynthase, N-Acetylglutamatkinase, N-Acetylglutamylphosphatreduktase, Acetylornithinaminotransferase, N-Acetylornithinase, Ornithincarbamyltransferase, Argininosuccinatsynthase usw. ein (siehe japanische Patentveröffentlichung Nrn. 5-23750 und 7-28749 ).
Die zuvor erwähnten L-Argininbiosyntheseenzymgene und das gdh-Gen können vom selben Vektor oder getrennt von zwei oder mehreren Arten von Vektoren getragen werden.
<3> Produktion von L-Arginin
L-Arginin kann effizient dadurch produziert werden, dass man einen Mikroorganismus, der wie oben beschrieben erhalten wurde, in einem Medium kultiviert, um L-Arginin in der Kultur zu produzieren und zu akkumulieren und indem man die L-Aminosäuren aus der Kultur sammelt.
Das Medium, das für die Kultur benutzt wird, kann ein wohl bekanntes Medium sein, das konventionell für die Produktion von Aminosäuren durch Fermentation gebraucht wird. Das heißt, es kann ein gewöhnliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten nach Bedarf enthält.
Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Fructose und Stärkehydrolysate; Alkohole, wie Glycerin und Sorbit; oder organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure usw., zu verwenden.
Als Stickstoffquelle ist es möglich, anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysate, Ammoniakgas, wässrigen Ammoniak usw. zu verwenden.
Als in Spuren vorkommende organische Nährstoffe enthält das Medium vorzugsweise eine geeignete Menge der benötigten Substanz, wie z.B. Vitamin B₁ und L-Homoserin, Hefeextrakt usw. Zusätzlich zu diesen Substanzen kann eine kleine Menge Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen usw. dem Medium zugesetzt werden.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter einer aeroben Bedingung für 1–7 Tage durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur ist vorzugsweise 24–37°C, und der pH des Mediums während der Kultivierung ist vorzugsweise 5–9. Anorganische oder organische Säuren oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas usw. können benutzt werden, um den pH anzupassen. L-Arginin kann gewöhnlicherweise aus dem Fermentationsmedium durch eine Kombination bekannter Techniken, wie z.B. Ionenaustauscherharz-Verfahren und andere, wiedergewonnen werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung spezifischer mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt.
<1> Klonierung des gdh-Gens, das aus coryneformem Bakterium stammt und Produktion von Plasmid für die Einführung des gdh-Gens.
Die Primer, die als SEQ ID NOS: 1 und 2 gezeigt werden, wurden auf der Basis der bekannten gdh-Gensequenz von Corynebacterium glutamicum (Molecular Microbiology, 6 (3) 317-326 (1992)) hergestellt, und PCR wurde durchgeführt, indem chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 als Matrize verwendet wurde, um ein gdh-Genfragment zu erhalten. DNA wurde auf gewöhnliche Weise gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859)) synthetisiert unter Verwendung eines DNA-Synthesizer-Modells 380B, hergestellt von Applied Biosystems. Die PCR wurde durch 25-malige Wiederholung eines Zyklus, der aus Reaktionen bei 94°C für 1 Minute, 55°C für 1 Sekunde und 72°C für 2,5 Minuten bestand, durchgeführt. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in die SmaI-Stelle an der Multi-Cloning Site des Klonierungsvektors pHSG399 (produziert durch Takara Shuzo) kloniert, um pHSG-GDH herzustellen.
Dann, um pHSG-GDH in coryneforme Bakterien autonom replizierbar zu machen, wurde ein Replikationsstartpunkt ( japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 5-7491 ) des bereits erhaltenen Plasmids pHM1519, das in coryneforme Bakterien autonom replizierbar ist (K. Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901–2903 (1984); japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 58-192900 ) eingeführt. Spezifisch wurde pHM1519 mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI verdaut, um ein Genfragment zu erhalten, das den Replikationsursprung enthält, und bei dem erhaltenen Fragment wurden die Enden durch Benutzung des Blunting-Kits, der von Takara Shuzo hergestellt wird, abgestumpft, und es wurde dann an die SalI-Stelle unter Verwendung eines SalI-Linkers (hergestellt durch Takara Shuzo) des pHSG-GDH eingeführt, um pGDH herzustellen. pHM1519 kann aus Corynebacterium glutamicum ATCC13058 gewonnen werden.
<2> Herstellung eines mit dem gdh-Gen transformierten L-Arginin-produzierenden Stammes von coryneformen Bakterien
pGDH wurde in ein L-Arginin-produzierendes Bakterium, Brevibacterium flavum AJ11345-Stamm, eingeführt. Die Einführung des Plasmids wurde unter Benutzung der elektrischen Pulsmethode (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-207791 ) durchgeführt. Der Transformant wurde als ein Chloramphenicol-resistenter Stamm auf einem CM2G-Plattenmedium (das 10 g Polypepton, 10 g Hefeextrakt, 5 g Glucose, 5 g NaCl und 15 g Agar in 1 L reinen Wassers enthält, pH 7,2), das 4 μg/ml Chloramphenicol enthält, selektioniert, um AJ11345/pGDH zu erhalten.
Das Brevibacterium flavum AJ11345 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 25. April 1979 hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM 2-4948, und wurde vom ursprünglichen Hinterlegungsort am 27.09.1999 zu einem internationalen Hinterlegungsort, der auf dem Budapester Vertrag basiert, transferiert, und wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM 82-6894 deponiert.
<3> Produktion von L-Arginin

AJ11345 und AJ11345/pGDH wurden jeweils auf Agarmedium ausplattiert, das 0,5 g/dl Glucose, 1 g/dl Polypepton, 1 g/dl Hefeextrakt, 0,5 g/dl NaCl und 5 μg/l Chloramphenicol enthielt und bei 31,5°C 20 Stunden lang kultiviert. Eine Platinöse der erhaltenen Bakterienzellen wurde in ein Medium, das 4 g/dl Glucose, 6,5 g/dl Ammoniumsulfat, 0,1 g/dl KH₂PO₄, 0,04 g/dl MgSO₄, 0,001 g/dl FeSO₄, 0,01 g/dl MnSO₄, 5 μg/dl Vitamin B₁, 5 μg/dl Biotin und Sojabohnenhydrolysat (45 mg/dl, bezogen auf den Stickstoffgehalt) enthielt, geimpft und bei 31,5°C 50 Stunden lang in einen Kolben unter Schütteln kultiviert. Die Produktionsmengen an α-Ketoglutarsäure, L-Arginin und L-Asparaginsäure werden in Tabelle 1 für jeden Stamm angezeigt. Tabelle 1

Stamm/Plasmid	α-Ketoglutarsäure		L-Arginin		L-Asparaginsäure
Stamm/Plasmid	(g/L)	(mol/L)	(g/L)	(mol/L)	(g/L)	(mol/L)
AJ11345	0,30	0,002	13,30	0,076	0,00	0,00
AJ11345/pGDH	0,06	0,0004	14,00	0,080	0,20	0,002

Die Ergebnisse der Tabelle 1 zeigen, dass die Produktionsmenge an L-Arginin stärker erhöht war im Vergleich mit der Abnahme an α-Ketoglutarsäure, wenn die GDH-Aktivität des L-Arginin-produzierenden Bakteriums erhöht war. Darüber hinaus zeigte der Stamm, dessen GDH-Aktivität erhöht war, eine erhöhte Nebenproduktionsmenge an L-Asparaginsäure. Dies weist darauf hin, dass die Zunahme der L-Argininproduktionsmenge nicht nur auf die Abnahme der Nebenproduktionsmenge an α-Ketoglutarsäure und die Zunahme an L-Glutaminsäure, die ein Vorläufer von L-Arginin war, zurückzuführen war. Es war bekannt, dass im L-Arginin-Biosynthesesystem L-Asparaginsäure als Substrat in der Reaktion, die von Argininosuccinatsynthase katalysiert wird, eingebaut wird, und es wird erwogen, dass die Zunahme in der Verfügbarkeit an Asparaginsäure durch GDH diese Reaktion begünstigte, und dadurch die Produktionsmenge an L-Arginin erhöhte. Dies bedeutet, dass die Erhöhung der GDH-Aktivität sowohl die Menge an zur Verfügung gestellter L-Glutaminsäure als auch L-Asparaginsäure erhöhte (siehe das Referenzbeispiel) und daher die L-Argininproduktionskapazität deutlich erhöht war.
Referenzbeispiel
pGDH wurde in ein L-Glutaminsäure-produzierendes Bakterien, Brevibacterium lactofermentum AJ13029-Stamm, eingeführt. Der Stamm AJ13029 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl 305-8566, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) am 02. September 1994 deponiert und erhielt die Zugangsnummer FERM 2-14501, und wurde vom ursprünglichen Hinterlegungsort zu einem internationalen Hinterlegungsort gemäß Budapester Vertrag am 01. August 1995 transferiert, und wurde mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5189 hinterlegt.
Die Einführung des Plasmids wurde mit Hilfe der elektrischen Pulsmethode (siehe japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 2-207791 ) durchgeführt. Die Transformanten wurden als Chloramphenicol-resistenter Stamm auf einem CM2G-Plattenmedium (enthaltend 10 g Polypepton, 10 g Hefeextrakt, 5 g Glucose, 5 g Natriumchlorid und 15 g Agar in 1 L reinen Wassers, pH 7,2), das 4 μg/ml Chloramphenicol enthielt, selektioniert, um AJ13029/pGDH zu erhalten.
AJ13029 und AJ13029/pGDH wurden in ein Medium, das 60 g Glucose, 2 g KH₂20₄, 1,5 g MgSO₄·7H₂O, 15 mg FeSO₄·7H₂O, 5 mg MnSO₄·4H₂O, 50 ml Sojabohnenhydrolysat, 2 mg Biotin, 3 mg Thiaminhydrochlorid in 1 L Wasser enthielt, pH 8,0, angeimpft und bei 31,5°C kultiviert, bis der im Kulturmedium enthaltene Zucker verbraucht war. Die erhaltene Kultur wurde mit einer Konzentration von 5 % in das gleiche Medium wie oben beschrieben geimpft und bei 37°C kultiviert, bis der Zucker, der im Kulturmedium enthalten war, verbraucht war. Die Produktionsmengen von L-Glutaminsäure und L-Asparaginsäure sind in Tabelle 2 für jeden Stamm gezeigt. Tabelle 2

Stamm/Plasmid L-Glutaminsäure L-Asparaginsäure

(g/L) (mol/L) (g/L) (mol/L)

AJ13029 33 0,22 0,49 0,0037

AJ13029/pGDH 35 0,24 0,95 0,0071

Sequenzprotokoll

Claims

Mikroorganismus, der modifiziert ist, um eine Aktivität der intrazellulären Glutamatdehydrogenase zu verstärken und der eine erhöhte Fähigkeit zur Anhäufung von L-Arginin in einem Medium im Vergleich mit einem nicht-modifizierten Mikroorganismus, wenn er in dem Medium kultiviert wird, aufweist, wobei der Mikroorganismus gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus coryneformen Bakterien.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die Aktivität der intrazellulären Glutamatdehydrogenase durch Erhöhung der Kopiezahl eines Gens verstärkt wird, das die intrazelluläre Glutamatdehydrogenase kodiert.
Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, wobei das Gen, das die Glutamatdehydrogenase kodiert, von einem coryneformen Bakterium abstammt.
Verfahren zur Erzeugung von L-Arginin, umfassend die folgenden Schritte: Kultivierung des Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Medium zur Erzeugung und Anhäufung von L-Arginin in dem Medium; und Sammeln des L-Arginins aus dem Medium.