SK285146B6 - Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu - Google Patents

Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu Download PDF

Info

Publication number
SK285146B6
SK285146B6 SK1635-97A SK163597A SK285146B6 SK 285146 B6 SK285146 B6 SK 285146B6 SK 163597 A SK163597 A SK 163597A SK 285146 B6 SK285146 B6 SK 285146B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ala
dna
leu
lysine
gly
Prior art date
Application number
SK1635-97A
Other languages
English (en)
Other versions
SK163597A3 (en
Inventor
Atsushi Hayakawa
Masakazu Sugimoto
Yasuhiko Yoshihara
Tsuyoshi Nakamatsu
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=18179283&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK285146(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ajinomoto Co., Inc. filed Critical Ajinomoto Co., Inc.
Publication of SK163597A3 publication Critical patent/SK163597A3/sk
Publication of SK285146B6 publication Critical patent/SK285146B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Je opísaná rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná v bunkách baktérií typu Corynebacterium, obsahujúca DNA sekvenciu kódujúcu aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom desenzibilizovaná, a DNA sekvenciu pre diaminopimelát dekarboxylázu a DNA sekvenciu kódujúcufosfoenolpyruvát karboxylázu. Tiež je opísaná baktéria typu Corynebacterium obsahujúca túto sekvenciu a spôsob prípravy L-lyzínu.

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu produkcie L-lyzínu kultiváciou mikroorganizmu, ktorý sa získal modifikáciou baktérie typu Corynebacterium, použitej na fermentačnú produkciu aminokyselín a podobne pomocou metódy, zakladajúcej sa na genetickom inžinierstve.
Doterajší stav techniky
L-lyzin, ktorý sa používa ako prísada do suchého krmiva, sa zvyčajne pripravuje fermentačnou metódou s použitím mutovaného kmeňa, produkujúceho L-lyzín patriaceho k baktériám typu Corynebacterium. Rôznymi L-lyzín produkujúcimi baktériami, ktoré sú v súčasnosti známe, sú tie, ktoré sa vytvorili umelou mutáciou, vychádzajúc zo štandardných kmeňov, patriacich k baktériám typu Corynebacterium.
Čo sa týka baktérií typu Corynebacterium, je opísaný vektorový plazmid, ktorý je autonómne replikovateľný v bakteriálnych bunkách a má markerový gén pre odolnosť proti liečivám (pozri US patent č. 4 514 502), a spôsob zavedenia génu do bakteriálnych buniek (napríklad zverejnená japonská patentová prihláška č. 2-207791). Tiež je opísaná možnosť množenia L-treonín alebo L-izoleucín produkujúcich baktérií s použitím opísaných metód (pozri US patenty č. 4 452 890 a 4 442 208). Čo sa týka množenia L-lyzín produkujúcich baktérií, je známa metóda, pri ktorej gén, ktorý sa zúčastňuje biosyntézy L-lyzínu, je včlenený do vektorového plazmidu, aby amplifíkoval gén v bakteriálnych bunkách (napríklad zverejnená japonská patentová prihláška č. 56-160997).
Známe gény pre biosyntézu L-lyzinu zahrnujú napríklad gén pre dihydrodipikolinátreduktázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 7-75578) a gén pre diaminopimelátdehydrogenázu (Ishino S. a spol., Nucleic Acids Res. J5, 3917, 1987), v ktorých je gén, zúčastňujúci sa biosyntézy L-lyzínu, klonovaný, ako aj gén pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 60-87788), gén pre dihydrodipikolinátsyntázu (japonský patentový spis č. 6-55149) a gén pre diaminopimelátdekarboxylázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 60-62994), v ktorých amplifikácia génu ovplyvňuje produkciu L-lyzínu.
Čo sa týka enzýmov, zúčastňujúcich sa biosyntézy L-lyzínu, je známy prípad enzýmu, ktorý podlieha inhibícii spätnou väzbou, keď sa použije ako štandardný typ. V tomto prípade sa produkcia L-lyzínu zlepší zavedením enzýmového génu, ktorý má takú mutáciu, že inhibícia spätnou väzbou sa desenzibilizuje. Známe gény tohto druhu špecificky zahrnujú napríklad gén pre aspartátkinázu (Medzinárodný zverejnený spis WO 94/25605).
Ako sme opísali, isté úspešné výsledky sa získali pomocou amplifikovania génov pre systém na biosyntézu L-lyzinu alebo zavedením mutovaných génov. Napríklad baktéria typu Corynebacterium, ktorá obsahuje mutovaný gén pre aspartátkinázu s desenzibilizovanou súčasnou inhibíciou lyzínom a treoninom, produkuje značné množstvo L-lyzínu (asi 25 g/1). Ale táto baktéria podlieha zníženiu rýchlosti rastu v porovnaní s baktériou, ktorá nemá žiadny mutovaný gén pre aspartátkinázu. Tiež sa uvádza, že produkcia L-lyzínu sa zlepší ďalším zavedením génu pre dihydrodipikolinátsyntázu popri mutovanom géne pre aspartátkinázu (Applied and Environmental Microbíology 57 (6), 1746 - 1752, 1991). Ale pri takejto baktérii dochádza k ďalšiemu zníženiu rýchlosti rastu.
Taktiež sa neuvádza žiadny prípad, v ktorom by sa zamýšľalo zlepšiť rast zosilnením génu pre biosyntézu L-lyzínu. Za súčasného stavu me je známy žiadny prípad pre baktérie typu Corynebacterium, v ktorom by niekto bol úspešný v značnom zlepšení výťažku L-lyzínu bez obmedzenia rastu kombináciou viacerých génov pre biosyntézu L-lyzínu.
Podstata vynálezu
Cieľom tohto vynálezu je zlepšiť výťažok L-lyzínu bez obmedzenia rastu baktérií typu Corynebacterium zosilnením viacerých génov pre biosyntézu L-lyzínu v kombinácii v baktériách typu Corynebacterium.
Keď sa cieľová látka produkuje fermentačne s použitím mikroorganizmu, rýchlosť produkcie, ako aj výťažok cieľovej látky vzhľadom na zavedený materiál sú mimoriadne dôležitým faktorom. Cieľová látka sa môže produkovať pozoruhodne lacno zvýšením rýchlosti produkcie na jednotku fermentačného zariadenia. V súlade s tým je priemyselne mimoriadne dôležité, aby výťažok fermentácie a rýchlosť produkcie navzájom zodpovedali jeden druhému. Tento vynález navrhuje riešenie opísaného problému, aby sa fermentačne produkoval L-lyzín s použitím baktérií typu Corynebacterium.
Princíp tohto vynálezu sa zakladá na skutočnosti, že rast baktérií typu Corynebacterium sa dá zlepšiť a ich rýchlosť produkcie L-lyzínu sa dá zlepšiť zosilnením kódu DNA sekvencie pre aspartátkinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom je v podstate desenzibilizovaná, a kódovania DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu v porovnaní s prípadom, v ktorom sú tieto DNA sekvencie zosilnené jednotlivo.
Z prvého aspektu tohto vynálezu sa poskytuje rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná v bunkách baktérií typu Corynebacterium, obsahujúca kód DNA sekvencie pre aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, a kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu. Poskytuje sa tiež rekombinantná DNA, ktorá ďalej obsahuje kód DNA sekvencie pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
Z druhého aspektu tohto vynálezu sa poskytuje baktéria typu Corynebacterium, obsahujúca aspartátkinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom je v podstate desenzibilizovaná, a obsahuje zosilnený kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu. Tiež sa poskytuje baktéria typu Corynebacterium, ktorá ďalej obsahuje zosilnený kód DNA sekvencie pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
Z tretieho aspektu tohto vynálezu sa poskytuje spôsob produkcie L-Iyzinu, zahrnujúci kroky kultivácie ktorejkoľvek z baktérií typu Corynebacterium, ako je opísané skôr, vo vhodnom médiu, aby sa L-lyzín mohol kultivovať a hromadiť v kultúre uvedenej baktérie, a odohrania L-lyzínu z tejto kultúry.
V ďalšom sa na aspartátkinázu odkazuje ako na „AK“, na génový kód pre AK sa odkazuje ako na „lysC“, na AK, v ktorej je desenzibilizovaná inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom, sa odkazuje ako na „mutovanú AK“, a na génový kód pre mutovanú AK sa odkazuje ako na „mutovaný lysC“, ak je to potrebné. Tiež na diaminopimelátdekarboxylázu sa odkazuje ako na „DDC“, na génový kód pre DDC sa odkazuje ako na „lysA“, na fosfoenolpyruvátkarboxylázu sa odkazuje ako na „PEPC“, a na génový kód pre PEPC sa odkazuje ako na „ppc“, ak je to potrebné.
Baktérie typu Corynebacterium, na ktoré odkazujeme v tomto vynáleze, sú skupinou mikroorganizmov, ako sú definované v Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. vydanie, str. 599, 1974, ktoré sú aeróbne, grampozitívne, acidolabilné tyčinky, ktoré nemajú žiadnu schopnosť tvoriť spóry. Baktérie typu Corynebacterium zahrnujú baktérie, patriace k rodu Corynebacterium, baktérie, patriace k rodu Brevibacterium, ktorý sa doteraz zaraďoval do rodu Brevibacterium, ale zjednotili sa ako baktérie, patriace v súčasnosti k rodu Corynebacterium, a baktérie, patriace k rodu Brevibacterium, úzko príbuzné s baktériami, patriacimi k rodu Corynebacterium.
Podľa tohto vynálezu sa vyprodukované množstvo a rýchlosť produkcie L-lyzínu z baktérií typu Corynebaclerium dá zlepšiť.
1. Príprava génov pre biosyntézu L-lyzínu, použitých pre tento vynález
Gény pre biosyntézu L-lyzínu, použité v tomto vynáleze, sa získajú prípravou chromozomálnej DNA z baktérie ako DNA donora, konštrukciou knižnice chromozomálnych DNA s použitím plazmidového vektora alebo podobne, výberom kmeňa, ktorý má požadovaný gén, a spätným získaním z vybraného kmeňa rekombinantnej DNA, do ktorej bol gén vložený. DNA donor pre gén pre biosyntézu L-lyzínu, použitý v tomto vynáleze, nie je špecificky obmedzený za predpokladu, že požadovaný gén pre biosyntézu L-lyzínu má expresiu enzýmového proteínu, ktorý pôsobí v bunkách baktérií typu Corynebacterium. Avšak DNA donorom je výhodne baktéria typu Corynebacterium.
Všetky gény lysC, dapA a ppc, pochádzajúce z baktérii typu Corynebacterium, majú známe sekvencie. V súlade s tým sa dajú získať uskutočnením amplifikácie metódou reakcie polymerázového reťazca (PCR; pozri White T. J. a spol., Trends Genet. 5, 185, 1989).
Každý z génov pre biosyntézu L-lyzínu, použitých v tomto vynáleze, sa dá získať určitými metódami, ako bude ukázané na príkladoch ďalej.
(1) Príprava mutovaného lysC
DNA fragment, obsahujúci mutovaný lysC, sa dá pripraviť z mutovaného kmeňa, v ktorom je synergická inhibícia AK aktivity spätnou väzbou L-lyzínom a L-tTeonínom v podstate desenzibilizovaná (Medzinárodný zverejnený spis WO 94/25605).
Takýto mutovaný kmeň sa dá získať napríklad zo skupiny buniek, pochádzajúcich zo štandardného kmeňa baktérií typu Corynebacterium, podrobeného mutačnému pôsobeniu použitím normálneho mutačného pôsobenia, ako je ultrafialové ožiarenie a pôsobenie mutujúcim činidlom, ako je N-metyl-N'-nitro-N-nitrozoguanidín (NTG). AK aktivita sa dá merať s použitím metódy, ktorú opísali Miyajima R. a spol. v The Joumal of Biochemistry 63 (2), 139 - 148, 1968. Najvýhodnejší takýto mutovaný kmeň je reprezentovaný L-lyzín produkujúcou baktériou AJ3445 (FERM P-1944), odvodenou mutačným pôsobením od štandardného kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (ktorá má súčasný zmenený názov Corynebacterium glutamicum).
Alternatívne sa mutovaný lysC dá získať tiež in vitro mutačným pôsobením na plazmid DNA, obsahujúci štandardný lysC. Z ďalšieho aspektu je známa informácia, týkajúca sa špecificky mutácie na desenzibilizáciu synergickej inhibicie AK spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom (Medzinárodný zverejnený spis WO 94/25605). V súlade s tým sa mutovaný lysC dá tiež pripraviť zo štandardného lysC na základe tejto informácie napríklad metódou na miesto zameranej mutagenézy.
Fragment, obsahujúci lysC, sa dá izolovať z baktérií typu Corynebacterium prípravou chromozomálnej DNA napríklad metódou podľa autorov Saito a Miura (H. Saito a K. Miura, Biochem. Biophys. Acta 72. 619, 1963), a amplifikáciou lysC metódou reakcie polymerázového reťazca (PCR; pozri White T. J. a spol., Trends Genet. 5, 185, 1989).
Príklady DNA primérov predstavujú jednovláknové DNA 23-méru a 21-méru, ktoré majú nukleotidové sekvencie, uvedené v SEQ ID č. 1 a 2 v zozname sekvencii, aby sa amplifikovala napríklad oblasť asi 1643 bp kódu pre lysC na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Biology 5 (5), 1197 - 1204, 1991; Mol. Gen. Genet. 224. 317 - 324, 1990). DNA sa dá syntetizovať bežnou metódou s použitím zariadenia DNA synthesizer model 38OB, vyrábaného firmou Applied Biosystems, a s použitím fosfoamiditovej metódy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981). PCR sa dá uskutočniť s použitím pristroja DNA Thermal Cycler Model PJ2000, vyrábaného firmou Takara Shuzo, a s použitím Taq DNA polymerázy metódou, navrhnutou dodávateľom.
Je výhodné, keď sa lysC, amplifikovaný PCR, naviaže na vektor DNA, autonómne replikovateľný v bunkách E. coli a/alebo baktérii typu Corynebacterium, aby sa pripravila rekombinantná DNA, a táto rekombinantná DNA sa vopred zavedie do buniek E. coli. Takýto postup uľahčuje nasledujúce operácie. Vektorom, autonómne replikovateľným v bunkách E. coli, je výhodne plazmidový vektor, ktorý je výhodne autonómne replikovateľný v bunkách hostiteľa, vrátane napríklad pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398 aRSFIOlO.
Keď sa fragment DNA, ktorý má schopnosť nechať plazmid, aby bol autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium, vloží do týchto vektorov, môžu sa použiť ako takzvaný kyvadlový vektor, autonómne replikovateľný aj v E. coli, aj v baktériách typu Corynebacterium.
Takýto kyvadlový vektor zahrnuje nasledujúce. Uvedené sú mikroorganizmy, ktoré majú každý z vektorov, a prístupové čísla v medzinárodných depozitných miestach (v zátvorkách).
pHC4: Escherichia coli AJ 12617 (FERM BP-3532) pAJ655: Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJl844: Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 39136) pAJ611: Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148: Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440: Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140)
Tieto vektory sa dajú získať z deponovaných mikroorganizmov nasledujúcim spôsobom. Bunky, odobraté vo fáze logaritmického rastu, sa lýzovali s použitím lyzozýmu a SDS, po čom nasledovalo oddelenie z lyzátu centrifúgovaním pri 30000 x g, aby sa získal supematant. K tomuto supematantu sa pridá polyetylénglykol, po čom nasleduje frakcionácia a čistenie pomocou centrifugácie s rovnovážnym gradientom hustoty chloridu cézneho-etídiumbromidu.
E. coli sa dá transformovať zavedením plazmidu napríklad metódou D. M. Morrisona (Methods in Enzymology 68, 326, 1979) alebo metódou, pri ktorej sa na prijímajúce bunky pôsobí chloridom vápenatým, aby sa zvýšila priepustnosť pre DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970).
Štandardný lysC sa získa, keď sa lysC izoluje zo štandardného AK kmeňa, zatiaľ čo mutovaný lysC sa získa, keď sa lysC izoluje z AK mutovaného kmeňa opísanou metódou.
Príklad nukleotidovej sekvencie DNA fragmentu, obsahujúceho štandardný lysC, je uvedený v SEQ ID č. 3 v zozname sekvencií. Aminokyselinová sekvencia a-podjednotky štandardného AK proteínu je vyvodená z nukleotidovej sekvencie a je uvedená v SEQ ID č. 4 v zozname sekvencií spolu s DNA sekvenciou. V SEQ ID č. 5 je uvedená len aminokyselinová sekvencia. Aminokyselinová sekvencia (Lpodjednotky štandardného AK proteínu je vyvodená z nukleotidovej sekvencie DNA a je uvedená v SEQ ID č. 6 v zozname sekvencií spolu s DNA sekvenciou.
V SEQ ID č. 7 je uvedená len aminokyselinová sekvencia.
V každej z týchto podjednotiek sa GTG použil ako iniciačný kodón a príslušná aminokyselina je reprezentovaná metionínom. Ale táto reprezentácia sa týka metionínu, valínu alebo formylmetionínu.
Mutovaný lysC, použitý v tomto vynáleze, nie je špecificky obmedzený za predpokladu, že kóduje AK, v ktorej je synergická inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treoninom desenzibilizovaná. Ako príklad mutovaného lysC však uvádzame taký, ktorý má mutáciu, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 279-ému alanínovému zvyšku, keď sa počíta od N-konca, zamení za aminokyselinový zvyšok iný než alanín a iný, než je kyslá aminokyselina v α-podjednotke, a aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 30-ému alanínovému zvyšku od N-konca, sa zamení za aminokyselinový zvyšok iný než alanín a iný, než je kyslá aminokyselina v (3-podjednotke v sekvencií aminokyselín AK štandardného typu. Aminokyselinová sekvencia AK štandardného typu špecificky zahrnuje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID č. 5 v zozname sekvencií ako α-podjednotku a aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID č. 7 v zozname sekvencií ako β-podjednotku.
Aminokyselinové zvyšky, výhodné ako zvyšky iné než alanín a iné než kyslá aminokyselina, zahrnujú treonínové, arginínové, cysteínové, fenylalanínové, prolínové, serínové, tyrozínové a valínové zvyšky.
Kodón, zodpovedajúci aminokyselinovému zvyšku, ktorý sa má nahradiť, nie je špecificky obmedzený, čo sa týka jeho typu, za predpokladu, že kóduje aminokyselinový zvyšok.
Predpovedá sa, že aminokyselinová sekvencia AK štandardného typu sa môže mierne odlišovať v závislosti od rozdielov v bakteriálnych druhoch a bakteriálnych kmeňoch. Tie AK, ktoré majú mutáciu na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v jednej alebo viacerých polohách, nevýznamných pre enzýmovú aktivitu, ako je opísané skôr, sa môžu tiež použiť pre tento vynález. DNA kód pre AK so spontánnou mutáciou sa dá získať izoláciou DNA, ktorá je krížiteľná napríklad s DNA s časťou nukleotidovej sekvencie, uvedenej v SEQ ID č. 3 za prísnych podmienok. Pod „prísnymi podmienkami“, na ktoré odkazujeme, máme na mysli podmienky, pri ktorých sa vytvára špecifický hybrid a nevytvára sa nešpecifický hybrid. Je ťažké jasne vyjadriť tieto podmienky číselnými hodnotami. Ale príkladom takýchto podmienok sú podmienky, pri ktorých nukleové kyseliny s vysokou homológiou, napríklad DNA s homológiou nie menšou než 90 %, sa krížia navzájom a nukleové kyseliny s homológiou nižšou, než je uvedená, sa navzájom nekrížia, alebo podmienka teploty od teploty vytopenia (Tm) úplne zostaveného hybridu po (Tm - 30) °C, výhodne od Tm po (Tm - 20 ) °C a koncentrácia soli zodpovedajúca 1 x SSC, výhodne 0,1 x SSC.
Iné AK, ktoré majú umelú mutáciu na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia iného jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov, sa tiež môžu použiť za predpokladu, že nevyvíjajú žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu synergickej inhibicie spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom. DNA kód pre AK s umelou mutáciou sa dá získať modifikáciou nukleotidovej sekvencie, aby došlo k nahradeniu, odstráneniu alebo vloženiu na špecifickom mieste napríklad miestne špecifickou mutagenézou. Tiež lysC s mutáciou sa dá získať pôsobením známym mutagénom. Pôsobenie mutagénom zahrnuje in vitro pôsobenie na DNA, obsahujúcu lysC, hydroxylamínom alebo podobne a pôsobenie na mikroorganizmus, ktorý má DNA, obsahujúcu lysC, mutagénom, ako je ultrafialové žiarenie alebo mutagénne činidlo, ktoré sa používa na bežnú umelú mutagenézu, ako je N-metyl-N'-nitro-N-nitrozoguanidín (NTG) alebo kyselina dusičná. Po pôsobení mutagénom sa miesto, na ktoré sa zaviedla mutácia, alebo na ktorom došlo k mutácii, dá stanoviť výberom DNA alebo mikroorganizmu, ktorá kóduje alebo ktorý produkuje AK, ktorá má AK aktivitu, a ktorej aminokyselinová sekvencia je mutovaná z DNA, podrobenej pôsobeniu mutagénom alebo z mikroorganizmu, podrobeného pôsobeniu mutagénom. Miesto zavedenej mutácie nie je špecificky obmedzené za predpokladu, že sa v podstate nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu inhibicie spätnou väzbou. Počet zavedených mutácii sa mení v závislosti od miesta a druhu mutovanej aminokyseliny v priestorovej štruktúre proteínu a nie je špecificky obmedzený za predpokladu, že sa v podstate nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu inhibicie spätnou väzbou. Tento počet jc obyčajne 1 až 20, výhodne 1 až 10.
Kmeň AJ12691, získaný zavedením mutovaného lysC plazmidu p399AK9B do kmeňa AJ12036 (FERM BP-734), ako štandardného kmeňa Brevibacterium lactofermentum bol deponovaný 10. apríla 1992 pod prístupovým číslom FERM P-12918 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intematíonal Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko), prenesený do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody z 10. februára 1995 a deponovaný pod prístupovým číslom FERM BP-4999.
(2) Príprava lysA
DNA fragment, obsahujúci lysA, sa dá pripraviť z chromozómu baktérie typu Corynebacterium pomocou PCR. DNA donor nie je špecificky obmedzený, avšak jeho príklad predstavuje kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
V baktériách typu Corynebacterium lysA tvorí operón spolu s argS (gén pre arginyl-tRNA syntázu) a lysA existuje za argS. Expresia lysA sa reguluje promótorom, existujúcim pred argS (pozri Joumal of Bacteriology, Nov., 7356 - 7362,1993). DNA sekvencie týchto génov sú známe pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 4 (11), 1819 - 1830, 1990; Molecular and Generál Genetics 212, 112 - 119, 1988), na základe čoho sa dajú pripraviť DNA priméry pre PCR. Špecifickými príkladmi takýchto DNA primárov sú DNA z 23-mérov, ktoré majú nukleotidová sekvencie uvedené v SEQ ID č. 8 v zozname sekvencií (zodpovedajúce číslam nukleotidov 11 až 33 v sekvencií nukleotidov, opísanej v Molecular Microbiology 4 (11), 1819 - 1830, 1990) a SEQ ID č. 9 (zodpovedajúce číslam nukleotidov 1370 až 1392 v sekvencií nukleotidov, opísanej v Molecular and Generál Genetics 212, 112 - 119, 1988). Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získanú lysA, sa dá uskutočniť tým istým spôsobom, ako bolo opísané pre lysC.
V príklade, ktorý bude opísaný neskôr, sa použil DNA fragment, obsahujúci promótor, argS a lysA, aby sa zosilnil lysA. Ale argS nie je pre tento vynález podstatný. Je možné použiť DNA fragment, v ktorom je lysA naviazaný tesne za promótorom.
Príklady sekvencie nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho argS a lysA, a vyvodenej sekvencie aminokyselín, ktorá sa má zakódovať touto sekvenciou nukleotidov, sú uvedené v SEQ ID č. 10. Príklad sekvencie aminokyselín, zakódovanej argS, je uvedený v SEQ ID č. 11 a príklad sekvencie aminokyselín, zakódovanej lysA, je uvedený v SEQ ID č. 12. Okrem DNA fragmentov, kódujúcich tieto sekvencie aminokyselín môže tento vynález ekvivalentne použiť DNA fragmenty, kódujúce sekvencie aminokyselín v podstate tie isté, ako sú sekvencie aminokyselín, uvedené v SEQ ID č. 12, a síce sekvencie aminokyselín s mutáciou na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že nemajú žiadny podstatný vplyv na DDC aktivitu. lysA so spontánnou alebo umelou mutáciou sa dá získať tým istým spôsobom ako pre DNA kód pre AK s mutáciou, ktorá nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu synergickej inhibície spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom.
(3) Príprava ppc
DNA fragment, obsahujúci ppc, sa dá pripraviť z chromozómu baktérie typu Corynebacterium pomocou PCR. DNA donor nie je špecificky obmedzený a jeho príkladom je kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869.
DNA sekvencie ppc génu sú známe pre Corynebacterium glutamicum (pozri O'Regan M. a spol., Gene 77, 237 - 251,1989), na základe čoho možno pripraviť DNA priméry pre PCR.
Špecifické príklady takýchto DNA primérov predstavujú DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 13 a 14 v zozname sekvencií. Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získaný ppc, sa dá uskutočniť tým istým spôsobom, ako bolo opísané pre lysC.
Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho ppc, a vyvodená sekvencia aminokyselín, ktorá sa má zakódovať touto sekvenciou nukleotidov, sú uvedené v SEQ ID č. 15. V SEQ ID č. 16 je uvedená len sekvencia aminokyselín.
Okrem DNA fragmentov, kódujúcich tieto sekvencie aminokyselín, tento vynález môže ekvivalentne použiť DNA fragmenty, kódujúce sekvencie aminokyselín v podstate tie isté, ako je sekvencia aminokyselín, uvedená v SEQ ID č. 16, a síce sekvencie aminokyselín s mutáciou na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že nemajú žiadny podstatný vplyv na PEPC aktivitu, ppc so spontánnou alebo umelou mutáciou sa dá získať tým istým spôsobom ako pre DNA kód pre AK s mutáciou, ktorá nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu synergickej inhibície spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom.
ppc Z baktérií typu Corynebacterium tvorí operón spolu s gap (gén pre glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu), pgk (gén pre fosfoglycerátkinázu) a tpi (gén pre triózofosfátizomerázu) a ppc existuje za tpi. Expresia ppc sa reguluje promótorom, existujúcim pred pgk (pozri Schwinde J. W. a spol., J. Bacteriol. 175 (12), 3905 - 3908, 1993). Preto, tak ako uvedený lysA, sa ppc dá amplifikovať spolu s pgk a tpi pomocou PCR, aby sa použil DNA fragment, obsahujúci pgk, tpi a ppc. Ako ukážeme v príklade, ktorý bude opísaný neskôr, je možné použiť DNA fragment, v ktorom je vhodný promótor naviazaný tesne pred kódujúcou oblasťou
PEPC. Promótor zahrnuje promótor lysC, tac promótor, pochádzajúci z E. coli, a tre promótor.
2. Rekombinantná DNA a baktéria typu Corynebacterium podľa tohto vynálezu
Rekombinantná DNA obsahuje kódujúcu DNA sekvenciu pre aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, a kódujúcu DNA sekvenciu pre diaminopimelátdekarboxylázu a je autonómne replikovateľná v bunkách baktérií typu Corynebacteria. Vo výhodnom uskutočnení rekombinantná DNA ďalej popri uvedených DNA sekvenciách obsahuje kódujúcu DNA sekvenciu pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
Baktéria typu Corynebacterium podľa tohto vynálezu má aspartátkinázu (mutovanú AK), v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, pričom DNA kód (lysA) pre diaminopimelátdekarboxylázu je zosilnený. Vo výhodnom uskutočnení je baktériou typu Corynebacterium podľa tohto vynálezu baktéria typu Corynebacterium, v ktorej je DNA kód (ppc) pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu ďalej zosilnený.
Výraz „zosilniť“ sa tu týka skutočnosti, že vnútrobunková aktivita enzýmu, zakódovaného touto DNA, sa zvýši napríklad zvýšením počtu kópií génu použitím silného promótora, použitím génového kódovania pre enzým s vysokou špecifickou aktivitou alebo kombináciou týchto prostriedkov.
Baktériami typu Corynebacterium, ktoré majú mutovanú AK, môžu byť tie, ktoré produkujú mutovanú aspartátkinázu ako výsledok mutácie, alebo tie, ktoré sú transformované zavedením mutovanej lysC.
Príklady baktérií typu Corynebacterium, použitých na zavedenie uvedenej DNA, zahrnujú napríklad nasledujúce, lyzín produkujúce kmene štandardného typu: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870; Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806; Corynebacterium callunae ATCC 15991; Corynebacterium glutamicum ATCC 13032; (Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869; (Corynebacterium lilium) ATCC 15990; (Brevibacterium flavum) ATCC 14067; Corynebacterium melassecola ATCC 17965; Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066; Brevibacterium immariophilum ATCC 14068; Brevibacterium roseum ATCC 13825; Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240; Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354;
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539).
Iné než opísané bakteriálne kmene, tie kmene, ktoré sa dajú použiť ako hostiteľ, zahrnujú napríklad mutované kmene so schopnosťou produkovať L-lyzín, odvodené od uvedených kmeňov. Takéto umelo mutované kmene zahrnujú nasledujúce: proti S-(2-aminoetyl)-cysteinu (v ďalšom skrátené na „AEC“) odolné mutované kmene (napríklad Brevibacterium lactofermentum AJ 11082 (NRRL B-l 147), japonské patentové spisy č. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438); mutované kmene, ktoré vyžadujú aminokyselinu, ako je L-homoserín, na svoj rast (japonské patentové spisy č. 48-28078 a 56-6499); mutované kmene, ktoré majú odolnosť proti AEC a vyžadujú aminokyseliny, ako L-leucín, L-homoserín, L-prolín, L-serín, L-arginin, L-alanín a L-valín (US patenty č. 3 708 395 a 3 825 472); mutované kmene, pro dukujúce L-lyzín, ktoré majú odolnosť proti DL-a-amino-e-kaprolaktámu, α-amino-lauryllaktámu, aspartátovým analógom, sulfa liečivám, chinoidu a N-lauroylleucínu; mutované kmene, produkujúce L-lyzín, ktoré majú odolnosť proti inhibítorom oxyaloacetátdekarboxylázy alebo enzýmom respiračného systému (japonské zverejnené patentové prihlášky č. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 5386089, 55-9783, 55-9759, 56-32995 a 56-39778 a japonské patentové spisy č. 53-43591 a 53-1833); mutované kmene, produkujúce L-lyzín, ktoré vyžadujú inozitol alebo kyselinu octovú (japonské zverejnené patentové prihlášky č. 559784 a 56-8692); mutované kmene, produkujúce L-lyzín, ktoré majú citlivosť proti kyseline fluórpyrohroznovej alebo teplote nie menšej než 34 °C (japonské zverejnené patentové prihlášky č. 55-9783 a 53-86090); a L-lyzín produkujúce mutované kmene, patriace k rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, ktoré vykazujú odolnosť proti etylénglykolu a produkujú L-lyzín (US patent č. 4 411 997).
V uvedenom uskutočnení sa na zosilnenie génov pre biosyntézu L-lyzinu v hostiteľovi, ako je opísané, tieto gény zavedú do hostiteľa s použitím plazmidového vektora, transpozónu alebo fágového vektora alebo podobne. Po zavedení sa očakáva, že dôjde k určitému rozsahu zosilnenia dokonca i s použitím vektora typu slabej kópie. Ale výhodné je použiť vektor typu viacnásobnej kópie. Takýto vektor zahrnuje napríklad plazmidové vektory pAJ655, pAJ844, pAJ611, pAJ3148 a pAJ440, opísané skôr. Okrem toho sú transpozóny, odvodené od baktérií typu Corynebacterium, opísané v medzinárodných zverejnených spisoch W002/02627 a WO93/18151, v európskom patentovom spise č. 445385, japonskej zverejnenej patentovej prihláške č. 6-46867, Vertes A. A. a spol., Mol. Microbiol. 11, 739 -
- 746, 1994, Bonamy C. a spol., Mol. Microbiol. 14, 571 -
- 581, 1994, Vertes A. A. a spol., Mol. Gen. Genet. 245. 397 - 405, 1994, Jagar W. a spol., FEMS Microbiology Letters 126, 1 - 6, 1995, v japonskej zverejnenej patentovej prihláške č. 7-107976, v japonskej zverejnenej patentovej prihláške č. 7-327680 a podobne.
V tomto vynáleze nie je nevyhnutné, aby bol mutovaný lysC bezpodmienečne zosilnený. Je možné použiť tie, ktoré majú mutáciu na lysC na chromozomálnej DNA, alebo v ktorých je mutovaný lysC včlenený do chromozomálnej DNA. Alternatívne sa mutovaný lysC môže zaviesť s použitím plazmidového vektora. Na druhej strane sú lysA a ppc výhodne zosilnené, aby sa L-lyzín produkoval efektívne.
Každý z génov lysC, lysA a ppc sa môže postupne zaviesť do hostiteľa s použitím rôznych vektorov. Alternatívne sa dva alebo tri druhy týchto génov môžu zaviesť spoločne s použitím jediného vektora. Ak sa použijú rôzne vektory, gény sa môžu zaviesť v ľubovoľnom poradí, ale je výhodné použiť vektory, ktoré majú stabilný mechanizmus zdieľania a uchovávania v hostiteľovi a ktoré sú schopné vzájomnej koexistencie.
Baktéria typu Corynebacterium, ktorá má mutovanú AK a ďalej obsahuje zosilnený lysA, sa získa napríklad zavedením do hostiteľskej baktérie typu Corynebacterium rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutovaný lysC, lysA a ppc, autonómne replikovateľnej v bunkách baktérii typu Corynebacterium.
Baktéria typu Corynebacterium, ktorá ďalej obsahuje zosilnený ppc okrem mutovaného lysC a lysA, sa získa napríklad zavedením do hostiteľskej baktérie typu Corynebacterium rekombinantnej DNA, obsahujúcej mutovaný lysC, lysA a ppc, autonómne replikovateľnej v bunkách baktérií typu Corynebacterium. Aj baktéria typu Corynebacterium obsahujúca zosilnený mutovaný lysC, lysA a ppc sa získa zavedením do hostiteľskej baktérie typu Coryne bacterium, obsahujúcej mutovaný lysC a lysA, rekombinantnej DNA, obsahujúcej ppc, autonómne replikovateľnej v bunkách baktérií typu Corynebacterium.
Uvedené rekombinantná DNA sa dajú získať napríklad vložením každého z génov, zúčastňujúcich sa biosyntézy L-lyzínu, do vektora, ako je plazmidový vektor, transpozón alebo fágový vektor, ako je opísané skôr.
V prípade, v ktorom sa použije ako vektor plazmid, sa rekombinantná DNA dá zaviesť do hostiteľa metódou elektrických impulzov (Sugimoto a spol., japonská zverejnená patentová prihláška č. 2-207791). Amplifikácia génu s použitím transpozónu sa dá uskutočniť zavedením plazmidu, nesúceho transpozón, do bunky hostiteľa a vyvolaním transpozície transpozónu.
3. Metóda produkcie L-lyzínu
L-lyzín sa dá efektívne produkovať kultiváciou vo vhodnom médiu baktérie typu Corynebacterium, obsahujúcej zosilnené gény pre biosyntézu L-lyzínu, ako sme opísali skôr, aby sa L-lyzín produkoval a zhromažďoval v kultúre baktérie, a odohraním L-lyzínu z tejto kultúry.
Príkladom média, ktoré sa má použiť, je bežné médium, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické ióny a voliteľne ďalšie organické zložky.
Ako zdroj uhlíka je možné použiť cukry, ako sú glukóza, fruktóza, sacharóza, melasa a škrobový hydrolyzát; a organické kyseliny, ako sú kyselina fumarová, kyselina citrónová a kyselina jantárová.
Ako zdroj dusíka je možné použiť anorganické amónne soli, ako sú síran amónny, chlorid amónny a fosforečnan amónny; organický dusík ako sójový hydrolyzát; plynný amoniak a vodný roztok amoniaku.
Pre zdroje organických stopových živín je žiaduce, aby obsahovali požadované látky, ako je vitamín B 1 a L-homoserín alebo kvasinkový extrakt alebo podobne v primeraných množstvách. Okrem uvedeného sa v malých množstvách pridá fosforečnan draselný, síran horečnatý, ióny železa, ióny horčíka a tak ďalej, ak je to potrebné.
Kultivácia sa výhodne uskutočňuje za aeróbnych podmienok počas asi 30 až 90 hodín. Kultivačná teplota sa výhodne udržuje pri 25 °C až 37 °C a pH sa v priebehu kultivácie výhodne udržuje pri 5 až 8. Na nastavenie pH sa môžu použiť anorganické alebo organické, kyslc alebo zásadité látky alebo plynný amoniak, alebo podobne. L-lyzín sa dá z kultúry odobrať kombináciou bežnej metódy s iónovýmennou živicou, precipitačnej metódy a iných známych metód.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidov p399AK9B a p399AKYB, obsahujúcich mutovaný lysC.
Obr. 2 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu p299LYSA, obsahujúceho lysA.
Obr. 3 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pLYSAB, obsahujúceho lysA a Brevi.-ori.
Obr. 4 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pAKPFds, obsahujúceho PPEC štrukturálny gén.
Obr. 5 znázorňuje spôsob konštrukcie nových klonovacích vektorov pre baktérie typu Corynebacterium, pVK6 a pVK7.
Obr. 6 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pPwm, obsahujúceho štandardný ppc s vysokou expresiou.
Obr. 7 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCL, obsahujúceho mutovaný lysC, lysA a Brevi.-ori.
Obr. 8 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pDPSB, obsahujúceho dapA a Brevi.-ori.
Obr. 9 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pDPRB, obsahujúceho dapB a Brevi.-ori.
Obr. 10 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pPK4D, obsahujúceho ddh a Brevi.-ori.
Obr. 11 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCRCAB, obsahujúceho lysC, dapA a Brevi.-ori.
Obr. 12 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCB, obsahujúceho mutovaný lysC, dapB a Brevi.-ori.
Obr. 13 znázorňuje spôsob konštrukcie plazmidu pCD, obsahujúceho mutovaný lysC a ddh.
Vynález konkrétnejšie vysvetlíme ďalej s odkazom na príklady.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Príprava lysC génu štandardného typu a mutovaného lysC génu z Brevibacterium lactofermentum
1. Príprava štandardného a mutovaného lysC a príprava plazmidov, ktoré ich obsahujú
Kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 a L-lyzín produkujúci mutovaný kmeň AJ3445 (FERM P-1944), získaný z kmeňa ATCC 13869 mutačným pôsobením, sa použili ako donory chromozomálnej DNA. Kmeň AJ3445 sa podrobil mutácii tak, že lysC sa zmenil tak, aby zahrnoval podstatnú desenzibilizáciu súčasnej inhibície lyzínom a treonínom (Joumal of Biochemistry 68, 701 - 710, 1970).
DNA fragment, obsahujúci lysC, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA PCR metódou (polymerázová reťazcová reakcia; pozri White T, J. a spol., Trcnds Genet. 5, 185, 1989). Čo sa týka DNA primérov, použitých na amplifikáciu, syntetizovali sa jednovláknové DNA z 23-méru a 21-méru s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 1 a 2, aby sa amplifikovala oblasť okolo 1643 bp kódu pre lysC na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 - 1204, 1991; a Mol. Gen. Genet. 224, 317 - 324, 1990). DNA sa syntetizovala bežnou metódou s použitím prístroja DNA synthesizer model 380B, ktorý vyrába firma Applied Biosystems, a s použitím fosfoamiditovej metódy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981).
Gén sa amplifikoval pomocou PCR s použitím zariadenia DNA Thermal Cycler Model PJ2000, vyrobeného firmou Takara Shuzo, a s použitím Taq DNA polymerázy metódou, navrhnutou dodávateľom. Fragment s 1643 kb amplifikovaného génu sa overil elektroforézou na agarózovom géli. Potom sa fragment, excidovaný z gélu, čistil bežnou metódou a nechal sa natráviť reštrikčnými enzýmami Nrul (vyrobené firmou Takara Shuzo) a EcoRI (vyrobené firmou Takara Shuzo).
pHSG399 (pozri Takeshita S. a spol., Gene 61, 63 - 74, 1987) sa použil ako klonovací vektor pre tento génový fragment. pHSG399 sa natrávil reštrikčnými enzýmami Smal (vyrobené firmou Takara Shuzo) a EcoRI a naviazal sa na amplifikovaný lysC fragment. DNA sa naviazala s použitím DNA ligation kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Pripravili sa takto plazmidy, v ktorých lysC fragmenty, amplifikované z chromozómov Brevibacterium lactofermentum, boli naviazané na pHS399. Plazmid, obsahujúci lysC z ATCC 13869 (kmeň štandardného typu) sa označil ako p399AKY a plazmid, obsahujú ci lysC z AJ3463 (baktéria, produkujúca L-lyzín) sa označil ako p399AK9.
DNA fragment (v ďalšom označený ako „Brevi.-ori“) so schopnosťou urobiť plazmid autonómne replikovateľným v baktérii, patriacej k rodu Corynebacterium, sa zaviedol do p399AKY a p399AK9, aby sa pripravili plazmidy, nesúce lysC, autonómne replikovateľné v baktériách, patriacich k rodu Corynebacterium. Brevi.-ori sa pripravil z plazmidového vektora pHK4, ktorý obsahuje Brevi.-ori a je autonómne replikovateľný v bunkách aj Escherichia coli, aj baktérií, patriacich k rodu Corynebacterium. pHK4 sa skonštruoval natrávením pHC4 pomocou Kpnl (vyrobené firmou Takara Shuzo) a BamHI (vyrobené firmou Takara Shuzo), extrahovaním Brevi.-ori fragmentu a jeho naviazaním na pHSG298, ktorý bol tiež natrávený Kpnl a BamHI (pozri japonskú zverejnenú patentovú prihlášku č. 5-7491). pHK4 dodáva hostiteľovi odolnosť proti kanamycínu. Escherichia coli, obsahujúca pHK4, sa označila ako Escherichia coli AJ13136 a deponovala sa L augusta 1995 pod prístupovým číslom FERM BP-5186 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305 Japonsko).
pHK4 sa natrávil reštrikčnými enzýmami Kpnl a BamHI a odštiepené okraje sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa naviazal fosforylovaný BamHI linker (vyrobené firmou Takara Shuzo), aby sa vykonala taká modifikácia, aby DNA fragment, zodpovedajúci Brevi.-ori časti, mohol byť excidovaný z pHK4 natrávením len pomocou BamHI. Tento plazmid bol natrávený BamHI a vytvorený Brevi.-ori DNA fragment sa naviazal na p399AKY a p399AK9, ktoré sa tiež natrávili BamHI, aby sa pripravili plazmidy, z ktorých každý obsahoval lysC gén, autonómne replikovateľný v baktériách, patriacich k rodu Corynebacterium.
Plazmid, obsahujúci lysC gén štandardného typu, pochádzajúci z p399AKY, sa označil ako p399AKYB, a plazmid, obsahujúci mutovaný lysC gén, pochádzajúci z p399AK9, sa označil ako p399AK9B. Proces konštrukcie p399AK9B a p399AKYB je znázornený na obr. 1. Kmeň AJ 12691, získaný zavedením mutovaného lysC plazmidu p399AK9B do kmeňa štandardného typu Brevibacterium lactofermentum (kmeň AJ12036, FERM BP-734), bol deponovaný 10. apríla 1992 pod prístupovým číslom FERM P-12918 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko), prenesený do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody z 10. februára 1995 a deponovaný pod prístupovým číslom FERM BP-4999.
2. Stanovenie nukleotidových sekvencií štandardného lysC a mutovaného lysC z Brevibacterium lactofermentum
Plazmid p399AKY, obsahujúci lysC štandardného typu a plazmid p399AK9, obsahujúci mutovaný lysC, sa pripravili z príslušných transformantov, aby sa stanovili nukleotidové sekvencie štandardného a mutovaného lysC. Stanovenie nukleotidových sekvencií sa uskutočnilo metódou Sangera a spol. (napríklad F. Sanger a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463, 1977).
Sekvencia nukleotidov lysC štandardného typu, zakódovaná p399AKY, je uvedená v SEQ ID č. 3 v zozname sekvencií. Na druhej strane nukleotidová sekvencia muto vaného lysC, zakódovaná p399AK9, mala len mutáciu jedného nukleotidu takú, že 1051 -vý G sa zamenil za A v SEQ ID č. 3 v porovnaní s lysC štandardného typu. Je známe, že lysC z Corynebacterium glutamicum má dve podjednotky (a, /3), zakódované do identického čítacieho rámca na identickom DNA vlákne (pozri Kalinowski J. a spol., Molecular Microbiology 5 (5), 1197 - 1204, 1991). Z homológie vychádzajúc sa predpokladá, že tu sekvenovaný gén má tiež dve podjednotky (a, S), zakódované do identického čítacieho rámca na identickom DNA vlákne.
Aminokyselinová sekvencia α-podjednotky štandardného AK proteínu, vyvodená z nukleotidovej sekvencie DNA, je uvedená v SEQ ID č. 4 spolu s DNA sekvenciou. V SEQ ID č. 5 je uvedená len aminokyselinová sekvencia. Aminokyselinová sekvencia /3-podjednotky štandardného AK proteínu, vyvodená z nukleotidovej sekvencie DNA, je uvedená v SEQ ID č. 6 spolu s DNA sekvenciou. V SEQ ID č. 7 je uvedená len aminokyselinová sekvencia. V každej z týchto podjednotiek sa používa GTG ako iniciačný kodón a zodpovedajúca aminokyselina je reprezentovaná metionínom. Ale táto reprezentácia sa týka metionínu, valínu alebo formylmetionínu.
Na druhej strane mutácia v sekvencii mutovaného lysC znamená výskyt takej substitúcie aminokyselinového zvyšku, že 279-ty alanínový zvyšok «-podjednotky sa zmení na treonínový zvyšok a 30-ty alanínový zvyšok ^-podjednotky sa zmení na treonínový zvyšok v aminokyselinovej sekvencii štandardného AK proteínu (SEQ ID č. 5, 7).
Príklad 2
Príprava lysA z Brevibacterium lactofermentum
1. Príprava lysA a konštrukcia plazmidu, ktorý obsahuje lysA
Kmeň štandardného typu Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 sa použil ako donor chromozomálnej DNA. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13869 bežným spôsobom. DNA fragment, obsahujúci argS, lysA, a promótor operónu, ktorý ich obsahuje, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA pomocou PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých na amplifikáciu, použili sa syntetické DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 8 a 9 v zozname sekvencii, aby sa amplifikovala oblasť okolo 3,6 kb kódu pre arginyl-tRNA syntázu a DDC na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 4 (11), 1819 - 1830, 1990; Molecular and Generál Genetics 212, 112 - 119, 1988). Syntéza DNA a PCR sa uskutočnili tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1. pHSG399 sa použil ako klonovací vektor pre fragment 3 579 bp amplifikovaného génu. pHSG399 sa natrávil reštrikčným enzýmom Smal (vyrobené firmou Takara Shuzo) a naviazal sa na DNA fragment, obsahujúci amplifikovaný lysA. Plazmid, získaný opísaným spôsobom, ktorý mal lysA, pochádzajúci z ATCC 13869, sa označil ako p399LYSA.
DNA fragment, obsahujúci lysA, sa extrahoval natrávením p399LYSA pomocou KpnI (vyrobené firmou Takara Shuzo) a BamHI (vyrobené firmou Takara Shuzo). Tento DNA fragment sa naviazal na pHSG299, natrávený KpnI a BamHI. Získaný plazmid sa označil ako p299LYSA. Proces konštrukcie p299LYSA je znázornený na obr. 2.
Do získaného p299LYSA sa zaviedol Brevi.-ori, aby sa skonštruoval plazmid, nesúci lysA, autonómne rcplikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. pHK4 sa natrávil reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHI a odštiepené okraje sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa naviazal fosforylovaný KpnI linker (vyrobené firmou Takara Shuzo), aby sa uskutočnila taká modifikácia, aby DNA fragment, zodpovedajúci Brevi.-ori časti, mohol byť excidovaný z pHK4 natrávením len pomocou KpnI. Tento plazmid bol natrávený KpnI a vytvorený Brevi.-ori DNA fragment sa naviazal na p299LYSA, ktorý sa tiež natrávil KpnI, aby sa pripravil plazmid, ktorý obsahoval lysA, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. Pripravený plazmid sa označil ako pLYSAB. Proces konštrukcie pLYSAB je znázornený na obr. 3.
2. Stanovenie nukleotidovej sekvencie lysA z Brevibacterium lactofermentum
Pripravil sa plazmid DNA z p299LYSA a jeho nukleotidová sekvencia sa stanovila tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1. Stanovená nukleotidová sekvencia a aminokyselinová sekvencia, o ktorej sa usudzuje, že je zakódovaná uvedenou nukleotidovou sekvenciou, sú uvedené v SEQ ID č. 10. Čo sa týka nukleotidovej sekvencie, aminokyselinová sekvencia, zakódovaná argS, a aminokyselinová sekvencia, zakódovaná lysA, sú uvedené v SEQ ID č. 11 a 12.
Príklad 3
Príprava ppc z Brevibacterium lactofermentum
1. Príprava ppc
Kmeň štandardného typu Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 sa použil ako donor chromozomálnej DNA. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13869 bežným spôsobom. DNA fragment, obsahujúci ppc, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA pomocou PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých na amplifikáciu, použili sa syntetické DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 13 a 14 v zozname sekvencii, aby sa amplifikovala oblasť okolo 3,3 kb kódu pre PEPC na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri O'Regan M. a spol., Gene 77, 237 - 251, 1989). Syntéza DNA a PCR sa uskutočnili tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1.
Fragment amplifikovaného génu s asi 3300 bp sa potvrdil elektroforézou na agarózovom géli, a potom sa fragment, extrahovaný z gélu, čistil bežnou metódou a natrávil reštrikčným enzýmom Sali (vyrobené firmou Takara Shuzo). Ako klonovací vektor pre ppc sa použil pHSG399. pHSG399 sa natrávil reštrikčným enzýmom Sali (vyrobené firmou Takara Shuzo) a naviazal sa na DNA fragment, obsahujúci amplifikovaný ppc. Plazmid, získaný opísaným spôsobom, ktorý mal ppc, pochádzajúci z ATCC 13869, sa označil ako pPCF.
2. Naviazanie ppc génu na lysC promótor pPCF, získaný opísaným spôsobom, sa natrávil reštrikčným enzýmom Dral (vyrobené firmou Takara Shuzo). Po odstránení DNA fragmentu s asi 150 bp pred PEPC štrukturálnym génom sa dosiahlo samonaviazanie, aby sa získal plazmid pPCFds. pPCFds sa natrávil reštrikčným enzýmom Sali (vyrobené firmou Takara Shuzo) a odštiepené okraje sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou.
p399AKYB, obsahujúci lysC štandardného typu, získaný v príklade 1, sa natrávil reštrikčnými enzýmami ApaLI a
PstI (oboje vyrobené firmou Takara Shuzo) a odštiepené okraje sa tupo zakončili tým istým spôsobom ako vyššie. Menší fragment spomedzi dvoch získaných DNA fragmentov obsahuje Brevi.-ori a promótor lysC. Tento fragment sa naviazal na uvedený fragment, získaný natrávením pPCFds pomocou Sali, a tupo sa zakončil s použitím DNA Ligation kit (vyrobené firmou Takara Shuzo).
DNA v ligačnom roztoku sa zaviedla do Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 metódou elektrických impulzov (Sugimoto a spol., japonská zverejnená patentová prihláška č. 2-207791). Transformanty sa vybrali z celého média, obsahujúceho 5 pg/ml chloramfenikolu. Plazmid DNA sa pozberal z transformantov a natrávil sa EcoRI, aby sa získal plazmid, v ktorom je lysC promótor naviazaný na ppc štrukturálny gén v normálnej orientácii. Získaný plazmid sa označil ako pAKPFds. Proces konštrukcie pAKPFds je znázornený na obr. 4. Na ppc, naviazaný na lysC promótor, v ďalšom odkazujeme ako na „ppc štandardného typu s vysokou expresiou“.
3. Vloženie ppc štandardného typu s vysokou expresiou do vektora ppc štandardného typu s vysokou expresiou, získaný skôr, sa amplifíkoval pomocou PCR, aby sa vložil do vektora s replikačným začiatkom, autonómne replikovateľného v baktériách typu Corynebacterium iných než Brevi.-ori. Čo sa týka DNA primérov, použil sa oligonukleotid, zodpovedajúci lysC promótorovej časti (SEQ ID č. 7), ktorý sa syntetizoval na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (5), 1197 - 1204, 1991; Mol. Gen. Genet. 224, 317 - 324, 1990), a oligonukleotid, zodpovedajúci ppc časti (SEQ ID č. 8), ktorý sa syntetizoval na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri O'Regan M. a spol., Gene 77. 237 - 251, 1989). Tieto priméry boli navrhnuté tak, aby fragment s asi 3150 bp, obsahujúci ppc štandardného typu s vysokou expresiou, mohol byť amplifikovaný a koniec amplifikovaného fragmentu DNA sa mohol natráviť reštrikčným enzýmom KpnI. Syntéza DNA a PCR sa uskutočnili tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1.
Klonovací vektor pVK7 pre baktérie typu Corynebacterium, ktorý bol novo skonštruovaný, sa použil ako vektor na zavedenie ppc štandardného typu s vysokou expresiou do baktérií typu Corynebacterium. pVK7 sa skonštruoval naviazaním pHSG299, vektora pre E. coli (Kmr; Takeshita S. a spol., Gene 61, 63 - 74, 1987), na pAM330, kryptoplazmid pre Brevibacterium lactofermentum, ako je opísané ďalej. pHSG299 sa natrávil reštrikčným enzýmom, vznikajúcim na mieste štiepenia, Avall (vyrobené firmou Takara Shuzo), tupo zakončil s použitím T4 DNA polymerázy, a naviazal sa na pAM330, ktorý bol natrávený HindlII (vyrobené firmou Takara Shuzo), a tupo sa zakončil s použitím T4 DNA polymerázy. V závislosti od orientácie vloženého pAM33O v pHSG299 sa dva získané plazmidy označili ako pVK.6 a pVK7, a pVK7 sa použil na nasledujúce pokusy. pVK7 je autonómne replikovateľný aj v E. coli, aj v Brevibacterium lactofermentum, a má viacpočetné klonovacie miesto, pochádzajúce z pHSG299 a lacZ'. Proces konštrukcie pVK.6 a pVK7 je znázornený na obr. 5.
Amplifikovaný fragment génu s asi 3150 bp sa potvrdil elektroforézou na agarózovom géli a potom sa fragment, extrahovaný z gélu, čistil bežnou metódou a natrávil reštrikčným enzýmom KpnI (vyrobené firmou Takara Shuzo). DNA fragment sa naviazal na pVK7, ktorý bol natrávený reštrikčným enzýmom KpnI. Pripravený plazmid sa označil ako pPwm. Proces konštrukcie pPwm je znázornený na obr. 6.
Príklad 4
Príprava plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutovaného lysC a lysA
Plazmid, obsahujúci mutovaný lysC, lysA a replikačný začiatok pre baktérie typu Corynebacterium, sa pripravil z plazmidu p399AK9B, obsahujúceho mutovaný lysC a Brevi.-ori, a plazmidu p299LYSA, obsahujúceho lysA. p299LYSA sa natrávil reštrikčnými enzýmami BamHI a KpnI (oba vyrobené firmou Takara Shuzo) a tupo zakončil. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Získaný DNA fragment sa naviazal na p399AK9B, ktorý bol natrávený Sali a tupo zakončený. Pripravil sa takto plazmid, obsahujúci mutovaný lysC a lysA, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium, a označil sa ako pCL. Proces konštrukcie pCL je znázornený na obr. 7.
Porovnávací príklad 1
Príprava dapA, dapB a ddh z Brevibacterium lactofermentum
Ako gény, súvisiace s biosyntézou L-lyzínu, iné ako lysC, lysA a ppc, sa dapA (gén pre dihydrodipikolinátsyntázu), dapB (gén pre dihydrodipikolinátreduktázu) a ddh (gén pre diaminopimelátdehydrogenázu) získali nasledujúcim spôsobom.
1. Príprava dapA a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho dapA
Ako donor chromozomálnej DNA sa použil štandardný kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869. Chromozomálna DNA sa pripravila z kmeňa ATCC 13869 bežnou metódou. DNA fragment, obsahujúci dapA, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA pomocou PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých na amplifikáciu, syntetizovali sa DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 19 a 20 v zozname sekvencií, aby sa amplifikovala oblasť okolo 1,5 kb kódu pre DDPS na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Nucleic Acids Research 18 (21), 6421, 1990; EMBL prístupové číslo X53993). Syntéza DNA a PCR sa uskutočnili tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1. pCRIOOO (vyrobila firma Invitrogen, pozri Bio/Technology 9, 657 - 663, 1991) sa použil ako klonovací vektor pre fragment amplifíkovaného génu s 1411 bp a naviazal sa na amplifikovaný dapA fragment. Naviazanie DNA sa uskutočnilo s použitím DNA ligation kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) podľa navrhnutej metódy. Skonštruoval sa teda plazmid, v ktorom dapA fragment s 1411 bp, amplifikovaný z chromozómu Brevibacterium lactofermentum, bol naviazaný na pCRIOOO. Plazmid, získaný opísaným spôsobom, ktorý mal dapA, pochádzajúci z ATCC 13869, sa označil ako pCRDAPA.
Transformovaný kmeň AJ13106, získaný zavedením pCRDAPA do kmeňa E. coli JM109, bol medzinárodne deponovaný od 26. mája 1995 pod prístupovým číslom FERM BP-5113 vNational Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko) na základe Budapeštianskej dohody.
Brev.-ori sa zaviedol do pripraveného pCRDAPA, aby sa skonštruoval plazmid, nesúci dapA, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. pHK4 sa natrávil reštrikčnými enzýmami KpnI a BamHI (vyrobené firmou Takara Shuzo) a odštiepené konce sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa naviazal fosforylovaný Smal linker (vyrobené firmou Takara Shuzo), aby sa urobila taká modifikácia, aby sa DNA fragment, zodpovedajúci Brevi.-ori časti, mohol excidovať z pHK4 natrávaním len pomocou Smal. Tento plazmid sa natrávil Smal a vytvorený Brevi.-ori fragment sa naviazal na pCRDAPA, ktorý bol tiež natrávený Smal, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci dapA, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. Tento plazmid sa označil ako pDPSB. Proces konštrukcie pDPSB (Kmr) je znázornený na obr. 8.
2. Príprava dapB a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho dapB
Štandardný kmeň Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 sa použil ako donor chromozomálnej DNA. Chromozomálna DNA sa pripravila z ATC 13869 kmeňa bežnou metódou. DNA fragment, obsahujúci dapB, sa amplifikoval z chromozomálnej DNA pomocou PCR. Čo sa týka DNA primérov, použitých na amplifíkáciu, syntetizovali sa DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ ID č. 21 a 22 v zozname sekvencií, aby sa amplifikovala oblasť okolo 2,0 kb kódu pre DDPR na základe sekvencie, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Joumal of Bacteriology 175 (9), 2743 - 2749). Syntéza DNA a PCR sa uskutočnili tým istým spôsobom, ako je opísané v príklade 1. pCR-Script (vyrobené firmou Invitrogen) sa použil ako klonovací vektor pre fragment amplífikovaného génu s 2001 bp a naviazal sa na amplifíkovaný dapB fragment. Skonštruoval sa takto plazmid, v ktorom bol dapB fragment s 2001 bp, amplifíkovaný z chromozómu Brevibacterium lactofermentum, naviazaný na pCR-Script. Plazmid, získaný opísaným spôsobom, ktorý mal dapB, pochádzajúci z ATCC 13869, sa označil ako pCR-DAPB. Transformovaný kmeň AJ13107, získaný zavedením pCRDAPB do kmeňa E. coli JM109, je medzinárodne deponovaný od 26. mája 1995 pod prístupovým číslom FERM BP-5114 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko) na základe Budapeštianskej dohody.
Fragment s 1101 bp, obsahujúci štrukturálny gén DDPR, sa extrahoval natrávením pCRDAPB pomocou EcoRV a Sphl. Tento fragment sa naviazal na pHSG399, ktorý bol natrávený HinclI a Sphl, aby sa pripravil plazmid. Pripravený plazmid sa označil ako p399DPR.
Do pripraveného p399DPR sa zaviedol Brevi.-ori, aby sa skonštruoval plazmid, nesúci dapB, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. pHK4 sa natrávil reštrikčným enzýmom KpnI (vyrobené firmou Takara Shuzo) a odštiepené konce sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa naviazal fosforylovaný BamHi linker (vyrobené firmou Takara Shuzo), aby sa urobila taká modifikácia, aby sa DNA fragment, zodpovedajúci Brevi.ori časti, mohol excidovať z pHK4 natrávaním len pomocou BamHi. Tento plazmid sa natrávil BamHi a vytvorený Brevi.-ori fragment sa naviazal na p399DPR, ktorý bol tiež natrávený BmaHI, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci dapB, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. Pripravený plazmid sa označil ako pDPRB. Proces konštrukcie pDPRB je znázornený na obr. 9.
3. Príprava ddh a konštrukcia plazmidu, obsahujúceho ddh ddh gén sa získal amplifikovaním ddh génu z chromozomálnej DNA Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 PCR metódou s použitím dvoch oligonukleotidových primérov (SEQ ID č. 23, 24), pripravených na základe známej nukleotidovej sekvencie ddh génu z Corynebacterium glutamicum (Ishino S. a spol., Nucleic Acids Res. 15, 3917, 1987). Získaný amplifíkovaný DNA fragment sa natrávil EcoT22I a Aval a odštiepené okraje sa tupo zakončili. Potom sa fragment vložil do Smal miesta pMWl 19, aby sa získal plazmid pDDH.
Potom sa pDDH natrávil Sali a EcoRI, po čom nasledovala tvorba tupých koncov. Potom sa získaný fragment naviazal na pUC18, ktorý bol natrávený Smal. Takto získaný plazmid sa označil ako pUCl 8DDH.
Do pUC18DDH sa zaviedol Brevi.-ori, aby sa skonštruoval plazmid, nesúci ddh, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. pHK4 sa natrávil reštrikčnými enzýmami KpnI a BamlII a odštiepené okraje sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa fosforylovaný PstI linker (vyrobené firmou Takara Shuzo) naviazal tak, že sa vložil do PstI miesta pHSG299. Plazmid, skonštruovaný opísaným spôsobom, sa označil ako pPK4. Potom sa pUC18DDH natrávil Xbal a KpnI a vytvorený fragment sa naviazal na pPK4, ktorý bol natrávený KpnI a Xbal. Takto sa skonštruoval plazmid, obsahujúci ddh, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. Tento plazmid sa označil ako pPK4D. Proces konštrukcie pPK4D je znázornený na obr. 10.
Porovnávací príklad 2
Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutovaného lysC a dapA, dapB alebo ddh
1. Konštrukcia kombinácie mutovaného lysC a dapA
Plazmid, obsahujúci mutovaný lysC, dapA a replikačný začiatok baktérie typu Corynebacterium, sa skonštruoval z plazmidu pCRDAPA, obsahujúceho dapA, a plazmidu p399AK9B, obsahujúceho mutovaný lysC a Brevi.-ori. p399AK9B bol úplne strávený Sali a potom sa tupo zakončil. Naň sa naviazal EcoRI linker, aby sa skonštruoval plazmid, v ktorom sa Sali miesto modifikovalo na EcoRI miesto. Získaný plazmid sa označil ako p399AK9BSE. Mutovaný lysC a Brevi.-ori sa excidovali ako jeden fragment čiastočným natrávením p399AK9BSE pomocou EcoRI. Tento fragment sa naviazal na pCRDAPA, ktorý bol natrávený EcoRI. Získaný plazmid sa označil ako pCRCAB. Tento plazmid je autonómne replikovateľný v E. coli a v baktériách typu Corynebacterium a dodáva hostiteľovi odolnosť proti kanamycínu, pričom tento plazmid obsahuje kombináciu mutovaného lysC a dapA. Proces konštrukcie pCRCAB jc znázornený na obr. 11.
Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutovaného lysC a dapB
Plazmid, obsahujúci mutovaný lysC a dapB, sa skonštruoval z plazmidu p399AK9, obsahujúceho mutovaný lysC, a z plazmidu p399DPR, obsahujúceho dapB. Fragment s 1101 bp, obsahujúci štrukturálny gén DDPR, sa extrahoval natrávením p399DPR EcoRV a Sphl. Tento fragment sa naviazal na p399AK9, ktorý bol natrávený Sali, a potom sa tupo zakončil a ďalej sa natrávil pomocou Sphl, aby sa skonštruoval plazmid, obsahujúci kombináciu muto vaného lysC a dapB. Tento plazmid sa označil ako p399AKDDPR.
Potom sa Brevi.-ori zaviedol do získaného p399AKDDPR. Plazmid pHK4, obsahujúci Brevi.-ori, sa natrávil reštrikčným enzýmom KpnI (vyrobené firmou Takara Shuzo) a odštiepené konce sa tupo zakončili. Tvorba tupých koncov sa uskutočnila s použitím DNA Blunting kit (vyrobené firmou Takara Shuzo) navrhnutou metódou. Po vytvorení tupých koncov sa naviazal fosforylovaný BamHI linker (vyrobené firmou Takara Shuzo), aby sa urobila taká modifikácia, aby sa DNA fragment, zodpovedajúci Brevi.-ori časti, mohol excidovať z pHK4 natrávením len pomocou BamHI. Tento plazmid sa natrávil BamHI a vytvorený Brevi.-ori fragment sa naviazal na p399AKDDPR, ktorý bol tiež natrávený BmaHI, aby sa pripravil plazmid, obsahujúci mutovaný lysC a dapB, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium. Skonštruovaný plazmid sa označil ako pCB. Proces konštrukcie pCB je znázornený na obr. 12.
3. Konštrukcia plazmidu, obsahujúceho kombináciu mutovaného lysC a ddh
Plazmid, obsahujúci mutovaný lysC, ddh a replikačný začiatok pre baktérie typu Corynebacterium, sa pripravil z plazmidu pUC18DDH, obsahujúceho ddh, a z plazmidu p399AK9B, obsahujúceho mutovaný lysC a Brevi.-ori. pUC18DDH sa natrávil reštrikčným enzýmom EcoRI (vyrobené firmou Takara Shuzo), tupo zakončil a naviazal na Sali polylinker na jeho konci, aby sa miesto EcoRI zmenilo na miesto Sali. Získaný plazmid sa natrávil Sali, aby sa získal DNA fragment, obsahujúci ddh.
Potom sa p399AK9B natrávil reštrikčným enzýmom Sali a naviazal na DNA fragment, obsahujúci ddh. Tak sa pripravil plazmid, obsahujúci mutovaný lysC, ddh a Brcvi.-ori, autonómne replikovateľný v baktériách typu Corynebacterium, a označil sa ako pCD. Proces konštrukcie pCD je znázornený na obr. 13.
Príklad 5
Zavedenie plazmidov, obsahujúcich gény pre biosyntézu L-lyzínu, do baktérie Brevibacterium lactofermentum, produkujúcej L-lyzín
Plazmidy, obsahujúce gény pre biosyntézu L-lyzínu, skonštruované uvedeným spôsobom, a sice p399AK9B (Cmr), pLYSAB (Cnf), pPwm (Km1), pCRCAB (Km4), pCB (Cmr), pCD (Cm1) a pCL (Cmr), sa zaviedli do L-lyzín produkujúcej baktérie AJ 11082 (NRRL B-11470) Brevibacterium lactofermentum. Kmeň AJ11082 má vlastnosť odolnosti proti AEC. Plazmidy sa zaviedli metódou elekTabuľka 1 trických impulzov (Sugimoto a spol., japonská zverejnená patentová prihláška č. 2-207791). Transformanty sa vybrali na základe markerov odolnosti proti liečivám, ktoré mali príslušné plazmidy. Transformanty sa vybrali z celého média, obsahujúceho 5 pg/ml chloramfenikolu, keď sa zaviedol plazmid, obsahujúci gén odolnosti proti chloramfenikolu, alebo sa transformanty vybrali z celého média, obsahujúceho 25 pg/ml kanamycínu, keď sa zaviedol plazmid, obsahujúci gén odolnosti proti kanamycínu.
Ku kmeňu, ktorého mutovaný lysC a lysA boli zosilnené medzi získanými transformantmi, sa zaviedol pPwm (Kmr), aby sa získal kmeň, v ktorom sa zosilnili všetky tri z mutovaného lysC, lysA a ppc (AJ11082/pCL/pPwm). Transformanty sa vybrali z celého média, obsahujúceho 5 pg/ml chloramfenikolu a 25 pg/ml kanamycínu.
Príklad 6
Produkcia L-lyzínu
Každý z transformantov, získaných v príklade 5, sa kultivoval v médiu, produkujúcom L-lyzín, aby sa vyhodnotila produkcia L-lyzínu. Médium, produkujúce L-lyzín, malo nasledujúce zloženie.
[Médium, produkujúce L-lyzín]
Nasledujúce zložky, iné než uhličitan vápenatý, sa rozpustili (v 1 1) a pH sa nastavilo na 8,0 pomocou KOH. Médium sa sterilizovalo pri 115 °C 15 minút, a potom sa pridal uhličitan vápenatý (50 g), ktorý bol oddelene sterilizovaný v horúcom vzduchu v suchom stave.
Glukóza 100 g
(NH4)2SO4 55 g
kh2po4 1 g
MgSO4.7H2O 1 g
Biotin 500 pg
Tiamín 2000 pg
FeSO4.7H2O 0,01 g
MnSO4.7H2O 0,01 g
Nikotínamid 5 mg
Proteínový hydrolyzát (Márnenou) 30 ml
Uhličitan vápenatý 50 g
Každý z rôznych typov transformantov a rodičovský kmeň sa naočkovali do média s opísaným zložením, aby sa uskutočnila kultivácia pri 31,5 °C s trepaním sem a tam. Množstvo vyprodukovaného L-lyzínu po 40 alebo 72 hodinách kultivácie je uvedené v tabuľke 1. V tabuľke lysC* reprezentuje mutovaný lysC.
Akumulácia L-lyzínu po 40 alebo 72 hodinách kultivácie
Bakteriálny kmeň/plazmid Zavedený gén Množstvo vyprodukovaného L-lyzínu (g/1)
Ρθ 40 hodinách PO 72 hodinách
AJ11082 22,0 29,8
AJ11082/p399AK9B lysC* 16,8 34,5
AJ11082/pLYSAB lysA 19,8 32,5
AJ11082/pPwm ppc 20,7 28,9
AJ11082/pCRCAB lysC*, dapA 19,7 36,5
AJ11082/pCB lysC*, dapB 23,3 35,0
AJ11082/pCD lysC*, ddh 15,0 27,0
AJ11082/pCL lysC*, lysA 24,0 44,0
AJ11082/pCL/pPwm lysC*, lysA, ppc 25,0 45,2
Ako je uvedené, keď sa mutovaný lysC, lysA alebo ppc zosilnili jednotlivo, alebo keď sa mutovaný lysC zosilnil v kombinácii s dapA alebo ddh, množstvo vyprodukovaného L-lyzínu bolo väčšie než alebo ekvivalentné množstvu, vyprodukovanému rodičovským kmeňom po 72 hodinách kultivácie, ale množstvo vyprodukovaného L-lyzínu bolo menšie než množstvo, vyprodukované rodičovským kmeňom po 40 hodinách kultivácie. Totiž rýchlosť produkcie L-lyzínu sa spomalila pri krátkom čase kultivácie, Podobne, keď sa mutovaný lysC a ddh zosilnili v kombinácii, množstvo vyprodukovaného L-lyzínu bolo menšie než množstvo, ktoré vyprodukoval rodičovský kmeň po 40 hodinách a po 72 hodinách kultivácie. Na rozdiel od toho sa v prípade, keď kmeň, v ktorom bol dapB zosilnený spolu s mutovaným lysC, rast sa zlepšil, rýchlosť produkcie L-lyzínu sa úspešne obnovila v krátkom čase kultivácie a akumulované množstvo L-lyzínu sa tiež zlepšilo pri dlhom čase kultivácie. V prípade kmeňa, v ktorom boli všetky tri mutovaný lysC, lysA a ppc zosilnené súčasne, produkcia L-lyzínu sa ďalej zlepšila.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(1) Prihlasovateľ: AJINOMOTO CO., LTD.
(ii) Názov vynálezu: Spôsob produkcie L-lyzínu (iii) Počet sekvencií: 24 (iv) Adresa pre korešpondenciu:
(A) Adresát:
(B) Ulica:
(C) Mesto:
(E) Štát:
(F) PSČ:
(v) Počítačom čitateľná forma:
(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release#1.0, Version #1.30 (vi) Súčasné prihlasovacie údaje:
(A) Číslo prihlášky:
(B) Dátum podania:
(C) Klasifikácia:
(vii) Údaje o skorších prihláškach:
(A) Číslo prihlášky: JP 8-325658 (B) Dátum podania: 5. decembra 1996 (viii) Informácie o zástupcovi/agentovi:
(A) Meno:
(B) Registračné číslo:
(ix) Telekomunikačné informácie:
(A) Telefón:
(B) Telefax:
(2) Informácie pre SEQ ID č. 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 1:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 2:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 21 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 2: ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 (2) Informácie pre SEQ ID č. 3:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 1643 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13869 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 3:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTŤGTCTC TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT
AAATATTAAA TCGAATATCA AIATACGGTC60
ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAÄCCCTGT120
GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240
ATTAGÄAACG TCGCTGAACG GÄTCGTTGCC300
GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT360
CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAÄC GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACAC2G ÄAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GTTCTC-GGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCAGAAATCA ACATTGÄCÄT GGTTCTGCAG GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTCÄC CTTCAGGTTC ÄGGGCAACTG GACCAATGTG CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CCCTTTIGGA AGÄGCGCAAT TTCCCAGCTG CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC
GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT4Θ0
CAGGCTGGTG TGCTCACCAC ĽGAGCGCCAC540
GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600
GTTAATAAAG AÄACCCGCGA TGTCACCACG660
GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT SAACGCTGAT720
GTGTATAXCG CTGACCCC-CG CATCGTTCCT780
GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC340
TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC900
ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960
GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC102Q
GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT1090
AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC1140
GGACGCCGTG CGATGGAGÄT CTTGAAGAAG1200
CTTTACGACG ACCAGGTCCG CAAAGTCTCC1260
GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG1320
TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG13B0
CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC1440
ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT1500
CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA1560
ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT1620
1643 (2) Informácie pre SEQ ID č. 4:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 1643 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Miesto: 217...1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 4:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GCAACCCTGT GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG Met Ala Leu Val Val Gin 1 5
120 1Θ0 234
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg íle Arg Asn Val
10 15 20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAC AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330
Ala Glu Arg tie Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp val val Val
25 30 35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
GCG GCA GTG AAT ccc GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT AŤG CTC CTG 426
Ala Ala Val Ásn Pro val Pro ?ro Ala Arg Glu Met ASp Met Leu Leu
55. 60 65 70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG C-CT ATT GAG 474
Thr Ala Gly Glu Arg íle Ser Asn Ala Leu val Ala Met Ala íle Glu
75 BO 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA tct TTC ACT GCC TCT CAG GCT GGT GTG 522
Ser Leu Gly Ala G1U Ala Gin ser Phe Thr Gly Ser cín Ala Gly Val
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg íle Val ASp VaL Thr Pro
105 110 115
GGT CGT GTG CCT GAA GCA CTC CAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Clu Gly Lys íle Cys íle Val Ala
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GCT 656
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg ASp val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GCT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762
Ala Asp val cys Glu Π e Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT ΑΑΓ GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810
Aap Pro Arg íle Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser LVS íle Leu val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg val Arg
215 220 225 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954
Ser ser Tyr ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu íle Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
C-AT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC CCA ACC GAC AAG 1002
ASp íle Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050
Ser GlU Ala Lys Val Thr val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pio Gly Glu
2 65 2?0 2?5
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098
Ala Ala Lys val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle ASp
280 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146
Met Val Leu Gin Asn val Ser Ser val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Íle
295 300 305 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG1194
Thr Phe Thr cys ŕio Arg Ala Asp Gly Arg Arg Als Met Glu íle Leu
315 320325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC1242
Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr AspAsp
330 335340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA1290
Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His?ro
345 350355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GÍA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn ValAsn
350 365370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ACT TCC GTG CTG ATC CGT13B6 íle Glu Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íleArg
375 380 385390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin PheGin
395 400405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr GlyArg
410 415420
ACTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCCGCCACG 1542 TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602 TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C1643 (2) Informácie pre SEQ ID č. 5:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 421 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 5:
Met Ala Leu Val Val Gin Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu G1U Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg íle Arg Asn Val Ala Glu Arg íle Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Sér Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu G1U Leu Ala Ma Ala val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Tie Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala íle Glu Sex Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr
85 9Q 95
Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
íle val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys íle Cys íle Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu íle Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg íle Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
ser Lys íle Leu Val Leu Aro Ser Val Glu Ty r Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
val Pro Leu Arg val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn ASO Pro Gly Thr Leu
225 230 235 140
íle Ala Gly Ser Met Glu Asp íle Pro Val Glu GlU Ala Val Leu Thr
245 2 50 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys val Thr Val Leu Gly IU
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu íle Asn íle Asp Het Val Leu Gin Asn val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys val Ser Leu val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser HiS Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp val Asn val Asn íle Glu Leu íle Sar Thr Ser Glu íle Arg
370 375 380
íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
395 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly G1U Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
(2) Informácie pre SEQ ID č. 6:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 1643 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Miesto: 964...1482 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 6:
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT120
GCAGAAAGAA AACÄCTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG180
GTAACTGTCA GCACGTÄGAT CGAAÄGGTGC ÄCAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT240
GGCGGTTCCT CGCTTGACAG TGCGGAACGC ATTAGAÄACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGACA CACCACGGAT360
CAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCA6TGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA ÄATGGATATG<20
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT460
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGT7GGC840
TCCÄAGAITT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TAC6CTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC9C0
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT960
CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA1008
Met Glu Glu Ala val Leu Thr Gly Val .Ala Thr Asp Lys Ser Glu 15 1015
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GCT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu AlaAla
2530
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT1134
Lya Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle Aso MetVal
4045
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC CAC ATC ACG TTC11S2
Leu Gin Asn Val Ser Ser val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle ThrPhe
5560
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG1200
7ht Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu LysLys
7075
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC1240
Leu Gin val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp GinVal
85 909«
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT1296
Gly Lys Val Ser Leu val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro GlyVal
100 105HO
ACC GCA GAG TTC ATG GAA CCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA134 4
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn íleGlu
115 12012S
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CCT GAA GAT1392
Leu íle Ser Thr Ser Glu íle Arg íle Ser Val Leu íle Arg GluAsp
130 135140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin LeuGly
145 150155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 14 90 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
150 165170
AGGAGTA6TT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 STTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCÄGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC1643 (2) Informácie pre SEQ ID č. 7:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 172 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 7:
Met Glu Glu Ala val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Tht Val Leu Gly íle Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu íle Asn íle Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn val ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp íle Thr Phe Thr
50 SS 60
Cys Pra Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu íle Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala □la- phe Met Glu Ala Leu Arg Asp VaL Asn Val Asn íle Glu Leu
115 120 125
íle ser Thr Ser Glu íle Arg Íle Ser Val Leu íle Arg Glu Asp • Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu HÍS Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly
145 150 155 150
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170
(2) Informácie pre SEQ ID č. 8:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 8:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 9:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 9:
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 10:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 3579 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómováDNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Miesto: 533...2182 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Miesto: 2188...3522 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 10:
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG TCTGGCCAGT TCATGGATTG GTTACCGAAG ATGSTGCCGT GATATCGCCA AOTGAGGGAT GGAGGCAATA TCTACCTGAG AGTGGGCATT GATACCAAAA CCTTTTTATT GTCGAACGGG CCCCAAAAAG CATATACAGA AGTATGGGTC GTATTCTGTG
AGGCTGCACT GCAACGACGT GCTGCCGAAG AAGCTATAGG GC7TTTCGCC TTGGGCAGGG CAGAATAGTG CATGGGCACG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCATTACGGC TCCAAGGÄCG GACCAATGAT ΤΓΤΤΟΑΤΤΑΑ CGACGGGTGT ACCICGGCTA
CGTAGTTTTG GTACATGGCT CATCGCACCA GGGCCACCGA ACCTTGACAA.AGCCCACGCT TCGATGCTGC CACATTGAGC ATGTTrrCTT GCGCTGCTCC GCGGCAAGAA CTGCTACTAC TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA GAATTTCTCC CC ATG
Met
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA 1 1 GAG GTT
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu íle Lys Glu Thr Ala val i G1U Val
5 10 15
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG - GTA GTT
Lee i Thr Ser Arg G1U Leu Asp Thr Ser val Leu Pro Glu Gin ' Val Val
20 25 30
jTG GAG CCT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC . AAC ATT
Val Git l Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr . Asn Ue
35 40 45
GCA TTC i CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT 1 TTG GCT
Ais i Leu i Gin . Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp : Leu Ala
$0 55 60 65
ACC TGC i CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT ' TCT GCT
Thr Trp > Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala íle Asp Ser Ala
70 75 80
GAA ATT 1 GCT 1 GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA ' GCA GCA
Glu 114 i Ala . Gly Pro Gly Phe Leu Asn íle Acg Leu Ala Al a . Ala Ala
85 90 95
CAG GGT ' GAA . ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT 1 rre gga
Gin Gly ' Glu íle Val Ala Lys íle Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe Gly
100 105 110
AAC TCC ; GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC < GTT TCT
Asn Ser Asp HiS Leu ser HiS Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe ' Val i Ser
115 120 125
GCA AAC CCA . ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG 1 GCT GCC
Ala i Asn > Pro Thr Gly Pro He His Letí Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala
130 135 140 14 5
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin íle Asp Arg Phe
165 170 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC
Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
180 185 190
GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA
Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr íle Lys Glu íle .Ala Glu Ala íle Val Glu
195 200 20:
AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT
Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu Leu
210 215 220 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC
Fhe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His íle Lys Ser Ser
230 235 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC
Leu MÍS Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
245 250 255
CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC
Leu Fhe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val Leu Lys A,p
260 265 270
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC
Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Tro Leu Arg ser Thr
275 280 2BŠ
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC
Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val val íle Lys Ser Asp Gly ASO
290 295 300 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC
Ala Ala Tyr íle Ala Gly Asp íle Ala Tyr Val Ala Aj p Lys Phe Ser
310 315 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT
Arg Gly His Asn Leu Asn íle Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly
325 330 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA cr? GGC TAC AAG CCA
Tyr íle Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro
340 345 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC
Glu Gly Val Glu Val Leu 11« Gly Gin Mat Val Asn Leu Leu Arg Asp
355 360 365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA
Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu
370 375 330 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG
ASP ASP Leu Val G1U Ala íle Gly íle Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu
390 395 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG
íle Arg Ser Ser val Asp Ser Ser Leu Asp He Asp Leu Gly Leu Trp
405 410 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC
Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly His
420 425 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC
Ala Arg Leu Cys Ser íle Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr
435 440 445
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT
G1U Glu Gly Ala Asp Leu ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
4S0 455 460 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT
Leu íle Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala
470 47S 490
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT
Asp Leu Arg Glu Pre His Arg íle Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala
485 490 495
120
100
240
300
360
420
480
535
583
631
679
127
175
823
871
919
967
1063
1111
1159
1207
1255
1303
1351
1399
1447
1495
1543
1591
1639
1687
1735
1783
1831
1879
1927
1975
2023
GAG GAA GGC GGA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA 1 GGC < GAT 1927
Clu Glu Gly Ala Asp UU Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
450 455 460 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT 197S
Leu íle Arg Thr Leu Gly Clu Phe Pro Ala val Val Lys Ala Ala Ala
470 473 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC cc-c ATT GCC CGC TAT GCT GAG CAA TTA GCT 2023
Mp Leu Axg Glu ?to His Acg íle Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Uu Ala
485 4 90 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG CTT 2071
Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His íle Leu Pro Lys Val
500 505 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CCT CTG GCA CTT GCA GCA 2119
Asp Glu Asp Thr Ala Pro 11· His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala
515 S26 525
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC 2167
Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Uu His Leu val Gly val Ser
530 535 540 545
GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214
Ala Pro Glu Lys Net Met Ala Thr Val Glu Asn Pl ie Asn Glu
550 1 5
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA CAA GAC GGC 2262
Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Atg Gin Glu Asp Gly
10 15 20 25
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CC? GAC CTC GCT GAA GAA TAC 2310
Val val Thr Val Ala Gly Val Pro Uu Pro Asp Leu Ala Clu Glu Tyr
30 35 40
GCA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT 2358
Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
45 50 55
CGC GAC ATG CCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA 2406
Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala
60 65 70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG 2454
Ser Lvs Ala Phe Leu Thr Lys Thr íle Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu
75 80 85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG 2502
Gly Leu Ala Leu Asp íle Ala Ser íle Asn Glu Leu Gly Íle Ala Leu
90 95 100 105
GCC : GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA 2550
Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Ar? He Thr Ala His Gly Asn Asn Lys
110 115 120
GGC GTA . GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GCT GTG GGA CAC GTG 2598
Oly val Glu phe Leu Arg Ala Leu Val Glr. Asn Gly val Gly His val
125 130 135
GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT 2546
val Leu Asp Ser Ala Gin Glu Uu Glu Leu Uu Asp Tyr Val Ala Ala
140 145 150
GGT ' GAA . GGC AAG ATT CAG GAC GTC TTC ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC 2694
Gly ’ Glu . Gly Lys lit Gin Asp Val Leu íle Arg Val Lys Pro Gly íle
155 160 165
GM . GCA . CK . ACC : CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG 2742
ôlv i Ala ι ΗΧ3 . Thr : H1S Glu Phe íle Ala Tht S»r SiS Glu Asp Gin Lys
170 175 180 185
TTC GGA TTC : tcc : ctg . GCA . TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC 2790
?h« i Gly ’ Phe ! Sex : Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala. Ala Lys Ala
190 195 200
GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC Gn 2838
Ala Asn Asn Ala G1U Asn Leu Asn Leu Val Gly Uu His cys HiS val
205 210 21$
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC 2886
Gly Ser Gin val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg
220 22S 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT 2934
Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin íle His Ser Glu Leu Gly Val Ala Uu
235 240 24S
CCT GAA CTG GAT CTC GCT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT 2982
Pro G1U Leu ASP uu Gly Gly Gly Tyr Gly íle Ala Tyr Thr Ala Ala
250 255 260 265
GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA 3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Uu Leu Thr Ala
270 275 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTC CTT 3078
Val Gly Lys Met Ala Ala GlU Leu Gly íle Asp Ala Pro Thr Val Leu
285 290 295
GTT GAG CCC GCC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC 3126
Val Glu Pro Gly Arg Ala íle Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr íle Tyt
300 305 310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC 3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
315 320 325
CGT TAC ATC GCC CTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA 3222
Arg Tyr íle Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn íle Arg Pro Ala
330 335 340 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270
Leu Tyr Gly ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Set Arg Phe Ala Glu
350 3S5 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318
Gly ASP P SO val Ser Thr Arg íle val Gly Ser His Cys G1U Sex Gly
365 370 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CGA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366
Asp íle Leu íle Asn Asp Glu íle Tyr Pro Ser Aso íle Thr Ser Gly
380 385 390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414
Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser
395 400 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462
Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Atg Ala
<10 41$ 420 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510
Giy Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp íle Uu
430 43$ 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562
Ser Leu Glu Ala
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579
(2) Informácie pre SEQ ID č. 11:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 550 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 11:
Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu íle tys Glu Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser val Leu Pro Glu Gin Val
20 25 30
val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro G1U His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
35 40 45
íle Ala Leu Gin Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu
50 55 60
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala íle Asp Ser
6S 70 75 80
Ala Glu íle Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn íle Arg Leu Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Gin Gly Glu íle Val Ala Lys íle Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp val Asn Leu Glu Phe val
115 120 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro 11« His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
130 135 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys
145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His GLy Arg Gin íle Asp Arg
165 170 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Giy Glu Pro Thr Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr íle Lys Glu íle Ala Glu Ala ne val
195 200 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu
210 215 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His íle Lys Ser
225 230 235 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His G1U Asn
245 250 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asd Lys Ala Val Gin val Leu Lys
260 265 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
275 280 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val val íle Lys Ser Asp Gly
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr íle Ala Gly Asp 11« Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe
305 310 315 320
Ser Arg Gly H1S Asn Leu Asn íle Tyr Met! Leu Gly Ala Asp His His
325 330 335
Gly Tyr íle Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ma Leu Gly Tyr Lys
340 345 350
pro Glu Gly VaL Glu Val Leu íle Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg
3S5 360 365
Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
370 375 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala íle Gly íle Asp Ala Ala Arg Tyr Ser
38S 390 395400
Leu íle Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp íle Asp Leu GlyLeu
405 410415
Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr val Gin Tyr Gly 420 425430
Hla Ala Arg Leu Cys Ser íle Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val 435 440445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly 450 435460
Asp Leu íle Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys AlaAla
465 470 475480
Ala Aso Leu Arg Glu Pro His Arg íle Ala Arg Tyr Ala Glu GluLeu
485 490495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His íle Leu Fro Lys 500 505510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro íle His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
515 520525
Ala Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val 530 535540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545SSO (2) Informácie pre SEQ ID č. 12:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 445 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 12:
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His val Trp 1 Pre
1 5 10 15
Arg Asn Ala val Arg Gin Glu Asp Gly val Val Thr Val Ala GLy VaL
20 25 3C
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr GLy Thr Pro Leu Ehe VaL VaL
35 40 45
Asp Glu ÄSp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
63 70 75 80
Thr íle Ala Arg Tro Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Len Asp Íle Ala
85 90 95
Ser íle Asn Glu Leu Gly íle Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg íle Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Ser Ala Gin Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys íle Gin Asp
14 5 150 155 160
Val Leu íle Arg Val Lys Pro Gly íle Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175
íle Ala Thr Ser His G1U Asp Gin Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn. Leu
195 200 20S
Asn Leu val Gly Leu His cys His Val Gly Ser Gin Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin
225 230 235 240
íle His Ser Glu Leu Gly val Ala Leu Pro Glu Leu ÄSp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly íle Ala Tyr Thr Ala Ala Glu GLu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu lei) Thr AU Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly íle Asp Ala Pro Thr val Leu Val GLU Pro Gly Arg Ala íle
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr íle Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
3C5 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Axg Tyr íle Ala Val Asp Gly
32S 330 335
Gly Met Ser Asp Asn íle Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr A?p
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glc Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
íle val Gly Ser His Cys Glu ser Gly Asp íle Leu Íle Asn Asp Glu
370 375 380
íle Tyr Pro Ser Asp íle Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala val Val Ser vaL Axg Ala Gly Ser ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg GlU Thr Leu Asp Asp Ue Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
(2) Informácie pre SEQ ID č. 13:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 13: TCGTCGGTCA GCCTGACGTC GAC 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 14:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 14:
TCTTGGTGTC GAAAGTGCAC ACC 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 15:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 3533 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: dve (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: genómová DNA (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Brevibacterium lactofermentum (B) Kmeň: ATCC 13869 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Miesto: 321...3077 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 15:
GGtGGTTCTG TTAAGGCAGA AACCGTCGCT CAGATCGTCG GTCAGCCTGA CGTCGÄCGGC60
GGACTTGTCG GTGGCGCTTC CCICGACGGT GAAGCATTCG CCAAGCTGGC TGCCAACGCT120
GCGAGCGTTG CTTAAAGTAC ASAGCTTTAA AGCACAGCCT TAAAGCACAG CCTTAAAGCA160
CAÄGCACTGT AGAAGTGCGG TľTTGATGÄG CCCATGAAAG CCATCGMAT CAATCGCCCA240
GCTAAACACC TGTTTTGCTG GGTGATTT7T IATCTCATGC ACGtľCAACAC CCTCAÄTGTG300
AAAGAGTGTI TAAAGTAGTT ATG ACT GAT TTT ΓΤΑ CGC GAT GAC ATC AGG350
Met Thr Asp Phe Leu Arg Asp Asp 11» Arg
S10
TTC CTC GGT CAA ATC CTC GGT GAG GTA ATT GCG GAA CAA GAA GGC CAG398
Ph» Leu Gly Gin íle Leu Gly Glu val Ila Ala Glu Gin Glu GlyGin
2025
GAG GTT TAT GAA CTG GTC GAA CAA GCG CGC CTG ACT TCT TTT GAT ATC446
Glu Val Tyr Glu Leu Val Glu Gin Ala Arg Leu Thr Ser Phe AspII»
3540
GCC AAG GGC AAC GCC GAA ATG GAT AGC CTG GTT CAG GTT TTC GAC GGC494
Α1» Lys Gly Asn Ala Glu Met Asp ser Leu val Gin val pne AspGly <5 5055
ATT ACT CCA GCC AAG GCA ACA CCG ATT GCT CGC GCA TTT TCC CAC TTC542 íle Thr Pro Ala Lys Ala Thr Pro íle Ala Arg Ala Phe Ser HlaPhe «0 6570
GCT CTG CTG GCT AAC CTG GCG GAA GAC CTC TAC GAT GAA GAG GTT CGT590
Ala Leu Leu Ala Asn Leu Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu LeuArg
80 8590
GAA CAG GCT CTC GAT GCA GGC GAC CCT CCG GAC AGC ACT CTT GAT636
Glu Gin Ala Leu Asp Ala Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr LeuAsp
10010S
GCC ACC TGG CTG AAA CTC AAT GAG GGC AAT GTT GGC GCA GAA GCT GTG 686
Ala Thr Trp Leu Lys Leu Asn Glu Gly Asn Val Gly Ala Glu Ala Val
110 lis 120
GCC GAT GTG CTG CGC AAT GCT GAG GTG GCG CCG GTT CTG ACT GCG CAC 734
Ala Asp val Leu Arg Asn Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala His
125 130 135
CCA ACT GAG ACT CGC CGC CGC ACT GTT TTT GAT GCG CAA AAG TGG ATC 762
Pro Thr Glu Thr Arg Arg Arg Thr Val Phe Asp Ala Gin Lys Trp íle
140 145 150
ACC ACC CAC ATG CGT GAA CGC CAC GCT TTG CAG TCT GCG GAG CCT ACC 830
Thr Thr His Met Arg Glu Arg His Ala Leu Gin Ser Ala Glu Pro Thr
155 160 165 170
GCT CGT ACG CAA AGC AAG TTG GAT GAG ATC GAG AAG AAC ATC CGC CGT 878
Ala Arg Thr Gin Ser Lys Leu Asp Glu íle Glu Lys Asn íle Arg Arg
Π5 180 185
CGC ATC ACC ATT TTG TGG CAG ACC GCG TTG ATT CGT GTG GCC CGC CCA 926
Arg íle Thr íle Leu Trp Gin Thr Ala Leu ne Arg val Ala Arg ?=o
190 195 200
CGT ATC CAG GAC GAG ATC GAA GTA GGG CTG CGC TAC TAC AAG CTG AGC 974
Arg 11» Glu Asp Glu 11« Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu s«r
205 210 215
CTT TTG GAA GAG ATT CCA CGT ATC AAC CGT GAT GTG GCT GTT GAG crr 1022
Leu Leu Glu Glu íle Pro Arg íle Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu
220 225 230
CGT CAG CGT TTC GGC GAG GAT GTT CCT TTG AAG CCC GTG GTC AAC CCA 1070
Arg Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Pro Leu Lys Pro Val Val Lys Pro
235 240 245 250
GGT TCC TGG ATT GGT GGA GAC CAC GAC GGT AAC CCT TAT GTC ACC GCG ma
Gly Ser Trp íle Gly Gly Asp HĹS ASp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala
2S5 280 265
GAA ÄCA GTT GAG TAT TCC ACT CAC CGC GCT GCG GAA ACC GTG CTC AAG 1166
Glu Thr val Glu Tyr Ser Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys
270 275 230
TAC TAT GCA CGC CAG CTG CAT TCC CTC GAG CAT GAG CTC AGC CTG TCG 1214
Tyr Tyr Ala Arg Gin Leu His Ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser
285 290 295
GAC CGC ATG AAT AAG GTC ACC CCG CAG CTG CTT GCG CTG GCA GAT GCC 1262
Asp Arg Met Asn Lys val Thr Pro Gin Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ala
300 305 310
GGG CAC AAC GAC GTG CCA AGC CGC GTG GAT GAG CCT TAT CGA CGC GCC 1310
Gly His Asn Asp Val Pro Ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala
315 320 325 330
GTC CAT GGC GTT CGC GGA CGT ATC CTC GCG ACG ACG GCC GAG CTG ATC 135a
Val His Gly Val Arg Gly Arg íle Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu íle
33S 340 345
GGC GAG GAC GCC GTT GAG GGC GTG TGG TTC AAG GTC TTT ACT CCA TAC 1406
Gly Glu Ä3p Ala Val Glu Gly Val Trp Phe Lys Val Phe Thr Pro Tyf
350 355 360
GCA TCT CCG GAA GAA TTC TTA AAC GAT GCG TTG ACC ATT GAT CAT TCT 1454
Ala Ser ?ro Glu Glu Phe Leu Asn Asp Ala Leu Thr íle Asp HiJ Ser
365 370 375
CTG CGT GAA TCC AAT GAC GTT CTC ATT GCC GAT GAT CGT TTG TCT GTG 1502'
Leu Arg Glu Ser Asn Asp Val Leu íle Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val
380 385 390
CTG ATT TCT GCC ATC GAG ACC TTT CGA TTC AAC CTT TAC GCA CTG GAT 1550
Leu ne Ser Ala íle Glu ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp
395 400 405 410
CTG CGC CAA AAC TCC GAA AGC TAC GAG GAC GTC CTC ACC GAG CTT TTC 1593
Leu Arg Gin Asn Sex Glu Ser Tyr Glu Aso Val Leu Thr Glu Leu Phe
415 42*0 425
GAA CGC GCC CAA GTC ACC GCA AAC TAC CGC GAG CTG TCT GAA GCA GAG 1646
Glu Arg Ala Gin Val Thr Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu
430 4 35 440
AAG CTT GAG GTG CTG CTG AAG GAA CTG CGC AGC CCT CGT CCG CTG ATC 1694
Lys Leu Glu Val Leu Leu Lys Glu Leu Arg Ser Pro Arg Pro Leu íle
445 4 50 455
CCG CAC GGT TCA GAT GAA TAC AGC GAC- GTC ACC GAC CGC GAG CTC GGC 1742
Pro HIS Gly ser ASp Glu Tyr Ser Glu val Thr Asp Arg Glu Leu Gly
460 465 470
ATC TTC CGC ACC GCG TCG GAG GCT GTT AAG AAA TTC GGG CCA CCG ATG 1790
11« Phe Arg Thr Ala Ser Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pre Arg Met
475 480 485 490
GTG CCT CAC TGC ATC ATC TCC ATG GCA TCA TCG GTC ACC GAT GTG CTC 1838
Val Pro His Cys íle íle Ser Met Ala Ser Ser Val Thr Asp Val Leu
495 500 505
GAG CCG ATG GTA TTG CTC AAG GAA TTC GGC CTC ATT GCA GCC AAC GGC 1886
Glu Pro Met Val Leu Leu Lys Glu Phe Gly Leu íle Ala Ala Asn Gly
510 515 520
GAC AAC CCA CGC GGC ACC GTC GAT GTC ATC CCA CTG ttc GAA ACC ATC 1934
Asp Asn Pro Arg Gly Thr Val Asp Val íle Pro Leu Phe Glu Thr íle
525 530 535
GAA GAT CTC CAG GCC GGC GCC GGA ATC CTC GAC GAA CTG TGG AAA ATT 1982
Glu Asp Leu Gin Ala Gly Ala Gly íle Leu Asp Glu Leu Trp Lys íle
'540 545 550
GAT CTT TAC CGC AAC TAC CTC CTG CAG CGC GAC AAC GTC CAG GAA GTC 2030
Asp Leu Tyr Arg Asn Tyr Leu Leu Gla Arg ASp Asn Val Gin Glu Víl
555 560 565 570
ATG CTC GGT TAC TCC GAT TCC AAC AAG GAT GGC GGA TAT TTC TCC GCA 2078
Met Leu Gly Tyr Ser Asp Ser Asn Lys Asp «y Gly Tyr Phe Ser Ala
575 580 585
AAC TGG GCG CTT TAC GAC GCG GAA CTG CAG CTC GTC GAA CTA TGC CGA 2126
Asn Trp Ala I.eu Tyr Asp Ala Glu Leu Gin Leu Val Glu Leu Cys Axg
590 595 600
TCA GCC GGG GTC AAG CTT CGC CTG TTC CAC GGC CGT GGT GGC ACC GTC 2174
Ser Ala Gly Val Lys Leu Axg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val
605 610 615
GGC CGC GGT GGC GGA CCT TCC TAC GAC GCG ATT CTT GCC CAG CCC ACG 2222
Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ser Tyr Asp Ala íle Leu Ala Gin Pro Arg
620 625 630
GGG GCT GTC CAA GGT TCC GTG CGC ATC ACC GAG CAG GGC GAG ATC ATC 2270
Gly Ala Val Gin Gly S»r Val Arg íle Thr Glu Gin Gly Glu íle íle
635 640 64 5 650
TCC GCT AAG TAC GGC AAC CCC GAA ACC GCG CGC CGA AAC CTC GAA GCT 2318
Ser Ala Lys Tyr Gly Asn Pro Glu Thr Ala Arg Arg Asn Leu Glu Ala
655 660 665
CTG GTC TCA GCA ACG CTT GAG GCA TCG CTT CTC GAC GTC TCC GAA CTC 2366
Leu Val Ser Ala Thr Leu Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val Ser Glu Leu
670 675 680
ACC GAT CAC CAA CGC GCG TAC GAC ATC ATG AGT GAG ATC TCT GAG CTC 2414
Thr Asp His Gin Arg Ala Tyr Asp rie Met Ser Glu íle Ser Glu Leu
685 690 695
AGC TTG AAG AAG TAC GCC TCC TTG GTG CAC GAG GAT CAA GGC TTC ATC 2462
Ser Leu Lys Lys Tyr Ala Ser Leu val H1S Glu Asp Gin Gly Phe íle
700 705 710
GA? TAC TTC ACC CAG TCC ACG CCG CTG CAG GAG ATT GGA TCC CTC AAC
Asp Tyr Phe Thr Gin Ser Thr Pro Leu Gin Clu íle Gly ser Leu Asn
715 720 725 730
ATC GGA TCC AGG CCT TCC TCA CGC AAG CAG ACC TCC TCG GTG GAA GAT
íle Gly Sex Arg Pre Ser Ser Arg Lys Clft 'hr Ser Sex Val Glu Asp
735 740 745
TTG CGA GCA ATC CCG TGG GTG CTC AGT TGG TCC CAG TC7 CGT GTC ATG
Leu Arg Ala íle Pro Trp Val Leu Ser Trs Ser Gin Ser --—9 Val Met
750 755 60
CTG CCG GGC TGG TTT GGT GTC GGC ACC GCA CTT GAG CAA TGG ATT GGC
Leu Pro Gly Trp Ph« Gly Val Gly Thr Ala Leu Glu Gin Trp íle Gly
765 770 775
GAA GGG GAG CAG GCC ACC CAG CGC ATT GCC GAG CTA CAA ACA CTC AAC
GLu Gly Glu Gin Ala Thr Gin Arg Íle Ala Glu Leu Gin Thr Leu Asn
?ac 785 79C
GAG TCC TGG CCA TTT TTC ACC TCA GTG TTG GAT AAC ATG GCT CAG GTG
Glu Ser Trp Pro Phe Phe Thr ser Val Leu ASp Asn Mat Ala Gin Val
795 600 805 810
ATG TCC AAG GCA GAG CTG CGT TTG GCA AAG CTC TAC GCA GAC CTG ATC
Met; Ser Lys Ala G1U Leu Arg L»U Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu íle
815 B2D 925
CCA GAT AGG GAA GTA GCT GAG CGC GTT TAT GCC GTC ATC CGC GAG GAA
Pro Asp Axg Glu Val Ala Glu Arg Val Tyr Ala val íle Arg Glu Glu
830 835 Θ4 C
TAC TTC CTG ACC AAG AAG ATG TTC TGC GTA ATC ACC GGT TCT GAT C-AT
Tyr Phe Leu Thr Lys Lys Met Ph· Cys Val 11« Thr Gly Ser Asp Asp
B45 850 355
CTG CTT GAT GAC AAC CCG CTT CTC GCA CGA TCC GTC CAG CGC CGA TAC
Leu Leu Asp ASp Asn Pro Leu Leu Ala Arg Ser Val Gin Arg Arg Tyr
860 865 870
CCC TAC CTG CTT CCA CTC AAC GTG ATC CAG GTA GAG ATG ATG CGA CGC
Pro Tyr Leu Leu Pro Leu Asn Val lle Gin Val Glu Met Met Arg Arg
8?5 880 88$ 890
TAC CGA AAA GGC GAC CAA AGC GAG CAA GTA TCC CGC AAC ATC CAG CTG
Tyr Arg Lys Gly ASp Gin Ser G1U Gin Val ser Arg Asn íle Gin Leu
895 900 905
ACC ATG AAC GGT CTT TCC ACT GCA CTG CGC AAC TCT GGC TAGTCCTGCT
Thr «e t Asn Gly Leu Ser Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly
910 915
GGGTAGGTAG TACTCGTGTA TACTGTCTAA AGTTAT7CGA ÄATCAGGTGG GAATAAGGTT CACCTGGGTT CTCAAACGGC AAAGGÄACAT TTTCCACATG C-CATTGACGC TTCAAATCAT CCTCGTCGTC GCCAGCCTGC TCATGACGGT TTTCGTCTTG CTGCACAAGG GCAAAGGCGG CGGACTCTCC ŕÄCCTCTTCG GTGGCGGTGT GCAGTCCAAT CTTTCGGGCT CCACTGTTGT TGAAAAGAAC CTGGATCGCG TCACCATTTT GGTTC-CCGTT MCTSGATTG TGTGCATŤST CGCACTCAAC CTCATCCAGA CTTATTCATA AGACACGAGC TTAAAAAGAG CGGTTCCCTT TTCATAGGGG AGCCGCTTTT TTGGGTTTTG TCGACC'GTT GTCTCCCCAC TGTTCCTC5G TGTGCACTTT CGACACCAAG ATTTCC
2510
2558
2606
2654
2702
2750
2798
284 6
2894
2942
2990
3038
3087
3147
3207
3267
3327
3387
3447
350?
3533 (2) Informácie pre SEQ ID č. 16:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 919 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 16:
Tyr Ser Glu Val Thr Asp Arg Glu Leu Gly íle Phe Arg Thr Ala Ser
465 470 47$ 4 60
Glu Ala Val Lys Lys Phe Gly Pro Arg Met Val pro His Cys íle íle
465 490 495
Ser Met Ala Ser Ser val Thr Asp Val Leu Glu Pro Met Val Leu Leu
500 505 510
Lys Glu Phe Gly Leu íle Ala Ala Asn Gly Asp Asn Pro Arg Gly Thr
S15 $20 525
Val Asp Val íle Pro Leu Phe Glu Thr íle Glu Asp Leu Gin Ala Gly
530 535 540
Ala Gly íle Leu Asp Glu Leu Trp Lys íle Asp Leu Tyr Arg ?_sn Tyr
545 550 555 560
Leu Leu Gin Arg Asp Asn Val Gin G1U Val Met Leu Gly Tyr Ser Asp
565 570 575
Ser Asn Lys Asp Gly Gly Tyr Phe Ser Ala Asn Trp Ala Leu Tyr Asp
580 585 590
Ala Glu Leu Gin Leu Val Glu Leu Cys Arg Ser Ala Gly Val Lys Leu
595 600 605
Arg Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly Gly Pro
610 615 620
Ser Tyr Asp Ala íle Leu Ala Gin Pro Arg Gly Ala Val Gin Gly Ser
625 630 635 640
Val Arg íle Thr Glu Gin Gly Glu íle íle Ser Ala Lys Tyr Gly Asn
645 650 655
Pro Glu Thx Ala Arg Axg Asn Leu Glu Ala Leu val Ser Ala Thr Leu
660 665 670
Glu Ala Ser Leu Leu Asp Val ser G1U Leu Thr Asp His Gin Arg Ala
67S 680 685
Tyr Asp íle Met Ser Glu íle Ser G1U Leu Ser Leu Lys Lys Tyr Ala
690 695 700
Ser Leu Val His Glu Asp Gin Gly Phe íle Asp Tyr Phe Thr Gin Ser
705 710 715 720
Thr Pro Leu Gin Glu íle Gly Ser Leu Asn íle Gly Ser Arg Pro Ser
725 730 735
Ser Arg Lys Gin Thr Ser Sec val Glu Asp Leu Arg Ala íle Pro Trp
740 745 750
Val Leu Ser Trp Ser Gin Ser Arg Val Met Leu Pro Gly Trp Phe Gly
755 7 60 765
val Gly Thr Ala Leu Glu Gin Trp íle Gly Glu Gly Glu Gin Ala Thr
770 775 780
Gin Arg íle Ala Glu Leu Gin Thr Leu Asn Glu Ser Trp Pro Phe Phe
785 790 795 800
Thr Ser Val Leu ASp Asn Met Ala Gin Val Met Ser Lys Ala Glu Leu
805 810 815
Arg Leu Ala Lys Leu Tyr Ala Asp Leu íle Pro ASp Arg Glu Val Ala
820 825 830
Glu Arg Val Tyr Ala Val íle Arg Glu Glu Tyr Phe Leu Thr Lys Lys
835 840 845
Met Phe Cys Val íle Thr Gly Ser Asp Asp Leu Leu Asp Asp Asn Pro
850 855 860
Leu Leu Ala Arg Ser val Gin Arg Arg Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Leu
865 870 875 880
Asn val íle Gin Val Glu Met Met Arg Arg Tyr Arg Lys Gly Asp Gin
88S 8 90 895
Ser Glu Gin Val Ser Arg Asn íle Gin Leu Thr Met Asn Gly Leu Ser
900 905 910
Thr Ala Leu Arg Asn Ser Gly
915
Met Thr Asp Phe 1 Leu 5 Arg Asp Asp íle Arg Fhe Leu 10 Gly Gin íle 15 Leu
Gly Glu Val íle Ala Glu Gin Glu Gly Gin Glu val Tyr Glu Leu Val
20 25 30
Glu Gin Ala Arg Leu Thr Ser Phe Asp íle Ala Lys Gly Asn Ala Glu
35 40 45
Met Asp Ser Leu Val Gin val Phe Asp Gly íle Thr Pro Ala Lys Ala
50 55 £0
Thr Pro íle Ala Arg Ala Phe Ser His Phe Ala Leu Leu Ala Asn Leu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Leu Tyr Asp Glu Glu Leu Arg Glu Gin Ala Lau Asp Ala
55 90 95
Gly Asp Thr Pro Pro Asp Ser Thr Leu Asp Ala Thr Trp Leu Lys Leu
100 105 110
Asn Glu Gly Asn val Gly Ala GLu Ala val Ala Asp Val Leu Arg Asn
115 120 125
Ala Glu Val Ala Pro Val Leu Thr Ala Kís Pro Thr Glu Thr Arg Arg
13C 135 140
Arg Thr Val Phe Asp Ala Gin Lys Trp Tie Thr Thr His Met Arg Glu
145 150 155 160
Arg HiS Ala Leu Gin Ser Aia Glu Pro Thr Ala Arg Thr Gin Ser Lys
165 170 175
Leu Asp Glu íle Glu Lys Asn íle Arg Axg Arg íle Thr íle Leu Trp
180 185 190
Gin Thr ALa Leu íle Arg Val Ala Arg Pro Axg íle G1U Asp Glu íle
195 200 205
Glu Val Gly Leu Arg Tyr Tyr Lys Leu Ser Leu Leu G1U G1U íle Pro
210 215 220
Arg íle Asn Arg Asp Val Ala Val Glu Leu Arg Glu Arg Phe GLy GLu
225 230 235 240
Asp VaL Pro Leu Lys Pro val Val Lys Pro Gly Ser Trp íle Gly Gly
245 250 255
Asp His Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Ala Glu Thr Val Glu Tyr Ser
250 265 270
Thr His Arg Ala Ala Glu Thr Val Leu Lys Tyr Tyr Ala Arg GLn Leu
275 260 265
His ser Leu Glu His Glu Leu Ser Leu Ser Asp Arg Met Asn Lys VaL
290 295 300
Thr Pro Gin Leu Leu. Ala Leu Ala Asp Ala Gly His Asn Asp Val Pro
305 310 31S 320
ser Arg Val Asp Glu Pro Tyr Arg Arg Ala Val His Gly Val Arg Gly
325 330 335
Arg íle Leu Ala Thr Thr Ala Glu Leu íle Gly Glu Asp Ala Val Glu
34C 345 350
Gly Val Trp Phe Lys val Phe Thr Pro Tyr Ala Ser Pro Glu Glu Phe
355 360 365
Leu Asn Asp Ala Leu Thr 116 Asp KĹS Ser Leu Axg G1U Ser Asn Asp
370 375 380
Val Leu íle Ala Asp Asp Arg Leu Ser Val Leu íle Ser Ala íle Glu
305 390 395 400.
ser Phe Gly Phe Asn Leu Tyr Ala Leu Asp Leu Arg Gin Asn Ser Glu
4 05 410 415
Ser Tyr Glu Asp Val Leu Thr Glu Lea Phe GLu Arg Ala Gin val Thr
420 425 430
Ala Asn Tyr Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Lys Leu Glu Val Leu Leu
4 3S 4 4 0 445
lya Glu Leu Arg ser Pro Arg Pro Leu íle Pro His Gly Ser Asp Glu
4 50 455 460
(2) Informácie pre SEQ ID č. 17:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 17:
CGCGAGGTAC CACCTGTCAC 20 (2) Informácie pre SEQ ID č. 18:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 18:
CAATCCAGGT ACCGGCAACC 20 (2) Informácie pre SEQ ID č. 19:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 19:
CGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 20:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 20: CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 21:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 21: GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 22:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 22: GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23 (2) Informácie pre SEQ ID č. 23:
(1) Charakteristiky sekvencie:
(A) DÍžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: nie (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 23:
CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 (2) Informácie pre SEQ ID č. 24:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 20 báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vláken: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Molekulový typ: iná nukleová kyselina (A) Označenie: /dese = „syntetická DNA“ (iv) Anti-orientácia: áno (xi) Opis sekvencie: SEQ ID č. 24: TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20

Claims (6)

1. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, obsahujúca DNA sekvenciu, kódujúcu aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzinom a L-treonínom desenzibilizovaná, DNA sekvenciu, kódujúcu diaminopimelátdekarboxylázu a DNA sekvenciu, kódujúcu fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
2. Rekombinantná DNA podľa nároku I, kde uvedenou aspartátkinázou, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom desenzibilizovaná, je aspartátkináza, pochádzajúca z baktérií typu Corynebacterium, a že uvedenou aspartátkinázou je mutovaná aspartátkináza, v ktorej sa aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 279-temu alanínovému zvyšku pri počítaní od N-konca, v aminokyselinovej sekvencii, uvedenej v SEQ ID č. 5, zmení na aminokyselinový zvyšok iný než alanínový a iný než kyslej aminokyseliny v jej α-podjednotke, a aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 30-temu alaninovému zvyšku pri počítaní od N-konca, v aminokyselinovej sekvencii, uvedenej v SEQ ID č. 7, sa zmení na aminokyselinový zvyšok iný než alanínový a iný než kyslej aminokyseliny v jej /3-podjednotke.
3. Rekombinantná DNA podľa nároku 1, kde uvedený kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu kóduje aminokyselinovú sekvenciu, uvedenú v SEQ ID č. 12.
4. Koryneformná baktéria, obsahujúca aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom desenzibilizovaná, a obsahuje zosilnený kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu a zosilnený kód DNA sekvencie pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.
5. Koryneformná baktéria podľa nároku 4, transformovaná zavedením rekombinantnej DNA, podľa nároku 1.
6. Spôsob výroby L-lyzínu, vyznačujúci sa t ý m , že zahrnuje kroky kultivácie koryneformnej baktérie, podľa nároku 4, vo vhodnom médiu, aby sa L-lyzín mohol produkovať a hromadiť v kultúre uvedenej baktérie, a odohrania L-lyzínu z tejto kultúry.
SK1635-97A 1996-12-05 1997-12-03 Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu SK285146B6 (sk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32565896A JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 1996-12-05 Ｌ−リジンの製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK163597A3 SK163597A3 (en) 1998-07-08
SK285146B6 true SK285146B6 (sk) 2006-07-07

Family

ID=18179283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1635-97A SK285146B6 (sk) 1996-12-05 1997-12-03 Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6221636B1 (sk)
EP (1) EP0857784B1 (sk)
JP (1) JP4075087B2 (sk)
CN (1) CN1161470C (sk)
BR (1) BRPI9706058B1 (sk)
DE (1) DE69736699T2 (sk)
DK (1) DK0857784T3 (sk)
ES (1) ES2273356T3 (sk)
HU (1) HU224409B1 (sk)
PL (1) PL190206B1 (sk)
SK (1) SK285146B6 (sk)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
JP2003135066A (ja) * 1999-03-19 2003-05-13 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
AU3194300A (en) * 1999-03-19 2000-10-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acid
RU2250266C2 (ru) * 1999-04-09 2005-04-20 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения l-аминокислоты
US20030049804A1 (en) 1999-06-25 2003-03-13 Markus Pompejus Corynebacterium glutamicum genes encoding metabolic pathway proteins
AU4720999A (en) * 1999-06-29 2001-01-31 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
US6599732B1 (en) 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
AU781091B2 (en) 1999-07-02 2005-05-05 Ajinomoto Co., Inc. DNA encoding sucrose PTS enzyme II
JP2003180348A (ja) * 1999-07-02 2003-07-02 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003169674A (ja) * 1999-07-02 2003-06-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP2003180355A (ja) * 1999-07-02 2003-07-02 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003144161A (ja) * 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2003144160A (ja) * 1999-07-02 2003-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
TWI289604B (en) 1999-10-04 2007-11-11 Ajinomoto Kk neform bacteria Genes for a heat resistant enzymes of amino acid biosynthetic pathway derived from thermophilic cory
WO2001048146A1 (fr) * 1999-12-24 2001-07-05 Ajinomoto Co., Inc. Procede de production d'acide l-amine et nouveau gene
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
DE60045191D1 (de) * 2000-03-09 2010-12-16 Evonik Degussa Gmbh Corynebacterium glutamicum gene, die für stoffwechselproteine kodieren
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US7368266B2 (en) 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
US20050255568A1 (en) * 2003-05-30 2005-11-17 Bailey Richard B Methods and compositions for amino acid production
DE102005032429A1 (de) 2005-01-19 2006-07-20 Degussa Ag Allele des mqo-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP1881076A1 (en) * 2006-07-17 2008-01-23 Evonik Degussa GmbH Method for producing L-amino acids
WO2008033001A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Cj Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
KR100838035B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100838038B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
KR100830826B1 (ko) * 2007-01-24 2008-05-19 씨제이제일제당 (주) 코리네박테리아를 이용하여 글리세롤을 포함한탄소원으로부터 발효산물을 생산하는 방법
JP2010226956A (ja) * 2007-07-23 2010-10-14 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JP5526785B2 (ja) 2008-01-23 2014-06-18 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
KR100930203B1 (ko) 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR100987281B1 (ko) 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
KR101126041B1 (ko) * 2008-04-10 2012-03-19 씨제이제일제당 (주) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
JP2010142200A (ja) 2008-12-22 2010-07-01 Ajinomoto Co Inc Ｌ−リジンの製造法
JPWO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2013-01-10 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2012196144A (ja) 2009-08-03 2012-10-18 Ajinomoto Co Inc ビブリオ属細菌を用いたｌ−リジンの製造法
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR101226384B1 (ko) * 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
EP2582815B1 (en) * 2010-06-15 2016-08-10 Daesang Corp. Production process for amino acids of the aspartate family using microorganisms
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
EP2796555B1 (en) 2011-12-21 2018-08-29 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
PL2700715T3 (pl) 2012-08-20 2019-03-29 Evonik Degussa Gmbh Sposób fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów z zastosowaniem ulepszonych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae
DE102014208199A1 (de) 2014-04-30 2015-11-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
ES2778037T3 (es) 2014-04-30 2020-08-07 Evonik Operations Gmbh Procedimiento para la producción de L-aminoácidos bajo empleo de una bacteria alcalífila
EP2940039A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems
WO2017089077A1 (en) 2015-11-27 2017-06-01 Evonik Degussa Gmbh Method for producing l-methionine
EP3533875B1 (en) 2016-09-01 2023-02-15 Ningxia Eppen Biotech Co. Ltd Corynebacterium for producing l-lysine by fermentation
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
EP3847270A1 (en) * 2018-09-07 2021-07-14 Archer Daniels Midland Company Engineered strains of corynebacteria
CN110804602B (zh) * 2019-11-18 2021-01-29 江南大学 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN114292315A (zh) * 2021-12-31 2022-04-08 宁夏伊品生物科技股份有限公司 ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4861722A (en) * 1983-08-24 1989-08-29 Ajinomoto Company, Inc. Coryneform bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-lysine
JPH0746994B2 (ja) * 1984-10-04 1995-05-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法
GB2223754B (en) 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
DE3908201A1 (de) 1989-03-14 1990-09-27 Degussa Verfahren zur fermentativen herstellung von l-lysin
JP3473042B2 (ja) * 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
JPH07155184A (ja) * 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
ZA964665B (en) * 1995-06-07 1997-01-07 Ajinomoto Kk Method of producing l-lysine
EP0756007A3 (en) * 1995-06-30 1997-10-29 Ajinomoto Kk Gene-marking process with artificial transposon
SK285201B6 (sk) 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
DE10031999A1 (de) 1999-09-09 2001-04-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE19943587A1 (de) 1999-09-11 2001-03-15 Degussa Neue für das dapF-Gen codierende Nukleotidsequenzen

Also Published As

Publication number Publication date
EP0857784A3 (en) 2002-10-16
JPH10165180A (ja) 1998-06-23
HUP9702361A3 (en) 2002-12-28
JP4075087B2 (ja) 2008-04-16
PL323545A1 (en) 1998-06-08
HU224409B1 (hu) 2005-08-29
US6221636B1 (en) 2001-04-24
DK0857784T3 (da) 2007-01-15
EP0857784A2 (en) 1998-08-12
ES2273356T3 (es) 2007-05-01
DE69736699T2 (de) 2007-09-20
HU9702361D0 (en) 1998-03-02
CN1187539A (zh) 1998-07-15
BRPI9706058B1 (pt) 2015-11-03
SK163597A3 (en) 1998-07-08
DE69736699D1 (de) 2006-11-02
EP0857784B1 (en) 2006-09-20
PL190206B1 (pl) 2005-11-30
CN1161470C (zh) 2004-08-11
HUP9702361A2 (hu) 1999-06-28
BR9706058A (pt) 1999-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285146B6 (sk) Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu
EP0841395B1 (en) Method of producing l-lysine
EP0854189B1 (en) Method for producing L-lysine
EP0811682B2 (en) Method of producing L-lysine
JP4168463B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
JPH0970291A (ja) 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20171203