DE69736699T2

DE69736699T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Lysin

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Publication number: DE69736699T2
Application number: DE69736699T
Authority: DE
Inventors: c/o Ajinomoto Co. Atsushi Kawasaki-shi Hayakawa; c/o Ajinomoto Co. Masakazu Kawasaki-shi Sugimoto; c/o Ajinomoto Co. Yasuhiko Kawasaki-shi Yoshihara; c/o Ajinomoto Co. Tsuyoshi Kawasaki-shi Nakamatsu
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1996-12-05
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: HUP9702361A2; DE69736699D1; PL323545A1; SK163597A3; PL190206B1; EP0857784B1; HU9702361D0; ES2273356T3; DK0857784T3; EP0857784A3; HUP9702361A3; EP0857784A2; CN1187539A; JPH10165180A; SK285146B6; CN1161470C; BR9706058A; JP4075087B2; US6221636B1; BRPI9706058B1

Description

Technischer Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von L-Lysin durch Kultivieren eines Microorganismus, der durch Modifizieren eines coryneformen Bakteriums erhalten wird, das für die fermentative Produktion der Aminosäure oder ähnliche mit Hilfe einer auf Gentechnik basierenden Technik.
L-Lysin, welches als Futterzusatzmittel verwendet wird, wird für gewöhnlich durch ein fermentatives Verfahren unter Verwendung eines L-Lysin-produzierenden Mutantenstamms hergestellt, der zu den corynoformen Bakterien gehört. Zahlreiche L-Lysin-herstellende Bakterien, die gegenwärtig bekannt sind, sind solche, die durch eine artifizielle Mutation, ausgehend von Wildtypstämmen, die zu den coryneformen Bakterien gehören, erzeugt wurden.
Was das coryneforme Bakterium angeht, ist ein Vektorplasmid offenbart worden, das autonom in Bakterienzellen replizierbar ist, und ein Medikamenten-Resistenz-Markergen hat (siehe US Patent Nr. 4,514,502) sowie ein Verfahren zum Einschleusen eines Gens in Bakterienzellen (z. B. Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 2-207791). Es ist ebenfalls eine Möglichkeit zum Züchten eines L-Threonin- oder L-Isoleucin-produzierenden Bakteriums offenbart worden, in dem die oben beschriebenen Techniken verwendet werden (siehe US Patent Nr: 4,452,890 und 4,442,208). Was das Züchten eines L-Lysin produzierenden Bakteriums angeht, ist eine Technik bekannt, bei der ein Gen, das an der Lysin-Biosynthese teilhat in ein Vektorplasmid eingeschlossen wurde, um das Gen in Bakterienzellen zu amplifizieren (siehe z. B. Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 56-160997).
Bekannte Gene der L-Lysin-Biosynthese schließen beispielsweise ein Dihydrodipicolinatreductasegen (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 7-75578) und ein Diaminopimelatdehydrogenasegen (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) ein, bei denen ein Gen, das an der L-Lysin-Biosynthese teilhat, kloniert worden ist, wie auch ein Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 60-87788), ein Dihydrodipicolinatsynthasegen (Japanische Patentanmel dung Offenlegungsschrift Nr. 6-55149), und ein Diaminopimelatdecarboxylasegen (Japanische Patentanmeldung Offenlegungsschrift Nr. 60-62994), bei denen eine Amplifikation eines Gens die L-Lysin-Produktionsfähigkeit beeinflusst.
Bezüglich der Enzyme, die an der L-Lysin-Biosynthese teilhaben, ist der Fall bekannt, dass ein Enzym Rückkoppelungsinhibierung unterworfen ist, wenn es als Wildtyp verwendet wird. In diesem Fall wird die L-Lysin-Produktionsfähigkeit durch Einschleusen eines Enzymgens verbessert, das eine solche Mutation hat, dass die Rückkoppelungsinhibierung desensibilisiert ist. Als solche bekannte Gene schließen beispielsweise spezifisch ein Aspartokinasegen ein (Internationale Veröffentlichung Pamphlet von WO 94/25605).
Wie oben beschrieben wurde, sind einige erfolgreiche Ergebnisse mit Hilfe einer Amplifizierung von Genen für das L-Lysin-Biosynthesesystem, oder die Einschleusung von mutierten Genen erzielt worden. Beispielsweise stellt ein coryneformes Bakterium, das ein mutiertes Aspartokinasegen mit desensibilisierter konzertierter Inhibierung durch Lysin und Threonin beherbergt, eine beträchtliche Menge an L-Lysin (ungefähr 25 g/l) her. Jedoch leidet dieses Bakterium am Nachteil der Wachstumsgeschwindigkeit, verglichen mit einem Bakterium, das kein mutiertes Aspartokinasegen beherbergt. Es ist ebenfalls berichtet worden, dass die L-Lysin-Produktionsfähigkeit weiter durch das Einschleusen eines Dihydrodipicolinasesynthasegens, zusätzlich zu einem mutierten Aspartokinasegen, verbessert werden kann (Applied and Environmental Microbiology, 57 (6), 1746–1752 (1991)). Jedoch leidet ein solches Bakterium weiter an einer Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit.
Es ist noch kein Fall berichtet worden, bei dem beabsichtigt wird, das Wachstum zu verbessern, in dem ein Gen für die L-Lysin-Biosynthese ebenfalls verstärkt wurde. Unter den vorliegenden Umständen ist kein Fall für coryneforme Bakterien bekannt, bei denen irgend jemand es geschafft hat, eine beträchtliche Verbesserung der L-Lysin-Ausbeute ohne die Beeinträchtigung des Wachstums zu erreichen, indem eine Vielzahl an Genen für die L-Lysin-Biosynthese kombiniert wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, die L-Lysin-Ausbeute ohne die Beeinträchtigung des Wachstums eines coryneformen Bakteriums zu verbessern, indem eine Vielzahl an Genen der L-Lysin-Biosynthese in Kombination in den coryneformen Bakterien verstärkt werden.
Wenn die gewünschte Substanz fermentativ unter Verwendung eines Microorganismus hergestellt wird, sind die Produktionsgeschwindigkeit wie auch die Ausbeute der gewünschten Substanz bezogen auf das hinzugefügte Material ein außerordentlich wichtiger Faktor. Eine gewünschte Substanz kann merklich günstiger durch Erhöhen der Produktionsgeschwindigkeit pro Einheit der Fermentationsausrüstung hergestellt werden. Daher ist es industriell äußerst bedeutsam, dass die fermentative Ausbeute und die Produktionsgeschwindigkeit miteinander kompatibel sind. Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung des Problems, das oben beschrieben worden ist, bereit, um L-Lysin fermentativ unter Verwendung eines coryneformen Bakteriums herzustellen.
Das Prinzip der vorliegenden Erfindung beruht auf der Tatsache, dass das Wachstum eines coryneformen Bakteriums verbessert werden kann, und dass die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit durch Verstärken einer DNA-Sequenz, die für ein Aspartokinase kodiert, bei der die Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensiblisiert ist, und einer DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase, verglichen mit dem Fall, in dem diese DNA-Sequenzen jeweils einzeln verstärkt sind, verbessert werden kann.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine rekombinante DNA bereitgestellt, die autonom in Zellen coryneformer Bakterien replizierbar ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die für eine Aspartikinase kodiert, bei der die Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, und eine DNA-Sequenz, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert. Die rekombinante DNA, die weiter eine DNA-Sequenz umfasst, die für eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert, wird ebenfalls bereitgestellt.
Nach einen zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein coryneformes Bakterium bereitgestellt, das eine Aspartokinase beherbergt, in der die Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, und die eine verstärkte DNA-Sequenz umfasst, die für eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert. Ein coryneformes Bakterium, das weiter eine verstärkte DNA-Sequenz umfasst, die für eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert, wird ebenfalls bereitgestellt.
Nach einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin bereitgestellt, das die Schritte der Kultivierung irgendeines coryneformen Bakteriums, das oben beschrieben worden ist, in einem geeigneten Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin herge stellt wird, und in einer Kultur des Bakteriums akkumuliert, und das Einsammeln des L-Lysins aus der Kultur umfasst.
Nachfolgend wird die Aspartokinase, falls notwendig, hier als „AK" bezeichnet, ein Gen, das für AK kodiert wird bezeichnet als „lysC", AK, die hinsichtlich der Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin desensibiliert ist, wird als „mutierte AK" bezeichnet, und ein Gen, das für eine mutierte AK kodiert, wird als „mutierte lysC" bezeichnet. Eine Diaminopimelatdecarboxylase wird, falls notwendig, als „DDC" bezeichnet, ein Gen, das für die DDC kodiert wird als „lysA" bezeichnet, eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase wird als „PEPC" bezeichnet, und ein Gen, das für PEPC kodiert, wird als „ppc" bezeichnet.
Coryneforme Bakterien, auf die in der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, sind eine Gruppe von Mikroorganismen, wie in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, Seite 599 (1974) definiert, welche aerobe Gram-positive nicht-acid-fast-Stäbchen sind, die keine Sporenbildende Fähigkeit aufweisen. Die coryneformen Bakterien schließen Bakterien ein, die zum Genus Corynebacterium gehören, Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, die zuvor in den Genus Brevibacterium klassifiziert worden sind, aber als Bakterien zusammengefasst worden sind, die zum Genus Corynebacterium gehören, und Bakterien, die zum Genus Brevibacterium gehören, welche Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, nahe verwandt sind.
Erfindungsgemäß kann die Produktionsmenge und die Produktionsgeschwindigkeit von L-Lysin in coryneformen Bakterien verbessert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Verfahren der Herstellung der Plasmide p399AK9B und p399AKYB dar, umfassend das mutierte lysC.
2 stellt ein Verfahren der Herstellung des Plasmids p299LASA, umfassend lysA, dar.
3 stellt ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids pLASAB, umfassend lysA und Brevi.-ori, dar.
4 stellt ein Verfahren zum Herstellen eines Plasmids pAKPFds, umfassend das PEPC-Strukturgen, dar.
5 stellt ein Verfahren zum Konstruieren von neuen Klonierungsvektoren, pVK6 und pVK7, für coryneforme Bakterien dar.
6 stellt ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids pPwm, umfassend eine Wildtyp-Hochexpressions-ppc, dar.
7 stellt ein Verfahren zur Herstellung des Plasmids pCL, umfassend mutiertes lysC, lysA und Brevi.-ori, dar.
8 stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids pDPSB, umfassend dapA und Brevi.-ori, dar.
9 stellt das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pDPRB, umfassend dapB und Brevi.-ori, dar.
10 stellt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pPK4D, umfassend ddh und Brevi.-ori, dar.
11 stellt ein Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCRCAB, umfassend lysC, dapA und Brevi.-ori, dar.
12 stellt das Verfahren zur Herstellung des Plasmids pCB, umfassend mutiertes lysC, dapB und Brevi.-ori, dar.
13 stellt das Verfahren zur Konstruktion des Plasmids pCD, umfassend mutiertes lysC und ddh, dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
<1> Herstellung von Genen für die L-Lysin-Biosynthese, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden
Die Gene für die L-Lysin-Biosynthese, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden jeweils durch Herstellen chromosomaler DNA aus einem Bakterium als DNA-Donor, Konstruieren einer chromosomalen DNA-Bibliothek unter Verwendung eines Plasmidvektors oder ähnlicher, das Auswählen eines Stammes, der das gewünschte Gen beherbergt, und das Gewinnen aus dem ausgewählten Stamm von rekombinanter DNA, in die das Gen inseriert worden ist, gewonnen. Der DNA-Donor für das Gen für die L-Lysin-Biosynthese, das erfindungsgemäß verwendet wird, ist nicht spezifisch limitiert, unter der Voraussetzung, dass das gewünschte Gen für die L-Lysin-Biosynthese ein Enzymprotein exprimiert, das in Zellen coryneformer Bakterien funktioniert. Jedoch ist der DNA-Donor bevorzugterweise ein coryneformes Bakterium.
Alle Gene lysC, dapA und ppc, die aus einem coryneformen Bakterium stammen, haben bekannte Sequenzen. Daher können sie durch das Durchführen einer Amplifikation gemäß dem Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion gewonnen werden (PCR, siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
Jedes der Gene für die L-Lysin-Biosynthese, das erfindungsgemäß verwendet wird, ist in Übereinstimmung mit bestimmten Verfahren, die unten beispielhaft dargestellt werden, zu gewinnen.
(1) Herstellung von mutiertem lysC
Ein DNA-Fragment, das mutiertes lysC enthält, kann aus einem mutierten Stamm hergestellt werden, in dem die synergistische Rückkoppelungsinhibierung der AK-Aktivität durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist (Internationale Veröffentlichung Pamphlet der WO 94/25605). Ein solcher mutierter Stamm kann beispielsweise aus einer Gruppe von Zellen gewonnen werden, die aus einem Wildtypstamm des coryneformen Bakteriums hervorgehen, welcher einer Mutationsbehandlung unterworfen worden ist, indem eine gewöhnliche Mutationsbehandlung wie eine ultraviolette Bestrahlung und die Behandlung mit einem Mutationsmittel wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) durchgeführt worden ist. Die AK-Aktivität kann unter Verwendung eines durch Miyajima, R. et al. in The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2), 139–148, beschriebenen Verfahrens gemessen werden. Der am meisten bevorzugte derartige Mutantenstamm wird durch das L-Lysin-produzierende Bakterium AJ3445 (FERM P-1944) dargestellt, das durch eine Mutationsbehandlung aus einem Wildtypstamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (mit dem jetzt geänderten Namen Corynebacterium glutamicum) abstammt.
Alternativ kann mutiertes lysC ebenfalls durch eine in vitro Mutationsbehandlung von Plasmid-DNA, die Wildtyp-lysC enthält, erhältlich sein. In einem weiteren Aspekt ist Information, die über die Mutation speziell bekannt ist, um eine synergistische Rückkoppelungsinhibierung von AK durch L-Lysin und L-Threonin zu desensibilisieren, vorhanden (Internationale Veröffentlichung Pamphlet der WO 94/25605). Daher kann mutiertes lysC auf Grundlage dieser Information gemäß, beispielsweise nach dem positionsabhängigen Mutageneseverfahren ebenfalls aus Wildtyp-lysC hergestellt werden.
Ein Fragment, das lysC umfasst, kann aus einem coryneformen Bakterium durch Herstellen chromosomaler DNA, beispielsweise gemäß dem Verfahren von Saito und Miura (H. Saito und K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)) isoliert werden, und indem lysC gemäß dem Polymerase-Kettenreaktionsverfahren amplifiziert wird (PCR; siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)).
DNA-Primer werden beispielhaft durch Einzelstränge der DNAs als 23-mer und 21-mer mit den Nucleotidsequenzen, die in den SEQ-Nummern 1 und 2 in der Sequenzliste gezeigt sind, dargestellt, um beispielsweise einen Bereich von ungefähr 1.643 Basenpaaren zu amplifizieren, der für lysC auf Grundlage von Corynebacterium glutamicum bekannten Sequenz kodiert (siehe Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197–1204; Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317–324). DNA kann in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren un ter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts vom Modells 380B synthetisiert werden, das von Applied Biosystems hergestellt wird, und unter Verwendung des Phosphoamiditverfahrens (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). Eine PCR kann unter Verwendung eines DNA-Thermo-Cyclers vom Modell PJ2000 hergestellt werden, das von Takara Shuzo produziert wird, und unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase gemäß dem von dem Lieferanten beschriebenen Verfahren.
Es wird bevorzugt, dass lysC, welches durch PCR amplifiziert wird, in Vektor-DNA ligiert wird, welche in E.coli-Zellen und/oder coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, um rekombinante DNA herzustellen, und dass die rekombinante DNA zuvor in E.coli-Zellen eingeschleust wurde. Eine solche Vorgehensweise macht die folgenden Arbeitsschritte einfach. Der autonom in E.coli-Zellen replizierbare Vektor ist bevorzugterweise ein Plasmidvektor, welcher bevorzugterweise autonom in den Wirtszellen replizierbar ist, einschließlich beispielsweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 und RSF1010.
Wenn ein DNA-Fragment mit der Fähigkeit, dem Plasmid zu ermöglichen, autonom in coryneformen Bakterien replizierbar zu sein, in diese Vektoren inseriert ist, können sie als sogenannte Shuttle-Vektoren verwendet werden, die autonom sowohl in E.coli als auch in coryneformen Bakterien replizierbar sind.
Ein solcher Shuttle-Vektor schließt die folgenden ein. Mikroorganismen, die jeden dieser Vektoren beherbergen, und die Zugangsnummern in internationalen Hinterlegungsstellen (in Klammern) sind angegeben.
pHC4: Escherichia coli AJ12617 (FERM BP-3532)
pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR 8201 (ATCC 39135)
pAJ1844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136)
pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138)
paJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137)
pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
Diese Vektoren sind aus den hinterlegten Mikroorganismen wie folgt zu gewinnen. Zellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, wurden unter Verwendung von Lysozym und SDS lysiert, gefolgt von einer Auftrennung des Lysats durch Zentrifugieren bei 30.000 X g, um einen Überstand zu gewinnen. Zu dem Überstand wird Polyethylenglycol gegeben, gefolgt von der Fraktionierung und Aufreiniung mit Hilfe einer Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation.
E.coli kann durch Einschleusen eines Plasmids, beispielsweise in Übereinstimmung mit dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), oder einem Verfahren, bei dem die Empfängerzellen mit Calciumchlorid behandelt werden, um die Permeabilität der DNA zu erhöhen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) transformiert werden.
Wildtyp-lysC wird gewonnen, wenn lysC aus einem AK-Wildtypstamm isoliert wird, während mutierte lysC gewonnen wird, wenn lysC gemäß dem oben beschriebenen Verfahren aus einem mutierten AK-Mutantenstamm isoliert wird.
Ein Beispiel einer Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das WildtyplysC enthält, wird in SEQ-ID Nr. 3 in der Sequenzliste gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins wird von der Nucleotidsequenz abgeleitet, und ist in SEQ-ID Nr. 4 in der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ-ID Nr. 5 gezeigt. Eine Aminosäuresequenz der β-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins wird von der Nucleotidsequenz der DNA abgeleitet, und ist in SEQ-ID Nr. 6 in der Sequenzliste zusammen mit der DNA-Sequenz gezeigt. Die Aminosäuresequenz alleine ist in SEQ-ID Nr. 7 gezeigt. In jeder der Untereinheiten wird GTG als Initiationscodon verwendet, und die entsprechende Aminosäure wird durch Methionin dargestellt. Jedoch bezieht sich diese Darstellung auf Methionin, Valin oder Formylmethionin.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete mutierte lysC ist nicht spezifisch beschränkt, vorausgesetzt, dass es für AK kodiert, in der die synergistische Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Thrionin desensibilisiert ist. Jedoch wird die mutierte lysC beispielhaft durch eine dargestellt, die eine Mutation einschließt, in der der Aminosäurerest, der dem Alaninrest an Position 279, vom N-Terminus aus gezählt, in einen Aminosäurerest geändert ist, der nicht Alanin ist, und anders ist als eine saure Aminosäure in der α-Untereinheit, sowie einen Aminosäurerest, der dem Alaninrest an Position 30 vom N-Terminus entspricht, wird in einen anderen Aminosäurerest geändert als Alanin, und in eine andere als eine saure Aminosäure in der β-Untereinheit in der Aminosäuresequenz der Wildtyp-AK. Die Aminosäuresequenz der Wildtyp-AK schließt spezifisch die in SEQ-ID Nr. 5 der Sequenzliste als α-Untereinheit gezeigte Aminosäuresequenz ein, sowie die Aminosäuresequenz, die in SEQ-ID Nr. 7 der Sequenzliste gezeigt ist, als β-Untereinheit ein.
Solche, die als Aminosäurerest bevorzugt sind, die nicht Alanin ist, und keine saure Aminosäure sind, schließen Threonin-, Arginin-, Cystein-, Phenylalanin-, Prolin-, Serin-, Tyrosin- und Valinreste ein.
Der Codon, der einem Aminosäurerest, der zu substituieren ist, entspricht, ist hinsichtlich seiner Art nicht besonders beschränkt, unter der Voraussetzung, dass er für einen Aminosäurerest kodiert. Es wird vorhergesagt, dass die Aminosäuresequenz der Wildtyp-AK sich in Abhängigkeit von dem Unterschied der Bakterienart und den Bakterienstämmen leicht unterscheiden kann. AKs, die eine Mutation haben, welche beispielsweise auf einer Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäurereste an einer oder mehreren Positionen beruht, die für die Enzymaktivität nicht relevant sind, wie oben beschrieben wurde, können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine DNA, die für eine AK kodiert, die eine spontane Mutation aufweist, kann durch Isolieren einer DNA gewonnen werden, welche beispielsweise mit der DNA mit einem Teil der in SEQ-ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist. Unter den hier genannten „stringenten Bedingungen" wird eine Bedingung verstanden, bei der ein spezifisches Hybrid gebildet wird, und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, die Bedingung in numerischen Werten klar auszudrücken. Jedoch wird diese Bedingung exemplarisch dargestellt durch eine Bedingung, unter der sich Nucleinsäuren mit hoher Homologie, z. B. DNAs mit einer Homologie von nicht weniger als 90 % miteinander hybridisieren, und Nucleinsäuren mit einer Homologie von weniger als den oben angegebenen Wert nicht miteinander hybridisieren, oder eine Bedingung mit einer Temperatur, ausgehend von der Schmelzpunkttemperatur (Tm) eines vollständig passenden Hybrids bis (Tm – 30)°C, bevorzugt von Tm bis (Tm – 20)°C und einer Salzkonzentration, die 1 × SSC, bevorzugt 0,1 × SSC entspricht.
Andere AKs, die eine künstliche Mutation, beispielsweise auf Grundlage einer Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäureresten haben, können, unter der Voraussetzung, dass im Wesentlich kein Einfluss auf die AK-Wirkung und auf die Desensiblisierung der synergistischen Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin ausgeübt wird, ebenfalls verwendet werden. Eine DNA, die für eine AK mit der künstlichen Mutation kodiert, kann durch Modifizieren der Nucleotidsequenz gewonnen werden, um eine Substitution, Deletion oder Insertion einer spezifischen Position durch, beispielsweise, positionsspezifische Mutagenese gewonnen werden. Auch lysC mit einer Mutation kann durch eine Behandlung mit einem bekannten Mutagen gewonnen werden. Die Mutagenbehandlung schließt eine in vitro-Behandlung von DNA, die lysC enthält, mit Hydroxylamin oder ähnlichem ein, und die Behandlung von Mikroorganismen, die eine DNA beherbergen, welche lysC mit einer Mutation enthält, wie beispielsweise durch ultraviolette Bestrahlung oder ein Mutationsmittel, das für gewöhnlich für die artifizielle Mutagenese verwendet wird, beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder Salpetersäure. Nach der Mutagenbehandlung kann eine Position, in der die Mutation eingeschleust worden ist, oder an der eine Mutation aufgetreten ist durch Auswählen einer DNA oder eines Mikroorganismus selektioniert werden, welcher für eine AK kodiert oder diese herstellt, die AK-Aktivität besitzt, und deren Aminosäuresequenz mutiert ist anhand von DNA, die einer Mutagenbehandlung unterworfen worden ist, oder des Mikroorganismus, der der Mutagenbehandlung unterworfen worden ist. Die Position der eingeschleusten Mutationen ist nicht spezifisch beschränkt, unter der Voraussetzung, dass im Wesentlichen kein Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensiblisierung der Rückkoppelungsinhibierung ausgeübt wird. Die Anzahl der eingeschleusten Mutationen varriiert in Abhängigkeit von der Position oder der Art der mutierten Aminosäure in der sterischen Struktur des Proteins, und ist nicht spezifisch beschränkt, mit der Maßgabe, dass im Wesentlichen kein Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der Rückkoppelungsinhibierung ausgeübt wird. Die Anzahl beträgt für gewöhnlich 1–20, bevorzugt 1–10.
Der durch das Einschleusen eines mutierten lysC-Plasmids p399AK9B in den AJ12036-Stamm (FERM BP-734) als Wildtypstamm von Brevibacterium lactofermentum gewonnene AJ12691, ist am 10. April 1992, unter Zugangsnr. FERM P-12918 beim National Institute of Bioscience and Human Technology des Ministeriums für Internationalen Handel und Industrie (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt worden, und in einer internationale Hinterlegung, beruhend auf dem Budapester Vertrag am 10. Februar 1995 überführt worden, und unter der Zugangsnr. FERM BP-4999 hinterlegt worden.
(2) Herstellung von lysA
Ein DNA-Fragment, das lysA enthält, kann vom Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe von PCR hergestellt werden. Der DNA-Donor ist nicht besonders beschränkt, jedoch wird er beispielhaft durch den Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm wiedergegeben.
In coryneformen Bakterien bildet lysA zusammen mit argS (arginyl-tRNA Synthasegen) ein Operon, und lysA liegt stromabwärts von argS. Die Expres sion von lysA wird durch einen Promotor reguliert, der stromaufwärts von argS vorhanden ist (siehe Journal of Bacteriology, Nov., 7356–7362 (1993)). DNA-Sequenzen dieser Gene sind bei Corynebacterium glutanicum bekannt (siehe Molecular Microbiology, 4 (11), 1819–1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988)), auf deren Grundlage DNA-Primer für die PCR hergestellt werden können. Solche DNA-Primer werden beispielhaft wiedergegeben durch 23-mer-DNAs, die jeweils die Nucleotidsequenzen haben, die in SEQ-ID Nr. 8 der Sequenzliste (entsprechend den Nucleotidnummern 11–33 in der Nucleotidsequenz, die in Molecular Microbiology, 4 (11), 1819–1830 (1990)) beschrieben ist und SEQ-ID Nr. 9 (entsprechend den Nucleotidpositionen 1370 bis 1392 der Nucleotidsequenz, die in Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988) beschrieben ist. Die Synthese von DNA, die PCR und die Herstellung eines Plasmids, das das gewonnene lysA enthält, kann auf gleiche Weise wie die für lysC, welche oben beschrieben worden ist, durchgeführt werden.
Im später beschriebenen Beispiel wurde ein DNA-Fragment, das einen Promotor, argS und lysA enthält, verwendet, um lysA zu verstärken. Jedoch ist argS für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich. Es ist erlaubt, ein DNA-Fragment zu verwenden, in dem lysA genau stromabwärts des Promotors ligiert ist.
Eine Nucleotidsequenz eines DNA-Fragments, das argS und lysA enthält, und eine Aminosäuresequenz, die abgeleitet davon durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, werden in SEQ-ID Nr. 10 beispielhaft dargestellt. Ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, die durch argS kodiert wird, ist in SEQ-ID Nr. 11 gezeigt, und ein Beispiel einer Aminosäuresequenz, das durch lysA kodiert wird, ist in SEQ-ID Nr. 12 gezeigt. Zusätzlich zu DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenzen kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die im Wesentlichen die gleichen sind, wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ-ID Nr. 12 gezeigt ist, d. h. Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die darauf beruhen, beispielsweise eine Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluss auf die DDC-Aktivität gibt. Das lysA mit spontaner oder artifizieller Mutation kann auf gleiche Weise wie die DNA gewonnen werden, die für die AK mit einer Mutation, welche keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desensibilisierung der synergistischen Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin ausübt.
(3) Herstellung von PPC
Ein DNA-Fragment, das PPC enthält, kann vom Chromosom eines coryneformen Bakteriums mit Hilfe von PCR gewonnen werden. Der DNA-Donor ist nicht besonders limitiert, jedoch wird er beispielhaft wiedergegeben durch Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm.
Die DNA-Sequenzen des ppc-Gens sind bei Corynebacterium glutamicum bekannt (siehe O'Regan, M. et al., Gene, 77, 237–251 (1989), und auf Grundlage davon können DNA-Primer für die PCR hergestellt werden. Solche DNA-Primer sind spezifisch beispielhaft dargegeben durch 23-mer-DNAs, die jeweils die Nucleotidsequenzen haben, die in SEQ-ID Nr. 13 und 14 der Sequenzliste gezeigt sind. Die Synthese der DNA, die PCR, und die Herstellung eines Plasmids, das das hergestellte ppc enthält, kann auf gleiche Weise durchgeführt werden, wie bei lysC, das oben beschrieben worden ist.
Eine Nucleotidsequenz des DNA-Fragments, das ppc enthält, und eine Aminosäuresequenz, die nach Ableitung durch die Nucleotidsequenz kodiert wird, wird in SEQ-ID Nr. 15 gezeigt. Die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ-ID Nr. 16 gezeigt.
Zusätzlich zu DNA-Fragmenten, die für diese Aminosäuresequenzen kodieren, kann die vorliegende Erfindung gleichermaßen DNA-Fragmente verwenden, die Aminosäuresequenzen kodieren, die im Wesentlichen die gleichen sind, wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ-ID Nr. 16 gezeigt ist, d. h. Aminosäuresequenzen mit einer Mutation, die beispielsweise auf einer Substitution, Deletion oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren beruht, vorausgesetzt, dass es keinen wesentlichen Einfluss auf die PEPC-Aktivität gibt. ppc mit spontaner oder artifizieller Mutation kann auf gleiche Weise gewonnen werden, wie die DNA, die für eine AK mit einer Mutation kodiert, die keinen Einfluss auf die AK-Aktivität und auf die Desibilisierung der synergistischen Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin ausübt.
Die ppc des coryneformen Bakteriums bildet zusammen mit gap (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Gen), pgk (Phosphoglyceratkinase-Gen) und tpi (Triosephosphatisomerase-Gen) ein Operon, und ppc liegt stromabwärts von tpi vor. Die Expression von ppc wird durch einen Promotor reguliert, der stromaufwärts von pgk vorhanden ist (siehe Schwinde, J. W. et al., J. Bacteriol., 175 (12), 3905–3908 (1993). Daher, wie beim oben erwähnten lysA, kann ppc zusammen mit pgk und tpi durch PCR amplifiziert werden, um ein DNA-Fragment zu verwenden, das pgk, tpi und ppc enthält. wie im später beschriebenen Beispiel gezeigt wird, ist es erlaubt, ein DNA-Fragment zu verwenden, bei dem ein geeigneter Promotor direkt stromaufwärts der kodieren den Region von PEPC ligiert ist. Der Promotor schließt einen Promotor für lysC, einen tac-Promotor, der von E.coli stammt, und einen trc-Promotor ein.
<2> Rekombinante DNA und coryneformes Bakterium der vorliegenden Erfindung
Die rekombinante DNA umfasst eine DNA-Sequenz, die eine Aspartokinase kodiert, in der die Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, und eine DNA-Sequenz, die eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, und autonom replizierbar ist in coryneformen Bakterienzellen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die rekombinante DNA weiter eine DNA-Sequenz, die für eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase zusätzlich zu den oben erwähnten DNA-Sequenzen kodiert.
Das erfindungsgemäße coryneforme Bakterium beherbergt eine Aspartokinase (mutierte AK), in der die Rückkoppelungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, wobei DNA (lysA), die für eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, verstärkt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das coryneforme Bakterium der vorliegenden Erfindung ein coryneformes Bakterium, bei dem DNA (ppc), die für eine Phosphoenolpyruvatcarboxalase kodiert, weiter verstärkt ist.
Der Begriff „verstärkt" bezieht sich hier auf die Tatsache, dass die intrazelluläre Aktivität eines Enzyms, das durch die DNA kodiert wird, beispielsweise durch Erhöhung der Kopienanzahl eines Gens, durch Verwendung eines starken Promotors, durch Verwendung eines Gens, das ein Enzym kodiert, das eine hohe spezifische Aktivität hat, oder durch eine Kombination dieser Mittel erhöht wird.
Das coryneforme Bakterium, das die mutierte AK beherbergt, kann eines sein, das die mutierte Aspartokinase als Ergebnis einer Mutation herstellt, oder ein solches, das durch Einschleusen mutierten lysCs transformiert ist.
Beispiele des coryneformen Bakteriums, das verwendet wird, um die oben beschriebene DNA einzuschleusen, schließen beispielsweise die folgenden Lysin-produzierenden Wildtyp-Stämme ein:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870;
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806;
Corynebacterium callunae ATCC 15991;
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032;
(Brevibacterium divaricatium) ATCC 14020;
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869;
(Corynebacterium lilium) ATCC 15990;
(Brevibacterium flavum) ATCC 14067;
Corynebacterium melassecola ATCC 17965;
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066;
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068;
Brevibacterium roseum ATCC 13825;
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240;
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Anders als die Bakterienstämme, die oben beschrieben sind, schließen solche, die als Wirt verwendbar sind, beispielsweise Mutantenstämme mit L-Lysin-Produktionsfähigkeit ein, die von den oben erwähnten Stämmen abstammen. Solche artifiziellen mutierten Stämme schließen folgende ein: S-(2-Aminoethyl)-cystein (nachfolgend abgekürzt als „AEC"), resistente Mutantenstämme (z. B. Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-1147), Japanische Patentveröffentlichungs-Nr. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 und 7-112438); Mutantenstämme, die eine Aminosäure, wie L-Homoserin für Wachstum benötigen (Japansiche Patentveröffentlichungs-Nr. 48-28078 und 56-6499); Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber AEC aufweisen und Aminosäuren wie L-Leucin, L-Homoserin, L-Prolin, L-Serin, L-Arginin, L-Alanin und L-Valin benötigen (United States Patente Nr. 3,708,395 und 3,825,472); L-Lysin-produzierende Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber DL-α-Amino-ε-Caprocaltam, α-Amino-lauryllactam, Aspartat-analoga, Sulfamedikamenten, Chinoid und N-Lauroylleucin aufweisen; L-Lysin-herstellende Mutantenstämme, die eine Resistenz gegenüber Inhibitoren der Oxyaloacetatdecarboxylase oder von Enzymen des Respirationssystems aufweisen (Japanische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 50-53588; 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 und 56-39778 und Japanische Patentveröffentlichungs-Nr. 53-43591 und 53-1833); L-Lysin-herstellende Mutantenstämme, die Inositol und Essigsäure benötigen (Japanische Patentanmeldung Offenlegungs-Nr. 55-9784 und 56-8692); L-Lysin-herstellende Mutantenstämme, die eine Empfindlichkeit gegenüber Fluoropyrovatsäure oder einer Temperatur von nicht weniger als 34°C aufweisen (Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungs-Nr. 55-9783 und 53-86090); und herstellende Mutantenstämme, die zum Genus Brevibacterium oder Corynebacterium gehören, welche eine Resistenz gegenüber Ethylenglycol aufweisen und L-Lysin herstellen (United States Patent Nr. 4,411,997).
In einer spezifischen Ausführungsform, um, wie oben beschrieben, die Gene für die L-Lysin-Biosynthese in dem Wirtzu verstärken, werden die Gene in den Wirt unter Verwendung eines Plasmidvektors, eines Transposons oder eines Phagenvektors oder ähnlicher eingeschleust. Nach der Einschleusung wird erwartet, dass in gewissem Ausmaß selbst bei der Verwendung eines Vektors mit niedriger Kopienzahl eine Verstärkung auftritt. Jedoch wird es bevorzugt, einen Vektor vom Typ für mehrfache Kopien zu verwenden. Solche Vektoren schließen beispielsweise die Plasmidvektoren pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148 und pAJ440, die oben beschrieben wurden, ein. Daneben sind Transposons, die von coryneformen Bakterien stammen, in den Internationalen Veröffentlichungspamphleten der WO 02/02627 und WO 93/18151, Europäische Patentveröffentlichungs-Nr. 445385, Japanische Patenanmeldungs-Offenlegungs-Nr. 6-46867, Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739–746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571–581 (1994), Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397–405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1–6 (1995), Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungs-Nr. 7-107976, Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungs-Nr. 7-327680 und ähnlichen beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung ist es nicht unverzichtbar, dass das mutierte lysC notwendigerweise verstärkt ist. Es ist erlaubt, solche zu verwenden, die eine Mutation in lysC der chromosomalen DNA haben, oder in denen das mutierte lysC in chromosomale DNA eingeschleust ist. Alternativ kann das mutierte lysC unter Verwendung eines Plasmidvektors eingeschleust werden. Andererseits sind lysA und ppc vorzugsweise verstärkt, um L-Lysin wirksam herzustellen.
Jedes der Gene lysC, lysA und ppc kann jeweils nacheinander unter Verwendung verschiedener Vektoren in den Wirt eingeschleust werden. Alternativ dazu können zwei oder drei Arten an Genen zusammen unter Verwendung eines einzelnen Vektors eingeschleust werden. Wenn verschiedene Vektoren verwendet werden, können die Gene in irgendeiner Reihenfolge eingeschleust werden, jedoch ist es bevorzugt, Vektoren zu verwenden, die eine stabile Gemeinschaft und einen Beherbungsmechanismus im Wirt haben, und die in der Lage sind, gemeinsam vorzuliegen.
Ein coryneformes Bakterium, das die mutierte AK beherbergt und außerdem verstärktes lysA umfasst, wird beispielsweise durch Einschleusen einer rekombinanten DNA in das Wirts-Corynebacterium gewonnen, die mutierte lysC, lysA und ppc enthält, welche in den Zellen coryneformer Bakterien autonom replizierbar sind.
Ein coryneformes Bakterium, das außerdem zusätzlich zu einer mutierten lysC und lysA eine verstärkte ppc umfasst, wird beispielsweise durch Einschleusen einer rekombinanten DNA, die mutiertes lysC, lysA und ppc enthält, die autonom in Zellen coryneformer Bakterien replizierbar sind, in das Wirts-Corynebacterium gewonnen. Ein coryneformes Bakterium, das ein verstärktes mutiertes lysC, lysA und ppc umfasst, wird außerdem durch Einschleusen einer rekombinanten DNA, die ppc enthält, die autonom in Zellen coryneformer Bakterien replizierbar ist, sowie in ein coryneformes Bakterium, das ein verstärktes mutiertes lysC und lysA umfasst, gewonnen.
Die oben erwähnten rekombinanten DNAs können beispielsweise durch Inserieren jedes dieser Gene, die an der L-Lysin-Biosynthese teilhaben in einen Vektor, wie einen Plasmidvektor, ein Transposon oder Phagenvektor, wie oben beschrieben worden ist, gewonnen werden.
In dem Fall, dass ein Plasmid als Vektor verwendet wird, kann die rekombinante DNA in den Wirt gemäß dem elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., Japanische Patentanmeldungs-Offenlegungs-Nr. 2-207791) eingeschleust werden. Die Amplifikation eines Gens unter Verwendung eines Transposons kann durch Einschleusen eines Plasmids in die Wirtszelle durchgeführt werden, das ein Transposon trägt, und durch die Induktion der Transposition des Transposons.
<3> Verfahren zum Produzieren von L-Lysin
L-Lysin kann effizient durch Kultivieren des coryneformen Bakteriums, das die verstärkten Gene für die L-Lysin-Biosynthese, die oben beschrieben worden sind, umfasst, in einem geeigneten Medium hergestellt werden, um zu ermöglichen, dass L-Lysin hergestellt und in der Kultur des Bakteriums akkumuliert wird, und indem L-Lysin aus der Kultur eingesammelt wird.
Das zu verwendende Medium wird beispielhaft dargestellt durch ein gewöhnliches Medium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und gegebenenfalls andere organische Bestandteile enthält.
Als Kohlenstoffquelle ist es möglich, Zucker wie Glucose, Fructose, Saccharose, Molassen und Stärkehydrolysat, und organische Säuren wie Fumarsäure, Zitronensäure und Bernsteinsäure zu verwenden.
Als Stickstoffquelle ist es möglich, anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat, organischen Stickstoff wie Sojabohnenhydrolysat, Stickstoffgas und wässrigen Harnstoff zu verwenden.
Als organische Spurenelementquellen ist es wünschenswert, dass die benötigten Substanzen, wie Vitamin B₁ und L-Homoserin oder Hefeextrakt oder ähnliche in geeigneten Mengen enthalten sind. Zusätzlich zu den oben genannten werden Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen usw., falls notwendig, in geringen Mengen hinzugegeben.
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen für ungefähr 30 bis 90 Stunden durchgeführt. Die Kultivierungstemperatur wird bevorzugterweise auf 25°C bis 37°C kontrolliert, und der pH wird während der Kultivierung vorzugsweise auf 5 bis 8 kontrolliert. Anorganische oder organische, saure oder alkalische Substanzen, oder Stickstoffgas oder ähnliche können zur Einstellung des pH-Werts verwendet werden. L-Lysin kann aus einer Kultur durch Kombinieren eines gewöhnlichen Ionen-Austauschharzverfahrens, eines Präzipitationsverfahrens oder andere bekannte Verfahren eingesammelt werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird genauer unten unter Bezugnahme auf die Beispiele geklärt.
Beispiel 1: Herstellung des Wildtyp-lysC-Gens und eines mutierten lysC-Gens aus Brevibacterium lactofermentum
<1> Herstellung von Wildtyp-lysC und mutierten lysC's und Herstellung von Plasmiden, die diese enthalten
Der Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869-Stamm und ein L-Lysin-produzierender Mutantenstamm AJ3445 (FERM P-1944), der von dem ATCC 13869-Stamm durch eine Mutationsbehandlung erhalten wurde, wurden als chromosomale DNA-Donoren verwendet. Der AJ3445-Stamm ist einer Mutation unterworfen worden, so dass lysC verändert wurde, um eine wesentliche Desensibilisierung der konzertierten Inhibierung durch Lysin und Threonin zu enthalten (Journal of Biochemistry, 68, 701–710 (1970)).
Ein DNA-Fragment, das lysC enthält, wurde aus chromosomaler DNA in Übereinstimmung mit dem PCR-Verfahren (Polymerase-Kettenreaktion; siehe White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) amplifiziert. Im Hinblick auf die DNA-Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden, wurden Einzelstränge von 23-mer und 21-mer DNAs mit den in SEQ-ID Nr. 1 und 2 gezeigten Nucleotidsequenzen auf Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197–1204, und Mol. Gen. Genet. (1990), 224, 317–324)synthetisiert, um einen Bereich von ungefähr 1.643 Basenpaaren zu amplifizieren, der für lysC kodiert. Die DNA wurde nach einem allgemeinen Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts vom Modell 380B synthetisiert, das von Applied Biosystems hergestellt wird, und in dem das Phosphoramiditverfahren verwendet wurde (siehe Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859).
Das Gen wurde mittels PCR unter Verwendung eines DNA-Thermocyclers vom Modell PJ200 amplifiziert, der von Takara Shuzo hergestellt wird, und in dem Taq DNA-Polymerase in Übereinstimmung mit dem Verfahren verwendet wurde, das von dem Lieferanten angegeben worden ist. Das amplifizerte Genfragment von 1.643 Kilobasen wurde durch Agarosegel-Electrophorese bestätigt. Danach wurde das Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und nach einem gewöhnlichen Verfahren aufgereinigt, und es wurde mit den Restriktionsenzymen NruI (hergestellt von Takara Shuzo) und EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut.
pHSG399 (siehe Takeshita, 5. et al., Gene (1987), 61, 63–74) wurde als Klonierungsvektor für das Genfragment verwendet. pHS399 wurde mit den Restriktionsenzymen SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) und EcoRI verdaut, und es wurde mit dem amplifizierten lysC-Fragment ligiert. DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren verwendet. So wurden Plasmide hergestellt, in denen die lysC-Fragmente von den Chromosomen von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert waren, welche jeweils mit pHSG399 ligiert worden waren. Das Plasmid, das lysC aus ATCC 13689 (Wildtyp-Stamm) umfasst, wurde als p399AKY bezeichnet, und ein Plasmid, das lysC aus AJ3463 umfasst (L-Lysin herstellendes Bakterium) wurde als p399AK9 bezeichnet.
Ein DNA-Fragment (nachfolgend bezeichnet als „Brevi.-ori") mit der Fähigkeit, das Plasmid autonom in Bakterien replizierbar zu machen, die zu dem Genus Corynebacterium gehören, wurde jeweils in p399AKY und p399AK9 eingeschleust, um Plasmide herzustellen, die lysC tragen, welches in Bakterien autonom replizierbar ist, die zu dem Genus Corynebacterium gehören. Brevi.-ori wurde vom Plasmidvektor pHK4 ausgehend hergestellt, der den Brevi.-ori enthält und sowohl in Escherichia coli-Zellen als auch in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom replizierbar ist. pHK4 wurde durch Verdauen von pHC4 mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) hergestellt, wobei ein Brevi.-ori-Fragment extrahiert wurde, und dieses mit pHSG298 ligiert wurde, der zuvor ebenfalls mit KpnI und BamHI verdaut worden ist (siehe Japanische Patentanmeldung Offenlegungs-Nr. 5-7491). pHK4 verleiht dem Wirt eine Kanamycin-Resistenz. Escherichia coli, das pHK4 beherbergt, wurde als Escherichi coli AJ13136 bezeichnet und am 1. August 1995 unter der Zugangs-Nr. FERM BP-5186 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministerium für internationalen Handel und Industrie (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt.
pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Glättungsprozedur wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung der glatten Enden wurde ein phophorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, damit das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus dem pHK4 alleine durch Verdau mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das hergestellte Brevi.-ori DNA-Fragment wurde mit p399AKY und p399AK9 ligiert, die ebenfalls mit BamHI verdaut worden sind, um Plasmide herzustellen, die jeweils das lysC-Gen enthalten, welches in Bakterien, die zum Genus Corynebacterium gehören, autonom replizierbar ist.
Das Plasmid, das das Wildtyp-lysC-Gen enthält, das aus p399AKY stammt, wurde als p399AKYB bezeichnet, und das Plasmid, das das mutierte lysC enthält, das aus p399AK9 stammt, wurde als p399AK9B bezeichnet. Das Verfahren zur Herstellung von p399AK9B und p399AKYB ist in 1 gezeigt. Der Stamm AJ12691, der durch Einschleusen des mutierten lysC-Plasmids p399AK9B in den Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum (AJ12036-Stamm, FERM BP-734) gewonnen wurde, wurde am 10. April 1992 unter der Zugangs-Nr. FERM P-12918 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für internationalen Handel und Industrie (1–3, Hiashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) hinterlegt, in eine internationale Hinterlegung auf Grundlage des Budapester Vertrags am 10. Februar 1995 transferiert, und unter der Zugangs-Nr. FERM BP-4999 hinterlegt.
<2> Bestimmung der Nucleotidsequenzen von Wildtyp-lysC und mutiertem lysC aus Brevibacterium lactofermentum
Das Plasmid p399AKY, das das Wildtyp-Gen lysC enthält, und das Plasmid p399AK9, das das mutierte lysC enthält, wurden aus den entsprechenden Transformanten hergestellt, um die Nucleotidsequenzen des Wildtyps und des mutierten lysC zu bestimmen. Die Nucleotidsequenz-Bestimmung wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Sanger et al. (siehe z. B. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)) durchgeführt.
Die Nucleotidsequenz von Wildtyp-lysC, welches durch p399AKY kodiert wird, ist in SEQ-ID Nr. 3 der Sequenzliste gezeigt. Andererseits hatte die Nucleotidsequenz des mutierten lysC, das durch p399AK9 kodiert wird, nur eine Mutation eines Nucleotids, so dass das G an Position 1051 in A in der SEQ-ID Nr. 3 geändert wurde, wenn es mit Wildtyp-lysC verglichen wurde. Es ist bekannt, dass lysC von Corynebacterium glutamicum zwei Untereinheiten (α, β) hat, welche in einem identischen Leseraster auf einem DNA-Strang kodiert sind (siehe Kalinowski, J. et al., Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197–1204). Wenn die Homologie beurteilt wird, wird vermutet, dass das Gen, das hier sequenziert wurde, auch zwei Untereinheiten (α, β) hat, die in einem identischen Leseraster auf einem identischen DNA-Strang kodiert werden.
Die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins, das von der Nucleotidsequenz der DNA abgeleitet wird, ist zusammen mit der DNA-Sequenz in SEQ-ID Nr. 4 gezeigt. Die Aminosäuresequenz alleine ist in SEQ-ID Nr. 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenz der β-Untereinheit des Wildtyp-AK-Proteins, die von der Nucleotidsequenz der DNA abgeleitet wird, ist zusammen mit der DNA-Sequenz in SEQ-ID Nr. 6 gezeigt. Die Aminosäuresequenz allein ist in SEQ-ID Nr. 7 gezeigt. In jeder der Untereinheiten wird GTG als Initiationscodon verwendet, und die entsprechende Aminosäure ist durch Methionin wiedergegeben. Jedoch bezieht sich diese Darstellung auf Methionin, Valin oder Formylmethionin.
Andererseits bedeutet die Mutation der Sequenz des mutierten lysC das Auftreten der Aminosäurerestsubstitution, bei der der Alaninrest an Position 279 der α-Untereinheit in einen Threoninrest geändert ist, und der Alaninrest an der Position 30 der β-Untereinheit in einen Threoninrest in der Aminosäuresequenz des Wildtyp-AK-Proteins (SEQ-ID Nr. 5, 7) geändert ist.
Beispiel 2: Herstellung von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
<1> Herstellung von lysA und Herstellung eines Plasmids, das lysA enthält
Der Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als Chromosomen-DNA-Donor verwendet. Chromosomale DNA wurde aus ATCC 13869-Stamm in Übereinstimmung mit einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, das argS, lysA und einen Promotor eines Operons enthält, das diese enthält, wurde von chromosomaler DNA mittels PCR amplifiziert. Im Hinblick auf die DNA-Primer, die für diese Amplifikation verwendet wurden, wurden auf Grundlage einer Sequenz, die für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Molecular Microbiology, 4 (11), 1819–1830 (1990); Molecular and General Genetics, 212, 112–119 (1988)), synthetische 23-mer DNAs mit den in SEQ-ID Nr. 8 und 9 in der Sequenzliste gezeigten Nucleotidsequenzen jeweils verwendet, um einen Bereich von ungefähr 3,6 Kilobasen zu amplifizieren, der für eine Arginyl-tRNA-Synthase und DDC kodiert. Die Synthese von DNA und PCR wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pHSG399 wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 3.579 Basenpaaren verwendet. pHSG399 wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und wurde mit dem DNA-Fragment ligiert, das das amplifizierte lysA enthält. Das Plasmid, das wie oben beschrieben gewonnen wurde, welches lysA enthält, das aus ATTC 13869 stammt, wurde als p399LYSA bezeichnet.
Das DNA-Fragment, das lysA enthält, wurde durch Verdau von p399LYSA mit KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) extrahiert. Dieses DNA-Fragment wurde mit pHSG299 ligiert, das mit KpnI und BamHI verdaut worden ist. Das gewonnene Plasmid wurde als p299LYSA bezeichnet. Das Verfahren zur Herstellung von p299LYSA ist in 2 gezeigt.
Brevi.-ori wurde in das erhaltene p299LYSA eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen, das lysA trägt, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Herstellung glatter Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (herstellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung der glatten Enden wurde ein phosphorylierter KpnI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, damit das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori entspricht, allein durch Verdau mit KpnI aus pHK4 ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit KpnI verdaut, und das erzeugte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p299LYSA ligiert, das ebenfalls mit KpnI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das lysA enthält, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pLYSAB bezeichnet. Das Verfahren zur Konstruktion von pLYSAB ist in 3 gezeigt.
<2> Bestimmung der Nucleotidsequenz von lysA aus Brevibacterium lactofermentum
Plasmid-DNA von p299LYSA wurde hergestellt, und dessen Nucleotidsequenz wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die bestimmte Nucleotidsequenz und eine Aminosäuresequenz, die davon abgeleitet wurde, und welche die Nucleotidsequenz kodiert, ist in SEQ-ID Nr. 10 gezeigt. Was die Nucleotidsequenz angeht, wurde eine Aminosäuresequenz, die durch argS kodiert ist, und eine Aminosäuresequenz, die durch lysA kodiert ist, jeweils in SEQ-ID Nr. 11 und 12 gezeigt.
Beispiel 3: Herstellung von ppc aus Brevibacterium lactofermentum
<1> Herstellung von ppc
Der Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Chromosomale DNA wurde aus dem ATCC-13869-Stamm nach einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Das DNA-Fragment, das ppc enthält, wurde von der chromosomalen DNA mit dem PCR-Verfahren amplifiziert. Bezüglich der DNA-Primer, die für die Amplifizierung verwendet wurden, wurden basierend auf einer bekannten Sequenz aus Corynebacterium glutamicum (siehe O'Regan, M. et al., Gene, 77, 237–251 (1989)) synthetische 23-mer-DNAs mit den in den SEQ-ID Nr. 13 bzw. 14 in der Sequenzliste gezeigten Nucleotidsequenzen verwendet, um eine Region von ungefähr 3,3 Kilobasen zu amplifizieren, welche für PEPC kodiert. Die Synthese von DNA und PCR wurde auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Das amplifizierte Genfragment von ungefähr 3.300 Basenpaaren wurde durch Agarosegel-Elektrophorese identifiziert, und dann wurde das aus dem Gel extrahierte Fragment durch ein gewöhnliches Verfahren gereinigt, und mit dem Restriktionsenzym SalI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo). pHSG399 wurde als Klonierungsvektor für PPC verwendet. pHSG399 wurde mit dem Restriktionsenzym SalI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und wurde mit dem DNA-Fragment ligiert, das das amplifizierte ppc enthält. Ein Plasmid, welches ppc trägt, das aus ATCC 13869 stammt, das wie oben beschrieben gewonnen wurde, wurde als pPCF bezeichnet.
<2> Ligierung des ppc-Gens mit dem lysC-Promotor
Das wie oben beschrieben gewonnene pPCF, wurde mit dem Restriktionsenzym DraI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut. Nachdem ein DNA-Fragment von ungefähr 150 Basenpaaren stromaufwärts des PEPC Strukturgens entfernt worden war, wurde eine Selbstligierung durchgeführt, um das Plasmid pPCFds zu gewinnen. pPCFds wurde mit dem Restriktionsenzym SalI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Bildung der glatten Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) gemäß dem angegebenen Verfahren durchgeführt.
p399AKYB, das das Wildtyp-lysC enthält, welches in Beispiel 1 gewonnen wurde, wurde mit den Restriktionsenzymen ApaLI und PstI (beide hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die geschnittenen Enden wurden auf gleiche Weise wie oben beschrieben, geglättet. Ein kleineres Fragment, aus den zwei gewonnenen DNA-Fragmenten, enthält Brevi.-ori und einen Promotor für lysC. Dieses Fragment wurde mit dem oben erwähnten Fragment ligiert, das durch Verdauen von pPCFds mit SalI gewonnen wurde, und unter Verwendung des DNA-Ligations-Kits geglättet (hergestellt von Takara Shuzo).
Eine DNA in einer Ligationslösung wurde in Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gemäß dem elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., Japanische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 2-207791) eingeschleust. Transformanten wurden auf Komplettmedium, enthaltend 5 μg/ml Chloramphenicol selektiert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten eingesammelt und mit EcoRI verdaut, um ein Plasmid zu gewinnen, in dem der lysC-Promotor mit dem ppc-Strukturgen in normaler Richtung ligiert war. Das erhaltene Plasmid wurde als pAKPFds bezeichnet. Das Verfahren zur Konstruktion von pAKPFds ist in 4 gezeigt. Das mit dem lysC-Promotor ligierte ppc wird nachfolgend als „Wildtyp-Hochexpressions-ppc" bezeichnet.
<3> Insertion des Wildtyp-Hochexpressions-ppc in den Vektor
Das Wildtyp-Hochexpressions-ppc, das oben gewonnen wurde, wurde mittels PCR amplifiziert, um es in einen Vektor mit einem Replikationsursprung einzubauen, der autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist, der nicht Brevi.-ori ist. Bezüglich der DNA-Primer wurde ein Oligonucleotid, das dem lysC-Promotorteil (SEQ-ID Nr. 7) entspricht, welches von einer Sequenz für lysC, das für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe Molecular Microbiology, 5 (5), 1197–1204 (1991); Mol. Gen. Genet., 224, 317–324 (1990)), synthetisiert, und ein Oligonucleotid, das dem ppc-Teil (SEQ-ID Nr. 8) entspricht, welches auf Grundlage einer Sequenz von ppc, das für Corynebacterium glutamicum bekannt ist (siehe O'Regan, M. et al., Gene, 77, 237–251 (1989)) wurde synthetisiert. Diese Primer wurden so entworfen, dass ein Fragment von ungefähr 3.150 Basenpaaren, das das Wildtyp-Hochexpressions-ppc enthält, ampliziert werden kann, und ein Ende des amplifizierten DNA-Fragments mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut werden kann. Die Synthese von DNA und die PCR wurden auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
Der Klonierungsvektor für coryneforme Bakterien, pVK7, welcher neu hergestellt wurde, wurde als Vektor zum Einschleusen des Wildtyp-Hochexpressions-ppc in coryneforme Bakterien konstruiert. pVK7 wurde durch Ligieren von pHSG299, einen Vektor für E.coli (Km^r; Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63–74 (1987)) mit pAM330, einem kryptischen Plasmid von Brevibacterium lactofermentum konstruiert, wie unten beschrieben wird. pHSG299 wurde mit dem Restriktionsenzym AvaII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, das zu einer Spaltstelle führte, an den Enden geglättet, in dem T4 DNA-Polymerase verwendet wurde, und mit pAM330 ligiert, das mit HindIII (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut worden ist, und unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase an den Enden geglättet. Abhängig von der Orientierung des inserierten pAM330 in pHSG299 wurden die zwei erhaltenen Plasmide als pVK6 und pVK7 bezeichnet, und pVK7 wurde für die folgenden Experimente verwendet. pVK7 ist sowohl in E.coli als auch in Brevibacterium lactofermentum autonom replizierbar und hat eine multiple Klonierungsstelle, die aus pHSG299 stammt, sowie lacZ'. Das Verfahren zur Konstruktion von pVK6 und pVK7 ist in 5 gezeigt.
Ein amplifiziertes Genfragment von ungefähr 3.150 Basenpaaren wurde durch Agarosegel-Elektrophorese identifiziert, und dann wurde das aus dem Gel extrahierte Fragment durch ein gewöhnliches Verfahren gereinigt und mit dem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut. Das DNA-Fragment wurde mit pVK7 ligiert, das mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut worden ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pPwm bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren von pPwm ist in 6 gezeigt.
Beispiel 4: Herstellung eines Plasmids, das eine Kombination aus mutiertem lysC und lysA umfasst
Ein Plasmid, das mutiertes lysC, lysA und einen Replikationsursprung für coryneforme Bakterien enthält, wurde aus dem Plasmid p399AK9B, das mutiertes lysC und einen Brevi.-ori enthält und Plasmid p299LYSA, das lysA enthält, hergestellt. p299LYSA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und KpnI (beide hergestellt von Takara Shuzo) verdaut und an den Enden geglättet. Die Bildung der glatten Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Das gewonnene DNA-Fragment wurde mit p399AK9B ligiert, das mit SalI verdaut worden ist und an den Enden geglättet wurde. Auf diese Weise wurde ein Plasmid, das mutiertes lysC und lysA enthält, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, hergestellt und als pCL bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren von pCL ist in 7 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1: Herstellung von dapA, dapB und ddh aus Brevibacterium lactofermentum
Als Gene, die mit L-Lysin-Biosynthese neben lysC, lysA und ppc assoziiert sind, wurden dapA (Dihydrodipicolinatsynthasegen), dapB (Dihydrodipicolinatreductasegen) und ddh (Diaminopimelatdehydrogenasegen) wie folgt gewonnen.
<1> Herstellung von dapA und Konstruktion eines Plasmids, das dapA enthält
Ein Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Chromosomale DNA wurde aus dem ATCC 13869-Stamm mit einem gewöhnlichen Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, das dapA enthält, wurde von chromosomaler DNA mittels PCR amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für diese Amplifizierung verwendet wurden, wurden 23-mer DNAs mit den Nucleotidsequenzen, die in den SEQ-ID Nr. 21 bzw. 22 der Sequenzliste gezeigt sind, auf Grundlage einer bekannten Sequenz für Corynebacterium glutamicum (siehe Nucleic Acids Research, 18 (21, 6421 (1990); EMBL Zugangs-Nr. X53993) synthetisiert, um einen Bereich von ungefähr 1,5 Kilobasen zu amplifizieren, welcher für DDPS kodiert. Die Synthese der DNA und PCR wurden auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR1000 (hergestellt von Invitrogen, siehe Bio/Technology, 9, 657–663 (1991)) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 1.411 Basenpaaren verwendet und mit dem amplifizierten dapA-Fragment ligiert. Die Ligierung der DNA wurde unter Verwendung eines DNA-Ligations-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) durchgeführt, die Waschschritte mit dem angegebenen Verfahren. Auf diese Weise wurde ein Plasmid hergestellt, bei dem das dapA-Fragment von 1.411 Basenpaaren vom Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert worden war, mit pCR1000 ligiert wurde. Das Plasmid, das wie oben beschrieben gewonnen wurde, welches dapA enthält, das aus ATCC 13869 stammt, wurde als pCRDAPA bezeichnet.
Ein Transformantenstamm AJ13106, der durch Einschleusen von pCRDAPA in dem E.coli JM109-Stamm gewonnen wurde, ist international seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangs-Nr. FERM BP-5113 beim National Institute of Biscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für internationalen Handel und Industrie (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) auf Grundlage des Budapester Vertrages hinterlegt worden.
Brevi.-ori wurde in das hergestellte pCRDAPA eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen, das dapA trägt, das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die gespaltenen Enden wurden geglättet. Die Bildung der glatten Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo), nach dem angegebenen Verfahren hergestellt. Nach der Bildung der glatten Enden wurde ein phosphory lierter SmaI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung durchzuführen, damit das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, allein aus pHK4 durch Verdau mit SmaI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit SmaI verdaut, und das hergestellte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert, das ebenfalls mit SmaI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das dapA enthält, das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Dieses Plasmid wurde als pDPSB bezeichnet. Das Verfahren zur Herstellung von pDPSB (Km^r) ist in 8 gezeigt.
<2> Herstellung von dapB und Konstruktion eines Plasmids, das dapB enthält
Ein Wildtyp-Stamm von Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 wurde als chromosomaler DNA-Donor verwendet. Chromosomale DNA wurde aus ATCC 13869-Stamm durch ein gewöhnliches Verfahren hergestellt. Ein DNA-Fragment, das dapB enthält, wurde von der chromosomalen DNA mittels PCR amplifiziert. Hinsichtlich der DNA-Primer, die für die Amplifikation verwendet wurden, wurden 23-mer-DNAs mit den Nucleotidsequenzen, die in den SEQ-ID Nr. 19 bzw. 20 in der Sequenzliste wiedergegeben sind, basierend auf der Sequenz, die für Brevibacterium lactofermentum bekannt ist (siehe Journal of Bacteriology, 175 (9), 2743–2749 (1993)) synthetisiert, um eine Region von ungefähr 2,0 kb zu amplifizieren, die für die DDPR kodiert. Die Synthese der DNA und PCR wurden auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. pCR-Script (hergestellt von Invitrogen) wurde als Klonierungsvektor für das amplifizierte Genfragment von 2.001 Basenpaaren verwendet, und mit dem amplifizierten dapB-Fragment ligiert. Auf diese Weise wurde ein Plasmid hergestellt, in dem das dapB-Fragment von 2.001 Basenpaaren, das aus dem Chromosom von Brevibacterium lactofermentum amplifiziert wurde, mit pCR-Script ligiert. Das Plasmid, das, wie oben beschrieben, gewonnen wurde, welches dapB enthielt, das aus ATCC 13869 stammt, wurde als pCRDAPB bezeichnet. Der Transformantenstamm AJ13107, der durch das Einschleusen von pCRDAPB in E.coli JM109-Stamm gewonnen wurde, ist international seit dem 26. Mai 1995 unter der Zugangs-Nr. FERM BP-5114 beim National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministeriums für internationalen Handel und Industrie (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japan) auf Grundlage des Budapester Vertrags hinterlegt worden.
Ein Fragment von 1.101 Basenpaaren, das ein Strukturgen von DDPR enthält, wurde durch Verdau von pCRDAPB mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit pHSG399 ligiert, das mit HincII und SphI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen. Das hergestellte Plasmid wurde als p399DPR bezeichnet.
Brevi.-ori wurde in das hergestellte p399DPR eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen, das dapB trägt, das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4 wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI (hergestellt von Takara Shuzo) verdaut, und die gespaltenen Enden wurden geglättet. Die Bildung der glatten Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung der glatten Endung wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung zu ergeben, damit das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 allein durch den Verdau mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das hergestellte Brevi.-ori-DNA-Fragment wurde mit p399DPR ligiert, das ebenfalls mit BamHI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das dapB enthält, das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. Das hergestellte Plasmid wurde als pDPRB bezeichnet. Das verfahren zur Konstruktion von pDPRB ist in 9 gezeigt.
<3> Herstellung von ddh und Konstruktion eines Plasmids, das ddh enthält.
Das ddh-Gen wurde durch Amplifizieren des ddh-Gens von chromosomaler DNA aus Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 in Übereinstimmung mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern (SEQ-ID Nr. 23, 24) auf Grundlage einer bekannten Nucleotidsequenz des ddh-Gens für Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)) hergestellt. Das gewonnene amplifizierte DNA-Fragment wurde mit EcoT22I und mit AvaI verdaut, und die gespaltenen Enden wurden geglättet. Danach wurde das Fragment in eine SmaI-Schnittstelle von pMW119 inseriert, um das Plasmid pDDH zu gewinnen.
Als nächstes wurde pDDH mit SalI und EcoRI verdaut, gefolgt von der Bildung glatter Enden. Danach wurde das gewonnene Fragment mit pUC18 ligiert, das mit SmaI verdaut worden ist. Das Plasmid, das auf diese Weise gewonnen wurde, wurde als pUC18DDH bezeichnet.
Der Brevi.-ori wurde in pUC18DDH eingeschleust, um ein Plasmid herzustellen, das ddh trägt, und das autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist. pHK4 wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut, und die geschnittenen Enden wurden geglättet. Die Bildung der glatten Enden wurde durch Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) nach dem angegebenen Verfahren hergestellt. Nach der Bildung der glatten Enden wurde ein phosphorylierter PstI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, so dass es in die PstI-Schnittstelle von pHSG299 inseriert wurde. Ein Plasmid, das, wie oben beschrieben, konstruiert wurde, wurde als pPK4 bezeichnet. Als nächstes wurde pUC18DDH mit XbaI und KpnI verdaut, und das erzeugte Fragment wurde mit pPK4 ligiert, welches mit KpnI und XbaI verdaut worden ist. Auf diese Weise wurde ein Plasmid, welches autonom in coryneformen Bakterien replizierbar ist, das ddh enthält, hergestellt. Dieses Plasmid wurde als pPK4D bezeichnet. Das Verfahren zur Konstruktion von pPK4D ist in 10 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung eines Plasmids, das die Kombination von mutiertem lysC und dapA, dapB oder ddh umfasst
<1> Konstruktion einer Kombinationen des mutierten lysC und dapA
Ein Plasmid, das mutiertes lysC, dapA und den Replikationsursprung für coryneforme Bakterien umfasst, wurde vom Plasmid pCRDAPA ausgehend hergestellt, das dapA umfasst, und das Plasmid p399AK9B, das mutiertes lysC umfasst und den Brevi.-ori. p399AK9B wurde vollständig mit SalI verdaut, und dann wurden die Enden geglättet. Ein EcoRI-Linker wurde daran ligiert, um ein Plasmid herzustellen, bei dem die SalI-Schnittstelle in eine EcoRI modifiziert worden ist. Das gewonnene Plasmid wurde als p399AK9BSE bezeichnet. Das mutierte lysC und Brevi.-ori wurden als ein Fragment durch teilweises Verdauen durch p399AK9BSE mit EcoRI ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde mit pCRDAPA ligiert, das mit EcoRI verdaut worden ist. Das gewonnene Plasmid wurde als pCRCAB bezeichnet. Dieses Plasmid ist in E.coli und coryneformen Bakterien autonom replizierbar und verleiht dem Wirt eine Kanamycinresistenz, wobei das Plasmid eine Kombination aus mutiertem lysC und dapA umfasst. Das Verfahren zur Konstruktion von pCRCAB ist in 11 gezeigt.
<2> Konstruktion eines Plasmids, das eine Kombination aus mutiertem lysC und dapB umfasst
Ein Plasmid, das mutiertes lysC und dapB umfasst, wurde vom Plasmid p399AK9 mit mutiertem lysC und dem Plasmid p399DPR mit dapB hergestellt. Ein Fragment von 1.101 Basenpaaren, das ein Strukturgen von DDPR enthält, wurde durch Verdau von p399DPR mit EcoRV und SphI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit p399AK9 ligiert, das mit SalI verdaut worden ist, und dann an den Enden geglättet worden ist, und dann weiter mit SphI verdaut worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das eine Kombination aus mutiertem lysC und dapB umfasst. Dieses Plasmid wurde als p399AKDDPR bezeichnet.
Als nächstes wurde ein Brevi.-ori in das gewonnene p399AKDDPR eingeschleust. Das Plasmid pHK4, das den Brevi.-ori enthält, wurde mit dem Restriktionsenzym KpnI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), und die gespaltenen Enden wurden geglättet. Die Bildung glatter Enden wurde unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kits (hergestellt von Takara Shuzo) in Übereinstimmung mit dem angegebenen Verfahren durchgeführt. Nach der Bildung der glatten Enden wurde ein phosphorylierter BamHI-Linker (hergestellt von Takara Shuzo) ligiert, um eine Modifizierung durchzuführen, damit das DNA-Fragment, das dem Brevi.-ori-Teil entspricht, aus pHK4 allein durch Verdau mit BamHI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wurde mit BamHI verdaut, und das hergestellte Brevi.-ori DNA-Fragment wurde mit p399AKDDPR ligiert, das ebenfalls mit BamHI geschnitten worden ist, um ein Plasmid herzustellen, das mutiertes lysC und dapB enthält, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist. Das konstruierte Plasmid wurde als pCB bezeichnet. Das Verfahren zur Konstruktion von pCB ist in 12 gezeigt.
<3> Konstruktion eines Plasmids, das eine Kombination aus mutiertem lysC und ddh umfasst
Ein Plasmid, das mutiertes lysC, ddh und einen Replikationsursprung für coryneforme Bakterien enthält, wurde aus dem Plasmid pUC18DDH hergestellt, das ddh enthält, und dem Plasmid p399AK9B, das mutiertes lysC und den Brevi.-ori enthält. pUC18DDH wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut (hergestellt von Takara Shuzo), an den Enden geglättet und mit einem SalI-Polylinker an einem Ende ligiert, um eine EcoRI-Schnittstelle in eine SalI-Schnittstelle zu ändern. Das erhaltene Plasmid wurde mit SalI verdaut, um ein DNA-Fragment zu gewinnen, das ddh enthält.
Dann wurde p399AK9B mit dem Restriktionsenzym SalI geschnitten, und mit dem DNA-Fragment ligiert, das ddh enthält. Auf diese Weise wurde ein Plasmid, das mutiertes lysC, ddh und einen Brevi.-ori enthält, das in coryneformen Bakterien autonom replizierbar ist, hergestellt, und als pCD bezeichnet. Das Konstruktionsverfahren für pCD ist in 13 gezeigt.
Beispiel 5: Einschleusung von Plasmiden, die Gene für die L-Lysin-Biosynthese umfassen, in ein L-Lysin-produzierendes Brevibacterium lactofermentum Bakterium
Die Plasmide, die gene für L-Lysin-Biosynthese umfassen, die, wie oben beschrieben, hergestellt wurden, d. h. p399AK9B (Cm^r), pLYSAB (Cm^r), pPwm (Km^r), pCRCAB (Km^r), pCB (Cm^r), pCD (Cm^r) und pCL (Cm^r) wurden jeweils in das L-Lysin-produzierende Bakterium AJ11082 (NRRL B-11470) von Brevibacterium lactofermentum eingeschleust. Der AJ11082-Stamm hat eine AEC-Resistenz. Die Plasmide wurden nach dem elektrischen Pulsverfahren (Sugimoto et al., Japanische Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 2-207791) eingeschleust. Die Transformanten wurden auf Grundlage von Medikamentenresistenz-Markern ausgewählt, die die jeweiligen Plasmide aufweisen. Transformanten wurden auf Komplettmedium selektiert, das 5 μg/ml Chloramphenicol enthält, wenn ein Plasmid, das eine Chloramphenicolresistenz umfasst, eingeschleust wurde, oder Transformanten wurden auf Komplettmedium, enthaltend 25 μg/ml Kanmycin selektiert, wenn ein Plasmid eingeschleust wurde, das ein Kanmycin-Resistenzgen umfasst.
In einen Stamm aus den oben genannten Transformanten, in dem mutiertes lysC und lysA verstärkt waren, wurde pPwm (Km^r) eingeschleust, um einen Stamm zu gewinnen, in dem die drei mutierten lysC, lysA und ppc verstärkt waren (AJ11082/pCL/pPwm). Die Transformanten wurden auf Komplettmedium, enthaltend 5 μg/ml Chloramphenicol und 25 μg/ml Kanamycin selektiert.
Beispiel 6: Produktion von L-Lysin
Jede der Transformanten, die in Beispiel 5 gewonnen wurden, wurde in einem L-Lysin-Produktionsmedium kultiviert, um dessen L-Lysin-Produktionsfähigkeit zu untersuchen.
[L-Lysin-Produktionsmedium]

Neben Calciumcarbonat wurden die folgenden Bestandteile (in 1 l) gelöst, und der pH wurde auf 8,0 mit KOH eingestellt. Das Medium wurde bei 115°C für 15 min sterilisiert, und Calciumcarbonat (50 g), das mit heißer Luft in trockenem Zustand separat sterilisiert worden ist, wurde danach hinzugegeben.

Glucose	100 g
(NH₄)₂SO₄	55 g
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄ 7H₂O	1 g
Biotin	500 μg
Thiamin	2.000 μg
FeSO₄ 7H₂O	0,01 g
MnSO₄ 7H₂O	0,01 g
Nicotinamid	5 mg
Proteinhydrolysat (Mamenou)	30 ml
Calciumcarbonat	50 g

Jede der zahlreichen Typen an Transformanten und der Parentalstämme wurden in das Medium mit der oben beschriebenen Zusammensetzung inokuliert, um eine Kultivierung bei 31,5°C bei umgekehrtem Schütteln durchzuführen. Die Menge des hergestellten L-Lysins nach 40 ode72 Stunden Kultivierung wird in Tabelle 1 gezeigt. In der Tabelle stellt lysC* mutiertes lysC dar.
Tabelle 1 Akkumulierung von L-Lysin nach Kultivierung über 40 oder 72 Stunden
Wie oben gezeigt, war die Menge produzierten L-Lysins, wenn mutiertes lysC, lysA oder ppc leicht erhöht war, oder wenn mutiertes lysC in Kombination mit dapA oder ddh verstärkt war, größer als oder äquivalent der, die durch den Parentalstamm nach 72 h Kultivierung hergestellt wurde, jedoch war die Menge hergestellten L-Lysins geringer als die, welche nach 40 h Kultivierung vom Parentalstamm hergestellt wurde. Das bedeutet, dass die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit durch Kultivierung über einen kürzeren Zeitraum verringert wurde. Gleichermaßen wurde, wenn mutiertes lysC und ddh verstärkt wurden, die Menge hergestellten L-Lysins kleiner als die, die durch den Parentalstamm nach 40 h und 72 h Kultivierung hergestellt wurde. Im Gegensatz dazu war in dem Fall, dass der Stamm, bei dem dapB zusammen mit dem mutierten lysC verstärkt war, das Wachstum verbessert, die L-Lysin-Produktionsgeschwindigkeit wurde erfolgreich in der kurzen Kultivierungsdauer wiederhergestellt, und die akkumulierte Menge an L-Lysin wurde über den langen Zeitraum der Kultivierung ebenfalls verbessert. Im Fall eines Stamms, in dem drei mutierte lysC, lysA und ppc gleichzeitig verstärkt waren, war die L-Lysin-Produktivität weiter verbessert.

Claims

Rekombinante DNA, die in Zellen coryneformer Bakterien autonom replizierbar ist, umfassend eine DNA-Sequenz, die eine Aspartokinase kodiert, in der die Rückkopplungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, eine DNA-Sequenz, die eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, und eine DNA-Sequenz, die eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert.
Rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, wobei diese Aspartokinase, in der die Rückkopplungsinhibierung durch L-Lysin und L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, eine Aspartokinase ist, die aus einem coryneformen Bakterium stammt, und wobei diese Aspartokinase eine mutierte Aspartokinase ist, in der ein Aminosäurerest, der dem 279. Alaninrest entspricht, wenn vom N-Terminus der Aminosäuresequenz, die in SEQ. ID. NO. 5 gezeigt ist, aus gezählt wird, in einen Aminosäurerest geändert ist, der nicht Alanin ist und anders als eine saure Aminosäure in deren α-Untereinheit ist, und ein Aminosäurerest, der dem 30. Alaninrest entspricht, wenn vom N-Terminus in der Aminosäuresequenz, die in SEQ. ID. NO. 7 gezeigt ist, aus gezählt wird, in einen Aminosäurerest geändert wird, der nicht Alanin ist und anders als eine saure Aminosäure in deren β-Unterheit ist.
Rekombinante DNA gemäß Anspruch 1, wobei diese DNA-Sequenz, welche die Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, eine Aminosäuresequenz kodiert, die in SEQ. ID. NO. 12 gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen die gleiche ist wie die Aminosäuresequenz, die in SEQ. ID. NO. 12 gezeigt ist.
Coryneformes Bakterium, welches eine Aspartokinase beherbergt, in der die Rückkopplungsinhibierung durch L-Lysin oder L-Threonin im Wesentlichen desensibilisiert ist, umfassend eine verstärkte DNA-Sequenz, welche eine Diaminopimelatdecarboxylase kodiert, und eine verstärkte DNA-Sequenz, die eine Phosphoenolpyruvatcarboxylase kodiert.
Coryneformes Bakterium gemäß Anspruch 4, das durch Einschleusung der in Anspruch 1 definierten rekombinanten DNA transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen von L-Lysin umfassend die Schritte des Kultivierens des in Anspruch 4 definierten coryneformen Bakteriums in einem geeigneten Medium, um zu ermöglichen, dass L-Lysin in einer Kultur des Bakteriums hergestellt und akkumuliert wird, und das Einsammeln des L-Lysins aus der Kultur.