DE60132277T2

DE60132277T2 - L-Glutaminsäure herstellendes Bacterium und Verfahren zur Herstellung von Glutaminsäure

Info

Publication number: DE60132277T2
Application number: DE60132277T
Authority: DE
Inventors: Hiromi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Ohtaki; Jun Kawasaki-ku Kawasaki-shi Nakamura; Hiroshi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Izui; Tsuyoshi Kawasaki-ku Kawasaki-shi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2021-07-04
Also published as: BR0102669A; PL348447A1; CN1763200A; CN1335394A; JP4304837B2; US20100124777A1; EP1174508B1; CN1664106A; KR20020003519A; AU5401901A; EP1174508A2; PE20020212A1; KR100809856B1; AU784207B2; DE60132277D1; US7307160B1; CN1335394B; RU2276189C2; CN1935983A; US20020137150A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eines neues L-Glutaminsäure-produzierendes Bakterium und ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter dessen Verwendung. L-Glutaminsäure ist eine wichtige Aminosäure in Nahrungsmitteln, Medikamenten usw.
Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Konventionell wird L-Glutaminsäure hauptsächlich hergestellt durch fermentative Verfahren unter Verwendung sogenannter L-Glutaminsäure herstellender coryneformer Bakterien, die zum Genus Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium gehören, oder mutanten Stämmen davon (Amino Acid Fermentation, S. 195–215, Gakkai Shuppan Center, 1986).
Es ist bekannt, dass bei der Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation Trehalose als sekundäres Produkt ebenfalls hergestellt wird. Daher sind Techniken entwickelt worden zum Abbau oder Metabolisieren der hergestellten Trehalose. Solche Techniken umfassen das Verfahren der Herstellung einer Aminosäure durch Fermentation unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums, in welchem die Fähigkeit auf Trehalose zu proliferieren, induziert ist ( japanisches veröffentlichtes (Kokai) Patent Nr. 5-276935 ) und das Verfahren zur Herstellung einer Aminosäure durch Fermentation unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums, in welchem ein Gen codierend für ein Trehalose-katabolisches Enzym amplifiziert ist ( koreanische Patentveröffentlichung (B1) Nr. 165836 ). Jedoch ist es nicht bekannt, wie die Bildung von Trehalose selbst in einem L-Glutaminsäure-herstellenden Bakterium supprimiert werden kann.
In E. coli wird die Synthese von Trehalose katalysiert durch Trehalose-6-phosphat-Synthase. Es ist bekannt, dass dieses Enzym durch das otsA-Gen codiert wird. Des Weiteren ist auch berichtet worden, dass ein Escherichia coli-Stamm, in dem das otsA-Gen unterbrochen wurde, kaum in einem hyperosmotischen Medium wachsen kann (H. M. Glaever et al., J. Bacteriol., 170(6), 2841–2849 (1998)). Jedoch ist das Verhältnis zwischen der Unterbrechung des otsA-Gens und der Herstellung von Substanzen bisher unbekannt.
Auf der anderen Seite ist, obwohl das treY-Gen von Brevibacterium helvolum unter den Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, bekannt ist, für diese kein otsA-Gen bekannt. In Bezug auf Bakterien, die zum Genus Mycobacterium gehören, ist ein Stoffwechselweg bekannt über eine Reaktion, die durch ein Genprodukt codiert durch das treS-Gen (Trehalosesynthase (TreS)) katalysiert wird, welches ein von dem otsA-Gen und dem treY-Gen unterschiedliches Gen ist, als ein Gen codierend für ein Enzym im Trehalose-Biosyntheseweg (De Smet K. A., et al., Microbiology, 146 (1), 199–208 (2000)). Jedoch verwendet dieser Stoffwechselweg Maltose als Substrat und bezieht sich nicht auf die übliche L-Glutaminsäurefermentation, die Glucose, Fructose oder Sucrose als Ausgangsmaterial verwendet.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Produktionseffizienz für L-Glutaminsäure in der L-Glutaminsäureherstellung durch Fermentation unter Verwendung von coryneformen Bakterien zu steigern durch die Unterdrückung der Herstellung von Trehalose als Sekundärprodukt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben sorgfältige Studien durchgeführt, um das zuvor erwähnte Ziel zu erreichen. Als Ergebnis fanden sie, dass Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, ein otsA-Gen und treY-Gen enthalten, wie Mycobacterium tuberculosis, und die Produktionseffizienz für L-Glutaminsäure verbessert wurde durch Unterbrechen von zumindest einem dieser Gene. Somit brachten sie die vorliegende Erfindung zustande.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt das Folgende zur Verfügung:
Ein coryneformes Bakterium mit der Fähigkeit, L-Glutaminsäure zu produzieren, worin in dem Bakterium die Trehalose-Synthesefähigkeit verringert oder deletiert ist durch Einführen einer Mutation, die die Transkription oder Translation eines Gens, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase, eines Gens, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, oder beider dieser Gene, supprimiert, oder durch Unterbrechen des Gens, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase, des Gens, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, oder beider dieser Gene,
worin das Gen, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase für ein Protein codiert, definiert in den folgenden (A) oder (B):

(A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30,
(B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30, umfassend Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Additionen von 1 bis 10 Aminosäureresten, und mit Trehalose-6-phosphatsynthase-Aktivität, und das Gen, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, für ein Protein codiert, definiert in den folgenden (C) oder (D):
(C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 32,
(D) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 32, umfassend Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Additionen von 1 bis 10 Aminosäureresten, und mit Maltooligosyltrehalosesynthase-Aktivität.

Das wie oben beschriebene coryneforme Bakterium, worin das Gen, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase eine DNA hat, definiert in den folgenden (a) oder (b):

(a) eine DNA, enthaltend eine Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 484–1938 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 29,
(b) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann mit einer Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 484–1938 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 29, eine Homologie von 75% oder mehr zu den vorhergehenden Nukleotidsequenzen zeigend, und codierend für ein Protein mit Trehalose-6-phosphatsynthase-Aktivität.

Das coryneforme Bakterium, wie oben beschrieben, worin das Gen, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, eine DNA hat, definiert in den folgenden (c) oder (d):

(c) eine DNA, enthaltend eine Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 82–2514 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 31,
(d) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist mit einer Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste der Nukleotid-Nummern 82–2514 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 31, eine Homologie von 80 oder mehr zu der vorangehenden Nukleotidsequenz zeigend, und codierend für ein Protein mit Maltooligosyltrehalosesynthase-Aktivität.

Ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend die Schritte des Kultivierens eines coryneformen Bakteriums, wie oben beschrieben, in einem Medium, um L-Glutaminsäure in dem Medium herzustellen und zu akkumulieren, und Sammeln der L-Glutaminsäure aus dem Medium.
Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität bedeutet eine Aktivität die Reaktion zu katalysieren, in welcher α,α-Trehaolose-6-phosphat und UDP hergestellt werden aus UDP-Glucose und Glucose-6-phosphat, und Maltooligosyltrehalosesynthaseaktivität bedeutet eine Aktivität, eine Reaktion zu katalysieren, in welcher Maltotriosyltrehalose hergestellt wird aus Maltopentose.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Produktionseffizienz für L-Glutaminsäure in der L-Glutaminsäureproduktion durch Fermentation unter Verwendung coryneformer Bakterien verbessert werden durch Inhibition der Herstellung von Trehalose als Sekundärprodukt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Im Folgenden wir die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Das coryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung ist ein coryneformes Bakterium mit der Fähigkeit, L-Glutaminsäure herzustellen, in welchem die Fähigkeit Trehalose zu synthetisieren, vermindert oder deletiert ist.
Die coryneformen Bakterien, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, umfassen die Gruppe der Mikroorganismen, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 599 (1974) definiert sind, welche aerobe Gram-positive Stäbchen sind, die keine Säureresistenz und keine aerobe Sporenbildungsfähigkeit aufweisen. Sie sind bisher klassifiziert worden in den Genus Brevibacterium, jedoch gegenwärtig vereint worden mit dem Genus Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)), und umfassen Bakterien, die zum Genus Brevibacterium oder Microbakterium, nahe verwandt mit dem Genus Corynebacterium, gehören. Beispiele solcher coryneformen Bakterien sind nachfolgend erwähnt.
Corynebacterium acetoacidophilum
Corynebacterium acetoglutamicum
Corynebacterium alkanolyticum
Corynebacterium callunae
Corynebacterium glutamicum
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum)
Corynebacterium melassecola
Corynebacterium thermoaminogenes
Corynebacterium herculis
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium immariophilum
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)
Brevibacterium roseum
Brevibacterium saccharolyticum
Brevibacterium thiogenitalis
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes)
Brevibacterium album
Brevibacterium cerium
Microbacterium ammoniaphilum
Insbesondere können die folgenden Stämme beispielhaft genannt werden.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, 13032, 13060
Corynebacterium lilium (Corynebacterium glutamicum) ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13665, ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Brevibacterium ammoniagenes (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerium ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Die Trehalosesynthesefähigkeit solcher oben erwähnter coryneformer Bakterien ist verringert oder deletiert durch Mutagenese oder Unterbrechen eines Gens, codierend für ein Enzym im Trehalosesyntheseweg unter Verwendung einer Mutagenesebehandlung oder genetischer Rekombinationsverfahren. Eine solche Mutation ist eine Mutation, die die Transkription oder Translation des Gens, codierend für das Enzym im Trehalosesyntheseweg unterdrückt, oder eine Mutation, die die Elimination oder die Verringerung eines Enzyms im Trehalosesyntheseweg bewirkt, worin das Enzym im Trehalosesyntheseweg Trehalose-6-phosphatsynthase und/oder Maltooligosyltrehalosesynthase ist.
Die Unterbrechung des Gens, codierend für ein Enzym im Trehalosesyntheseweg kann durchgeführt werden durch Gensubstitution unter Verwendung der homologen Rekombination. Ein Gen auf einem Chromosom eines coryneformen Bakteriums kann unterbrochen werden durch Transformieren des coryneformen Bakteriums mit DNA, enthaltend ein Gen, codierend für ein Enzym im Trehalosesyntheseweg, das so modifiziert ist, dass ein Teil davon deletiert sein sollte und somit das Enzym im Trehalosesyntheseweg nicht normal funktionieren sollte (Gen vom Deletionstyp), und Ermöglichen der Rekombination zwischen dem Gen vom Deletionstyp und dem normalen Gen auf dem Chromosom. Eine derartige Genunterbrechung durch homologe Rekombination ist bereits etabliert worden. Zu diesem Zweck kann ein Verfahren erwähnt werden, das lineare oder zyklische DNA verwendet, welche nicht in coryneformen Bakterien repliziert und ein Verfahren unter Verwendung eines Plasmids, enthaltend einen temperaturempfindlichen Replikationsanfang. Ein Verfahren unter Verwendung zyklischer DNA, die nicht in coryneformen Bakterien repliziert oder ein Plasmid, enthaltend einen temperaturempfindlichen Replikationsanfang, ist jedoch bevorzugt.
Das Gen, codierend für ein Enzym im Trehalosesyntheseweg ist das otsA-Gen oder treY-Gen, oder kann aus beiden diesen Genen bestehen. Da die Nukleotidsequenz des otsA-Gens und des treY-Gens von Brevibacterium lactofermentum und flankierende Regionen davon durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt worden sind, können diese Gene einfach erhalten werden, indem Primer, basierend auf den Sequenzen, hergestellt werden und PCR durchgeführt wird (Polymerasekettenreaktion, siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) unter Verwendung der Primer und chromosomaler DNA von Brevibacterium lactofermentum als Template.
Die Nukleotidsequenz, umfassend das otsA-Gen und die Nukleotidsequenz, umfassend das treY-Gen von Brevibacterium lactofermentum, erhalten in den später beschriebenen Beispielen, sind als SEQ ID NOS: 29 bzw. 31 gezeigt. Des Weiteren werden die Aminosäuresequenzen, codiert durch diese Nukleotidsequenzen, in SEQ ID NOS: 30 bzw. 32 gezeigt.
Das otsA-Gen und treY-Gen können jeweils solche Gene sein, die für ein Protein codieren, umfassend Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder einer Mehrzahl von Positionen, vorausgesetzt, dass die Aktivität der Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalosesynthase, die dadurch codiert wird, nicht zerstört wurde. Während die Anzahl von "mehreren" Aminosäuren unterschiedlich ist in Abhängigkeit von den Positionen und Arten von Aminosäureresten in der dreidimensionalen Struktur des Proteins, liegt sie im Bereich von 1 bis 10.
Eine DNA, die im Wesentlichen für dasselbe Protein wie Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalosesynthase, die oben beschrieben sind, codiert, kann erhalten werden, z. B., durch Modifizieren von jeder der Nukleotidsequenzen durch, z. B., positionsspezifische Mutageneseverfahren, so dass ein oder mehrere Aminosäurereste an einer bestimmten Stelle eine Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion umfassen sollten. Solch eine modifizierte DNA, wie oben beschrieben, kann auch erhalten werden durch eine allgemein bekannte Mutationsbehandlung. Die Mutationsbehandlung umfasst ein Verfahren der Behandlung von DNA, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalose in vitro, z. B., mit Hydroxylamin, und ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus, z. B., ein Bakterium, das zum Genus Escherichia gehört, enthaltend ein DNA, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalose mit Ultraviolett-Strahlung oder einem mutagenen Mittel, das allgemein verwendet wird zur Mutationsbehandlung, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), und salpetrige Säure.
Die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion eines Nukleotids, wie oben beschrieben, umfasst auch natürlich vorkommende Mutanten oder Varianten auf der Basis von z. B. individuellen Unterschieden oder Unterschieden in der Art oder dem Genus der Mikroorganismen, die Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalose enthalten.
Eine DNA, codierend für im Wesentlichen dasselbe Protein wie Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalosesynthase, wie oben beschrieben, kann erhalten werden durch Exprimieren einer solchen DNA mit einer Mutation, wie oben beschrieben, in einer geeigneten Zelle, und Untersuchen der Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität oder Maltooligosyltrehalosesynthaseaktivität des exprimierten Produkts.
Eine DNA, codierend für im Wesentlichen dasselbe Protein wie Trehalose-6-phosphatsynthase kann auch erhalten werden durch Isolieren einer DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist mit einer DNA, die z. B. eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu den Nukleotid-Nummern 484–1938 der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 29 gezeigt ist, aufweist oder einer Sonde, die hergestellt werden kann anhand der Nukleotidsequenz, mit einer Homologie von 75% oder mehr zu der vorhergehenden Nukleotidsequenz und die Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität hat, aus einer DNA, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase mit einer Mutation oder von einer Zelle, die eine solche enthält. In ähnlicher Weise kann eine DNA, codierend für im Wesentlichen dasselbe Protein wie Maltooligosyltrehalosesynthase auch erhalten werden durch Isolieren einer DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist mit einer DNA, die z. B. eine Nukleotidsequenz, korrespondierend zu den Nukleotid-Nummern 82–2514 der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 31 gezeigt wird, aufweist, oder einer Sonde, die hergestellt werden kann aus der Nukleotidsequenz mit einer Homologie von 80% oder mehr der vorangehenden Nukleotidsequenz und mit Maltooligosyltrehalosesynthaseaktivität aus einer DNA, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, mit einer Mutation oder von einer Zelle, die eine solche enthält.
Die "stringenten Bedingungen", wie hierin verwendet, sind Bedingungen, unter welchen sogenannte spezifische Hybride gebildet werden, und nicht-spezifische Hybride nicht gebildet werden. Es ist schwierig, solche Bedingungen klar auszudrücken unter Verwendung von irgendwelchen numerischen Werten. Jedoch umfasst z. B. stringente Bedingung eine Bedingung, unter welcher DNAs mit hoher Homologie miteinander hybridisieren. Alternativ werden die stringenten Bedingungen beispielhaft angegeben durch Bedingungen, unter welchen DNAs miteinander hybridisieren bei einer Salzkonzentration, korrespondierend zu den üblichen Bedingungen des Waschens bei der Southern-Hybridisierung, d. h. 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C.
Als Sonde kann auch eine Teilsequenz von jedem Gen verwendet werden. Solch eine Sonde kann hergestellt werden durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, hergestellt basierend auf der Nukleotidsequenz von jedem Gen als Primer und ein DNA-Fragment, enthaltend jedes Gen als Template. Wenn ein DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 300 Basenpaaren als Sonde verwendet wird, können die Waschbedingungen für die Hybridisierung aus 50°C, 2 × SSC und 0,1% SDS bestehen.
Gene, die unter solchen Bedingungen, wie oben beschrieben, hybridisierbar sind, umfassen solche mit einem Stopp-Codon, erzeugt in einer codierenden Region des Gens, und solche ohne Aktivität infolge einer Mutation des aktiven Zentrums. Jedoch können solche Mutanten leicht entfernt werden durch Ligieren jedes der Gene mit einem kommerziell erhältlichen Expressionsvektor und Messen der Trehalose-6-phosphatsynthaseaktivität oder Maltooligosylthrehalosesynthaseaktivität.
Wenn ein otsA-Gen oder treY-Gen verwendet wird für die Unterbrechung der Gene auf Chromosomen von coryneformen Bakterien, müssen die codierten Trehalose-6-phosphatsynthase oder Maltooligosyltrehalosesynthase ihre Aktivitäten nicht aufweisen. Des Weiteren kann das otsA-Gen oder das treY-Gen, das verwendet wird für die Genunterbrechung, ein Gen sein, abgeleitet von einem anderen Mikroorganismus, solange es mit diesen Genen von coryneformen Bakterien homolog rekombinieren kann. Zum Beispiel kann ein otsA-Gen von Bakterien, die zum Genus Escherichia oder Mycobacterium, ein treY-Gen von Bakterien, die zum Genus Arthrobacter, Brevibacterium helvolum oder Bakterien, die zum Genus Rhizobium gehören, erwähnt werden.
Ein Gen vom Deletionstyp des otsA-Gens oder treY-Gens kann hergestellt werden durch Herausschneiden einer bestimmten Region mit Restriktionsenzymen aus einem DNA-Fragment, enthaltend eines dieser Gene oder einen Teil davon, um zumindest einen Teil der codierenden Region zu deletieren oder eine die Expression regulierende Sequenz, wie ein Promotor.
Des Weiteren kann ein Gen vom Deletionstyp auch erhalten werden durch Durchführen von PCR unter Verwendung von Primern, die so entworfen sind, dass ein Teil des Gens deletiert werden soll. Des Weiteren kann ein Gen vom Deletionstyp erhalten werden durch Einzelnukleotidmutation, z. B. eine Frame-Shift-Mutation.
Genunterbrechung des otsA-Gens wird nachfolgend beschrieben. Genunterbrechung des treY-Gens kann in ähnlicher Weise durchgeführt werden.
Ein otsA-Gen auf einem Wirtschromosom kann wie folgt ersetzt werden durch ein otsA-Gen vom Deletionstyp. Das heißt, ein otsA-Gen vom Deletionstyp und ein Markergen für Resistenz gegenüber einem Medikament, wie Kanamycin, Chloramphenicol, Tetracyclin und Streptomycin, werden in ein Plasmid inseriert, welches nicht autonom in coryneformen Bakterien replizieren kann, um eine rekombinante DNA herzustellen. Ein coryneformes Bakterium kann mit der rekombinanten DNA transformiert werden, und der transformierte Stamm kann in einem Medium kultiviert werden, welches den Wirkstoff enthält, um einen transformierten Stamm zu erhalten, in welchem die rekombinante DNA in chromosomale DNA eingeführt worden ist. Alternativ kann ein solcher transformierter Stamm erhalten werden unter Verwendung eines temperaturempfindlichen Plasmids als Plasmid, und Kultivieren der Transformante bei einer Temperatur, bei welcher das temperaturempfindliche Plasmid nicht replizieren kann.
In einem Stamm, in welchem die rekombinante DNA in ein Chromosom, wie oben beschrieben inkorporiert wurde, verursacht die rekombinante DNA Rekombination mit einer otsA-Gensequenz, die ursprünglich auf dem Chromosom existierte, und die zwei fusionierten Gene, umfassend das chromosomale otsA-Gen und das otsA-Gen vom Deletionstyp, werden in das Chromosom inseriert, so dass andere Teile der rekombinanten DNA (Vektoranteil und Wirkstoffresistenzmarkergen) zwischen diesen gelegen sein sollten.
Dann wird, um nur das otsA-Gen vom Deletionstyp in der chromosomalen DNA zu belassen, eine Kopie des otsA-Gens aus der chromosomalen DNA zusammen mit dem Vektoranteil (umfassend das Wirkstoffresistenzmarkergen) durch Rekombination von zwei otsA-Genen eliminiert. In diesem Fall wird entweder das normale otsA-Gen in der chromosomalen DNA belassen und das otsA-Gen vom Deletionstyp wird herausgeschnitten, oder umgekehrt wird das otsA-Gen vom Deletionstyp in der chromosomalen DNA belassen und das normale otsA-Gen wird herausgeschnitten. Es kann bestätigt werden, welche Art des Gens in der chromosomalen DNA verblieben ist durch Untersuchen der Struktur des otsA-Gens auf dem Chromosom durch PCR, Hybridisierung oder dergleichen.
Das coryneforme Bakterium, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine verstärkte Aktivität eines Enzyms aufweisen, das die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert zusätzlich zu der Deletion oder der Verringerung der Trehalosesynthesefähigkeit. Beispiele von Enzymen, die die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysieren, umfassen Glutamatdehydrogenase, Glutaminsynthase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase, Pyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Phosphoenolpyruvatsynthase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase, Glucosephosphatisomerasen usw.
Des Weiteren kann in dem coryneformen Bakterium, das für die vorliegende Erfindung verwendet wird, ein Enzym, welches eine Reaktion zur Herstellung einer anderen Verbindung als L-Glutaminsäure durch Abzweigen vom Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure katalysiert, verringert oder ausgeschaltet werden. Beispiele solcher Enzyme umfassen α-Ketoglutaratdehydrogenase, Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroximatsynthase, Acetolactatsynthase, Formiatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, L-Glutamatdecarboxylase, 1-Pyrrolindehydrogenase, usw.
Des Weiteren kann durch Einführen einer temperaturempfindlichen Mutation für eine Biotinaktivitäts-inhibierende Substanz, wie ein Tensid, in ein coryneformes Bakterium mit L-Glutaminsäureherstellungsfähigkeit, das Bakterium befähigt werden, L-Glutaminsäure in einem Medium zu produzieren, welches einen Überschuss an Biotin enthält, in der Abwesenheit einer Biotinaktivitäts-inhibierenden Substanz (siehe WO 96/06180 ). Als ein solches coryneformes Bakterium kann der Brevibacterium lactofermentum AJ13029-Stamm, offenbart in WO 96/06180 , erwähnt werden. Der AJ13029-Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (gegenwärtig die unabhängige administrative Körperschaft, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, postal code: 305–5466) am 02. September 1994 hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer FERM P-14501. Dann wurde er übergeführt in eine internationale Hinterlegung unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 01. August 1995 und erhielt die Eingangsnummer FERM BP-5189.
Wenn ein coryneformes Bakterium mit L-Glutaminsäureherstellungsfähigkeit, in welchem die Trehalosesynthesefähigkeit verringert oder deletiert ist, in einem geeigneten Medium kultiviert wird, akkumuliert L-Glutaminsäure in dem Medium.
Das Medium, das zur Herstellung von L-Glutaminsäure verwendet wird, ist ein übliches Medium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Spurennährstoffe, wie benötigt enthält. Als Kohlenstoffquelle können Zucker wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Sucrose, Maltose, Melassen und Stärkehydrolysate, Alkohole wie Ethanol und Inositol, oder organische Säuren wie Essigsäure, Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Ammoniak, organischer Stickstoff wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Mais- Extrakt ("corn steep liquor") und Sojabohnenhydrolysat, Ammoniakgas, wässriges Ammoniak usw. verwendet werden. Als anorganische Ionen (oder Quellen davon) wird eine geringe Menge von Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen usw. hinzugefügt. In Bezug auf die organischen Spurenelemente ist es wünschenswert, die benötigten Substanzen, wie Vitamin B₁, Hefeextrakt usw. in einer geeigneten Menge, wie benötigt, hinzuzufügen.
Die Kultur wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, erhalten durch Schütteln, Rühren zur Belüftung oder dergleichen, für 16 bis 72 Stunden. Während der Kultur wird die Kulturtemperatur kontrolliert, um zwischen 30 bis 45°C zu liegen, und der pH-Wert wird kontrolliert, um 5 bis 9 zu betragen. Für eine derartige Einstellung des pH-Werts können anorganische oder organische Säuren oder alkalische Substanzen, Ammoniakgas usw. verwendet werden.
Die Gewinnung der L-Glutaminsäure aus der Fermentationsbrühe kann durchgeführt werden durch z. B. Verfahren unter Verwendung von Ionenaustauschharzen, Kristallisation usw. Genauer gesagt, kann L-Glutaminsäure auf einem Anionenaustauscherharz adsorbiert werden und von diesem isoliert werden, oder durch Neutralisation kristallisiert werden.
Beispiele
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung spezifischer erklärt werden in Bezug auf die folgenden Beispiele.
Beispiel 1: Konstruktion eines Stamms von Brevibacterium lactofermentum, in dem das otsA-Gen unterbrochen ist
<1> Klonieren des otsA-Gens
Da das otsA-Gen von Brevibacterium lactofermentum nicht bekannt war, wurde es erhalten unter Verwendung einer Nukleotidsequenz eines otsA-Gens eines anderen Mikroorganismus als Referenz. Die otsA-Gene von Escherichia und Mycobacterium sind bisher in Bezug auf ihre gesamte Nukleotidsequenz aufgeklärt worden (Kaasen I., et al., Gene, 145 (1), 9–15 (1994); De Smet K. A., et al., Microbiology, 146 (1), 199–208 (2000)). Daher wurden zuerst in Bezug auf eine Aminosäuresequenz, die abgeleitet wurde von diesen Nukleotidsequenzen, die DNA-Primer 21 (SEQ ID NO: 1) und P2 (SEQ ID NO: 2) für PCR synthetisiert. Die DNA-Primer 21 und P2 korrespondieren zu den Regionen der Nukleotid-Nummern 1894–1913 bzw. 2531–2549 der Nukleotidsequenz des otsA-Gens von Escherichia coli (GenBank-Hinterlegungsnummer X69160). Sie korrespondieren auch zu den Regionen der Nukleotid-Nummern 40499–40518 bzw. 41166–41184 des otsA-Gens von Mycobacterium tuberculosis (GenBank-Hinterlegungsnummer 295390).
Dann wurde PCR durchgeführt unter Verwendung der Primer 21 und P2 und chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 als eine Vorlage mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 50°C für 0,5 Minuten und 72°C für 4 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Als Ergebnis wurde im Wesentlichen eine einzige Art eines amplifizierten Fragments von etwa 0,6 kbp erhalten. Dieses amplifizierte Fragment wurde in einen Plasmidvektor pCR2.1 unter Verwendung des "Original TA Cloning Kit", hergestellt von Invitrogen, kloniert, um pCotsA zu erhalten. Dann wurde die Nukleotidsequenz des klonierten Fragments bestimmt.
Basierend auf der Nukleotidsequenz des wie oben erhaltenen otsA-Gens wurden DNA-Primer P10 (SEQ NO: 8) und 212 (SEQ ID NO: 10) neu synthetisiert, und unbekannte benachbarte Regionen des partiellen Fragments wurden amplifiziert durch "inverse PCR" (Triglia, T., et al., Nucleic Acids Res., 16, 81–86 (1988); Ochman H., et al., Genetics, 120, 621–623 (1988)). Die chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde verdaut mit dem Restriktionsenzym BamHI, BglII, ClaI, HindIII, KpnI, MluI, MunL, SalI oder XhoI, und selbst-ligiert unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo). Unter Verwendung der resultierenden DNA als Template und den DNA-Primern 210 und P12 wurde PCR durchgeführt mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 4 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Als Ergebnis wurde, wenn ClaI oder BglII als Restriktionsenzym verwendet wurde, für jeden Fall ein amplifiziertes Fragment von 4 kbp erhalten. Die Nukleotidsequenzen dieser amplifizierten Fragmente wurde direkt bestimmt unter Verwendung der DNA-Primer P5 bis 29 (SEQ ID NOS: 3–7) und P11 bis P15 (SEQ ID NOS: 9–13). So wurde die gesamte Nukleotidsequenz des otsA-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 bestimmt wie in SEQ ID NO: 29 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, codiert durch diese Nukleotidsequenz, wird in SEQ ID NOS: 29 und 30 gezeigt.
Wenn die Homologie der Sequenz des zuvor genannten otsA-Gens bestimmt wurde in Bezug auf das otsA-Gen von Escherichia coli (GenBank-Hinterlegungsnummer X69160) und das otsA-Gen von Mycobacterium tuberculosis (GenBank-Hinterlegungsnummer 295390) zeigt die Nukleotidsequenz Homologien von 46,3% bzw. 55,9%, und die Aminosäuresequenz zeigte Homologien von 30,9% bzw. 51,7%. Die Homologien wurden berechnet unter Verwendung der Software "GENETIX-WIN" (Software Development), basierend auf der Lipman-Person-Methode (Science, 227, 1435–1441 (1985)).
<2> Herstellung eines Plasmids zur Unterbrechung des otsA-Gens
Um das Vorhandensein oder das Fehlen eines Verbesserungseffekts auf die L-Glutaminsäureherstellung durch Unterbrechung eines Gens, codierend für ein Enzym im Trehalosebiosyntheseweg in coryneformen Bakterien zu untersuchen, wurde ein Plasmid zur Unterbrechung des otsA-Gens hergestellt. Ein Plasmid zur Unterbrechung des otsA-Gens wurde wie folgt hergestellt. PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des Plasmids pCotsA, welches zuvor konstruiert wurde bei der Klonierung des otsA-Gens, als Template, und den Primern P29 (SEQ ID NO: 33) und P30 (SEQ ID NO: 34), umfassend die ClaI-Schnittstelle mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen von 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 8 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Das amplifizierte Fragment wurde mit ClaI verdaut, blunt-ended unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) und selbst-ligiert unter Verwendung von T4-Ligase (Takara Shuzo), um ein Plasmid pCotsAC, enthaltend das otsA-Gen mit einer Frame-Shift-Mutation (die Nukleotide 1258–1300 von SEQ ID NO: 29 wurden deletiert) an einer ungefähr zentralen Stelle davon.
<3> Herstellen eines Stamms, in dem das otsA-Gen unterbrochen wurde
Unter Verwendung des Plasmids pCotsAC zur Gen-Unterbrechung wurde ein L-Glutaminsäure-herstellendes Bakterium, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, transformiert durch das Electric-Pulse-Verfahren, und Transformanten wurden selektiert in Bezug auf die Fähigkeit in CM2B-Medium, enthaltend 20 mg/l Kanamycin, zu wachsen. Da das Plasmid pCotsAC zur Unterbrechung des otsA-Gens keinen Replikationsbeginn enthielt, der in Brevibacterium lactofermentum funktionieren könnte, erlitten die resultierenden Transformanten, erhalten durch Verwendung des Plasmids, homologe Rekombination, die auftrat zwischen den otsA-Genen auf dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum und dem Plasmid pCotsAC zur Genunterbrechung. Aus den homolog rekombinanten Stämmen, erhalten wie oben beschrieben, wurden in Stämme, in welchen der Vektorteil des Plasmids pCotsAC zur Genunterbrechung, infolge des Wiederauftretens von homologer Rekombination eliminiert worden war, ausgewählt auf Basis der erworbenen Kanamycinsensitivität als Marker.
Aus den Stämmen, die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurde ein Stamm selektiert, der die erwünschte Frame-Shift-Mutation enthielt. Selektion eines solchen Stamms wurde durchgeführt durch PCR unter Verwendung von chromosomaler DNA, extrahier aus einem Stamm, der Kanamycin-empfindlich geworden war als Template und den DNA-Primern P8 (SEQ ID NO: 14) und P13 (SEQ ID NO: 11) mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 1 Minute, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde, und Sequenzieren des erhaltenen amplifizierten Fragments unter Verwendung der DNA-Primer P8, um das Fehlen der Funktion des otsA-Gens infolge des Einführens der Frame-Shift-Mutation zu bestätigen. Der Stamm, der wie oben beschrieben erhalten wurde, wurde als ΔOA-Stamm bezeichnet.
Beispiel 2: Konstruktion eines Stamms, in dem das treY-Gen unterbrochen war
<1> Klonieren des treY-Gens
Da das treY-Gen von Brevibacterium lactofermentum nicht bekannt war, wurde es erhalten unter Verwendung von Nukleotidsequenzen von treY-Genen aus anderen Mikroorganismen als Referenz. Die Nukleotidsequenzen des treY-Gens waren bisher aufgeklärt worden für die Genera Arthrobacter, Brevibacterium und Rhizobium (Maruta K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1289 (1), 10–13 (1996); GenBank-Hinter legungsnummer AF039919; Maruta K., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60 (4), 717–720 (1996)). Daher wurden zunächst unter Bezug auf die Aminosäuresequenz, abgeleitet aus diesen Nukleotidsequenzen, die PCR-DNA-Primer P3 (SEQ ID NO: 14) und P4 (SEQ ID NO: 15) synthetisiert. Die DNA-Primer P3 und P4 korrespondieren zu den Bereichen der Nukleotid-Nummern 975–992 bzw. 2565–2584 der Nukleotidsequenz des treY-Gens von Arthrobacter sp. (GenBank-Hinterlegungsnummer D63343). Des Weiteren korrespondieren sie zu den Regionen der Nukleotid-Nummern 893–910 bzw. 2486–2505 des treY-Gens von Brevibacterium helvolum (GenBank-Hinterlegungsnummer AF039919). Des Weiteren korrespondieren sie zu den Regionen der Nukleotid-Nummern 862–879 bzw. 2452–2471 des treY-Gens von Rhizobium sp. (GenBank-Hinterlegungsnummer D78001).
Dann wurde PCR durchgeführt unter Verwendung der Primer P3 und P4 und chromosomaler DNA aus Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 als Template mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Als Ergebnis wurde im Wesentlichen eine einzige Art eines amplifizierten Fragments mit etwa 1,6 kbp erhalten. Dieses amplifizierte Fragment wurde in einem Plasmidvektor pCR2.1 unter Verwendung des "Original TA Cloning Kit", hergestellt von Invitrogen, kloniert. Dann wurde die Nukleotidsequenz für etwa 0,6 kb bestimmt.
Auf Basis der Nukleotidsequenz des Teilfragments des treY-Gens, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wurden die DNA-Primer P16 (SEQ ID NO: 16) und P26 (SEQ ID NO: 26) neu synthetisiert und unbekannte benachbarte Regionen des partiellen Fragments wurden durch "inverse PCR" amplifiziert (Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res., 16, 81–86 (1988); Ochman H., et al., Genetics, 120, 621–623 (1988)). Die chromosomale DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde verdaut mit dem Restriktionsenzym BamHI, HindIII, SalI oder XhoI und selbst-ligiert unter Verwendung von T4-DNA- Ligase (Takara Shuzo). Unter Verwendung dieser DNA als Template und den DNA-Primern P16 und P26 wurde PCR durchgeführt mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 1 Minute und 72°C für 4 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Als Ergebnis wurde, wenn HindIII oder SalI als das Restriktionsenzym verwendet wurde, ein amplifiziertes Fragment mit 0,6 kbp bzw. 1,5 kbp erhalten. Die Nukleotidsequenzen dieser amplifizierten Fragmente wurden direkt bestimmt unter Verwendung der DNA-Primer 216 bis P28 (SEQ ID NOS: 16–28). So wurde die gesamte Nukleotidsequenz des treY-Gens von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 bestimmt, wie in SEQ ID NO: 31 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, codiert durch diese Nukleotidsequenz, wird in SEQ ID NOS. 31 und 32 gezeigt.
Als die Homologie der Sequenz des zuvor erwähnten treY-Gens bestimmt wurde in Bezug auf das treY-Gen von Arthrobacter sp. (GenBank-Hinterlegungsnummer D63343), das treY-Gen von Brevibacterium helvolum (GenBank-Hinterlegungsnummer AF039919) und das treY-Gen von Rhizobium sp. (GenBank-Hinterlegungsnummer D78001), zeigte die Nukleotidsequenz Homologien von 52,0%, 52,3% bzw. 51,9%, und die Aminosäuresequenz zeigte Homologien von 40,9%, 38,5% bzw. 39,8%. Die Homologien wurden berechnet unter Verwendung der Software "GENETIX-WIN" (Software Development), basiert auf dem Lipman-Person-Verfahren (Science, 227, 1435–1441 (1985)).
<2> Herstellung des Plasmids zur treY-Genunterbrechung
Um das Vorhandensein oder das Fehlen eines Verbesserungseffekts auf die L-Glutaminsäureproduktivität durch Unterbrechung des Gens, codierend für das Enzym im Trehalosebiosyntheseweg in coryneformen Bakterien zu untersuchen, wurde ein Plasmid zur Unterbrechung des treY-Gens hergestellt. Zunächst wurde PCR durchgeführt unter Verwendung der Primer 217 (SEQ ID NO: 17) und P25 (SEQ ID NO: 25) und die chromosomale DNA von ATCC 13869 als Template mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 60°C für 0,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde. Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI verdaut und ligiert mit pHSG299 (Takara Shuzo, verdaut mit EcoRI unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo), um das Plasmid pHtreY zu erhalten. Des Weiteren wurde dieses pHtreY, verdaut mit AflII (Takara Shuzo), blunt-ended unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) und selbst-ligiert unter Verwendung von T4-Ligase (Takara Shuzo), um das Plasmid pHtreYA zu konstruieren, welches das treY-Gen mit einer Frame-Shift-Mutation (vier Nukleotide wurden nach dem 1145. Nukleotid in die Sequenz von SEQ ID NO: 31 eingefügt) an einer ungefähr zentralen Stelle davon enthielt.
<3> Herstellung eines Stamms, in dem das treY-Gen unterbrochen war
Unter Verwendung des Plasmids pCtreYA zur Genunterbrechung wurde ein L-Glutaminsäure-herstellendes Bakterium, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, transformiert durch das Electric-Pulse-Verfahren und Transformanten wurden selektiert in Bezug auf die Fähigkeit in CM2B-Medium, enthaltend 20 mg/l Kanamycin, zu wachsen. Da das Plasmid pCtreYa zur treY-Genunterbrechung keinen Replikationsbeginn enthält, welcher in Brevibacterium lactofermentum funktionieren kann, erlitten die Transformanten, erhalten unter Verwendung des Plasmids, Rekombination zwischen den treY-Genen des Brevibacterium lactofermentum-Chromosoms und dem Plasmid pCtreYA zur Genunterbrechung. Aus den wie oben beschrieben erhaltenen homolog rekombinanten Stämmen wurden Stämme selektiert, in welchen der Vektorteil des Plasmids pCtreYA zur Genunterbrechung eliminiert worden war infolge des wiederholten Auftretens von homologer Rekombination, auf Basis der wiedererlangten Kanamycinempfindlichkeit als Marker.
Aus den Stämmen, erhalten wie oben beschrieben, wurde ein Stamm selektiert, der die erwünschte Frame-Shift-Mutation enthielt. Die Selektion eines solchen Stamms wurde durchgeführt durch PCR unter Verwendung der DNA-Primer P19 (SEQ ID NO: 19) und 225 (SEQ ID NO: 25) mit einem Zyklus, bestehend aus Reaktionen bei 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 0,5 Minuten und 72°C für 1,5 Minuten, welcher für 30 Zyklen wiederholt wurde, und Sequenzieren des erhaltenen Fragments unter Verwendung der DNA-Primer P21 oder P23, um das Fehlen der Funktion des treY-Gens zu bestätigen infolge des Einführens der Frame-Shift-Mutation. Der wie oben beschrieben erhaltene Stamm wurde als ΔTA-Stamm bezeichnet.
Beispiel 3: Evaluierung der L-Glutamatherstellungsfähigkeit von dem ΔOA-Stamm und dem ΔTA-Stamm
Der ATCC 13869-Stamm, ΔOA-Stamm und ΔTA-Stamm wurden jeweils zur Herstellung von L-Glutaminsäure wie folgt kultiviert. Jeder dieser Stämme wurde wiederaufgefrischt durch Kultivieren in einem CM2B-Plattenmedium, und jeder wiederaufgefrischte Stamm wurde kultiviert in einem Medium, enthaltend 80 g Glucose, 1 g KH₂PO₄, 0,4 g MgSO₄, 30 g (NH₄)₂SO₄, 0,01 g FeSO₄·7H₂O, 0,01 g MnSO₄·7H₂O, 15 ml Sojabohnenhydrolysat-Lösung, 200 μg Thiaminhydrochlorid, 3 μg Biotin und 50 g CaCO₃ in 1 l reinem Wasser (eingestellt auf pH 8,0 mit KOH) bei 31,5°C. Nach der Kultur wurde die Menge der L-Glutaminsäure, die in dem Medium angesammelt war, und die Absorption der Kulturbrühe, die 51-fach verdünnt worden war, bei 620 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Brevibacterium lactofermentum-Stämme, in welchen das otsA-Gen oder das treY-Gen unterbrochen worden war, zeigte Wachstum in einem ähnlichen Maß zu jenem des Elternstammes und zusätzlich eine erhöhte L-Glutaminsäureherstellung im Vergleich zum Elternstamm. Tabelle 1

Stamm OD₆₂₀ (× 51) L-Glutaminsäure (g/l) Ausbeute (%)

ATCC 13869 0,930 40,2 48,4

ΔOA 1,063 43,8 52,8

ΔTA 0,850 45,6 54,9
(Erklärung des Sequenzprotokolls)

SEQ ID NO: 1: Primer P1 zur Amplifikation von otsA
SEQ ID NO: 2: Primer P2 zur Amplifikation von otsA
SEQ ID NO: 3: Primer P5
SEQ ID NO: 4: Primer P6
SEQ ID NO: 5: Primer P7
SEQ ID NO: 6: Primer P8
SEQ ID NO: 7: Primer P9
SEQ ID NO: 8: Primer P10
SEQ ID NO: 9: Primer P11
SEQ ID NO: 10: Primer P12
SEQ ID NO: 11: Primer P13
SEQ ID NO: 12: Primer P14
SEQ ID NO: 13: Primer P15
SEQ ID NO: 14: Primer P3 zur Amplifikation von treY
SEQ ID NO: 15: Primer P4 zur Amplifikation von treY
SEQ ID NO: 16: Primer P16
SEQ ID NO: 17: Primer P17
SEQ ID NO: 18: Primer P18
SEQ ID NO: 19: Primer P19
SEQ ID NO: 20: Primer P20
SEQ ID NO: 21: Primer P21
SEQ ID NO: 22: Primer P22
SEQ ID NO: 23: Primer P23
SEQ ID NO: 24: Primer P24
SEQ ID NO: 25: Primer P25
SEQ ID NO: 26: Primer P26
SEQ ID NO: 27: Primer P27
SEQ ID NO: 28: Primer P28
SEQ ID NO: 29: Nukleotidsequenz des otsA-Gens
SEQ ID NO: 30: Aminosäuresequenz von OtsA
SEQ ID NO: 31: Nukleotidsequenz des treY-Gens
SEQ ID NO: 32: Aminosäuresequenz von TreY
SEQ ID NO: 33: Primer P29
SEQ ID NO: 34: Primer P30

Sequenzprotokoll

Claims

Coryneformes Bakterium mit der Fähigkeit, L-Glutaminsäure zu produzieren, worin in dem Bakterium die Trehalose-Synthesefähigkeit verringert oder deletiert ist durch Einführen einer Mutation, die die Transkription oder Translation eines Gens, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase, eines Gens, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, oder beide dieser Gene, suprimiert, oder durch Unterbrechen des Gens, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase, des Gens, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, oder beide dieser Gene, worin das Gen, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase für ein Protein codiert, definiert in den folgenden (A) oder (B): (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30, (B) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 30, umfassend Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Additionen von 1 bis 10 Aminosäureresten, und mit Trehalose-6-phosphatsynthase-Aktivität, und das Gen, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, für ein Protein codiert, definiert in den folgenden (C) oder (D): (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 32, (D) ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 32, umfassend Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Additionen von 1 bis 10 Aminosäureresten, und mit Maltooligosyltrehalosesynthase-Aktivität.
Coryneformes Bakterium gemäss Anspruch 1, worin das Gen, codierend für Trehalose-6-phosphatsynthase eine DNA hat, definiert in den folgenden (a) oder (b): (a) eine DNA, enthaltend eine Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 484–1938 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 29, (b) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann mit einer Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 484–1938 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 29, eine Homologie von 75% oder mehr zu den vorhergehenden Nukleotidsequenzen zeigend, und codierend für ein Protein mit Trehalose-6-phosphatsynthase-Aktivität.
Coryneformes Bakterium gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Gen, codierend für Maltooligosyltrehalosesynthase, eine DNA hat, definiert in den folgenden (c) oder (d): (c) eine DNA, enthaltend eine Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste mit den Nukleotid-Nummern 82–2514 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 31, (d) eine DNA, unter stringenten Bedingungen hybridisierbar mit einer Nukleotidsequenz, umfassend zumindest die Reste der Nukleotid-Nummern 82–2514 in der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 312, eine Homologie von 80% oder mehr zu der vorangehenden Nukleotidsequenz zeigend, und codierend für ein Protein mit Maltooligosyltrehalosesynthase-Aktivität.
Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, umfassend die Schritte des Kultivierens eines coryneformen Bakteriums gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem Medium, um L-Glutaminsäure in dem Medium herzustellen und zu akkumulieren, und Ernten der L-Glutaminsäure aus dem Medium.