KR20100120663A - Ｌ-아미노산의 제조법 - Google Patents

Abstract

L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 미세조류의 배양물의 파쇄물, 당해 미세조류가 생산하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물 등의, 당해 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는 당해 미세조류의 처리물을 포함하는 배지, 특히, 전분의 당화물, 또는 유지의 가수분해물을 당 처리물로서 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취함으로써, L-아미노산을 제조한다.

Description

Ｌ-아미노산의 제조법{Method of producing L-amino acid}

본 발명은, 미생물을 사용한 L-아미노산의 제조법에 관한 것이다. L-아미노산은, 조미료, 식품 첨가물, 사료 첨가물, 화학 제품, 의약품 등의 여러 가지 분야에 이용된다.

L-트레오닌, L-리신 등의 L-아미노산은, 이들 L-아미노산 생산능을 갖는 에스케리키아속 세균 등의 L-아미노산 생산균을 사용하여 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 이러한 L-아미노산 생산균으로서는, 자연계로부터 분리된 균주 또는 당해 균주의 인공 변이주, 유전자 재조합에 의해 L-아미노산 생합성 효소가 증강된 재조합체 등이 사용되고 있다. L-트레오닌의 제조법으로서는, 예를 들면, 특허 문헌 1 내지 4에 기재된 방법을 들 수 있다. 한편, L-리신의 제조법으로서는, 예를 들면, 특허 문헌 5 내지 8에 기재된 방법을 들 수 있다.

발효법에 의한 L-아미노산의 공업 생산에 있어서는, 탄소원으로서 당류, 즉, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 폐당밀, 전분가수분해물 등이 사용되고 있다. L-아미노산의 발효 제조법에 탄소원으로서, 자주 사용되는 것은 옥수수나 카사바 등의 고등 식물에 유래하는 전부의 당화물이다. 이들은 수분 함량이 낮고 전분 함량이 높은 점에서 공업적으로 전분을 수득하는 것이 용이하다. 이것에 대해, 미세조류에 포함되는 전분은, 건조 중량당으로는, 옥수수나 카사바에 필적하는 함량이지만, 조류의 배양액당의 건조 조(藻)체 중량은, 1%에 미치지 않는다. 조체를 분리하고, 탈수를 하고, 세포를 파쇄하여 전분을 취출하고, 다시 정제하는 공정은 번잡하고 곤란하다. 특허 문헌 9 내지 10 또는 비특허 문헌 1에는, 미세조류의 전분을 사용하여 에탄올 발효를 실시하는 것이 기재되어 있지만, 에탄올 발효의 결과는 나타나 있지 않다. 또한, 미세조류의 전분을 당화하여 아미노산 생산에 사용한 예는 지금까지 나타나 있지 않다.

대표적인 아미노산 생산균인 에스케리키아 콜라이는, 글리세롤을 유일한 탄소원으로 하여 생육하는 것이 가능한 것(비특허 문헌 2), 및, 탄소쇄 12 이상의 장쇄 지방산을 유일한 탄소원으로 하여 생육 가능한 것(비특허 문헌 3)이 알려져 있다. 따라서, 에스케리키아 콜라이는 유지의 가수분해물인 장쇄 지방산과 글리세롤을 모두 자화가 가능하지만, 리파제 활성을 갖고 있지 않으며, 유지를 직접 자화할 수는 없는 것이 비특허 문헌 4에 기재되어 있다. 또한, 일반적으로 장쇄 지방산의 용해도는 매우 낮은 것이 알려져 있으며, 비특허 문헌 5에는, 용해도는, 라우르산은 0.1g/L 이상이지만, 올레산은 0.0003g/L 이하, 팔미트산은, 0.00000003g/L 이하라는 측정 결과가 기재되어 있다. 따라서, 수용성이 높은 글리세롤과 지방산을 동시에 자화시키는 것은 곤란하며, 장쇄 지방산과 글리세롤의 혼합물인 유지의 가수분해물을 탄소원으로서 사용한 직접 발효법에 의한 L-아미노산의 생산에 관해서는, 지금까지 보고가 없다.

일반적으로 식용 유지로서 사용되는 유량(油糧) 식물인 대두의 종자나 오일팜(oil palm)의 과실은 20% 정도의 유지를 포함하고 있다. 이것에 대해, 비특허 문헌 6에 보고되어 있는 바와 같이, 미세조류는 유지를 생산하는 것이 알려져 있으며, 면적당의 유지의 수량은 유량 식물을 크게 상회한다. 그러나, 전분과 같이 조체 분리, 탈수, 세포 파쇄, 추가의 정제의 공정은 번잡하고 곤란하다. 따라서, 조류 유래의 유지를 탄소원으로서 사용한 직접 발효법에 의한 L-아미노산의 생산에 관해서도, 지금까지 보고는 없다.

특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 제(평)5-304969호

특허 문헌 2: 국제공개 제98/04715호 팜플렛

특허 문헌 3: 일본 공개특허공보 제(평)05-227977호

특허 문헌 4: 미국특허출원공개 제2002/0110876호 명세서

특허 문헌 5: 일본 공개특허공보 제(평)10-165180호

특허 문헌 6: 일본 공개특허공보 제(평)11-192088호

특허 문헌 7: 일본 공개특허공보 2000-253879호

특허 문헌 8: 일본 공개특허공보 2001-057896호

특허 문헌 9: 미국특허출원공개 제2006/135308호 명세서

특허 문헌 10: 미국특허출원공개 제2007/0202582호 명세서

비특허 문헌 1: Matsumoto, M. et al. 2003. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108: 247-254

비특허 문헌 2: Lin, E. C. C. 1996. p.307-342. In F. D. Neidhardt(ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, Armrican Society for Microbiology Press, Washington, D .C.

비특허 문헌 3: Clark, D. P. and Cronan Jr., J. E. 1996. p.343-357. In F. D. Neidhardt(ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biobgy/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.

비특허 문헌 4: Brenner, D. J. and Farmer III, J. J. Family I. 2005. p.587-669. In: D. J Brenner, N. R. Krieg and J. T. Staley, Editors, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume Two: The Proteobacteria Part B: The Gammaproteobacteria, Springer New York

비특허 문헌 5: Vorum, H. et al. 1992. Biochimica et Biophysica Acta, 1126: 135-142.

비특허 문헌 6: Chisti Y. 2007. Biotechnol. Adv. 25: 294-306.

본 발명은, 보다 효율이 양호한 L-아미노산의 제조법을 제공하는 것이며, 특히는, 종래, 주로 고등 식물 유래의 당류를 탄소원으로 하여 실시되어 온 미생물을 사용한 L-아미노산의 발효 제조법에 대해서, 미세조류 유래의 탄소원을 사용함으로써, 보다 염가의 L-아미노산의 제조법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 실시한 결과, L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 미세조류로부터 수득한 전분을 효소에 의해 가수분해 처리하여 수득된 당화물, 또는, 미세조류의 조체 파쇄물, 또는 유지를 포함하는 그 추출물 또는 당해 추출물의 분획물을 가수분해하여 수득되는 가수분해물을 완전히 정제하지 않고 탄소원으로 하는 배지에서 배양함으로써, 효율적으로 L-아미노산을 생산할 수 있는 것을 밝혀내었다. 이 지견에 기초하여 본 발명은 완성되었다.

본 발명의 방법은, L-아미노산 생산능을 갖는 세균을, 미세조류의 처리물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법으로서, 당해 처리물이, 상기 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는 것인, L-아미노산의 제조법이다. 당해 처리물은, 예를 들면, (1) 당해 미세조류의 배양물의 파쇄물, (2) 당해 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는, (3) 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물이다.

상기 처리물은, 바람직하게는, 전분을 생산하는 미세조류의 조체 파쇄물, 또는 전분을 포함하는 그 추출물 또는 당해 추출물의 분획물을 가수분해하여 수득되는 당화물이다. 상기 당화물은, 바람직하게는, 미세조류의 조체 파쇄물 또는 전분을 포함하는 그 분획물로부터, 아밀라제를 사용한 효소 반응에 의해 수득된 반응 산물이다. 상기 아밀라제는 바람직하게는 글루코아밀라제이다.

또한, 상기 처리물은, 바람직하게는, 유지를 생산하는 미세조류의 조체 파쇄물, 또는 유지를 포함하는 그 추출물 또는 당해 추출물의 분획물을 가수분해하여 수득되는 가수분해물이다. 상기 가수분해물은, 바람직하게는, 미세조류의 조체 파쇄물 또는 유지를 포함하는 그 분획물로부터, 리파제를 사용한 효소 반응에 의해 수득된 반응 산물이다. 상기 가수분해물은, 유화 처리를 실시한 것이라도 양호하다.

상기 파쇄물의 취득법은, 고온 처리, 유기 용매 처리, 자비(煮沸) 처리, 강알칼리 처리로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 방법이다. 고온 처리로서는, 예를 들면, 150℃ 이상의 온도에서 처리하는 것을 들 수 있다.

상기 미세조류는, 바람직하게는, 녹조강, 트레복시조강, 또는 규조강에 속하는 조류이며, 더욱 바람직하게는, 녹조강(Chlorophyceae)에 속하는 조류이다.

상기 세균은, 바람직하게는, 장내세균과에 속하는 세균 또는 코리네형 세균이며, 더욱 바람직하게는, 에스케리키아속에 속하는 세균이다.

상기 L-아미노산은, 예를 들면, L-리신, L-트레오닌, L-글루탐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산이다.

상기 L-아미노산이 L-리신인 경우에는, 상기 세균이 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 디아미노피멜산 데카르복실라제, 디아미노피멜산 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 디아미노피멜산 에피머라제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 및, 석시닐 디아미노피멜산 데아실라제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되고 있고, 및/또는, 리신 데카르복실라제의 활성이 약화되어 있는 것이 바람직하다.

상기 L-아미노산이 L-트레오닌인 경우에는, 상기 세균이 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제, thr 오페론으로 암호화되는 아스파르토키나제 I, 호모세린 키나제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 및, 트레오닌 신타제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있는 것이 바람직하다.

상기 L-아미노산이 L-글루탐산인 경우에는, 상기 세균이 글루타메이트 데하이드로게나제, 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카르복실라제, 및 메틸 시트르산 신타제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있고, 및/또는, α-케토글루타르산 데하이드로게나제의 활성이 약화되어 있는 것이 바람직하다.

상기 배지는 상기 처리물을 탄소원으로서 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은, 또한, L-아미노산의 제조 방법으로서, 이하의 공정을 포함하는 방법도 제공한다.

(a) 미세조류를 배지에서 배양하고, 당해 배양물을, 파쇄, 추출, 분획 및 가수분해로부터 선택되는 1 이상의 방법에 의해 처리하고, L-아미노산 생산능을 갖는 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진하는 당해 미세조류의 처리물을 조제하고,

(b) 당해 세균을, 당해 미세조류의 처리물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고,

(c) 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.

상기 처리물은, 예를 들면, (1) 당해 미세조류의 배양물의 파쇄물, (2) 당해 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는, (3) 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물인 처리물이다.

상기 파쇄의 방법은, 바람직하게는, 고온 처리, 유기 용매 처리, 자비 처리, 강알칼리 처리로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 방법이다.

처리물 조제 공정은, 전분을 생산하는 미세조류를 파쇄 및/또는 추출·분획하고, 그 처리물을 가수분해함으로써 당화하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 당화하는 공정은, 아밀라제를 사용한 효소 반응을 가하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 아밀라제는 바람직하게는 글루코아밀라제이다.

처리물 조제 공정은, 유지를 생산하는 미세조류를 파쇄 및/또는 추출·분획하고, 그 처리물을 가수분해하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 가수분해 공정은, 리파제를 사용한 효소 반응을 실시하는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 가수분해물은 유화 처리를 실시한 것이라도 양호하다.

상기 미세조류는, 바람직하게는, 녹색 식물문, 부등모 식물문에 속하는 조류이며, 더욱 바람직하게는, 상기 미세조류는 녹조강, 트레복시조강, 또는 규조강에 속하는 조류이다. 특히 바람직하게는, 상기 미세조류는, 녹조강(Chlorophyceae)에 속하는 조류이다.

상기 세균은, 바람직하게는, 장내세균과에 속하는 세균 또는 코리네형 세균이며, 더욱 바람직하게는, 에스케리키아 콜라이이다.

본 발명에 의하면, L-아미노산을 보다 효율적으로 제조할 수 있고, 특히 미세조류 유래의 염가의 탄소원을 사용함으로써, 염가로 L-아미노산을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

<1> 본 발명에서 사용하는 미세조류와 그 배양법

본 발명에 있어서의 미세조류(microalgae)는, 어떤 것이라도 사용할 수 있지만, 전분 및/또는 유지를 조체 내에 축적하는 미세조류인 것이 바람직하다.

조류(algae)란, 산소 발생형 광합성을 실시하는 생물 중, 주로 지상에 생식하는 이끼 식물, 양치 식물, 종자 식물을 제외한 것을 모두 가리킨다. 조류에는, 원핵 생물인 사이아노박테리아(남조)(cyanobacteria)로부터, 진핵 생물인 회색 식물문(Glaucophyta), 홍색 식물문(홍조)(Rhodophyta), 녹색 식물문(Chlorophyta), 크립토 식물문(크립토조)(Cryptophyta), 하프토 식물문(하프토조)(Haptophyta), 부등모 식물문(Heterokontophyta), 와편모 식물문(와편모조)(Dinophyta), 유글레나 식물문(Euglenophyta), 클로라라크니온 식물문(Chlorarachniophyta)으로 분류되는 여러 가지 단세포 생물 및 다세포 생물이 포함된다. 미세조류는, 이들 조류로부터 다세포 생물인 조류를 제외한 미시적인 구조를 갖는 조류를 가리킨다[참조: 바이오디버시티 시리즈 (3) 조류의 다양성과 계통: 치하라 미쓰오 편 쇼카보(1999)].

조류를 비롯한 식물은, 전분을 저장 다당으로 하는 경우가 많다[참조: Ball, S. G. and Morell, M. K. 2003. Annual Review of Plant Biology, 54: 207-233]. 전분을 축적하는 조류는 많은 것이 알려져 있으며, 대표적인 조류로서는, 녹색 식물문에 속하는 담녹조강(Prasinophyceae), 녹조강(Chlorophyceae), 트레복시조강(Trebouxiophyceae), 갈파래조강(Ulvophyceae), 윤조강(Charophyceae) 등이 있다. 중에서도, 녹조강(Chlorophyceae) 및 트레복시조강(Trebouxiophyceae)에 속하는 조류는 자주 연구되고 있으며, 녹조강에 속하는 조류로서는 클라미도모나스(Chlamydomonas)속이, 트레복시조강에 속하는 조류로서는 클로렐라(Chlorella)속을 들 수 있다. 구체적으로는, 클라미도모나스속으로서는, 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)[참조: Ball, S. G. 1998. The Molecular Biology of Chloroplasts and Mitochondria in Chlamydomonas, pp.549-567. Rochaix J.-D., Goldschmidt-Clermont M., and Merchant S.(Eds), Kluwer Academic Publishers]를, 클로렐라속으로서는, 클로렐라 케슬레리(Chlorella kessleri, 구칭 Chlorella vulgaris)[참조: Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147]을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 클라미도모나스 레인하드티로서, Chlamydomonas reinhardtii CC125주, 클로렐라 케슬레리로서는, Chlorella kessleri 11h주를 들 수 있다. 이러한 주는, 예를 들면, 텍사스대학 조류 컬처 컬렉션(The University of Texas at Austin, The Culture Collection of Algae(UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA]에, 각각, UTEX 2244과 UTEX 263의 수납 번호로 보존되어 있으며, UTEX로부터 입수할 수 있다. 클로렐라 케슬레리 11h주는, 동경대학 분자세포생물학연구소 IAM 컬처 컬렉션에 있어서 531의 보존 번호로 보존된 후, 독립행정법인 국립환경연구소 미생물계통보존 시설(NIES)로 이관되어 있다. 또한, 동주는, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션[참조: ATCC, P. 0. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America]에 ATCC11468의 수납 번호로 보존되어 있으며, ATCC로부터 분양을 받을 수도 있다.

또한 미세조류에는, 유지를 저장 물질로서 축적하는 것이 있는 것이 알려져 있다[참조: Chisti, Y. 2007. Biotechnol Adv. 25: 294-306]. 이러한 조류로서는, 녹색 식물문이나 부등모 식물문에 속하는 것이, 잘 알려져 있다. 녹색 식물문 중에서는, 녹조강(Chlorophyceae)에 속하는 조류를 들 수 있고, 녹조강에 속하는 조류로서는, 네오클로리스 올레오어번던스(Neochloris oleoabundans)[참조: Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440], 나노클로리스 sp(Nannochloris sp.)[참조: Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117] 등을 들 수 있다. 부등모 식물문에는 황금색조강(Chrysophyceae), 딕티오카조강(Dictyochophyceae), 페랄고조강(Pelagophyceae), 라피도조강(Rhaphidophyceae), 규조강(Bacillariophyceae), 갈조강(Phaeophyceae), 황녹조강(Xanthophyceae), 진안점조강(Eustigmatophyceae)이 분류되지만, 자주 사용되는 규조강에 속하는 조류로서는, 탈라시오시라 슈도나나(Thalassiosira pseudonana)[참조: Tonon, T et al. 2002. Phytochemistry 61: 15-24]을 들 수 있다. 네오클로리스 올레오어번던스로서, 구체적으로는, Neochloris oleoabundans UTEX 1185주, 나노클로리스 sp로서는, Nannochloris sp. UTEX LB 1999주, 탈라시오시라 슈도나나로서는, Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2주를 들 수 있다. 이러한 균주는, 텍사스대학 조류 컬처 컬렉션[참조: The University of Texasat Austin, The Culture Collection of Algae(UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA]로부터 입수할 수 있다.

미세조류의 배양에 관해서는 많은 지견이 있으며, Chlorella속, Arthrospira속(Spirulina), 또는, Dunaliella salina 등은, 식용으로서 대규모의 공업적인 배양이 실시되고 있다[참조: Spolaore, P. et al. 2006. J. Biosci. Bioeng. 101: 87-96]. 클라미도모나스 레인하드티에는, 예를 들면, 0.3×HSM 배지[참조: Oyama, Y. et al. 2006. Planta 224: 646-654]을 사용할 수 있고, 클로렐라 케슬레리에는, 0.2×감보그 배지[참조: Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147] 등을 사용할 수 있다. 네오클로리스 올레오어번던스나 나노클로리스 sp는, 변형된 NORO 배지[참조: Yamaberi, K. et al. 1998. J. Mar. Biotechnol. 6: 44-48; Takagi, M. et al. 2000. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 112-117]나 Bold's Basal Medium[참조: Tornabene, T. G. et al. 1983. Enzyme and Microb. Technol. 5: 435-440; Archibald, P. A. and Bold, H. C. 1970. Phytomorphology 20: 383-389]을 사용하여 배양할 수 있다. 규조강에 속하는 조류로서는, 탈라시오시라 슈도나나에는, F/2 배지[참조: Lie, C. -P. and Lin, L.-P. 2001. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 207-214] 등을 적합하게 사용할 수 있다. 또한 미세조류의 배양에는, 포토바이오 리액터를 사용할 수도 있다[참조: WO2003/094598호 팜플렛].

배양은, 본 배양의 용적에 대해, 1 내지 50% 전배양액을 첨가하여 실시하는 경우가 많다. 초발 pH는 7 내지 9의 중성 부근이 바람직하고, 배양 중에는 pH 조정을 하지 않는 경우가 많지만, 필요에 따라서 하는 경우도 있다. 배양 온도는, 25 내지 35℃가 바람직하고, 특히 28℃ 부근이 일반적으로 자주 사용되는 온도이지만, 배양 온도는, 사용하는 조류에 적합한 온도이면 상관없다. 배양액에는, 공기를 불어 넣는 경우가 많으며, 통기량으로서는, 1분간의 배양액 용적당의 통기량 0.1 내지 2vvm(volume per volume per minute)이 자주 사용된다. 또한 CO₂를 불어 넣는 것도, 생육을 빠르게 하기 위해서 이루어지지만, 통기량에 대해, 0.5 내지 5% 정도 불어 넣는 것이 바람직하다. 빛의 조사 강도도 미세조류의 종류에 따라, 최적이 다르지만, 1,000 내지 10,000lux 정도가 자주 사용된다. 광원은, 옥내에서는 백색의 형광등을 사용하는 것이 일반적이지만, 이것으로 제한되지 않는다. 옥외에서 태양광으로 배양하는 것도 가능하다. 필요에 따라서, 배양액을 적절한 강도로 교반, 또는 순환하는 경우도 있다. 또한, 조류는, 질소원이 고갈되면 유지를 조체 내에 축적하는 것이 알려져 있으며[참조: Thompson GA Jr. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1302: 17-45], 질소원의 농도를 보다 제한한 배지를 본 배양에 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서 미세조류의 배양물이란, 조체를 포함하는 배양액, 배양액으로부터 회수한 조체를 포함한다.

조체를 배양액으로부터 회수하는 방법은, 일반적인 원심분리나 여과, 또는, 응집제(flocculant)를 사용한 중력에 의한 침강 등의 방법으로 가능하다[참조: Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515].

<2> 미세조류의 처리 방법과 미세조류의 처리물

본 발명에 있어서, 미세조류의 처리물이란, 파쇄한 미세조류의 세포에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는 처리물로서, L-아미노산 생산능을 갖는 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는 것을 가리키고, 구체적으로는, (1) 당해 미세조류의 배양물의 파쇄물, (2) 당해 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는, (3) 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물을 들 수 있다.

「L-아미노산의 생산 축적을 촉진시킨다」란, 처리물에 포함되는, 파쇄한 미세조류의 세포에 유래하는 유기물의 혼합물이, 세균의 증식 및 L-아미노산의 제조에 있어서, 균체 성분 및 L-아미노산을 구성하는 탄소의 공급원으로서 실질적으로 기여하는 것을 의미하고, 이러한 기여를 할 수 있는 처리물이면, 본 발명의 「L-아미노산의 생산 축적량이 촉진되는 처리물」에 포함된다.

처리물이 L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는지 여부는, 처리물의 유무 이외에는 동조건으로 당해 세균을 배양하고, 배양물 중에 있어서의 L-아미노산의 생산 축적량을 비교함으로써 확인할 수 있다.

처리물을 첨가하지 않은 배양물 중의 L-아미노산 축적에 비해 향상되고 있으면 어느 것이라도 양호하지만, 바람직하게는 첨가하지 않은 배양물에 비해 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상 L-아미노산 축적이 향상되고 있는 것이 바람직하다.

처리물을 첨가함으로써, 미생물의 생육 속도가 향상되는 것, 배지 중의 미생물의 균체량이 증대하는 것도 본 발명의 「L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는」 것에 포함되고, 생육 속도나 균체량이 첨가되지 않은 배양물에 비해 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상 증대하고 있는 것이 바람직하다.

또한, 처리물이 탄소원을 포함하는 경우에는, 세균의 증식 및 L-아미노산의 제조에 있어서, 균체 성분 및 L-아미노산을 구성하는 탄소의 공급원으로서 실질적으로 기여할 수 있으면, 본 발명의 L-아미노산의 생산 축적량이 촉진되는 처리물에 포함된다.

따라서, 처리물을 첨가하지 않은 조건에 비해, L-아미노산의 생산 축적량이 증대하고 있는 경우도 본 발명의 처리물에 포함되지만, 포함되는 탄소원과 동량의 정제된 물질로 이루어지는 탄소원을 가한 경우에 비해 L-아미노산 생산 축적량이 향상되고 있는 것이 바람직하다.

또한, 정제된 물질로 이루어지는 탄소원을 사용하는 경우에 비해, 탄소원을 정제하는 처리 공정이 단축되어 있는 경우도 L-아미노산 생산 축적이 향상되고 있다고 할 수 있다. 처리 공정의 단축 시간은, 10% 이상, 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상 단축되어 있는 것이 바람직하다.

처리물로서는, 상기의 예 이외에, L-아미노산의 생산 축적의 촉진을 지표로 하여, 파쇄, 추출, 분획, 가수분해, 및, 이들의 임의의 조합에 의해, 목적의 처리물을 수득할 수 있다.

배양물을 파쇄하는 방법은, 조체가 충분히 파쇄되는 방법이면, 어떤 방법이라도 상관없지만, 예를 들면, 고온 처리(예를 들면, 100℃ 이상의 온도(바람직하게는 150℃ 이상, 더욱 바람직하게는 175 내지 215℃)에서의 처리), 유기 용매 처리(예를 들면, 메탄올:클로로포름 혼합 용매에 의한 처리), 자비 처리, 강알칼리 처리, 초음파 처리나 프렌치 프레스 등의 방법 및 이들의 임의의 조합이 적합하게 사용된다. 고온 처리에는, 수열 반응이라고 불리는 조건에서의 고온 고압 반응도 포함된다. 또한, 조체를 건조시킨 후에, 물리적인 방법으로 파쇄하는 것도 가능하다. 파쇄한 조류 유래의 유기물 용액은, 그대로 조추출물로서 사용하는 것 또는, 가수분해 반응에 제공할 수 있지만, 여과나 원심분리 등에 의해, 세포벽 등의 불용물을 제거하거나, 동결 건조 등에 의해 농축시킬 수도 있다. 또한, 어느 정도의 분획을 실시한 전분을 포함하는 용액을 사용해도 양호하다. 조체 파쇄물로부터의 전분의 분획은, 비중의 차이에 기초하며, 예를 들면 현탁액으로부터의 침강 속도 등으로, 단백 획분을 분리 회수할 수 있다. 또한, 조체 파쇄물로부터 유지를 분획할 수도 있다. 조체의 파쇄물, 또는 동파쇄물을 농축한 것에, 예를 들면 80% 메탄올 또는 80% 아세톤을 가하고, 여기에 불용성의 유지를, 헥산이나 클로로포름 등의 용매로 추출함으로써, 조(粗)지용성 획분으로서 유지를 추출할 수 있다.

본 발명의 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물에는, 탄소원으로서 이용할 수 있는 것이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 경우에는, 아미노산 발효를 위한 배지에 별도 추가하는 탄소원을 감소시키거나 없애거나 할 수 있다. 탄소원으로서 이용할 수 있는 것으로서는 전분 및/또는 유지의 가수분해물을 들 수 있다.

본 발명의 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물에, 미세조류가 생산하는 전분이 포함되어 있는 경우에는, 이 당화물을 탄소원으로서 배지에 첨가할 수 있다. 전분의 당화물은, 예를 들면, 미세조류 유래의 유기물 용액 또는 전분을 포함하는 그 분획물로부터, 산가수분해 등의 화학적인 방법이나 아밀라제를 사용한 효소 반응에 의해 수득할 수 있다.

전분은 글루코스가 α-1,4-글루코시드 결합에 의해 직쇄상으로 결합한 아밀로스와 α-1,4-글루코시드 결합과 α-1,6-글루코시드 결합의 양자의 직쇄를 가지에 갖는 아밀로펙틴으로 이루어지는 고분자 다당류이다. 아밀라제(amylase)는, 전분 등의 글루코시드 결합을 가수분해하는 효소의 총칭이다. 작용하는 부위의 차이에 의해, α-아밀라제(α-amylase EC3.2.1.1), β-아밀라제(β-amylase EC3.2.1.2), 및 글루코아밀라제(glucoamylase EC3.2.1.3)로 대별된다. α-아밀라제는 전분이나 글리코겐 등의 α-1,4-글루코시드 결합을 무작위로 절단하는 엔도형의 효소이다. β-아밀라제는 전분의 비환원성 말단으로부터 말토스 단위로 α-1,4-글루코시드 결합을 축차 분해하는 엑소형의 효소이다. 글루코아밀라제(아밀로글루코시다제라고도 불린다)는 전분의 비환원성 말단으로부터 글루코스 단위로 α-1,4-글루코시드 결합을 축차 분해하는 엑소형의 효소로, 아밀로펙틴에 포함되는 α-1,6-결합도 분해한다. 글루코아밀라제는, 전분으로부터 직접 글루코스를 생성하기 때문에, 글루코스의 제조에 널리 사용되고 있으며, 본 발명에 있어서도 바람직한 효소이다.

곡물 유래의 전분의 당화 반응은, 공업적으로도 실시되고 있는 많은 예가 있다[참조: Robertson, G. H. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 353-365]. 이러한 예와 같이 하여, 조체로부터, 효소 반응에 의해 당화물을 수득하는 것이 가능하다. 파쇄한 조체를 포함하는 용액을 효소 처리하는 경우에는, 전처리로서, 자비, 초음파 처리, 알칼리 처리 등을 조합하여 사용하는 것이 바람직하다[참조: Izumo, A. et al. 2007. Plant Science 172: 1138-1147].

효소 반응의 조건은, 사용하는 효소의 성질에 따라서 적절히 설정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 아밀로글루코시다제(시그마-알드리치사 A-9228)에서는, 효소 농도 2 내지 20U/mL, 온도 40 내지 60℃, pH 4 내지 6이 바람직하다. 한편, pH의 조제에 있어서, L-아미노산의 제조에 사용하는 세균이 자화할 수 있는 유기산을 완충액으로서 사용하면, 전분의 당화물과 함께 당해 유기산을 탄소원으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 효소 반응 산물을 그대로 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 미세조류에 의해 생산되는 전분의 당화물이란, 상기한 바와 같이, 전분을 가수분해하여, 세균이 자화 가능한 말토스 또는 글루코스와 같은 올리고당 또는 단당을 생성시킨 것을 말한다. 또한, 미세조류에 의해 생산되는 전분의 당화물은, 전분의 실질적으로 전체가 당화되어 있어도 양호하지만, 일부가 당화된 것이라도 양호하다. 바람직하게는, 전분의 50중량% 이상, 보다 바람직하게는 70중량% 이상, 특히 바람직하게는 90중량% 이상이 글루코스로 변환된 것이 바람직하다. 또한, 미세조류에 의해 생산되는 전분의 당화물은, 미세조류가 생산하는 전분 이외의 탄수화물 또는 그 당화물을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물에, 미세조류가 생산하는 유지가 포함되어 있는 경우는, 이 가수분해물을 탄소원으로 하여 배지에 첨가할 수도 있다. 미세조류의 조체를 열처리 등에 의해 파쇄한 조추출액을 그대로 가수분해하는 것도 가능하지만, 에탄올, 메탄올과 클로로포름의 혼합물, 또는 아세톤 등의 용매에 의해 추출되는 유기물의 혼합 용액을 가수분해할 수도 있다. 이러한 용액은, 그대로 사용할 수 있지만, 동결 건조, 증발 등의 처리에 의해 농축할 수도 있다. 이 용액은, 아미노산 등의 유기 질소원으로서 이용 가능한 성분, 금속류 등의 아미노산 생산능을 갖는 세균의 생육에 유효한 성분을 포함하고 있으며, 탄소원으로서가 아닌 배지 성분으로서도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 미세조류가 생산하는 유지는, 유지의 가수분해, 바람직하게는 효소에 의한 유지의 가수분해가 가능한 한 어떤 형태라도 양호하지만, 구체적으로는, 조체 파쇄물, 유지를 포함하는 균체 파쇄물의 추출물, 동추출물로부터 수득되는 유지를 포함하는 분획물 등을 들 수 있다. 또한, 상기 추출물 또는 분획물은, 유지 이외의 아미노산 발효에 유효한 유기물을 포함하는 것이 바람직하다.

유지는, 지방산과 글리세롤의 에스테르이며, 트리글리세라이드라고도 불린다. 미세조류가 생산하는 유지로서는, 가수분해에 의해 생성되는 지방산종이, 본 발명의 방법에 사용하는 세균이 탄소원으로서 자화할 수 있는 것이 바람직하고, 이들의 함량이 높은 것이 보다 바람직하다. L-아미노산 생산능을 갖는 세균이 자화할 수 있는 장쇄의 지방산종으로서는, 라우르산, 밀리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 등을 들 수 있다. 또한, 일반적으로 생물은, 유지 이외에도 가수분해에 의해 지방산을 유리하는 지질(lipid)을 포함하고 있으며, 지질의 가수분해에 의해 생성되는 지방산을 탄소원으로서 사용할 수도 있다. 지질로서는, 단순 지질(Simple Lipid)인, 납(wax)이나 세라미드(Ceramide), 또는, 복합 지질로서는, 인지질(Phospholipid)이나 당지질(Glycolipid) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 유지의 가수분해물이란, 상기 미세조류 유지를 화학적 방법 또는 효소적 방법 등에 의해 가수분해하여 수득되는 가수분해물이다. 화학적인 가수분해법으로서는, 고온(250 내지 260℃), 고압(5 내지 6MPa)하에서 유지와 물을 향류 접촉시키는 연속 고온 가수분해법이 일반적으로 실시되고 있다. 또한, 강산 존재하나, 산촉매 존재하에서 유지의 가수분해가 일어나는 것이 알려져 있다[참조: 미국 특허 제4,218,386호]. 또한, 효소를 사용하여 저온(30℃ 전후)에서 반응을 실시하는 것도 공업적으로 실시되고 있다[참조: Jaeger, K. E. et al. 1994. FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-63]. 상기 효소로서는, 유지의 가수분해 반응을 촉매하는 효소 리파제를 사용할 수 있다.

구체적으로는 예를 들면, 유지와 물을 동량 주입하고, 200℃에서 1시간 정도, 소형 압력 용기 중에서 가열 교반함으로써, 70 내지 80% 정도의 가수분해율을 수득할 수 있다. 공업적으로는, 고온(250 내지 260℃), 고압(5 내지 6MPa) 조건이 사용된다. 한편, 효소적 방법은, 보다 마일드한 조건으로 가수분해를 실시할 수 있다. 물과 유지를 교반하면서, 리파제 반응에 적합한 온도로 효소 반응을 실시하는 것은, 당업자라면 용이하다. 리파제는 공업적으로 중요한 효소이며, 여러 가지 산업적 이용이 이루어지고 있다[참조: Hasan, F. et al. 2006. Enzyme and Microbiol. Technol. 39: 235-251]. 사용하는 효소는, 1종이라도 2종 이상이라도 양호하다.

리파제는, 유지를 지방산과 글리세롤로 가수분해하는 효소이며, 트리아실글리세롤 리파제(triacylglycerol lipase), 트리아실글리세라이드 리파제(triacylglyceride lipase)라고도 불린다.

리파제는 다양한 생물로부터 발견되고 있지만, 상기의 반응을 촉매하는 리파제이면, 어떤 종의 리파제도 사용하는 것이 가능하다. 최근, 지방산 에스테르인 바이오디젤 연료를, 유지와 알콜로부터 리파제 효소를 사용하여 생산하는 여러 가지 시도도 이루어지고 있다[참조: Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001. J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416].

미생물 유래의 대표적인 리파제로서는, Bacillus속, Burkholderia속, Pseudomonas속, Staphylococcus속 유래의 리파제가 다수 알려져 있다[참조: Jaeger, K. E., and Eggert, T. 2002. Curr. Opin. Biotechnol.13: 390-397].

예로서, Bacillus subtilis 유래의 LipA(GenBank Accession No. M74010)을 암호화하는 유전자의 염기 서열을 서열번호 1에, 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다.

Burkholderia glumae 유래의 LipA(GenBank Accession No. X70354)을 암호화하는 유전자의 염기 서열은 서열번호 3에, 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타낸다.

Pseudomonas aeruginosa 유래의 LipA(GenBank Accession No. D50587)을 암호화하는 유전자의 염기 서열을 서열번호 5에, 아미노산 서열을 서열번호 6에 나타낸다.

Staphylococcus aureus 유래의 리파제(GenBank Accession No. M12715)의 염기 서열을 서열번호 7에, 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타낸다.

또한, 효모 Candida antarctica 유래 리파제(GenBank Accession No. Z30645) 도 자주 이용되는 리파제의 하나이다[참조: Breivik, H., Haraldsson, G. G. and Kristinsson, B.1997. J. Am. Oil Chem. Soc.74: 1425-1429]. 상기 리파제를 암호화하는 유전자의 염기 서열을 서열번호 9에, 아미노산 서열을 서열번호 10에 나타낸다.

또한, 효모 Candida rugosa(Candida cylindracea)에는, 개별 유전자로 암호화되는 5개 이상의 리파제의 존재가 알려져 있다[참조: Alberghina, L. and Lotti, M. 1997. Methods Enzymol. 284: 246-260]. 주요한 리파제로서 LIP1과 LIP2가 알려져 있으며, LIP1을 암호화하는 lip1(GenBank Accession No. X64703)의 유전자의 염기 서열을 서열번호 11에, 아미노산 서열을 서열번호 12에 나타낸다. LIP2를 암호화하는 lip2(GenBank Accession No. X64703)의 유전자의 염기 서열을 서열번호 13에, 아미노산 서열을 서열번호 14에 나타낸다. 한편, Candida cylindracea 등의 Candida속 효모에서는, 보편 코드에서는 류신을 암호화하는 CTG 코돈이 세린을 암호화하고 있는 것이 알려져 있다[참조: Kawaguchi, Y. et al. 1989. Nature 341: 164-166; Ohama, T. et al. 1993. Nucleic Acids Res.21: 4039-4045]. 서열번호 11 내지 14에서는, CTG에 대응하는 아미노산을 편의상 Leu라고 기재하고 있지만, 실제는 Ser이다.

상기의 리파제는, 상기의 미생물의 균체 또는 배양물로부터 조제한 것을 사용할 수 있지만, 각 리파제를 암호화하는 유전자를 사용하고, 유전자공학기술을 이용하여 다른 숙주 미생물로 발현시킴으로써 조제한 것이라도 양호하다. Candida rugosa(Candida cylindracea) 등의, CTG 코돈이 세린을 암호화하고 있는 효모 유래의 유전자를 다른 숙주에서 발현시키는 경우는, CTG을 세린을 암호화하는 다른 보편 코돈으로 변경할 필요가 있다[참조: Schmidt-Dannert, C. 1999. Bioorg. Med. Chem. 7: 2123-2130].

리파제의 서열 위의 특징으로서는, lipase box라고 불리는 GXSXG 모티프를 활성 중심의 Ser 주변에 갖는 것, 리파제, 에스테라제, 세린 프로테아제에 공통적으로 나타나는 catalytic traid라고 불리는 Ser, Asp, His의 3개의 잔기의 보존성을 들 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2에 나타낸 Bacillus subtilis 유래의 LipA의 아미노산 서열에 있어서, lipase box는 106 위치에서 110 위치에 상당하고, catalytic traid은 108 위치의 Ser, 164 위치의 Asp, 및 187 위치의 His의 3개의 잔기가 상당한다.

유지의 가수분해물은, 지방산과 글리세롤의 혼합물이며, 일반적인 유지의 가수분해물에 포함되는 지방산에 대한 글리세롤의 중량비는 10% 정도인 것이 알려져 있다. 가수분해물은, 가수분해 반응후의 반응물 그 자체라도 양호하고, 지질에 유래하는 지방산이나 글리세롤 등의 세균이 자화 가능한 탄소원을 포함하는 한, 반응물을 분획 또는 정제한 것이라도 양호하다. 가수분해물이 지방산 및 글리세롤을 포함하는 경우는, 글리세롤의 지방산에 대한 중량비는, 2 내지 50:100인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 5 내지 20:100인 것이 바람직하다.

유지의 가수분해물은, 실온 부근의 온도에 있어서는, 글리세롤을 포함하는 하층(수상)과, 지방산을 포함하는 상층(유상)으로 분리되어 있는 것이 일반적이다. 하층을 채취하면, 주로 글리세롤을 포함하는 획분이 수득된다. 또한, 상층을 채취하면, 주로 지방산을 포함하는 획분이 수득된다. 본 발명에 있어서는, 탄소원으로서, 이들 중 어느 것을 사용해도 되지만, 글리세롤과 지방산 양자를 사용하는 것이 바람직하다. 가수분해물로서 글리세롤 및 지방산의 양자를 포함하는 것을 사용하는 경우는, 가수분해물을 유화 처리하는 것이 바람직하다. 유화 처리로서는, 유화 촉진제 첨가, 교반, 균질화, 초음파 처리 등을 들 수 있다. 유화 처리에 의해, 세균이 글리세롤 및 지방산을 자화하기 쉬워져, L-아미노산 발효가 보다 유효해질 것으로 생각된다. 유화 처리는, L-아미노산 생산능을 갖는 세균이, 지방산과 글리세롤의 혼합물을 자화하기 쉽게 하는 처리이면, 어떤 것이라도 상관없다. 예를 들면, 유화 방법으로서, 유화 촉진제나 계면활성제를 가하는 것 등이 고려된다. 여기서 유화 촉진제로서는, 인지질이나 스테롤을 들 수 있다. 또한 계면활성제로서는, 비이온 계면활성제에서는, 폴리(옥시에틸렌) 소르비탄 모노올레산 에스테르(Tween 80) 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, n-옥틸 β-D-글루코시드 등의 알킬 글루코시드, 자당 스테아르산 에스테르 등의 자당 지방산 에스테르, 폴리글리세린 스테아르산 에스테르 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르 등을 들 수 있다. 양성 이온 계면활성제로서는, 알킬베타인인 N,N-디메틸-N-도데실글리신 베타인 등을 들 수 있다. 이외에도, 트리톤 X-100(Triton X-100), 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(Brij-58)나 노닐페놀 에톡실레이트(Tergitol NP-40) 등의 일반적으로 생물학 분야에서 사용되는 계면활성제가 이용 가능하다.

또한, 지방산과 같은 난용해성 물질의 유화나 균일화를 촉진시키기 위한 조작도 유효하다. 이 조작은, 지방산과 글리세롤의 혼합물의 유화나 균일화를 촉진시키는 조작이면, 어떤 조작이라도 상관없다. 구체적으로는, 교반 처리, 균질기 처리, 호모 믹서 처리, 초음파 처리, 고압 처리, 고온 처리 등을 들 수 있지만, 교반 처리, 균질기 처리, 초음파 처리 및 이들의 조합이 보다 바람직하다.

상기 유화 촉진제에 의한 처리와, 교반 처리, 균질기 처리 및/또는 초음파 처리를 조합하는 것이 특히 바람직하고, 이러한 처리는, 지방산이 보다 안정된 알칼리 조건하에서 실시되는 것이 바람직하다. 알칼리 조건으로서는, pH 9 이상이 바람직하고, pH 10 이상이 보다 바람직하다.

글리세롤의 농도는 F-키트 글리세롤[참조: Roche Diagnostics사 제조]과 같은 키트나 여러 가지 바이오센서에 의해 측정이 가능하다. 또한, 지방산 또는 유지의 농도는, 가스 크로마토그래피[참조: Hashimoto, K. et al. 1996. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70: 22-30]이나 HPLC[참조: Lin, J. T. et al. 1998. J. Chromatogr. A. 808: 43-49]에 의해 측정하는 것이 가능하다.

<4> 본 발명에서 사용하는 세균

본 발명에 있어서는, L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 사용한다. 세균으로서는, 미세조류에 의해 생산되는 유기물, 특히, 전분의 당화물 또는 유지의 가수분해물로부터 L-아미노산을 효율적으로 제조할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 에스케리키아속, 판토에아속, 엔테로박터속 등의 장내세균과에 속하는 세균, 및, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 미크로박테리움속에 속하는 소위 코리네형 세균 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 L-아미노산 생산균은, 유지의 가수분해물의 자화 능력을 높이도록 개변되어 있어도 상관없다. 예를 들면, 장내세균군에 발견되는 지방산 대사를 조절하는 DNA 결합 능력을 갖는 전사 인자 FadR을 암호화하는 유전자의 결손 등을 들 수 있다[참조: DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691; DiRusso, C. C. et al. 1993. Mol. Microbiol. 7: 311-322]. 구체적으로는, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 fadR 유전자는, Genbank Acession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 1,234,161 내지 1,234,880에 위치하고, GenBank accession No. AAC74271로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. fadR 유전자 서열을 서열번호 15에 나타낸다.

본 발명에 있어서의 L-아미노산 생산균은, 글리세롤 대사에 관여하는 유전자가 개변되어 있어도 된다.

글리세롤 대사에 관여하는 유전자로서는, 글리세롤의 자화성을 향상시키기 위해서, glpR 유전자[참조: EP1715056]의 발현이 약화되어 있거나, glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpF, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa 및 talC 유전자 등의 글리세롤 대사 유전자[참조: EP1715055A]의 발현이 강화되어 있어도 된다.

특히 글리세롤 자화성을 높이기 위해, 글리세롤 데하이드로게나제 유전자(gldA)와 PEP 의존형 디하이드록시아세톤 키나제 유전자(dhaKLM) 또는 ATP 의존형 디하이드록시아세톤 키나제 유전자(dak)를 조합하여 강화시키는 것이 바람직하다. 또한, 프럭토스-6-인산 알돌라제(fsaB)의 발현이 강화되어 있어도 된다[참조: WO2008/102861].

또한, 글리세롤키나제(glpK)에 있어서는, 프럭토스-1,6-인산에 의한 피드백 저해가 해제된 탈감작형 glpK 유전자를 사용하는 것이 바람직하다[참조: WO2008/081959, WO2008/107277].

장내세균과는, 에스케리키아, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 판토에아, 포토르하브두스, 프로비덴시아, 살모넬라, 세라티아, 시겔라, 모르가넬라, 예르시니아 등의 속에 속하는 세균을 포함한다. 특히, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)에서 사용되고 있는 분류법에 의해 장내세균과로 분류되어 있는 세균이 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용할 수 있는 에스케리키아속에 속하는 세균은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 나이트하르트 외 저서[참조: Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp.2477-2483. Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.]에 기술되어 있는 계통의 것이 포함된다. 구체적으로는, 프로토 타입의 야생주 K-12주 유래의 에스케리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에스케리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등을 들 수 있다.

이들의 균주는, 예를 들면 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(주소 P.0. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)로부터 분양을 받을 수 있다. 즉, 각 균주에 대응하는 등록 번호가 부여되어 있으며, 이 등록 번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다. 각 균주에 대응하는 등록 번호는, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션의 카탈로그에 기재되어 있다. 이하의 ATCC 번호가 기재된 균주에 관해서도 동일하다.

판토에아속에 속하는 세균이란, 당해 세균이 미생물학의 전문가에게 알려져 있는 분류에 의해, 판토에아속으로 분류되어 있는 것을 의미한다. 엔테로박터 아글로메란스의 어느 종의 것은, 최근, 16S rRNA의 염기 서열 분석 등에 기초하여, 판토에아 아글로메란스, 판토에아 아나나티스, 판토에아 스테와르티이 그 외로 재분류된다[참조: Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. 43: 162-173]. 본 발명에 있어서, 판토에아속에 속하는 세균에는, 이와 같이 판토에아속으로 재분류된 세균도 포함된다.

판토에아속 세균의 대표적인 균주로서, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스테와르티이(Pantoea stewartii) 판토에아 아글로메란스, 판토에아 시트레아(Pantoea citrea)를 들 수 있다. 구체적으로는, 하기의 균주를 들 수 있다.

판토에아 아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614)[참조: 유럽 특허출원공개0952221호 명세서]

판토에아 아나나티스 AJ13356주(FERM BP-6615)[참조: 유럽 특허출원공개0952221호 명세서]

또한, 이들 균주는, 유럽 특허출원공개 0952221호 명세서에는 엔테로박터 아글로메란스로서 기재되어 있지만, 현재는, 상기한 바와 같이, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아나나티스로 재분류되어 있다.

엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 유럽 특허출원공개 952221호 명세서에 예시된 균주를 사용할 수 있다. 엔테로박터속의 대표적인 주로서, 엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287주를 들 수 있다.

에르위니아속 세균으로서는, 에르위니아 아밀로보라, 에르위니아 카로토보라를 들 수 있고, 클렙시엘라속 세균으로서는, 클렙시엘라 플란티콜라를 들 수 있다. 구체적으로는, 하기의 균주를 들 수 있다.

에르위니아 아밀로보라 ATCC 15580주

에르위니아 카로토보라 ATCC 15713주

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399주(FERM BP-6600)[참조: 유럽 특허출원공개 955368호 명세서]

클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410주(FERM BP-6617)[참조: 유럽 특허출원공개 955368호 명세서]

본 발명에 있어서, 「코리네형 세균」이란, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만, 현재 코리네박테리움속으로 분류된 세균도 포함한다[참조: Liebl, W. et al. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol., 41: 255-260], 또한 코리네박테리움속과 매우 근연한 브레비박테리움속 세균을 포함한다. 이러한 코리네형 세균의 예로서 이하의 것을 들 수 있다.

코리네박테리움 아세토아시도필룸

코리네박테리움 아세토글루타미쿰

코리네박테리움 알카놀리티쿰

코리네박테리움 칼루나에

코리네박테리움 글루타미쿰

코리네박테리움 리리움

코리네박테리움 멜라세콜라

코리네박테리움 서모아미노게네스(코리네박테리움 에피시엔스)

코리네박테리움 허큘리스

브레비박테리움 디바리카툼

브레비박테리움 플라붐

브레비박테리움 임마리오필룸

브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미쿰)

브레비박테리움 로제움

브레비박테리움 사카롤리티쿰

브레비박테리움 티오게니탈리스

코리네박테리움 암모니아게네스

브레비박테리움 알붐

브레비박테리움 세리눔

미크로박테리움 암모니아필룸

구체적으로는, 하기와 같은 균주를 예시할 수 있다.

코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806

코리네박테리움 알카놀리티쿰 ATCC 21511

코리네박테리움 칼루나에 ATCC 15991

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060

코리네박테리움 리리움 ATCC 15990

코리네박테리움 메라세콜라 ATCC 17965

코리네박테리움 서모아미노게네스 AJ12340(FERM BP-1539)

코리네박테리움 허큘리스 ATCC 13868

브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020

브레비박테리움 플라붐 ATCC 13826, ATCC 14067

브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869(코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13869)

브레비박테리움 로제움 ATCC 13825

브레비박테리움 사카롤리티쿰 ATCC 14066

브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6871, ATCC 6872

브레비박테리움 알붐 ATCC 15111

브레비박테리움 세리눔 ATCC 15112

미크로박테리움 암모니아필룸 ATCC 15354

본 발명에 있어서, 아미노산 생산능을 갖는 세균이란, 배지에 배양했을 때, L-아미노산을 생산하고, 배지 중에 분비되는 능력을 갖는 세균을 말한다. 또한, 바람직하게는, 목적으로 하는 L-아미노산을 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양을 배지에 축적시킬 수 있는 세균을 말한다. L-아미노산은, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린을 포함한다. 특히, L-트레오닌, L-리신 및 L-글루탐산이 바람직하다.

이하, 상기와 같은 세균에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법, 또는 상기와 같은 세균에 L-아미노산 생산능을 증강시키는 방법에 관해서 서술한다.

L-아미노산 생산능을 부여하기 위해서는, 영양 요구성 변이주, L-아미노산의 유사체 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, L-아미노산의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제 등, 종래, 코리네형 세균 또는 에스케리키아속 세균 등의 아미노산 생산균의 육종에 채용되어 온 방법을 적용할 수 있다[참조: 아미노산 발효, (주) 학회출판센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77 내지 100페이지]. 여기에서, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은, 단독이라도 양호하며, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한, 발현이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도, 2종 또는 3종 이상이라도 양호하다. 또한, 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 양호하다.

L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, 유사체 내성주, 또는 대사 제어 변이주를 취득하기 위해서는, 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서, 영양 요구성, 유사체 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.

또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 유전자 재조합에 의해, 효소 활성을 증강시킴으로써도 실시할 수 있다. 효소 활성의 증강은, 예를 들면, L-아미노산의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다. 유전자의 발현을 증강시키기 위한 방법으로서는, 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 적당한 플라스미드, 예를 들면 미생물 내에서 플라스미드의 복제 증식 기능을 담당하는 유전자를 적어도 포함하는 플라스미드 벡터에 도입한 증폭 플라스미드를 도입하는 것, 또는, 이들 유전자를 염색체 위에서 접합, 전이 등에 의해 다카피화하는 것, 또한 이들 유전자의 프로모터 영역에 변이를 도입함으로써 달성할 수도 있다[참조: 국제공개 팜플렛 제95/34672호].

상기 증폭 플라스미드 또는 염색체 위에 목적 유전자를 도입하는 경우, 이들 유전자를 발현시키기 위한 프로모터는 코리네형 세균에 있어서 기능하는 것이면 어떠한 프로모터라도 양호하며, 사용하는 유전자 자신의 프로모터라도 양호하고, 개변된 것이라도 양호하다. 코리네형 세균에서 강력하게 기능하는 프로모터를 적절히 선택하는 것이나, 프로모터의 -35, -10 영역을 컨센서스 서열에 근접시킴으로써도 유전자의 발현량의 조절이 가능하다. 이상과 같은, 효소 유전자의 발현을 증강시키는 방법은, 국제공개 제00/18935호 팜플렛, 유럽 특허출원공개1010755호 명세서 등에 기재되어 있다.

이하, 세균에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법, 및 L-아미노산 생산능이 부여된 세균에 관해서 예시한다.

L-트레오닌 생산균

L-트레오닌 생산능을 갖는 미생물로서 바람직한 것은, L-트레오닌 생합성계 효소의 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강된 세균을 들 수 있다. L-트레오닌 생합성계 효소로서는, 아스파르토키나제 III(lysC), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제(asd), thr 오페론으로 암호화되는 아스파르토키나제 I(thrA), 호모세린 키나제(thrB), 트레오닌 신타제(thrC), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(아스파르테이트 트랜스아미나제)(aspC)를 들 수 있다. 괄호 안은, 그 유전자의 약호이다(이하의 기재에 있어서도 동일). 이러한 효소 중에서는, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 아스파르토키나제 I, 호모세린 키나제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 및 트레오닌 신타제가 특히 바람직하다. L-트레오닌 생합성계 유전자는, 트레오닌 분해가 억제된 에스케리키아속 세균에 도입해도 양호하다. 트레오닌 분해가 억제된 에스케리키아속 세균으로서는, 예를 들면, 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결손된 TDH6주[참조: 일본 공개특허공보 2001-346578호] 등을 들 수 있다.

L-트레오닌 생합성계 효소는, 최종 산물의 L-트레오닌에 의해 효소 활성이 억제된다. 따라서, L-트레오닌 생산균을 구축하기 위해서는, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 L-트레오닌 생합성계 유전자를 개변하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 thrA, thrB, thrC 유전자는, 트레오닌 오페론을 구성하고 있지만, 트레오닌 오페론은, 어테뉴에이터 구조를 형성하고 있으며, 트레오닌 오페론의 발현은, 배양액 중의 이소류신, 트레오닌에 저해를 받고, 어테뉴에이션에 의해 발현이 억제된다. 이 개변은, 어테뉴에이션 영역의 리더 서열 또는, 어테뉴에이터를 제거함으로써 달성할 수 있다[참조: Lynn, S. P. et al. 1987. J. Mol. Biol. 194: 59-69; 국제공개 제02/26993호 팜플렛; 국제공개 제2005/049808호 팜플렛].

트레오닌 오페론의 상류에는, 고유의 프로모터가 존재하지만, 비천연 프로모터로 치환해도 되고[참조: 국제공개 제98/04715호 팜플렛], 트레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다 파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되는 트레오닌 오페론을 구축해도 된다[참조: 유럽 특허 제0593792호 명세서]. 또한, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 세균을 개변하기 위해서, α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV)에 내성인 균주를 선발하는 것도 가능하다.

이와 같이 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 트레오닌 오페론은, 숙주 내에서 카피수가 상승하고 있거나, 또는 강력한 프로모터에 연결되어 발현량이 향상되고 있는 것이 바람직하다. 카피수의 상승은, 플라스미드에 의한 증폭 이외에, 트랜스포존, Mu-파지 등으로 게놈 위에 트레오닌 오페론을 전이시킴으로써도 달성할 수 있다.

L-트레오닌 생합성계 효소 이외에도, 해당계, TCA 회로, 호흡쇄에 관한 유전자나 유전자의 발현을 제어하는 유전자, 당의 도입 유전자를 강화시키는 것도 적합하다. 이러한 L-트레오닌 생산에 효과가 있는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제(pntAB) 유전자[참조: 유럽 특허733712호 명세서], 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(pepC)[참조: 국제공개 제95/06114호 팜플렛], 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps)[참조: 유럽 특허 제877090호 명세서], 코리네형 세균 또는 바실러스속 세균의 피루브산 카르복실라제 유전자[참조: 국제공개 제99/18228호 팜플렛, 유럽 출원공개 제1092776호 명세서]를 들 수 있다.

또한, L-트레오닌에 내성을 부여하는 유전자, L-호모세린에 내성을 부여하는 유전자의 발현을 강화하는 것이나, 숙주에 L-트레오닌 내성, L-호모세린 내성을 부여하는 것도 적합하다. 내성을 부여하는 유전자로서는, rhtA 유전자[참조: Livshits, V. A. et al. 2003. Res. Microbiol. 154: 123-135), rhtB 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제0994190호 명세서], rhtC 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제1013765호 명세서], yfiK, yeaS 유전자[참조: 유럽 특허출원공개 제1016710호 명세서]을 들 수 있다. 또한 숙주에 L-트레오닌 내성을 부여하는 방법은, 유럽 특허출원공개 제0994190호 명세서나, 국제공개 제90/04636호 팜플렛 기재의 방법을 참조할 수 있다.

L-트레오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, E.coli TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)[참조: 미국 특허 제5,175,107호, 미국 특허 제5,705,371호], E.coli 472T23/pYN7(ATCC 98081)[참조: 미국 특허 제5,631,157호], E.coli NRRL-21593[참조: 미국 특허 제5,939,307호], E.coli FERM BP-3756[참조: 미국 특허 제5,474,918호], E.coli FERM BP-3519 및 FERM BP-3520[참조: 미국 특허 제5,376,538호], E.coli MG442[참조: Gusyatiner et al., 1978. Genetika(in Russian), 14: 947-956], E.coli VL643 및 VL2055[참조: 유럽 특허출원공개 제1149911호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

TDH-6주는 thrC 유전자를 결손하고, 수크로스 자화성이며, 또한, 그 ilvA 유전자가 리키(leaky) 변이를 가진다. 이 주는 또한, rhtA 유전자에, 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대한 내성을 부여하는 변이를 가진다. B-3996주는, RSF1010유래 벡터에, 변이 thrA 유전자를 포함하는 thrA*BC 오페론을 삽입한 플라스미드pVIC40을 보유한다. 이러한 변이 thrA 유전자는, 트레오닌에 의한 피드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화한다. B-3996주는, 1987년 11월 19일, 올유니온 사이언티픽 센터 오브 안티바이오틱스(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)에, 수탁번호 RIA 1867로 기탁되어 있다. 이 주는, 또한, 1987년 4월 7일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오르가니즘즈(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)에, 수탁번호 B-3996으로 기탁되어 있다.

E.coli VKPM B-5318[참조: EP0593792B]도, L-트레오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서 사용할 수 있다. B-5318주는, 이소류신 비요구성이며, 플라스미드 pVIC40 중의 트레오닌 오페론의 제어 영역이, 온도 감수성 람다 파지 C1 리프레서 및 PR 프로모터에 의해 치환되어 있다. VKPM B-5318은, 1990년 5월 3일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오르가니즘즈(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)에, 수탁번호 VKPM B-5318로 국제 기탁되어 있다.

에스케리키아 콜라이의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 thrA 유전자는 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 337 내지 2,799에 위치하고, GenBank accession No. AAC73113으로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 에스케리키아 콜라이의 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자는 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 2,801 내지 3,733에 위치하고, GenBank accession No. AAC73114로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 에스케리키아 콜라이의 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자는 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 3,734 내지 5,020에 위치하고, GenBank accession No. AAC73115로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 이들 3개의 유전자는, 리더 펩타이드를 암호화하는 thrL 유전자의 하류에, thrLABC로 이루어지는 트레오닌 오페론으로서 암호화되어 있다. 트레오닌 오페론의 발현을 증대시키기 위해서는, 전사에 영향을 주는 어테뉴에이터 영역을, 바람직하게는, 오페론으로부터 제거하는 것이 유효하다[참조: 국제공개 제2005/049808호, 국제공개 제2003/097839호].

트레오닌에 의한 피드백 저해에 내성인 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 변이 thrA 유전자, 및, thrB 유전자 및 thrC 유전자는, 트레오닌 생산주 E.coli VKPM B-3996에 존재하는 주지의 플라스미드 pVIC40으로부터 하나의 오페론으로서 취득할 수 있다. 플라스미드 pVIC40의 상세한 것은, 미국 특허 제5,705,371호에 기재되어 있다.

rhtA 유전자는, 호모세린 및 트레오닌에 내성을 부여하는 유전자(rht: resistant to threonine/homoserine)로서 취득된 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 848,433 내지 849,320(상보쇄)에 위치하고, GenBank accession No. AAC73900으로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 또한, rthA의 발현을 향상시키는 rhtA23 변이가, ATG 개시 코돈에 대해 -1위치의 G→A 치환인 것이 판명되고 있다[참조: Livshits, V. A. et al. 2003. Res Microbiol. 154: 123-135, 유럽 특허출원공개 제1013765호].

에스케리키아 콜라이의 asd 유전자는 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 3,571,798 내지 3,572,901(상보쇄)에 위치하고, GenBank accession No. AAC76458로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다[참조: White, T. J. et al. 1989. Trends Genet. 5: 185-189]. 다른 미생물의 asd 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.

또한, 에스케리키아 콜라이의 aspC 유전자는 Genbank Accession No. U00096으로 등록되어 있는 에스케리키아 콜라이 MG1655주의 게놈 서열 위의 염기 번호 983,742 내지 984,932(상보쇄)에 위치하고, GenBank accession No. AAC74014로 등록되어 있는 단백질을 암호화하는 유전자이며, PCR에 의해 수득할 수 있다. 다른 미생물의 aspC 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.

L-리신 생산균

이하, L-리신 생산균 및 그 구축 방법을 예로서 나타낸다.

예를 들면, L-리신 생산능을 갖는 주로서는, L-리신 유사체 내성주 또는 대사 제어 변이주를 들 수 있다. L-리신 유사체의 예로서는, 옥사리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(이하,「AEC」라고 약기하는 경우가 있다.), γ-메틸 리신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 리신 유사체에 대해 내성을 갖는 변이주는, 장내세균과에 속하는 세균이나 코리네형 세균을 통상의 인공 변이 처리함으로써 수득할 수 있다. L-리신 생산균으로서 구체적으로는, 에스케리키아 콜라이 AJl1442주(FERM BP-1543, NRRL B-12185; 일본 공개특허공보 제(소)56-18596호 및 미국 특허 제4346170호 명세서), 에스케리키아 콜라이 VL611주[참조: 일본 공개특허공보 2000-189180호] 등을 들 수 있다. 또한, 에스케리키아 콜라이의 L-리신 생산균으로서, WC196주[참조: 국제공개 제96/17930호 팜플렛]을 사용할 수도 있다.

또한, L-리신 생합성계의 효소 활성을 상승시킴으로써도, L-리신 생산균을 구축할 수 있다. 이러한 효소 활성의 상승은, 효소를 암호화하는 유전자의 카피수를 세포내에서 상승시키는 것, 또는 발현 조절 서열을 개변함으로써 달성할 수 있다.

유전자의 발현을 증강시키기 위한 개변은, 예를 들면, 유전자 재조합 기술을 이용하여, 세포 중의 유전자의 카피수를 높임으로써 실시할 수 있다. 예를 들면 gapA 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 숙주 세균으로 기능하는 벡터, 바람직하게는 멀티 카피형의 벡터와 연결하여 재조합 DNA를 제작하고, 이것을 세균에 도입하여 형질전환하면 된다.

유전자의 카피수를 높이는 것은, 상기한 바와 같은 유전자를 세균의 게놈 DNA 위에 다카피 존재시킴으로써도 달성할 수 있다. 세균의 게놈 DNA 위에 유전자를 다카피로 도입하기 위해서는, 게놈 DNA 위에 다카피 존재하는 서열을 표적으로 이용하여 상동 재조합에 의해 실시한다. 게놈 DNA 위에 다카피 존재하는 서열로서는, 반복성 DNA, 전이 인자의 말단부에 존재하는 역반복을 이용할 수 있다. 또한, 게놈 위에 존재하는 gapA 유전자 옆에, 각각의 유전자를 탠덤으로 연결시켜도 되고, 게놈 위의 불필요한 유전자 위에 중복해서 편입시켜도 양호하다. 이러한 유전자 도입은, 온도 감수성 벡터를 사용하고, 또는 integration 벡터를 사용하여 달성할 수 있다.

또는, 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자를 트랜스포존에 탑재하고 이것을 전이시켜서 게놈 DNA 위에 다카피 도입하는 것도 가능하다. 게놈 위에 유전자가 전이한 것의 확인은, 유전자의 일부를 프로브로 하여, 서던 하이브리드화를 실시함으로써 확인할 수 있다.

또한, 유전자의 발현의 증강은, 상기한 유전자 카피수의 증폭 이외에, 국제공개 00/18935호 팜플렛에 기재한 방법으로, 게놈 DNA 위 또는 플라스미드 위의 유전자의 각각의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 강력한 것으로 치환하는 것이나, 각 유전자의 -35, -10 영역을 컨센서스 서열에 근접시키는 것, 유전자의 발현을 상승시키는 레귤레이터를 증폭시키는 것, 또는, 유전자의 발현을 저하시키는 레귤레이터를 결실 또는 약화시킴으로써도 달성된다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, araBA 프로모터, 람다 파지의 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, T7 프로모터, φ10 프로모터 등이 강력한 프로모터로서 알려져 있다. 또한, gapA 유전자의 프로모터 영역, SD 영역에 염기 치환 등을 도입하고, 보다 강력한 것으로 개변하는 것도 가능하다. 프로모터의 강력한 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 외의 논문[참조: Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. 1995. 1:105-128] 등에 기재되어 있다. 또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈간의 스페이서, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열에 있어서의 수개의 뉴클레오타이드의 치환이 mRNA의 번역 효율에 매우 영향을 미치는 것이 알려져 있으며, 이들을 개변하는 것도 가능하다. 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 영역은, 프로모터 검색 벡터나 GENETYX 등의 유전자 해석 소프트를 사용하여 결정할 수도 있다. 이러한 프로모터 치환 또는 개변에 의해 유전자의 발현이 강화된다. 발현 조절 서열의 치환은, 예를 들면 온도 감수성 플라스미드를 사용한 방법이나, Red 드리븐 인테그레이션법[참조: WO2005/010175]을 사용할 수 있다.

L-리신 생합성계 효소를 암호화하는 유전자로서는, 디하이드로디피콜린산 합성효소 유전자(dapA), 아스파르토키나제 유전자(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제 유전자(dapB), 디아미노피멜산 탈탄산효소 유전자(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제 유전자(ddh)[참조: 국제공개 제96/40934호 팜플렛], 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)60-87788호], 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제 유전자(aspC)[참조: 일본 특허공보 제(평)6-102028호], 디아미노피멜산 에피머라제 유전자(dapF)[참조: 일본 공개특허공보 2003-135066호], 아스파라긴산 세미알데히드 탈수소효소 유전자(asd)[참조: 국제공개 제00/61723호 팜플렛] 등의 디아미노피멜산 경로의 효소의 유전자, 또는 호모 아코니트산 하이드라타제 유전자[참조: 일본 공개특허공보 2000-157276호] 등의 아미노아디프산 경로의 효소 등의 유전자를 들 수 있다. 또한, 친주는, 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)[참조: EP1170376A], 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자(pntAB)[참조: 미국 특허 제5,830,716호], L-리신 배출 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ybjE 유전자[참조: WO2005/073390], 글루탐산 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자(gdhA)[참조: Valle F. et al. 1983. Gene 23: 199-209], 또는, 이들의 임의의 조합의 유전자의 발현 레벨이 증대하고 있어도 된다. 괄호내는, 이들 유전자의 약호이다.

에스케리키아 콜라이 유래의 야생형 디하이드로디피콜린산 합성효소는 L-리신에 의한 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있으며, 에스케리키아 콜라이 유래의 야생형 아스파르토키나제는 L-리신에 의한 억제 및 피드백 저해를 받는 것이 알려져 있다. 따라서, dapA 유전자 및 lysC 유전자를 사용하는 경우, 이들 유전자는, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 유전자인 것이 바람직하다.

L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 DNA로서는, 118위치의 히스티딘 잔기가 티로신 잔기로 치환된 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 들 수 있다. 또한, L-리신에 의한 피드백 저해를 받지 않는 변이형 아스파르토키나제를 암호화하는 DNA로서는, 352위치의 트레오닌 잔기가 이소류신 잔기로 치환, 323위치의 글리신 잔기가 아스파라긴 잔기로 치환, 318위치의 메티오닌이 이소류신으로 치환된 서열을 갖는 AKIII를 암호화하는 DNA를 들 수 있다(이들 변이체에 관해서는 미국 특허 제5661012호 및 제6040160호 명세서 참조). 변이형 DNA는 PCR 등에 의한 부위 특이적 변이법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 변이형 디하이드로디피콜린산 합성효소를 암호화하는 변이형 dapA 및 변이형 아스파르토키나제를 암호화하는 변이형 lysC을 포함하는 플라스미드로서, 광숙주역 플라스미드 RSFD80, pCAB1, pCABD2가 알려져 있다[참조: 미국 특허 제6040160호 명세서]. 동플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 JM109주[참조: 미국 특허 제6040160호 명세서]는, AJ12396으로 명명되고, 동주는 1993년 10월 28일에 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터)에 수탁번호 FERM P-13936으로서 기탁되어, 1994년 11월 1일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, FERM BP-4859의 수탁번호하에 기탁되어 있다. RSFD80은, AJ12396주로부터 공지의 방법에 의해 취득할 수 있다.

L-리신 생산에 있어서, 이러한 효소로서는, 호모세린 데하이드로게나제, 리신 데카르복실라제(cadA, ldcC), 말산 효소(malic enzyme) 등이 있으며, 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손된 주는 국제공개 제WO95/23864호, 제WO96/17930호 팜플렛, 제WO2005/010175호 팜플렛 등에 기재되어 있다.

리신 데카르복실라제 활성을 저하 또는 결손시키기 위해서는, 리신 데카르복실라제를 암호화하는 cadA 유전자와 ldcC 유전자의 양자의 발현을 저하시키는 것이 바람직하다. 양 유전자의 발현 저하는, WO2006/078039호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

이들 효소 활성을 저하 또는 결손시키는 방법으로서는, 통상의 변이 처리법 또는 유전자 재조합 기술에 의해, 게놈 위의 상기 효소의 유전자에, 세포 중의 당해 효소의 활성이 저하 또는 결손되는 변이를 도입하면 양호하다. 이러한 변이의 도입은, 예를 들면, 유전자 재조합에 의해, 게놈 위의 효소를 암호화하는 유전자를 결손시키거나, 프로모터나 샤인 달가노(SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 개변하거나 하는 것 등에 의해 달성된다. 또한, 게놈 위의 효소를 암호화하는 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 또한 시종 코돈을 도입하는 것(넌센스 변이), 1 내지 2 염기 부가·결실되는 프레임 시프트 변이를 도입하는 것, 유전자의 일부분, 또는 전영역을 결실시킴으로써도 달성할 수 있다[참조: Wang, J. P. et al. 2006. J. Agric. Food Chem. 54: 9405-9410; Winkler, W. C. 2005. Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 594-602; Qiu, Z. and Goodman, M. F. 1997. J. Biol. Chem. 272: 8611-8617; Wente, S. R. and Schachman, H. K. 1991. J. Biol. Chem. 266: 20833-20839]. 또한, 코드 영역의 전체 또는 일부가 결실된 변이 효소를 암호화하는 유전자를 구축하고, 상동 재조합 등에 의해, 당해 유전자로 게놈 위의 정상 유전자를 치환하는 것, 또는 트랜스포존, IS 인자를 당해 유전자에 도입함으로써도 효소 활성을 저하 또는 결손시킬 수 있다.

예를 들면, 상기의 효소의 활성을 저하 또는 결손시키는 변이를 유전자 재조합에 의해 도입하기 위해서는, 이하와 같은 방법이 사용된다. 목적 유전자의 부분 서열을 개변하고, 정상적으로 기능하는 효소를 생산하지 않도록 한 변이형 유전자를 제작하고, 당해 유전자를 포함하는 DNA로 장내세균과에 속하는 세균으로 형질전환하고, 변이형 유전자와 게놈 위의 유전자로 재조합을 일으키게 함으로써, 게놈 위의 목적 유전자를 변이형으로 치환할 수 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환은, 「Red 드리븐 인테그레이션(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법[참조: Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645], Red 드리븐 인테그레이션법과 λ파지 유래의 절취 시스템[참조: Cho, E. H., Gumpot, R. I., Gardner, J. F. J. 2002. Bacteriol. 184: 5200-5203]을 조합한 방법[참조: WO2005/010175호] 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법 등이 있다[참조: 미국 특허 제6303383호; 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호]. 또한, 상기한 바와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 변이 도입은, 숙주 위에서 복제능을 갖지 않는 플라스미드를 사용해도 실시할 수 있다.

바람직한 L-리신 생산균으로서, 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를 들 수 있다[참조: WO2006/078039]. 이 균주는, WC196주로부터, 리신 데카르복실라제를 암호화하는 cadA 및 1dcC 유전자를 파괴하고, 리신 생합성계 유전자를 포함하는 플라스미드 pCABD2[참조: 미국 특허 제6,040,160호]을 도입함으로써 구축한 주이다. WC196주는, E.coli K-12에 유래하는 W3110주로부터 취득된 주로, 352위치의 트레오닌을 이소류신으로 치환함으로써 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제 III를 암호화하는 변이형 lysC 유전자[참조: 미국 특허 제5,661,012호]로 W3110주의 염색체 위의 야생형 lysC 유전자를 치환한 후, AEC 내성을 부여함으로써 육종되었다[참조: 미국 특허 제5,827,698호]. WC196주는, Escherichia coli AJ13069로 명명되고, 1994년 12월 6일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되어, 1995년 9월 29일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어 수탁번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다[참조: 미국 특허 제5,827,698호]. WC196ΔcadAΔldcC 자체도, 바람직한 L-리신 생산균이다. WC196ΔcadAΔldcC는, AJ110692라고 명명되어, 2008년 10월 7일, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 국제 기탁되어, 수탁번호 FERM BP-11027이 부여되어 있다.

pCABD2는, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에스케리키아 콜라이 유래의 디하이드로디피콜린산 합성효소(DDPS)를 암호화하는 변이형 dapA 유전자와, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에스케리키아 콜라이 유래의 아스파르토키나제 III를 암호화하는 변이형 lysC 유전자와, 에스케리키아 콜라이 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자와, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 유래 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 ddh 유전자를 포함하고 있다[참조: 국제공개 제WO95/16042, WO01/53459호 팜플렛].

상기와 같은 L-리신 생합성에 관여하는 효소의 유전자 발현을 증강시키는 수법, 효소 활성을 저하시키는 방법은, 그 밖의 L-아미노산 생합성 효소를 암호화하는 유전자에 관해서도 동일하게 적용할 수 있다.

L-리신 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, AEC 내성 변이주(브레비박테리움 락토퍼멘텀에 J11082(NRRL B-11470) 주 등: 일본 특허공보 제(소)56-1914호, 일본 특허공보 제(소)56-1915호, 일본 특허공보 제(소)57-14157호, 일본 특허공보 제(소)57-14158호, 일본 특허공보 제(소)57-30474호, 일본 특허공보 제(소)58-10075호, 일본 특허공보 제(소)59-4993호, 일본 특허공보 제(소)61-35840호, 일본 특허공보 제(소)62-24074호, 일본 특허공보 제(소)62-36673호, 일본 특허공보 제(평)5-11958호, 일본 특허공보 제(평)7-112437호, 일본 특허공보 제(평)7-112438호]; 그 생육에 L-호모세린 등의 아미노산을 필요로 하는 변이주[참조: 일본 특허공보 제(소)48-28078호, 일본 특허공보 제(소)56-6499호]; AEC에 내성을 나타내고, 또한 L-류신, L-호모세린, L-프롤린, L-세린, L-아르기닌, L-알라닌, L-발린 등의 아미노산을 요구하는 변이주[참조: 미국 특허 제3708395호 및 제3825472호 명세서]; DL-α-아미노-ε-카프로락탐, α-아미노-라우릴락탐, 아스파라긴산-유사체, 설파제, 퀴노이드, N-라우로일류신에 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주; 옥살로아세트산 탈탄산효소(데카르복실라제) 또는 호흡계 효소 저해제의 내성을 나타내는 L-리신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)50-53588호, 일본 공개특허공보 제(소)50-31093호, 일본 공개특허공보 제(소)52-102498호, 일본 공개특허공보 제(소)53-9394호, 일본 공개특허공보 제(소)53-86089호, 일본 공개특허공보 제(소)55-9783호, 일본 공개특허공보 제(소)55-9759호, 일본 공개특허공보 제(소)56-32995호, 일본 공개특허공보 제(소)56-39778호, 일본 특허공보 제(소)53-43591호, 일본 특허공보 제(소)53-1833호]; 이노시톨 또는 아세트산을 요구하는 L-리신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)55-9784호, 일본 공개특허공보 제(소)56-8692호]; 플루오로피루브산 또는 34℃ 이상의 온도에 대해 감수성을 나타내는 L-리신 생산 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)55-9783호, 일본 공개특허공보 제(소)53-86090호]; 에틸렌글리콜에 내성을 나타내고, L-리신을 생산하는 브레비박테리움속 또는 코리네박테리움속의 생산 변이주[참조: 미국 특허 제4411997호]를 들 수 있다.

L-시스테인 생산균

L-시스테인 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 피드백 저해 내성의 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 상이한 cysE 대립유전자(allele)로 형질전환된 E.coli JM15[참조: 미국 특허 제6,218,168호, 러시아 특허출원 제2003121601호], 세포에 독성의 물질을 배출하는데도 적합한 단백질을 암호화하는 과잉 발현 유전자를 갖는 E.coli W3110[참조: 미국 특허 제5,972,663호], 시스테인 데설포하이드라제 활성이 저하된 E.coli주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)11-155571호], cysB 유전자에 의해 암호화되는 양의 시스테인 레귤론의 전사 제어 인자의 활성이 상승한 E.coli W3110[참조: 국제공개 제0127307호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

L-류신 생산균

L-류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 류신 내성의 E.coli주(예를 들면, 57주(VKPM B-7386, 미국 특허 제6,124,121호)) 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신 등의 류신 유사체 내성의 E.coli주[참조: 일본 특허공보 제(소)62-34397호 및 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호], 국제공개 제96/06926호에 기재된 유전자 공학적 방법으로 수득된 E.coli주, E.coli H-9068[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용하는 세균은, L-류신 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 된다. 이러한 유전자의 예로서는, 바람직하게는 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필 말레이트 신타제를 암호화하는 변이 leuA 유전자[참조: 미국 특허 제6,403,342호]로 대표되는, leuABCD 오페론의 유전자를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하는 세균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 된다. 이러한 유전자의 예로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: 유럽 특허출원공개 제1239041호]를 들 수 있다.

코리네형 세균의 L-이소류신 생산균으로서는, 측쇄 아미노산 배출 단백질을 암호화하는 brnE 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 2001-169788호], L-리신 생산균과의 프로토플라스트 융합에 의해 L-이소류신 생산능을 부여한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-74293호], 호모세린 데하이드로게나제를 강화한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-91193호], 트레오닌 하이드록사메이트 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-195293호], α-케토말론 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15695호], 메틸 리신 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15696호]를 들 수 있다.

L-히스티딘 생산균

L-히스티딘 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, E.coli 24주(VKPM B-5945, 러시아 특허 제2003677호), E.coli 80주(VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호), E.coli NRRL B-12116-B12121[참조: 미국 특허 제4,388,405호], E.coli H-9342(FERM BP-6675) 및 H-9343(FERM BP-6676)[참조: 미국 특허 제6,344,347호], E.coli H-9341(FERM BP-6674)[참조: 유럽 특허출원공개 제1085087호], E.coli AI80/pFM201[참조: 미국 특허 제6,258,554호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

L-히스티딘 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-히스티딘 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대한 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드롤라제 유전자(hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제 유전자(hisI), 포스포리보실포름이미노-5-아미노이미다졸 카르복사미드 리보타이드 이소머라제 유전자(hisA), 아미드 트랜스퍼라제 유전자(hisH), 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스페라제 유전자(hisC), 히스티디놀 포스파타제 유전자(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자(hisD) 등을 들 수 있다.

hisG 및 hisBHAF I로 암호화되는 L-히스티딘 생합성계 효소는 L-히스티딘에 의해 저해되는 것이 알려져 있으며, 따라서, L-히스티딘 생산능은, ATP 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(hisG)에 피드백 저해에 대한 내성을 부여하는 변이를 도입함으로써 효율적으로 증대시킬 수 있다[참조: 러시아 특허 제2003677호 및 제2119536호].

L-히스티딘 생산능을 갖는 주의 구체예로서는, L-히스티딘 생합성계 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 벡터를 도입한 E.coli FERM-P 5038 및 5048[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-005099호], 아미노산 수송의 유전자를 도입한 E.coli주[참조: 유럽 특허출원공개 제1016710호], 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여한 E.coli 80주(VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호) 등을 들 수 있다.

L-글루탐산 생산균

L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, E.coli VL334thrC⁺[참조: EP1172433] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. E.coli VL334(VKPM B-1641)은, thrC 유전자 및 ilvA 유전자에 변이를 갖는 L-이소류신 및 L-트레오닌 요구성주이다[참조: 미국 특허 제4,278,765호]. thrC 유전자의 야생형 대립유전자는, 야생형 E.coli K-12주(VKPM B-7)의 세포에서 증식된 박테리오파지 P1을 사용하는 일반적 형질도입법에 의해 도입되었다. 이 결과, L-이소류신 요구성의 L-글루탐산 생산균 VL334thrC⁺(VKPM B-8961)이 수득되었다.

L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-글루탐산 생합성계 효소 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강된 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 유전자의 예로서는, 글루타메이트 데하이드로게나제(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루타메이트 신테타제(gltAB), 이소시트레이트 데하이드로게나제(icdA), 아코니테이트 하이드라타제(acnA, acnB), 시트르산 신타제(gltA), 메틸 시트르산 신타제(prpC), 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(ppc), 피루베이트 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루베이트 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루베이트 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세로뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세레이트 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(gapA), 트리오스 포스페이트 이소머라제(tpiA), 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제(fbp), 포스포프럭토키나제(pfkA, pkfB), 글루코스 포스페이트 이소머라제(pgi) 등을 들 수 있다. 이들 효소 중에서는, 글루타메이트 데하이드로게나제, 시트르산 신타제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 및 메틸 시트르산 신타제가 바람직하다.

시트레이트 신테타제 유전자, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 유전자, 및/또는 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증대하도록 개변된 주의 예로서는, 유럽 특허출원공개 제1078989호, 유럽 특허출원공개 제955368호 및 유럽 특허출원공개 제952221호에 개시된 것을 들 수 있다.

L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기되어 L-글루탐산 이외의 화합물의 합성을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 주도 들 수 있다. 이러한 효소의 예로서는, 이소시트레이트 리아제(aceA), α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(sucA), 포스포트랜스아세틸라제(pta), 아세테이트 키나제(ack), 아세토하이드록시산 신타제(ilvG), 아세토락테이트 신타제(ilvI), 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제(pfl), 락테이트 데하이드로게나제(ldh), 글루타메이트 데카르복실라제(gadAB) 등을 들 수 있다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결손되거나, 또는, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 에스케리키아속에 속하는 세균, 및, 이들의 취득 방법은 미국 특허 제5,378,616호 및 제5,573,945호에 기재되어 있다.

구체예로서는 하기의 것을 들 수 있다.

E.coli W3110sucA::Km^r

E.coli AJ12624(FERM BP-3853)

E.coli AJ12628(FERM BP-3854)

E.coli AJ12949(FERM BP-4881)

E.coli W3110sucA::Km^r은, E.coli W3110의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 유전자(이하,「sucA 유전자」라고도 한다)을 파괴함으로써 수득된 주이다. 이 주는, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 완전히 결손하고 있다.

또한, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 코리네형 세균으로서는, 예를 들면, 이하의 주를 들 수 있다.

브레비박테리움 락토퍼멘텀 L30-2주[참조: 일본 공개특허공보 2006-340603호]

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ΔS주[참조: 국제공개 95/34672호 팜플렛]

브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ12821(FERM BP-4172; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서)

브레비박테리움 플라붐 AJ12822(FERM BP-4173; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12823(FERM BP-4174; 프랑스 특허공보 9401748호 명세서)

코리네박테리움 글루타미쿰 L30-2주[참조: 일본 공개특허공보 2006-340603호]

L-글루탐산 생산균의 다른 예로서는, 에스케리키아속에 속하고, 아스파라긴산 대사 길항 물질에 내성을 갖는 것을 들 수 있다. 이러한 주는, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 결손하고 있어도 되며, 예를 들면, E.coli AJ13199(FERM BP-5807)[참조: 미국 특허 제5,908,768호], 또한 L-글루탐산 분해능이 저하된 FERM P-12379[참조: 미국 특허 제5,393,671호]; AJ13138(FERM BP-5565)[참조: 미국 특허 제6,110,714호] 등을 들 수 있다.

판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균의 예로서는, 판토에아 아나나티스 AJ13355주를 들 수 있다. 동주는, 시즈오카현 이와타시의 토양으로부터, 저pH로 L-글루탐산 및 탄소원을 포함하는 배지에서 증식시킬 수 있는 주로서 분리된 주이다. 판토에아 아나나티스 AJ13355는, 1998년 2월 19일에, 독립행정법인 산업기술종합 연구소 특허생물기탁센터(주소 우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1츄오 다이6)에, 수탁번호 FERM P-16644로서 기탁되어, 1999년 1월 11일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-6614가 부여되어 있다. 한편, 동주는, 분리된 당시는 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans)로 동정되어, 엔테로박터 아글로메란스 AJ13355로서 기탁되었지만, 최근 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)로 재분류되어 있다.

또한, 판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균으로서, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(αKGDH) 활성이 결손되거나, 또는, αKGDH 활성이 저하된 판토에아속에 속하는 세균을 들 수 있다. 이러한 주로서는, AJ113355주의 αKGDH-E1 서브유니트 유전자(sucA)를 결손시킨 AJ13356[참조: 미국 특허 제6,331,419호], 및 AJ13355주로부터 점액질 저생산 변이주로서 선택된 SC17주 유래의 sucA 유전자 결손주인 SC17sucA[참조: 미국 특허 제6,596,517호]이 있다. AJ13356은, 1998년 2월 19일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-16645로서 기탁되어, 1999년 1월 11일에 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-6616이 부여되어 있다. AJ13355 및 AJ13356은, 상기 기탁 기관에 Enterobacter agglomerans로서 기탁되어 있지만, 본 명세서에서는, Pantoea ananatis로서 기재한다. 또한, SC17sucA주는, private number AJ417이 부여되고, 2004년 2월 26일에 상기의 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁번호 FERM BP-08646으로서 기탁되어 있다.

또한, 판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균으로서, SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주, AJ13601주, NP106주, 및 NA1주를 들 수 있다. SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주는, SC17sucA주에, 에스케리키아 콜라이 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA), 포스포에놀피루브산 카르복실라제 유전자(ppsA), 및 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자(gdhA)를 포함하는 플라스미드 RSFCPG, 및, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA)를 포함하는 플라스미드 pSTVCB을 도입하여 수득한 주이다. AJ13601주는, 이 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주로부터 저pH하에서 고농도의 L-글루탐산에 내성을 나타내는 주로서 선택된 주이다. 또한, NP106주는, AJ13601주로부터 플라스미드 RSFCPG+pSTVCB을 탈락시킨 주이다. AJ13601주는, 1999년 8월 18일에, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 1 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-17516으로서 기탁되어, 2000년 7월 6일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제 기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-7207이 부여되어 있다.

또한 코리네형 세균에게 L-글루탐산 생산능을 부여하는 방법으로서, 메카노센서티브 채널(mechanosensitive channel)을 암호화하는 yggB 유전자를 증폭시키는 방법[참조: 국제공개WO2006/070944호], 코드 영역내에 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법을 사용하는 것도 가능하다. yggB 유전자는, Genbank Accession No. NC_003450으로 등록되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032주의 게놈 서열 위의 염기 번호 1,337,692 내지 1,336,091(상보쇄)에 위치하고, NCgl1221이라고도 불리는 GenBank accession No. NP_600492로 등록되어 있는 막단백질을 암호화하는 유전자이다.

L-글루탐산 생산능을 부여 또는 증강시키는 다른 방법으로서, 유기산 유사체나 호흡 저해제 등에 대한 내성을 부여하는 방법이나 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 들 수 있다. 예를 들면, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)50-113209호], 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-065198호], 우레아제를 약화시키는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)52-038088호], 말론산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)52-038088호], 벤조피론 또는 나프토퀴논류에 대한 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호], HOQNO 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-140895호], α-케토말론산 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호], 구아니딘 내성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-35981호], 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)4-88994호] 등을 들 수 있다.

이러한 내성균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.

브레비박테리움 플라붐 AJ3949(FERM BP-2632: 일본 공개특허공보 제(소)50-113209호)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11628(FERM P-5736; 일본 공개특허공보 제(소)57-065198호)

브레비박테리움 플라붐 AJ11355(FERM P-5007; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11368(FERM P-5020; 일본 공개특허공보 제(소)56-1889호)

브레비박테리움 플라붐 AJ11217(FERM P-4318; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11218(FERM P-4319; 일본 공개특허공보 제(소)57-2689호)

브레비박테리움 플라붐 AJ11564(FERM P-5472; 일본 공개특허공보 제(소)56-140895호)

브레비박테리움 플라붐 AJ11439(FERM P-5136; 일본 공개특허공보 제(소)56-35981호)

코리네박테리움 글루타미쿰 H7684(FERM BP-3004; 일본 공개특허공보 제(평)04-88994호)

브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11426(FERM P-5123; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호)

코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11440(FERM P-5137; 일본 공개특허공보 제(평)56-048890호)

브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ11796(FERM P-6402; 일본 공개특허공보 제(평)58-158192호)

L-페닐아라닌 생산균

L-페닐아라닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드로게나제 및 티로신 리프레서를 결손한 E.coli AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197) [참조: 국제공개03/044191호], 피드백 저해가 해제된 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드라타제를 암호화하는 변이형 pheA34 유전자를 보유하는 E.coli HW1089(ATCC 55371)[참조: 미국 특허 제5,354,672호], E.coli MWEC101-b[참조: KR8903681], E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147[참조: 미국 특허 제4,407,952호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주로서, 피드백 저해가 해제된 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드라타제를 암호화하는 유전자를 보유하는 E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) 및 AJ12604라고 명명된 E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERM BP-3579)도 사용할 수 있다[참조: EP 488424 B1]. 또한, yedA 유전자 또는 yddG유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에스케리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국 특허출원공개 2003/0148473호 및 2003/0157667, 국제공개 03/044192호].

코리네형 세균의 페닐알라닌 생산균으로서는, 포스포에놀피루브산 카르복실라제 또는 피루브산 키나제 활성이 저하된 코리네박테리움 글루타미카 BPS-13주(FERM BP-1777, K77(FERM BP-2062) 및 K78(FERM BP-2063)[참조: 유럽 특허공개공보 331145호, 일본 공개특허공보 제(평)02-303495호], 티로신 요구성주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)05-049489호] 등을 사용할 수 있다.

또한, 페닐알라닌 생산균으로서는, 부생물을 세포내에 도입하도록 개변하는 것, 예를 들면, L-트립토판의 도입 유전자 tnaB, mtr이나, L-티로신의 도입 유전자인 tyrP의 발현량을 향상시킴으로써도, 효율적으로 L-페닐알라닌을 생산하는 균주를 취득할 수 있다[참조: EP1484410].

L-트립토판 생산균

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 변이 trpS 유전자에 의해 암호화되는 트립토파닐-tRNA 신테타제가 결손된 E.coli JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)[참조: 미국 특허 제5,756,345호], 세린에 의한 피드백 저해를 받지 않는 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립유전자 및 트립토판에 의한 피드백 저해를 받지 않는 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립유전자를 갖는 E.coli SV164(pGH5)[참조: 미국 특허 제6,180,373호], 트립토파나제가 결손된 E.coli AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)[참조: 미국 특허 제4,371,614호], 포스포에놀피루브산 생산능이 증대된 E.coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps[참조: WO9708333, 미국 특허 제6,319,696호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에스케리키아속에 속하는 L-트립토판 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국 특허출원공개 2003/0148473 및 2003/0157667호].

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA), 3-데옥시-D-아라비노헵튤론산-7-인산 신타제(aroG), 3-데하이드로퀴네이트 신타제(aroB), 시킴산 데하이드로게나제(aroE), 시킴산 키나제(aroL), 5-에놀산피루빌시킴산-3-인산 신타제(aroA), 코리슴산 신타제(aroC), 프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제 및, 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강된 주도 들 수 있다. 프레펜산 데하이드라타제 및 코리슴산 뮤타제는, 2기능 효소(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase(CM/PDH))로서 pheA 유전자에 의해 암호화되어 있다. 이들의 효소 중에서는, 포스포글리세레이트 데하이드로게나제, 3-데옥시-D-아라비노헵튤론산-7-인산 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 시킴산 데하이드라타제, 시킴산 키나제, 5-에놀산피루빌시킴산-3-인산 신타제, 코리슴산 신타제, 프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드로게나제가 특히 바람직하다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 모두 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 해제하는 변이를 이들 효소에 도입해도 양호하다. 이러한 변이를 갖는 주의 구체예로서는, 탈감작형 안트라닐레이트 신타제를 보유하는 E.coli SV164, 및, 피드백 저해가 해제된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이 serA 유전자를 포함하는 플라스미드 pGH5[참조: 국제공개 94/08031호]을 E.coli SV164에 도입함으로써 수득된 형질전환주를 들 수 있다.

L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 저해 해제형 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 트립토판 오페론이 도입된 주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-71397호, 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호, 미국 특허 제4,371,614호]도 들 수 있다. 또한, 트립토판 오페론(trpBA)중의 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여해도 양호하다. 트립토판 신타제는, 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화되는 α 및 β 서브유니트으로 이루어진다. 또한, 이소시트레이트 리아제-말레이트 신타제 오페론의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 개량해도 양호하다[참조: 국제공개 2005/103275호].

코리네형 세균으로서는 설파구아니딘에 내성주인 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ12118(FERM BP-478 일본 특허공보 01681002호], 트립토판 오페론이 도입된 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)63240794호], 코리네형 세균 유래의 시킴산 키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보01994749호]을 사용할 수 있다.

L-프롤린 생산균

L-프롤린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, ilvA 유전자가 결손되고, L-프롤린을 생산할 수 있는 E.coli 702ilvA(VKPM B-8012)[참조: 유럽 특허공개 공보 1,172,433호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 사용하는 세균은, L-프롤린 생합성에 관여하는 유전자의 일종 이상의 발현을 증대시킴으로써 개량해도 양호하다. L-프롤린 생산균에 바람직한 유전자의 예로서는, L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 글루타메이트 키나제를 암호화하는 proB 유전자[참조: 독일 특허 제3127361호]를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하는 세균은, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량해도 양호하다. 이러한 유전자로서는, b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: 유럽 특허공개 공보 1,239,041호]를 들 수 있다.

L-프롤린 생산능을 갖는 에스케리키아속에 속하는 세균의 예로서는, NRRL B-12403 및 NRRL B-12404[참조: 영국 특허 제2075056호], VKPM B-8012[참조: 러시아 특허출원 2000124295], 독일 특허 제3127361호에 기재된 플라스미드 변이체, Bloom F. R. et al(The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)에 기재된 플라스미드 변이체 등의 E.coli주를 들 수 있다.

L-아르기닌 생산균

L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, E.coli 237 주(VKPM B-7925)[참조: 미국 특허출원공개 2002/058315호], 및 변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 보유하는 그 유도주[참조: 러시아 특허출원 제2,001,112,869호], E.coli 382주(VKPM B-7926)[참조: 유럽 특허공개 공보 1,170,358호], N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산주[참조: 유럽 특허공개 공보 1,170,361호] 등의 에스케리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-아르기닌 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는, N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 유전자(argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 유전자(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자(argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제 유전자(argF), 아르기니노석신산 신테타제 유전자(argG), 아르기니노석신산 리아제 유전자(argH), 카바모일 포스페이트 신테타제 유전자(carAB)를 들 수 있다.

L-발린 생산균

L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, ilvGMEDA 오페론을 과잉 발현하도록 개변된 주[참조: 미국 특허 제5,998,178호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어테뉴에이션에 필요한 ilvGMEDA 오페론의 영역을 제거하고, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 감쇠하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 오페론의 ilvA 유전자가 파괴되어, 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.

L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 아미노아실 t-RNA 신테타제의 변이를 갖는 변이주[참조: 미국 특허 제5,658,766호]도 들 수 있다. 예를 들면, 이소류신 tRNA 신테타제를 암호화하는 ileS 유전자에 변이를 갖는 E.coli VL1970을 사용할 수 있다. E.coli VL1970은, 1988년 6월 24일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오르가니즘즈(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)에, 수탁번호 VKPM B-4411로 기탁되어 있다.

또한, 생육에 리포산을 요구하는, 및/또는, H⁺-ATPase를 결실하고 있는 변이주[참조: 국제공개 96/06926호]를 친주로서 사용할 수 있다.

코리네형 세균의 L-발린 생산균으로서는, 예를 들면, L-발린산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강하도록 개변된 균주를 들 수 있다. L-발린산 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면, ilvBNC 오페론에 의해 암호화되는 효소, 즉 ilvBN에 의해 암호화되는 아세토하이드록시산 신타제나 ivlC에 의해 암호화되는 이소메로 리덕타제[참조: 국제공개 00/50624호]를 들 수 있다. 한편, ilvBNC 오페론은, L-발린 및/또는 L-이소류신 및/또는 L-류신에 의한 오페론의 발현 조절을 받기 때문에, 생성되는 L-발린에 의한 발현 억제를 해제하기 위해서 어테뉴에이션을 해제하는 것이 바람직하다.

L-발린 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서는, L-발린 생산을 감소시키는 물질 대사 경로에 관여하는, 적어도 1종의 효소의 활성을 저하 또는 결손시킴으로써 실시해도 좋다. 예를 들면, L-류신 합성에 관여하는 트레오닌 데하이드라타제나 D-판토테네이트 합성에 관여하는 효소의 활성을 저하시키는 것이 고려된다[참조: 국제공개 00/50624호].

L-발린 생산능을 부여하는 다른 방법으로서, 아미노산 유사체 등에 대한 내성을 부여하는 방법도 들 수 있다.

예를 들면, L-이소류신 및 L-메티오닌 요구성, 및 D-리보스, 퓨린 리보뉴클레오사이드 또는 피리미딘 리보뉴클레오사이드에 내성을 가지며, L-발린 생산능을 갖는 변이주(FERM P-1841, FERM P-29, 일본 특허공보 제(소)53-025034)나, 폴리케토이드류에 내성을 갖는 변이주(FERM P-1763, FERM P-1764, 일본 특허공보 제(평)06-065314호), 아세트산을 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 L-발린 내성을 나타내고, 또한 글루코스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 피루브산 유사체(플루오로피루브산 등)에 감수성을 갖는 변이주(FERM BP-3006, FERM BP-3007, 일본 특허공보 3006929호)를 들 수 있다.

L-이소류신 생산균

L-이소류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, 6-디메틸아미노퓨린에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-304969호], 티아이소류신, 이소류신 하이드록사메이트 등의 이소류신 유사체에 내성을 갖는 변이주, 또한 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-130882호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 트레오닌 데아미나제, 아세토하이드록시산 신타제 등의 L-이소류신 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-458호,FR0356739, 및 미국 특허 제5,998,178호].

코리네형 세균의 L-이소류신 생산균으로서는, 측쇄 아미노산 배출 단백질을 암호화하는 brnE 유전자를 증폭시킨 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 2001-169788호], L-리신 생산균과의 프로토플라스트 융합에 의해 L-이소류신 생산능을 부여한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-74293호], 호모세린 데하이드로게나제를 강화한 코리네형 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-91193호], 트레오닌 하이드록사메이트 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-195293호], α-케토마론 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15695호], 메틸 리신 내성주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)61-15696호]를 들 수 있다.

L-메티오닌 생산균

L-메티오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는, L-트레오닌 요구주, 노르류신에 내성을 갖는 변이주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다[참조: 일본 공개특허공보 2000-139471호]. 또한, 메티오닌 리프레서를 결손한 주나, 호모세린 트랜스석시닐라제, 시스타티오닌 γ-신타제 등의 L-메티오닌 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2000-139471호].

유전자 재조합에 의해, 상기의 L-아미노산 생산균을 육종하는 경우, 사용하는 유전자는, 상기한 유전자 정보를 갖는 유전자나, 공지의 서열을 갖는 유전자에 한정되지 않고, 암호화되는 단백질의 기능이 손상되지 않는 한, 그 유전자의 호모로그나 인위적인 개변체 등, 보존적 변이를 갖는 유전자도 사용할 수 있다. 즉, 공지의 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 등을 포함하는 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다.

여기서, 「1 또는 수개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개를 의미한다. 또한, 보존적 변이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는, Phe, Trp, Tyr간에, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는, Leu, Ile, Val간에, 극성 아미노산인 경우에는, Gln, Asn간에, 염기성 아미노산인 경우에는, Lys, Arg, His간에, 산성 아미노산인 경우에는, Asp, Glu간에, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는, Ser, Thr 사이에서 서로 치환하는 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은, 보존적 치환이며, 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg으로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp으로부터 Asn, Glu 또는 Gln로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His으로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp으로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및 Vat로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, 유전자가 유래하는 미생물의 개체 차이, 종의 차이에 기초하는 경우 등의 천연적으로 생기는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 생기는 것도 포함된다. 이러한 유전자는, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 암호화되는 단백질의 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 공지된 유전자의 염기 서열을 개변함으로써 취득할 수 있다.

또한, 상기와 같은 보존적 변이를 갖는 유전자는, 암호화되는 아미노산 서열 전체에 대해, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지며, 야생형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 양호하다.

또한, 유전자의 서열에 있어서의 각각의 코돈은, 유전자가 도입되는 숙주에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환한 것이라도 양호하다.

보존적 변이를 갖는 유전자는, 변이제 처리 등, 통상 변이 처리에 사용되는 방법에 의해 취득된 것이라도 양호하다.

또한, 유전자는, 공지의 유전자 서열의 상보 서열 또는 그 상보 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 공지의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 양호하다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 그것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도에서, 1회, 보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.

프로브로서는, 유전자의 상보 서열의 일부를 사용할 수도 있다. 이러한 프로브는, 공지의 유전자 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 이들의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR로 제작할 수 있다. 예를 들면, 프로브로서, 300bp 정도 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세정의 조건은, 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.

상기의 유전자의 호모로그 및 보존적 변이에 관한 기재는, 상기의 리파제 유전자에 관해서도 동일하게 적용된다.

<3> L-아미노산의 제조법

본 발명의 L-아미노산의 제조법에 있어서는, 미세조류의 상기 처리물을 포함하는 배지에서, L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취한다. 또는, (a) 미세조류를 배지에서 배양하고, 당해 배양물을, 파쇄, 추출, 분획 및 가수분해로부터 선택되는 1 이상의 방법에 의해 처리하고, L-아미노산 생산능을 갖는 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진시키는 당해 미세조류의 처리물을 조제하고, (b) 당해 세균을, 당해 미세조류의 처리물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고, (c) 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취한다. 상기 처리물은 탄소원으로서 포함되는 것이 바람직하고, 이 경우에는, 특히 전분의 당화물 또는 유지의 가수분해물을 포함하는 처리물인 것이 바람직하다.

상기 「탄소원으로서」란, 세균의 증식 및 L-아미노산의 제조에 있어서, 균체 성분 및 L-아미노산을 구성하는 탄소의 공급원으로서 실질적으로 기여할 수 있는 것을 의미한다. 미세조류에 의해 생산되는 유기물을 가하지 않은 배지에 비해, 가수분해물을 첨가한 배지에서 배양했을 때가 세균의 생육 또는 L-아미노산의 생성 축적이 양호하면, 상기 가수분해물은 탄소원으로 평가된다. 한편, 배지는 미세조류에 의해 생산되는 유기물만을 탄소원으로서 포함하고 있어도 되고, 다른 탄소원을 포함하고 있어도 된다.

본 발명의 방법은, 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양법(continuous culture) 모두 사용할 수 있고, 배지 중의 유지의 가수분해물은 초발 배지에 포함되어 있어도 되고, 유가 배지에 포함되어 있어도 되며, 이들 양자에 포함되어 있어도 된다.

유가 배양이란, 배양 용기에 배지를 연속적 또는 간헐적으로 유가하고, 배양 종료시까지 그 배지를 용기로부터 제거하지 않는 배양 방법을 말한다. 또한 연속 배양이란, 배양 용기에 배지를 연속적 또는 간헐적으로 유가하는 동시에 용기로부터 배지(통상, 유가하는 배지와 등량)을 제거하는 방법을 말한다. 또한, 초발 배지란, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 유가 배지를 유가시키기 전의 회분 배양(batch 배양)에 사용하는 배지(배양 개시시의 배지)를 의미하고, 유가 배지란 유가 배양 또는 연속 배양을 실시할 때에 발효조에 공급하는 배지를 의미한다. 또한, 회분 배양(batch 배양)이란, 1회마다 새로운 배지를 준비하고, 거기에 주를 심어서 수확까지 배지를 가하지 않는 방법을 의미한다.

사용하는 미세조류에 의해 생산되는 유기물은, L-아미노산을 제조하기에 적합한 농도이면 어떤 농도로 사용해도 상관없다. 전분의 당화물인 글루코스 농도로서는, 바람직하게는 0.05 내지 50w/v% 정도, 보다 바람직하게는 0.1 내지 40w/v% 정도, 특히 바람직하게는 0.2 내지 20w/v% 정도 배지에 함유시킨다. 유지의 가수분해물인 글리세롤 및 지방산의 양으로서는, 0.01 내지 10w/v%, 바람직하게는 0.02 내지 5w/v%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 2w/v% 정도 배지에 함유시키는 것이 바람직하다. 미세조류에 의해 생산되는 유기물은, 단독으로 사용할 수도 있고, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 폐당밀, 전분가수분해물 등의 다른 탄소원과 조합하여 사용할 수도 있다. 이 경우, 미세조류에 의해 생산되는 유기물과 다른 탄소원은 임의의 비율로 혼합하는 것이 가능하지만, 탄소원 중의 미세조류에 의해 생산되는 유기물의 비율은, 10중량% 이상, 보다 바람직하게는 50중량% 이상, 보다 바람직하게는 70중량%인 것이 바람직하다. 다른 탄소원으로서 바람직한 것은, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 락토제, 갈락토스, 폐당밀, 전분가수분해물이나 바이오매스의 가수분해에 의해 수득된 당액 등의 당류, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 석신산 등의 유기산류이다.

또한, 전분의 효소적 가수분해를, 완충액으로서 유기산의 존재하에서 실시한 경우, 당해 유기산을 당화물과 함께 탄소원으로서 배지에 첨가해도 된다. 탄소원 중의 전분의 당화물과 유기산의 비율은 임의라도 양호하지만, 1:1 내지 1:3이 바람직하다. 유기산으로서는, 사용하는 세균이 자화할 수 있는 것이면 어느 것이라도 양호하지만, 예를 들면, 아세트산, 시트르산, 석신산, 푸마르산 등을 들 수 있고, 특히 아세트산이 바람직하다.

배양 개시시의 미세조류에 의해 생산되는 전분의 당화물과 유지의 가수분해물의 바람직한 초발 농도는 상기한 바와 같지만, 배양 중의 미세조류에 의해 생산되는 전분의 당화물과 유지의 가수분해물의 소비에 따라, 미세조류에 의해 생산되는 유기물의 혼합물을 첨가해도 양호하다.

또한, 본 발명에 있어서, 조류 유래의 유기물은, 배양의 전체 공정에 있어서 일정 농도 포함되어도 되고, 유가 배지에만 또는 초발 배지에만 첨가되어 있어도 되며, 그 밖의 탄소원이 충족되어 있으면, 일정 시간 유지의 가수분해물이 부족한기간이 있어도 된다. 일시적이란, 예를 들면 발효 전체의 시간 중 10% 이내, 또는 20% 이내, 최대로 30% 이내의 시간으로 유지의 가수분해물이 부족해도 된다. 이와 같이 일시적으로 유지의 가수분해물의 농도가 0이 되는 경우가 있어도, 조류에 의해 생산되는 유기물을 포함하는 배지에서의 배양 기간이 존재하는 경우는, 본 발명의「배지는 조류에 의해 생산되는 유기물을 탄소원으로서 포함하고」라는 문언에 포함된다.

사용하는 배지는, 조류에 의해 생산되는 유기물을 포함하는 것 이외에는, 미생물을 사용한 L-아미노산의 발효 생산에 있어서 종래부터 사용되어 온 배지를 사용할 수 있다. 즉, 탄소원에 더해서, 질소원, 무기 이온 및 필요에 따라 그 밖의 유기 성분을 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 여기에서, 질소원으로서는, 황산암모늄, 염화암모니아, 인산암모늄, 아세트산암모늄, 우레아 등의 무기 암모늄염 또는 질산염, 대두 가수분해물 등의 유기 질소, 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다. 또한, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수침지 여액, 대두 가수분해물 등도 이용할 수 있다. 배지 중에 이러한 질소원이 1종만 포함되어 있어도 되고, 2종 이상 포함하고 있어도 된다. 이들 질소원은, 초발 배지에도 유가 배지에도 사용할 수 있다. 또한, 초발 배지, 유가 배지 모두, 동일한 질소원을 사용해도 되고, 유가 배지의 질소원을 초발 배지와 상이한 것을 사용해도 된다.

본 발명의 배지에는, 탄소원, 질소원 이외에 인산원, 유황원이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 인산원으로서는, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨, 피롤린산 등의 인산 중합체 등을 이용할 수 있다. 또한, 유황원이란, 유황 원자를 포함하고 있는 것이면 어느 것이라도 양호하지만, 황산염, 티오황산염, 아황산염 등의 황산염, 시스테인, 시스틴, 글루타티온 등의 황 함유 아미노산이 바람직하고, 이 중에서도 황산암모늄이 바람직하다.

또한, 배지에는, 상기 성분 이외에, 증식 촉진 인자(증식 촉진 효과를 갖는 영양소)가 포함되어 있어도 된다. 증식 촉진 인자란, 미량 금속류, 아미노산, 비타민, 핵산, 또한 이러한 것을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 대두 단백 분해물 등을 사용할 수 있다. 미량 금속류로서는, 철, 망간, 마그네슘, 칼슘 등을 들 수 있고, 비타민으로서는, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니코틴, 니코틴산아미드, 비타민 B12 등을 들 수 있다. 이러한 증식 촉진 인자는 초발 배지에 포함되어 있어도 되고, 유가 배지에 포함되어 있어도 된다.

또한, 배지에는, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다. 특히 본 발명에 사용할 수 있는 L-리신 생산균은, 후술과 같이 L-리신 생합성 경로가 강화되고 있고, L-리신 분해능이 약화되어 있는 것이 많기 때문에, L-트레오닌, L-호모세린, L-이소류신, L-메티오닌으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상을 첨가하는 것이 바람직하다. 초발 배지와 유가 배지는, 배지 조성이 동일해도 되며, 상이해도 된다. 또한, 초발 배지와 유가 배지는, 유황 농도가 동일해도 되고, 상이해도 된다. 또한, 유가 배지의 유가가 다단계로 이루어지는 경우, 각각의 유가 배지의 조성은 동일해도 되고, 상이해도 된다.

또한, 본 발명에서 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 및 필요에 따라서 기타 성분을 포함하는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것이라도 양호하다.

조류에 의해 생산되는 유기물은 탄소원 이외에, 아미노산에 사용되는 성분을 포함하고 있다. 본 발명에서 사용하는 배지는, 필요에 따라서, 질소원 및 그 밖의 성분을 통상의 배지보다도 감소시키는 것이 가능하다.

배양은 호기적 조건하에서 1 내지 7일간 실시하는 것이 양호하며, 배양 온도는 20 내지 45℃, 바람직하게는 24 내지 45℃, 특히 바람직하게는 33 내지 42℃에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양은 통기 배양이 바람직하고, 산소 농도는, 포화 농도에 대해 5 내지 50%로, 바람직하게는 10% 정도로 조절해서 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 배양 중의 pH는 5 내지 9가 바람직하다. 한편, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 예를 들면 탄산칼슘, 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다.

상기와 같은 조건하에서, 바람직하게는 10시간 내지 12O시간 정도 배양함으로써, 배양액 중에 저량(著量)의 L-아미노산이 축적된다. 축적되는 L-아미노산의 농도는 배지 또는 균체로부터 채취, 회수할 수 있는 농도이면 어느 것이라도 양호하지만, 바람직하게는 1g/L 이상, 보다 바람직하게는 50g/L 이상, 더욱 바람직하게는 100g/L 이상이다.

또한, L-리신 등의 염기성 아미노산을 제조할 때는, 배양 중의 pH가 6.5 내지 9.0, 배양 종료시의 배지의 pH가 7.2 내지 9.0이 되도록 제어하고, 발효 중의 발효조내 압력이 양이 되도록 제어하거나, 또는, 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하여, 배지 중의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 적어도 2g/L 20mM 이상 존재하는 배양기가 있도록 하고, 상기 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 염기성 아미노산을 주로 하는 양이온의 카운터 이온으로 하는 방법으로 발효하고, 목적의 염기성 아미노산을 회수하는 방법으로 제조를 해도 좋다[참조: 일본 공개특허공보 2002-65287, US2002-0025564A, EP1813677A].

또한, L-글루탐산 발효에 있어서는, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하고, 배지 중에 L-글루탐산을 석출시키면서 배양을 실시할 수도 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0을 들 수 있다[참조: 유럽 특허출원공개 제1078989호 명세서]

배양액으로부터의 L-아미노산의 회수는 통상 이온 교환 수지법, 침전법 기타 공지의 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다. 또한, 균체내에 L-아미노산이 축적되는 경우에는, 예를 들면 균체를 초음파 등에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 균체를 제거하여 수득되는 상청으로부터 이온 교환 수지법 등에 의해, L-아미노산을 회수할 수 있다. 회수되는 L-아미노산은, 유리 L-아미노산이라도, 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염을 포함하는 염이라도 양호하다.

또한, 본 발명에 있어서 채취되는 L-아미노산은, 목적으로 하는 L-아미노산 이외에 미생물 균체, 배지 성분, 수분, 및 미생물의 대사 부산물을 포함하고 있어도 된다. 채취된 L-아미노산의 순도는, 50% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상이다[참조: US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878].

실시예 1

이하, 실시예에서, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 본 실시예에는, 텍사스대학 조류 컬처 컬렉션(The University of Texas at Austin, The Culture Collection of Algae(UTEX), 1 University Station A6700, Austin, TX 78712-0183, USA)로부터 입수한 Chlorella kessleri 11h주(UTEX 263), Neochloris oleoabundans UTEX 1185주, Nannochloris sp. UTEX LB 1999주 및 Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2주를 사용하였다.

〔실시예 1(1)〕미세조류 Chlorella kessleri의 배양

Chlorella kessleri를, 100mL의 0.2×감보그 B5 배지[니혼세약쿠 제조]을 넣은 500mL용 삼각 플라스크에서 30℃, 빛 강도 10,000lux[TOMY사제 배양 장치 CL-301]로 6일 동안 진탕 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. 한편, 광원에는, 형광등으로부터의 백색광을 사용하였다. 0.2×감보그 B5 배지 800mL을 넣은 1L 용 배지병(medium bottle)에, 전배양액 16mL을 첨가하고, 배양 온도 30℃, 빛 강도 10,000lux로, 500mL/min으로, CO₂ 농도가 3%가 되도록 공기와 CO₂의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 12일간 배양을 실시하였다.

(0.2×감보그 B5 배지)

KNO₃ 500mg/L

MgSO₄·7H₂O 50mg/L

NaH₂PO₄·H₂O 30mg/L

CaCl₂·2H₂O 30mg/L

(NH₄)₂SO₄ 26.8mg/L

Na₂-EDTA 7.46mg/L

FeSO₄·7H₂O 5.56mg/L

MnSO₄·H₂O 2mg/L

H₃BO₃ 0.6mg/L

ZnSO₄·7H₂O 0.4mg/L

KI 0.15mg/L

Na₂MoO₂·2H₂O 0.05mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.005mg/L

CoCl₂·6H₂O 0.005mg/L

120℃ 15분 오토클레이브 살균

〔실시예 1(2)〕Chlorella kessleri로부터의 전분 당화액의 조제

실시예 1(1)의 배양액 1L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 그 침전물에 80mL의 에탄올을 가하고, 조체를 현탁시킨 후에 30분 자비하였다. 그 현탁액을 원심분리하고, 조체를 침전시킨 후에, 80mL의 에탄올로 2회 세정한 후, 데시케이터 내에서 건조시켰다. 그 건조 조체에 40mL의 0.2M KOH를 첨가하고, 30분 동안 자비하고, 다시 초음파 장치[Kubota사 제조의 INSONATOR 201MA]에 의해 15,000W, 10분의 처리를 실시하여 세포를 파쇄하였다. 그 파쇄액에 8mL의 1M 아세트산 용액, 250U의 아밀로글루코시다제[시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사 제조의 A-9228]를 가하고, 55℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 반응물 중의 글루코스를 바이오틱 애널라이저 AS210[사쿠라세이키 제조]로 정량하였다. 효소 농도를 2배로 해도, 생성되는 글루코스량은 거의 변화가 없었던 점에서, 전분 중 대부분이 글루코스로 변환되어 있다고 추정되었다. 조체 파쇄물(잔사)을 원심분리에 의해 제거하고, 그 상청을 아미노산 발효의 탄소원으로서 사용하였다.

〔실시예 1(3)〕Chlorella kessleri 유래의 전분 당화액을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

L-리신 생산균으로서 국제공개 제2006/078039호 팜플렛에 기재되어 있는 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를 사용하였다. WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를 스트렙토마이신 황산염 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지(Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L, 한천 15g/L)에서 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 한천 배지 위의 세포를 긁어 모아 스트렙토마이신 황산염 20mg/L을 함유하는 L-리신 생산 배지 40mL을 넣은 500mL용 삼각 플라스크에 식균하고, 배양 온도 37℃에서, 24시간 동안 배양을 실시하였다. 본 배양에 있어서는, Chlorella kessleri가 생산하는 전분으로부터 조제한 실시예 1(2)의 당화액(글루코스량으로서 2.75g/L)과 그 조제시에, 완충액으로서 이용한 아세트산 4.8g/L을 탄소원으로 하였다. 대조로서, 동 농도의 글루코스, 또는 아세트산의 한쪽을 포함하는 배지와, 글루코스와 아세트산의 양자를 탄소원으로서 포함하는 배지에서 배양을 실시하였다.

(L-리신 생산 배지 조성)

(A구)

탄소원

글루코스 2.75g/L

아세트산 4.8g/L

(B구)

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1g/L

Yeast Extract 2g/L

FeSO₄·7H₂O 10mg/L

MnSO₄·4H₂O 10mg/L

(C구)

탄산칼슘 15g/L

A구, B구는 115℃에서 10분간, 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간, 건열 멸균하였다. 실온으로 냉각후 3개를 혼합하고, MgSO₄·7H₂O 용액을 최종농도 1g/L이 되도록 첨가하였다.

배양 종료후, 글루코스의 소비를 바이오틱 애널라이저 AS210[사쿠라세이키 제조]로 확인하고, 생육도를 생균수의 카운트에 의해, L-리신량은 BF-5[오시케소쿠키 제조]에 의해 측정하였다. 플라스크 2개씩 실시한 배양 결과의 평균치를 표 1에 기재한다.

시약 글루코스와 아세트산을 각각 단독의 탄소원으로 한 경우, 각각, 1.1g/L, 0.3g/L의 L-리신을 축적하였다. 시약 글루코스와 아세트산을 혼합하여 탄소원으로 한 경우에는, 각 탄소원 단독으로의 L-리신 축적량의 합계에 상당하는 1.4g/L의 L-리신을 축적하였다. 이것과 동농도의 조류가 생산한 전분 유래의 글루코스 및 아세트산으로부터는, 동등 이상의 1.8g/L의 L-리신의 축적을 확인하고, 유효한 탄소원인 것이 나타났다.

탄소원	생균수 (x107)	L-리신 농도 (g/L)
조류 유래 글루코스 2.75 g/L 아세트산 4.8g/L	14.7	1.8
시약 글루코스 2.75 g/L 아세트산 4.8g/L	7.6	1.4
시약 글루코스 2.75 g/L	83.0	1.1
아세트산 4.8g/L	6.0	0.3

〔실시예 2(1)〕Chlorella kessleri로부터의 전분을 포함하지 않는 유기물액의 조제

실시예 1(1)의 배양액 3.6L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 그 침전물에 100mL의 에탄올을 가하고, 조체를 현탁시킨 후, 실온에서 24시간 동안 정치하였다. 그 후, 여과를 실시하여 여과액을 회수하고, 조체 잔사를 100mL의 에탄올로 2회 추출 조작을 실시하여, 합계 300mL의 에탄올 추출액으로 하였다. 그 에탄올 추출액을 로터리 증발기에 의해 에탄올 제거한 후, 멸균수에 용해하고, 수산화칼륨 수용액으로 pH 7.0으로 맞추고, 조체 유래의 유기물액 45mL을 조제하였다. 그 유기물액을, 115℃에서 10분간 오토클레이브 멸균한 후, L-리신 발효의 배지 성분의 대체로서 사용하였다. 본 유기물액은 전분을 포함하고 있지 않기 때문에, 아미노산 생산균에 이용할 수 있는 탄소원은 포함되어 있지 않다.

〔실시예 2(2)〕Chlorella kessleri 유래의 전분을 포함하지 않는 유기물액을 탄소원 이외의 배지 성분으로서 사용한 L-리신 생산 배양

L-리신 생산균인 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를, 스트렙토마이신 황산염 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에서 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 한천 배지 위의 세포를 긁어 모아, 스트렙토마이신 황산염 20mg/L를 함유하는 L-리신 생산 배지 4mL을 넣은 굵은 시험관에 식균하고, 배양 온도 37℃에서, 24시간 동안 배양을 실시하였다.

본 배양에 있어서는, L-리신 생산 배지 중의 B구의 성분을 반감한 배지(이하, 본 배지를 「L-리신 생산 배지(반량 B구)」라고 부른다)에 Chlorella kessleri조체로부터 추출한 실시예 2(1)의 유기물액 75μL(배양액으로 환산하면, 6mL분에 상당)을 첨가하고, 배양을 실시하였다. 대조로서는, L-리신 생산 배지, L-리신 생산 배지(반량 B구), 및 글루코스가 들어 있지 않은 L-리신 생산 배지(반량 B구)에 유기물액 75μL을 첨가한 조건으로, 배양을 실시하였다.

[L-리신 생산 배지 조성]

(A구)

글루코스 20g/L

(B구)

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1g/L

Yeast Extract 2g/L

FeSO₄·7H₂O 10mg/L

MnSO₄·4H₂O 10mg/L

(C구)

탄산칼슘 30g/L

A구, B구는 115℃에서 10분간, 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간, 건열 멸균하였다.

실온으로 냉각후, 3개를 혼합하고, MgSO₄·7H₂O 용액을 최종농도 1g/L이 되도록 첨가하였다.

배양 종료후, 글루코스의 소비를 바이오틱 애널라이저 AS210[사쿠라세이키 제조]로 확인하고, 생육도를 생균수의 카운트에 의해, L-리신량은 BF-5[오시케소쿠키 제조]에 의해 측정하였다. 굵은 시험관 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 2에 기재한다.

L-리신 생산 배지, L-리신 생산 배지(반량 B구)에서 배양한 경우, 각각, 8.09g/L, 7.89g/L의 L-리신을 축적하였다. 또한, 글루코스가 들어 있지 않은 L-리신 생산 배지(반량 B구)에 조체 추출의 유기물액을 첨가한 경우, L-리신 축적량은 0.14g/L이며, 탄소원으로서는 거의 사용되지 않는다. 한편, L-리신 생산 배지(반량 B구)에 조체 추출 유기물액을 첨가하여 배양한 경우, 8.34g/L의 L-리신을 축적하고, L-리신 생산 배지에서의 L-리신 축적량을 상회하는 결과로부터, 조체 추출 유기물액이 탄소원 이외의 배지 성분의 대체로서 유효한 것이 나타났다.

배지 성분	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
L-리신 생산 배지	22.2	8.09
L-리신 생산 배지 (반량 B구)	43.6	7.89
L-리신 생산배지 (반량 B구) 조체 추출 유기물액	39.1	8.34
글루코스를 제외한 L-리신 생산 배지 (반량 B구) 조체 추출 유기물액	6.3	0.14

〔실시예 3(1)〕Chlorella kessleri의 자 퍼멘터에 의한 배양

Chlorella kessleri를, 0.2×감보그 B5 배지[니혼세약쿠 제조] 500mL을 넣은 2L용 자 퍼멘터[ABLE사 제조]로 30℃, 빛 강도 20,000lux로 7일 동안 교반 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. 한편, 본 자 퍼멘터는, 광원으로서, 백색광을 발하는 환형 형광등이 유리 용기의 주변을 둘러싸는 광조사형의 자 퍼멘터이다. 0.2×감보그 B5 배지 1.5L을 넣은 2L용 미니 자 퍼멘터에, 전배양액 30mL을 첨가하고, 배양 온도 30℃, 빛 강도 20,000lux로, 500mL/min로 CO₂ 농도를 3%로 유지하면서 공기-CO₂ 혼합 가스를 불어 넣고, 14일간 배양을 실시하였다.

[실시예 3(2)〕Chlorella kessleri로부터의 고온 처리에 의한 전분을 포함하는 유기물의 혼합 용액과 아밀라제에 의한 당화액의 조제

실시예 3(1)의 조류 배양액 300mL을 고온 반응 장치 내의 반응 용기에 투입하고, 교반하면서 60분에 걸쳐 175℃ 또는 215℃까지 승온시킨 후, 각각의 온도에서 5분간 유지시켰다.

175℃의 고온 처리한 조체 파쇄액 200mL을, 3N HCl을 사용하여 pH 5.5로 조정한 후, 500U의 아밀로글루코시다제[시그마-알드리치사 제조의 A-9228]을 가하고, 55℃에서 교반하면서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 여과를 실시하여 여과액을 회수하고, 로터리 증발기[EYELA사 제조]를 사용하여 10mL까지 농축시켰다. 그 농축액을, 1N KOH를 사용하여 pH 7.8로 조정하고, 15mL로 메스업한 후, 115℃, 10분의 조건으로, 오토클레이브 처리를 실시하였다.

〔실시예 3(3)〕Chlorella kessleri 유래의 고온 처리에 의한 전분을 포함하는 유기물의 혼합 용액의 아밀라제 처리에 의한 당화액을 탄소원으로 한 L-글루탐산 생산 배양

L-글루탐산 생산균으로서는, 일본 공개특허공보 2006-340603호에 기재된 브레비박테리움 락토퍼멘텀 L30-2주를 사용하였다. L30-2주를 CM-Dex 플레이트 배지에 파종하고 31.5℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 플레이트 배지 위의 세포를 1백금이분 긁어 모아 L-글루탐산 생산 배지 4mL을 넣은 굵은 시험관에 식균하고, 배양 온도 31.5℃에서, 13시간 동안 배양을 실시하였다. 본 배양에 있어서의 탄소원으로서, Chlorella kessleri의 조류 전분 분해물로부터 조제한 실시예 3(2)의 당화액(글루코스량으로서 1.0g/L), 및 대조로서 동 농도 시약 글루코스를 사용하였다. 또한, L-글루탐산 생산 배지, 및 L-글루탐산 생산 배지 중의 B구의 성분을 반감한 배지(이하, 본 배지를 「L-글루탐산 생산 배지(반량 B구)」라고 부른다)의 2종류의 배지 성분으로, 배양을 실시하였다.

[CM-Dex 배지]

글루코스 5g/L

폴리펩톤 10g/L

효모 추출물 10g/L

KH₂PO₄ 1g/L

MgSO₄·7H₂O 0.4g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

요소 3g/L

대두 가수분해물 1.2g/L

비오틴 10㎍/L

NaOH를 사용하고, pH 7.5로 조정. 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균 조건.

[L-글루탐산 생산 배지 조성]

(A구)

탄소원

조류 유래의 전분 분해물 1.0g/L(글루코스)

(B구)

(NH₄)₂SO₄ 15g/L

KH₂PO₄ 1g/L

MgSO₄·7H₂O 0.4g/L

FeSO₄·7H₂O 10mg/L

MnSO₄·4H₂O 10mg/L

VB1·HCl 200㎍/L

비오틴 300㎍/L

대두 가수분해물 0.48g/L

(C구)

탄산칼슘 50g/L

A구, B구는, KOH를 사용하여 각각 pH 7.8, pH 8.0으로 조정하고 115℃에서 10분, 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간, 건열 멸균하였다. 각각 실온으로 냉각후, 3개를 혼합하였다.

배양 종료후, L-글루탐산의 축적량은 BF-5[오시케소쿠키 제조]에 의해 측정하였다. 또한, L-글루탐산 생산 배지 및 L-글루탐산 생산 배지(반량 B구)에는, 대두 가수분해물 유래의 L-글루탐산이, 원래 0.45g/L, 0.24g/L 포함되어 있기 때문에, 측정값으로부터 배지 성분 중의 대두 가수분해물분의 L-글루탐산량을 뺀 값을 표 3에 기재한다.

시약 글루코스를 탄소원으로 하고, L-글루탐산 생산 배지, L-글루탐산 생산 배지(반량 B구)에서 배양한 경우, 각각, 0.74g/L, 0.57g/L의 L-글루탐산을 축적하였다. 한편, 조류 유래의 전분 분해물(조류 유래 글루코스)을 탄소원으로 한 경우에는, L-글루탐산의 축적량은 0.84g/L, 0.70g/L이 되고, 시약 글루코스를 사용한 경우보다도 L-글루탐산의 축적량이 향상되는 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터, 조류 유래의 전분 분해물은, L-글루탐산 배양의 탄소원으로서 유용한 것이 나타났다.

배지 성분 탄소원	L-글루탐산 농도 (g/L)
글루탐산 생산 배지 시약 글루코스 1.0 g/L	0.74
글루탐산 생산 배지 (반량 B구) 시약 글루코스 1.0 g/L	0.57
글루탐산 생산 배지 조류 유래 글루코스 1.0 g/L	0.84
글루탐산 생산 배지 (반량 B구) 조류 유래 글루코스 1.0 g/L	0.70

〔실시예 4(1)〕Chlorella kessleri로부터의 고온 처리에 의한 전분을 포함하는 유기물의 혼합 용액의 아밀라제와 리파제에 의한 분해물의 조제

실시예 3(2)에서 조제한 215℃의 고온 처리한 조체 파쇄액 80mL의 pH를 1N HCl을 사용하여 6.0으로 조정한 후, 400U의 아밀로글루코시다제 단독[시그마-알드리치사 제조 A-9228] 또는 동량의 아밀로글루코시다제와 1000U의 리파제[시그마-알드리치사 제조 L1754] 양 효소를 가하고, 50℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후의 각 반응액을 10mL까지 농축한 후, 아밀로글루코시다제 단독 처리액 중의 잔사를 원심분리로 제거하고, 또한 상청의 pH를 1N NaOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 15ml로 메스업한 후, 120℃에서 20분의 조건으로, 오토클레이브 처리하였다. 한편, 양 효소의 처리액은, 1.13mL의 10% Tween 80 수용액을 가하고, 60℃로 가온한 후, 볼텍스로 교반하였다. 다음에, 그 양 효소의 처리액 중의 잔사를 원심분리로 제거하고, 또한 상청의 pH를 1N NaOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 15mL로 메스업한 후, 120℃, 20분의 조건으로, 오토클레이브 처리하였다. 각 탄소원 중의 글루코스와 지방산의 양을 측정하고, 배양 평가에 사용하였다.

〔실시예 4(2)〕fadR을 결손한 에스케리키아 콜라이 L-리신 생산균의 구축

에스케리키아 콜라이의 지방산 대사를 조절하는 전사 인자 FadR은 fadR 유전자(서열번호 15)에 의해 암호화되어 있다[참조: DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691]. 본 유전자 파괴의 친주는, 에스케리키아 콜라이의 L-리신 생산주로서, 국제특허공보 WO2006/078039에 기재된 WC196ΔcadAΔldcC주를 사용하였다.

지방산 대사를 조절하는 전사 인자를 암호화하는 fadR 유전자의 결실은, Datsenko와 Wanner에 의해 최초로 개발된 「Red-driven integration」이라고 불리는 방법[참조: Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645]과 λ파지 유래의 절취 시스템[참조: Cho, E. H., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. 2002. J. Bacteriol. 184: 5200-5203]에 의해 실시하였다. 「Red-driven integration」에 의하면, 목적으로 하는 유전자의 일부를 합성 올리고뉴클레오타이드의 5'측에, 항생 물질 내성 유전자의 일부를 3'측에 디자인한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수득된 PCR 산물을 사용하고, 1단계로 유전자 파괴주를 구축할 수 있다. 또한 λ파지 유래의 절취 시스템을 조합함으로써, 유전자 파괴주에 도입한 항생 물질 내성 유전자를 제거할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2005-058227호, WO2005/010175]

PCR의 주형으로서, 플라스미드 pMW118-attL-kan-attR[참조: 일본 공개특허공보 2005-058227호, WO2005/010175)을 사용하였다. pMW118-attL-kan-attR은, pMW118[타카라바이오사 제조]에 λ파지의 부착 부위인 attL 및 attR 유전자와 항생 물질 내성 유전자인 kan 유전자를 삽입한 플라스미드이며, attL-kan-attR의 순으로 삽입되어 있다.

이러한 attL과 attR의 양 말단에 대응하는 서열을 프라이머의 3' 말단에, 목적 유전자인 fadR 유전자의 일부에 대응하는 프라이머의 5' 말단에 갖는 서열번호 16 및 17에 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머에 사용하여 PCR을 실시하였다.

증폭된 PCR 산물을 아가로스 겔로 정제하고, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드 pKD46을 포함하는 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC주에 전기천공에 의해 도입하였다. 플라스미드 pKD46[참조: Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-6645]은, 아라비노스 유도성 ParaB 프로모터로 제어되는 λRed 상동 재조합 시스템의 Red 레콤비나제를 암호화하는 유전자(γ, β, exo 유전자)를 포함하는 λ파지의 합계 2154 염기의 DNA 단편(GenBank/EMBL 등록번호 J02459, 제31088번째 내지 33241번째)를 포함한다. 플라스미드 pKD46은 PCR 산물을 WC196ΔcadAΔldcC주의 염색체에 편입시키기 위해 필요하다.

전기천공용의 컴피턴트 세포는 다음과 같이 하여 조제하였다. 즉, 100mg/L의 암피실린을 포함한 LB 배지(트립톤 10g/L, Yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L) 중에서 30℃, 밤새 배양한 에스케리키아 콜라이 WC196주를, 암피실린(100mg/L)과 L-아라비노스(1mM)을 포함한 5mL의 LB 배지에서 100배 희석하였다. 수득된 희석물을 30℃에서 통기하면서 OD600이 약 0.6이 될 때까지 생육시킨 후, 100배로 농축하고, 10% 글리세롤로 3회 세정함으로써 전기천공에 사용할 수 있게 하였다. 전기천공은 70μL의 컴피턴트 세포와 약 100ng의 PCR 산물을 사용하여 실시하였다. 전기천공 후의 세포는 1mL의 SOC 배지[참조: Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork]을 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Km(카나마이신)(40mg/L)을 포함하는 LB 한천 배지 위에서 평판배양하고, Km 내성 재조합체를 선택하였다. 다음에, pKD46 플라스미드를 제거하기 위해, Km을 포함하는 LB 한천 배지 위, 42℃에서 2회 계대하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성을 시험하고, pKD46이 탈락되어 있는 암피실린 감수성 주를 취득하였다.

카나마이신 내성 유전자에 의해 식별할 수 있었던 변이체의 fadR 유전자의 결실을, PCR에 의해 확인하였다. 수득된 fadR 결손주를 WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan주라고 명명하였다.

다음에, fadR 유전자 내에 도입된 att-kan 유전자를 제거하기 위해서, 헬퍼 플라스미드, 상기의 pMW-intxis-ts[참조: 일본 공개특허공보 2005-058227호, WO2005/010175]를 사용하였다. pMW-intxis-ts는, λ파지의 인테그라제(Int)를 암호화하는 유전자, 절제 효소(Xis)를 암호화하는 유전자를 탑재하고, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드이다.

상기에서 수득된 WC196ΔcadAΔldcCΔfadR::att-kan주의 컴피턴트 세포를 통상적인 방법에 의해 제작하고, 헬퍼 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환하고, 30℃에서 100mg/L의 암피실린을 포함하는 LB 한천 배지 위에서 평판 배양하고, 암피실린 내성주를 선택하였다.

다음에, pMW-intxis-ts 플라스미드를 제거하기 위해서, LB 한천 배지 위, 42℃에서 2회 계대하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성, 및 카나마이신 내성을 시험하고, att-kan 및 pMW-intxis-ts가 탈락되어 있는 fadR 파괴주인 카나마이신, 암피실린 감수성 주를 취득하였다. 이 주를 WC196ΔcadAΔldcCΔfadR주라고 명명하였다.

WC196LCΔfadR주를 dapA, dapB, lysC 및 ddh 유전자를 탑재한 리신 생산용 플라스미드 pCABD2[참조: WO95/16042]로 통상적인 방법에 따라 형질전환하고, WC196ΔcadAΔldcCΔfadR/pCABD2주를 수득하였다.

상기에서 제작한 주를 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 LB 배지에서 OD₆₀₀가 약 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 배양액과 등량의 40% 글리세롤 용액을 가하고 교반한 후, 적당량씩 분주, -80℃로 보존하고, 글리세롤 스톡으로 하였다.

〔실시예 4(3)〕Chlorella kessleri 유래의 고온 처리에 의한 전분을 포함하는 유기물의 혼합 용액의 아밀라제와 리파제에 의한 분해물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

L-리신 생산균인 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcCΔfadR/pCABD22를, 스트렙토마이신 황산염 20mg/L을 함유하는 LB 한천 배지에서 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 한천 배지 위의 세포를 긁어 모아, 스트렙토마이신 황산염 20mg/L를 함유하는 L-리신 생산 배지 4mL을 넣은 굵은 시험관에 식균하고, 배양 온도 37℃에서, 24시간 동안 배양을 실시하였다. 본 배양에 있어서는, Chlorella kessleri가 생산하는 전분으로부터 조제한 실시예 4(1)의 당화액(글루코스량으로서 1.33g/L)과 전분과 유지로부터 조제한 실시예 4(1)의 가수분해액을 탄소원으로 하였다. 대조로서, 동농도의 글루코스를 탄소원으로서 포함하는 배지에서 배양을 실시하였다.

(L-리신 생산 배지 조성)

(A구)

탄소원

조류 유래의 전분 분해물 1.33g/L(글루코스)

(B구)

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1g/L

Yeast Extract 2g/L

FeSO₄·7H₂O 10mg/L

MnSO₄·4H₂O 10mg/L

(C구)

탄산칼슘 15g/L

A구, B구는 115℃에서 10분간, 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간, 건열 멸균하였다. 실온으로 냉각후 3개를 혼합하고, MgSO₄·7H₂O 용액을 최종농도 1g/L이 되도록 첨가하였다.

배양 종료후, 글루코스의 소비를 BF-5[오시케소쿠키 제조]로 확인하고, 생육도를 생균수의 카운트에 의해, L-리신량은 BF-5[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 시험관 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 4에 기재한다.

시약 글루코스를 탄소원으로 한 경우, 0.6g/L의 L-리신을 축적하였다. 이것과 동농도의 조류가 생산한 전분 유래의 글루코스로부터는, 동등 이상의 0.8g/L의 L-리신의 축적을 확인하고, 유효한 탄소원인 것이 나타났다. 또한, 조류가 생산한 전분의 당화물을 또한 유지 분해 처리함으로써 1.0g/L의 L-리신의 축적을 확인하였다. 유지를 분해하고, 지방산과 글리세롤로 함으로써 이용을 가능하게 함으로써, L-리신 생산균의 탄소원의 이용이 향상되고, L-리신 축적의 향상이 확인되었다.

탄소원	배양 시간 (h)	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
조류 유래 글루코스 1.33 g/L	24	0.9	0.8
조류 유래 글루코스 1.24 g/L + 유지분 처리물	24	10.5	1.0
시약 글루코스 1.33 g/L	24	0.8	0.6

〔실시예 5(1)〕미세조류 Neochloris oleoabundans의 배양

Neochloris oleoabundans UTEX 1185주를, 100mL의 변형된 NORO 배지를 넣은 500mL용 삼각 플라스크에서 30℃, 빛 강도 10,000lux[TOMY사 제조 배양 장치 CL-301]로 6일간 진탕 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. 한편, 광원에는, 형광등으로부터의 백색광을 사용하였다. 변형된 NORO 배지 800mL을 넣은 L용 배지병에, 전배양액 32mL을 첨가하고, 배양 온도 30℃, 빛 강도 10,000lux로, 500mL/min으로 CO₂ 농도가 3%이 되도록 공기와 CO₂의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 14일간 배양을 실시하였다.

[변형된 NORO 배지]

NaCl 29.22g/L

KNO₃ 1.0g/L

MgCl₂·6H₂O 1.5g/L

MgSO₄·7H₂O 0.5g/L

KCl 0.2g/L

CaCl₂·2H₂O 0.2g/L

K₂HPO₄ 0.045g/L

트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 2.45g/L

Na₂-EDTA 1.89mg/L

ZnSO₄·7H₂O 0.087mg/L

H₃BO₃ 0.61mg/L

CoCl₂·6H₂O 0.015mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.06mg/L

MnCl₂ 0.23mg/L

(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.38mg/L

Fe(III)·EDTA 3.64mg/L

비타민 B1 0.1mg/L

비타민 B12 0.5mg/L

비오틴 0.5mg/L

pH를 1N HCl로 8.0으로 조정후, 120℃에서 10분간 오토클레이브 살균

〔실시예 5(2)〕Neochloris oleoabundans로부터의 유지의 추출과 가수분해물의 조제

실시예 5(1)의 배양액 3.6L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 수득된 조체를 사용하여, 하기의 추출 조작을 3회 반복하였다. 우선, 조체를 100mL의 메탄올:클로로포름=2:1에 현탁시킨 후에, 초음파 장치[Kubota사 제조의 INSONATOR 201MA]에 의해 15,000W, 10분의 처리를 실시하여, 세포를 파쇄하였다. 그 파쇄액을 밤새 정치 추출한 후, 여과에 의해 고형물을 제거하고, 추출액을 회수하였다.

상기에서 수득된 추출액을 등량으로 나누고, 각각의 추출액을 농축한 것을 조추출물로 하였다. 조추출물을 80% 메탄올 100mL에 현탁시키고, 그 현탁액과 헥산 100mL을 가한 분액 깔때기 내에서 액액 분배를 3회 실시하여, 유지를 포함하는 헥산층(유지 획분이라고 부른다)과 수용성 유기물을 많이 포함하는 80% 메탄올층(수용성 획분이라고 부른다)을 수득하였다. 조추출물과 유지 획분을 미리 가온한 45mL의 열수와 혼합한 후에, 리파제(시그마-알드리치사 제조 L1754, Candida rugosa 유래 type VII) 500U를 가하고, 42℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 조추출물과 유지 획분의 반응액과 수용성 획분의 지방산 농도와 글리세롤 농도를 측정하고, 각각 아미노산 발효의 탄소원으로서 사용하였다.

〔실시예 5(3)〕Neochloris oleoabundans 유래의 유지 가수분해물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

L-리신 생산균인 에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 각 100μL을, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/8양의 균체를, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 이하에 기재된 발효 배지 20mL을 넣은 판구 플라스크에 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 37℃에 있어서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 5(2)의 조류 유래의 각 샘플을, 증류수에 현탁시킨 후, 1% 농도가 되도록 Tween 80을 가하고, pH를 3N KOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 120℃에서 20분 오토클레이브를 실시한 것을 탄소원 용액으로서 사용하였다. 배양에 사용한 배지 조성(최종농도)을 이하에 나타낸다. 조류 유래의 조추출물의 가수분해물, 조류 유래의 유지 획분의 가수분해물, 또는, 조류 유래의 수용성 획분을 탄소원으로서 사용하였다. 각각의 탄소원에 관해서, 측정된 지방산 농도와 글리세롤 농도의 합이 기재되어 있다. 또한, 대조로서, 시약 지방산과 시약 글리세롤을 혼합하고, 동농도가 되도록 조정한 탄소원을 사용하였다. 미세조류 Neochloris oleoabundans로부터 추출한 유지의 가수분해물의 지방산과 글리세롤의 분석을 실시하고, 주요한 지방산으로서 포함되어 있었던 올레산[쥰세가가쿠사 제조 일급], 리놀산[나카라이테스크사 제조] 및 팔미트산[나카라이테스크사 제조 특급]을 중량 조성비 4.2:3.8:1.0으로 포함하고, 지방산과 글리세롤의 중량 조성비가 11.4:1이 되도록 조정하였다.

[에스케리키아속 세균 L-리신 생산 배지]

탄소원으로서

시약 지방산+시약 글리세롤 1.09g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

조류 유래의 조추출물의 가수분해물 1.09g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

조류 유래의 유지 획분의 가수분해물 1.19g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

조류 유래의 수용성 획분 0.04g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

중 어느 하나

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

Yeast Extract 2.0g/L

탄산칼슘 30g/L

KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분 오토클레이브를 실시하였다. 단, 탄소원, MgSO₄·7H₂O는, 각각 별도 살균한 후, 혼합하였다. 탄산칼슘은, 180℃에서 3시간, 건열 멸균하고 별도 첨가.

24시간 후에, 배양 상청의 L-리신의 양을 바이오틱 애널라이저 AS310[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 본 배지에서는 생육도는, 생균수를 계수함으로써 실시하였다. 플라스크 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 5에 기재한다. 대상으로 하는 계면활성제 0.5% Tween 80 용액만을 탄소원으로 했을 때의 L-리신 농도는 배지 유래의 L-리신이며, L-리신 생산은 확인되지 않았지만, 조류 유래의 조추출물의 효소 가수분해물을 사용한 경우는, 양호한 L-리신 생산을 확인하였다. 조류 유래의 조추출물로부터 추출한 유지 획분의 가수분해물을 사용한 경우는, 시약 지방산과 시약 글리세롤의 대조 탄소원과 동등 이상의 L-리신 생산을 확인하고, 또한, 지방산을 탄소원으로서 거의 포함하지 않는 조추출물 유래의 수용성 획분을 사용한 경우도, L-리신 생산을 확인하였다. 이것으로부터, 미세조류의 조체로부터 추출된 유지 획분의 가수분해물뿐만 아니라, 수용성의 유기물로부터도 L-리신 생산이 가능하여, 조체의 조추출물의 가수분해물로부터 시약 지방산과 시약 글리세롤의 대조 탄소원을 크게 상회하는 L-리신 생산이 가능한 것이 나타났다.

탄소원	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
0.5% Tween80	2.1	0.21
시약 지방산 + 시약 글리세롤 (1.09 g/L) + 0.5% Tween80	6.1	0.68
조류 유래의 조추출물의 가수분해물 (1.09 g/L) + 0.5% Tween80	1.2	1.06
조류 유래의 유지획분의 가수분해물 (1.19 g/L) + 0.5% Tween80	4.5	0.73
조류 유래의 수용성 성분 (0.04 g/L) + 0.5% Tween80	4.8	0.62

〔실시예 6(1)〕Neochloris oleoabundans의 배양

Neochloris oleoabundans UTEX 1185주를, 100mL의 변형된 NORO 배지를 넣은 500mL용 삼각 플라스크에서 30℃, 빛 강도 5,000lux[TOMY사 제조 배양 장치 CL-301]로 6일간 진탕 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. 한편, 광원에는, 형광등으로부터의 백색광을 사용하였다. 변형된 NORO 배지 800mL을 넣은 L용 배지병에, 전배양액 32mL을 첨가하고, 배양 온도 30℃, 빛 강도 5,000lux로, 500mL/min로 CO₂ 농도가 3%이 되도록 공기와 CO₂의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 14일간 배양을 실시하였다.

[변형된 NORO 배지]

NaCl 29.22g/L

KNO₃ 1.0g/L

MgCl₂·6H₂O 1.5g/L

MgSO₄·7H₂O 0.5g/L

KCl 0.2g/L

CaCl₂·2H₂O 0.2g/L

K₂HPO₄ 0.045g/L

트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 2.45g/L

Na₂-EDTA 1.89mg/L

ZnSO₄·7H₂O 0.087mg/L

H₃BO₃ 0.61mg/L

CoCl₂·6H₂O 0.015mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.06mg/L

MnCl₂ 0.23mg/L

(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.38mg/L

Fe(III)·EDTA 3.64mg/L

비타민 B1 0.1mg/L

비타민 B12 0.5㎍/L

비오틴 0.5㎍/L

1N HCl로 pH 8.0으로 조정후, 120℃에서 10분간 오토클레이브 살균

〔실시예 6(2)〕Neochloris oleoabundans로부터의 지질의 추출과 가수분해물의 조제

실시예 6(1)의 배양액 1.8L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 그 침전물에 50mL의 메탄올:클로로포름=2:1을 첨가하고, 하기의 추출 조작을 3회 반복하였다. 우선, 조체를 50mL의 메탄올:클로로포름=2:1에 현탁시키고, 밤새, 정치 추출한 후, 여과에 의해 고형물을 제거하고, 추출액을 회수하였다.

수득된 조추출물을 80% 메탄올 80mL에 현탁시키고, 그 현탁액과 헥산 100mL을 첨가한 분액 깔때기 내에서 액액 분배를 3회 실시하여, 지질류를 포함하는 헥산층(지질 획분이라고 부른다)을 수득하였다. 지질 획분을 미리 가온한 50mL의 열수와 혼합한 후에, 리파제(시그마-알드리치 제조 L1754) 700U를 가하고, 42℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 종료후, 그 용액을 30mL까지 농축하고, 이를 15mL씩 나누고, 그 중의 1개를 유지 가수분해물로 하였다. 또한, 또 하나의 유지 분해물 중의 당지질이나 인지질을 가수분해하기 위해서, 이하의 방법에 의해 알칼리 가수분해를 실시하였다. 우선, 유지 분해물의 용액이 종몰농도 0.1N NaOH가 되도록 조제하고, 그 용액을 핫 플레이트 위에서, 95℃로 가온하면서, 90분간 교반하고, 알칼리 가수분해 처리를 실시하였다. 이러한 리파제 처리후, 알칼리 가수분해한 용액을 전체 지질류 가수분해물로 하였다.

〔실시예 6(3)〕Neochloris oleoabundans 유래의 지질 가수분해물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 각 100μL을, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/40 양의 균체를, 굵은 시험관의, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 이하에 기재된 발효 배지의 4mL에 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 37℃에 있어서 24시간 동안 배양하였다. 탄소원이 되는 실시예 6(2)의 조류 유래의 각 샘플은, 가수분해후의 용액에, 2% 농도가 되도록 Tween 80을 첨가하고, pH를 3N KOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 120℃에서 20분 오토클레이브를 실시한 것을 탄소원 용액으로서 사용하였다. 배양에 사용한 배지 조성을 이하에 나타낸다. A구는 탄소원이며, 측정된 지방산 농도와 글리세롤 농도의 합이 기재되어 있다.

[에스케리키아속 세균 L-리신 생산 배지]

(A구)

조류 유래의 유지 가수분해물 1.22g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

조류 유래의 전지질류의 가수분해물 2.14g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

중 어느 하나

(B구)

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

Yeast Extract 2.0g/L

(C구)

탄산칼슘 30g/L

A구, B구는 115℃에서 10분 동안 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간 동안 건열 멸균하였다. 실온으로 냉각후 A구, B구와 C구를 혼합후, MgSO₄·7H₂O 용액을 최종농도 1g/L이 되도록 첨가하였다.

조류 유래의 유지 분해물은, 리파제 단독 처리인 점에서, 지질류 중의 당지질이나 인지질 등은 거의 분해되지 않고, 유지만이 분해된 탄소원이다. 한편, 조류 유래의 전체 지질류 분해물은, 리파제 처리후, 또한 알칼리 가수분해처리를 실시하고 있는 점에서, 유지뿐만 아니라, 당지질이나 인지질도 분해되어 있다. 이러한 탄소원 중의 지방산과 글리세롤량의 합을 비교하면, 유지 가수분해물이 1.22g/L인 것에 대해서, 전체 지질류 분해물에서는, 유지에 더하여, 당지질이나 인지질도 분해되고, 그 탄소원의 양이 2.14g/L로 증가하고 있는 것이 확인되었다. 이들 가수분해물을 탄소원으로서 사용하고, 배양을 실시하여, 24시간후의 배양 상청의 L-리신의 양을 바이오틱 애널라이저 AS310[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 본 배지에서는 생육도는, 생균수를 계수함으로써 실시하였다. 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 6에 기재한다. 대조로 한 계면활성제 0.5% Tween 80 용액만을 탄소원으로 했을 때의 L-리신 농도는 배지 유래의 L-리신이며, L-리신 생산은 확인되지 않았지만, 조류 유래의 유지 분해물로부터는, L-리신의 생산이 확인되었다. 조류 유래의 전체 지질류 분해물로부터는, 양호한 L-리신의 생산이 확인되었다. 이것으로부터, 미세조류의 조체로부터 추출된 유지뿐만 아니라, 당지질이나 인지질로부터도 L-리신 생산이 가능하여, 조체의 전체 지질류로부터도 L-리신 생산이 가능한 것이 나타났다.

탄소원	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
0.5% Tween80	2.6	0.19
조류 유래의 유지 가수분해물 (1.22 g/L) + 0.5% Tween80	12.3	1.00
조류 유래의 전체 지질류 분해물 (2.14 g/L) + 0.5% Tween80	20.0	1.51

〔실시예 7(1)〕미세조류 Nannochloris sp.의 배양

Nannochloris sp. UTEX LB 1999주를, 100mL의 변형된 NORO 배지를 넣은 500mL용 삼각 플라스크에서 30℃, 빛 강도 10,000lux[TOMY사 제조 배양 장치 CL-301]로 6일간 진탕 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. 한편, 광원에는, 형광등으로부터의 백색광을 사용하였다. 변형된 NORO 배지 800mL을 넣은 1L용 배지병에, 전배양액 32mL을 첨가하고, 배양 온도 30℃, 빛 강도 10,000lux로, 500mL/min로 CO₂ 농도가 3%이 되도록 공기와 CO₂의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 14일간 배양을 실시하였다.

〔실시예 7(2)〕Nannochloris sp.로부터의 유지의 추출과 가수분해물의 조제

실시예 7(2)의 배양액 3.6L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 수득된 조체를 사용하여, 하기의 추출 조작을 3회 반복하였다. 우선, 조체를 100mL의 메탄올:클로로포름=2:1에 현탁시킨 후에, 초음파 장치[Kubota사 제조 INSONATOR 201MA]에 의해 15,000W으로 10분간 처리를 실시하여, 세포를 파쇄하였다. 그 파쇄액을 밤새 정치 추출한 후, 여과에 의해 고형물을 제거하고, 추출액을 회수하였다. 수득된 추출액을 농축한 후, 80% 메탄올 100mL에 현탁시키고, 그 현탁액과 헥산 100mL을 첨가한 분액 깔때기 내에서 액액 분배를 3회 실시하고, 유지를 포함하는 헥산층(유지 획분)과 수용성 유기물을 많이 포함하는 80% 메탄올층(수용성 획분)을 수득하였다. 다음에, 유지 획분을 미리 가온한 40mL의 열수에 현탁시킨 후에, 500U의 리파제[시그마 L1754]를 가하고, 42℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 그 반응액과 수용성 획분의 지방산 농도와 글리세롤 농도를 측정하고, 각각을 아미노산 발효의 탄소원으로서 사용하였다.

〔실시예 7(3)〕Nannochloris sp.유래의 유지 가수분해물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

에스케리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 각 100μL을, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/8 양의 균체를, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 이하에 기재된 발효 배지 20mL을 넣은 판구 플라스크에 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 37℃에서 16 또는 20시간 동안 배양하였다. 실시예 7(2)의 조류 유래의 각 샘플을, 증류수에 현탁시킨 후, 1% 농도가 되도록 Tween 80을 더하고, pH를 3N KOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브를 실시한 것을 탄소원 용액으로서 사용하였다. 배양에 사용한 배지 조성을 이하에 나타낸다. 조류 유래의 유지 획분 가수분해물 또는 조류 유래의 수용성 획분을 탄소원으로서 사용하였다. 각각의 탄소원에 관해서 측정된 지방산 농도와 글리세롤 농도의 합이 기재되어 있다.

[에스케리키아속 세균 L-리신 생산 배지]

탄소원으로서

조류 유래의 유지 획분의 가수분해물 1.06g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

조류 유래의 수용성 획분 0.00g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

중 어느 하나

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

Yeast Extract 2.0g/L

탄산칼슘 30g/L

KOH로 pH 7.0L로 조정하고, 115℃에서 10분간 오토클레이브를 실시하였다. 단, 탄소원, MgSO₄·7H₂O는, 각각 별도 살균한 후, 혼합하였다. 탄산칼슘은, 180℃에서 3시간 동안, 건열 멸균하여 별도 첨가.

배양 종료 후에, 배양 상청의 L-리신의 양을 바이오틱 애널라이저 AS310[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 본 배지에서는 생육도는, 생균수를 계수함으로써 실시하였다. 플라스크 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 7에 기재한다. 대상으로 하는 계면활성제 0.5% Tween 80 용액만을 탄소원으로 했을 때의 L-리신 농도는 배지 유래의 L-리신이며, L-리신 생산은 확인되지 않았지만, Nannochloris sp.유래의 유지 획분의 가수분해물을 사용한 경우는, 양호한 L-리신 생산을 확인하였다. 또한, 지방산을 탄소원으로서 포함하지 않는 수용성 유기물을 사용한 경우도, L-리신 생산을 확인하였다.

탄소원	배양 시간 (h)	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
0.5% Tween80	20	2.1	0.12
조류 유래의 유지획분 가수분해물 (1.06 g/L) + 0.5% Tween80	16	11.1	1.02
조류 유래의 수용성 획분 (0.00 g/L) + 0.5% Tween80	20	0.5	1.23

〔실시예 8(1)〕Nannochloris sp.로부터의 조유기물의 추출과 유지의 가수분해물의 조제

실시예 7(1)과 같이 하여 배양한 Nannoch1oris sp.UTEX LB 1999주의 배양액 1.2L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 수득된 조체를 사용하여, 하기의 추출 조작을 3회 반복하였다. 우선, 조체를 100mL의 메탄올:클로로포름=2:1에 현탁시킨 후에, 초음파 장치[Kubota사 제조 INSONATOR 201MA]에 의해 15,000W로 10분간 처리하고, 세포를 파쇄하였다. 그 파쇄액을 밤새 정치 추출한 후, 여과에 의해 고형물을 제거하고, 추출액을 회수하고, 농축하였다. 다음에, 미리 가온한 40mL의 열수에 현탁한 후, 리파제[시그마-알드리치사 제조 L1754] 500U를 첨가하고, 42℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 그 반응액의 지방산 농도와 글리세롤 농도를 측정하고, 각각을 아미노산 발효의 탄소원으로서 사용하였다.

〔실시예 8(2)〕Nannochloris sp.유래의 조유기물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

에스케리키아 콜라이 WC196LC/pCABD2주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 각 100μL을, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/8양의 균체를, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 이하에 기재된 발효 배지 20mL을 넣은 판구 플라스크에 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 37℃에서 16 또는 20시간 동안 배양하였다. 탄소원이 되는 실시예 8(1)의 조류 유래의 각 샘플은, 증류수에 현탁시킨 후, 1% 농도가 되도록 Tween 80을 더하고, pH를 3N KOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 120℃에서 20분 오토클레이브를 실시한 것을 탄소원 용액으로서 사용하였다. 배양에 사용한 배지 조성을 이하에 나타낸다. 탄소원으로서 사용한 조류 유래의 조추출물의 가수분해물에 관해서 측정된 지방산 농도와 글리세롤 농도의 합이 기재되어 있다.

[에스케리키아속 세균 L-리신 생산 배지]

조류 유래의 조추출물의 가수분해물 0.37g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

Yeast Extract 2.0g/L

탄산칼슘 30g/L

KOH로 pH 7.0으로 조정하고, 115℃에서 10분 동안 오토클레이브를 실시하였다. 단, 탄소원, MgSO₄·7H₂O는, 각각 별도 살균한 후, 혼합하였다. 탄산칼슘은, 180℃에서 3시간 동안 건열 멸균하여 별도 첨가.

배양 종료 후에, 배양 상청의 L-리신의 양을 바이오틱 애널라이저 AS310[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 본 배지에서는 생육도는, 생균수를 계수함으로써 실시하였다. 플라스크 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 8에 기재한다. 대상으로 하는 계면활성제 0.5% Tween 80 용액만을 탄소원으로 했을 때의 L-리신 농도는 배지 유래의 L-리신이며, L-리신 생산은 확인되지 않았지만, Nannochloris sp.유래의 조추출물의 가수분해물로부터, L-리신 생산을 확인하였다.

탄소원	배양 시간 (h)	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
0.5% Tween80	24	4.2	0.22
조류 유래의 조추출물의 가수분해물 (0.37 g/L) + 0.5% Tween80	24	13.1	0.56

〔실시예 9(1)〕규조 Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2주의 배양

Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2주를, 500mL의 F/2 배지를 넣은 1L용 배지병에서, 배양 온도 25℃, 빛 강도 7,000lux로, 200mL/min으로 CO₂ 농도가 1%이 되도록 공기와 CO₂의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 3일간 배양하고, 이것을 전배양액으로 하였다. F/2 배지의 해수 성분으로서는, 인공 해수인 아쿠아마린 S[야시마야쿠힌사(YASHIMA PURE CHEMICALS) 제조]를 사용하였다. F/2 배지 800mL을 넣은 1L용 배지병에, 전배양액 32mL을 첨가하고, 배양 온도 25℃, 빛 강도 7,000lux로, 200mL/min으로 CO₂ 농도가 1%이 되도록 공기와의 혼합 가스를 불어 넣으면서, 7일간 배양을 실시하였다. 한편, 광원에는, 형광등으로부터의 백색광을 사용하였다.

(F/2 배지)

NaNO₃ 75mg/L

NaH₂PO₄·H₂O 5mg/L

Na₂SiO₃·9H₂O 20mg/L

FeCl₃·6H₂O 6.4mg/L

MnSO₄·H₂O 0.304mg/L

ZnSO₄·7H₂O 0.046mg/L

Na₂MoO₄·2H₂O 14.6㎍/L

CuCl₂·2H₂O 13.6㎍/L

Na₂EDTA·2H₂O 8.8mg/L

CoCl₂·6H₂O 23.8㎍/L

비타민 B12 0.135mg/L

비오틴 0.025mg/L

비타민 B1 1.1mg/L

아쿠아마린 S(인공 해수) 40g/L

120℃에서 10분 동안 오토클레이브 살균

〔실시예 9(2)〕Thalassiosira pseudonana로부터의 조유기물의 추출과 가수분해물의 조제

실시예 9(1)의 배양액 1.8L분의 조체를 원심분리로 침전시키고, 그 침전물에 50mL의 메탄올:클로로포름=2:1을 가하고, 하기의 추출 조작을 3회 반복하였다. 우선, 조체를 50mL의 메탄올:클로로포름=2:1에 현탁시키고, 밤새, 정치 추출한 후, 여과에 의해 고형물을 제거하고, 추출액을 회수하였다.

수득된 추출액을 농축한 후, 40mL의 열수에 현탁시킨 후에, 리파제[시그마 L1754] 500U를 가하고, 42℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 그 반응액의 지방산 농도와 글리세롤 농도를 측정하고, 각각을 아미노산 발효의 탄소원으로서 사용하였다.

〔실시예 9(3)〕Thalassiosira pseudonana 유래의 유지 가수분해물을 탄소원으로 한 L-리신 생산 배양

에스케리키아 콜라이 WC196LC/pCABD2주의 글리세롤 스톡을 융해하고, 각 100μL을, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 L 플레이트에 균일하게 도포하고, 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 수득된 플레이트의 약 1/40 양의 균체를, 굵은 시험관의, 25mg/L의 스트렙토마이신을 포함하는 이하에 기재된 발효 배지의 4mL에 접종하고, 왕복 진탕 배양 장치로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 탄소원이 되는 실시예 9(2)의 조류 유래의 각 샘플은, 가수분해후의 용액에, 2% 농도가 되도록 Tween 80을 첨가하고, pH를 3N KOH를 사용하여 7.0으로 조정하고, 120 ℃, 20분 오토클레이브를 실시한 것을 탄소원 용액으로서 사용하였다. 배양에 사용한 배지 조성을 이하에 기재한다. A구는 탄소원이며, 측정된 지방산 농도와 글리세롤 농도의 합이 기재되어 있다.

[에스케리키아속 세균 L-리신 생산 배지]

[A구]

조류 유래의 조추출물의 가수분해물 1.09g/L(지방산 농도+글리세롤 농도)

[B구]

(NH₄)₂SO₄ 24g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

Yeast Extract 2.0g/L

[C구]

탄산칼슘 30g/L

A구, B구는 115℃에서 10분, 오토클레이브 살균하고, C구는 180℃에서 3시간 동안 건열 멸균하였다. 실온으로 냉각후 A구, B구와 C구를 혼합후, MgSO₄·7H₂O 용액을 최종농도 1g/L이 되도록 첨가하였다.

배양 종료 후에, 배양 상청의 L-리신의 양을 바이오틱 애널라이저 AS310[사쿠라세이키 제조]에 의해 측정하였다. 본 배지에서는 생육도는, 생균수를 계수함으로써 실시하였다. 2개씩 실시한 배양의 결과의 평균치를 표 9에 기재한다. 대조로 한 계면활성제 0.5% Tween 80 용액만을 탄소원으로 했을 때의 L-리신 농도는 배지 유래의 L-리신이며, L-리신 생산은 확인되지 않았지만, Thalassiosira pseudonana 유래의 조추출물의 가수분해물로부터, 양호한 L-리신 생산을 확인하였다.

탄소원	배양 시간 (h)	생균수 (x108)	L-리신 농도 (g/L)
0.5% Tween80	20	4.2	0.21
조류 유래의 조추출물의 가수분해물 (1.09 g/L) + 0.5% Tween80	20	4.1	0.81

〔서열표의 설명〕

서열번호 1: Bacillus subtilis 유래 LipA 유전자의 염기 서열

서열번호 2: Bacillus subtilis 유래 LipA의 아미노산 서열

서열번호 3: Burkholderia glumae 유래 LipA 유전자의 염기 서열

서열번호 4: Burkholderia glumae 유래 LipA의 아미노산 서열

서열번호 5: Pseudomonas aeruginosa 유래 LipA 유전자의 염기 서열

서열번호 6: Pseudomonas aeruginosa 유래 LipA의 아미노산 서열

서열번호 7: Staphylococcus aureus 유래 리파제 유전자의 염기 서열

서열번호 8: Staphylococcus aureus 유래 리파제의 아미노산 서열

서열번호 9: Candida antarctica 유래 리파제 유전자의 염기 서열

서열번호 10: Candida antarctica 유래 리파제의 아미노산 서열

서열번호 11: Candida rugosa 유래 리파제 유전자 lip1의 염기 서열

서열번호 12: Candida rugosa 유래 리파제 LIP1의 아미노산 서열

서열번호 13: Candida rugosa 유래 리파제 유전자 lip2의 염기 서열

서열번호 14: Candida rugosa 유래 리파제 LIP2의 아미노산 서열

서열번호 15: Eschrichia coli 전사 인자 유전자 fadR의 염기 서열

서열번호 16: fadR 증폭용 프라이머

서열번호 17: fadR 증폭용 프라이머

효율적으로 L-아미노산을 제조할 수 있다. 특히, 미세조류 유래의 탄소원을 사용함으로써, 보다 염가로 L-아미노산을 제조할 수 있다.

통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 FERMBP-5252 19941206 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11027 20081007

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method of producing L-amino acid <130> C987-C8392 <150> JP 2008-012553 <151> 2008-01-23 <150> JP 2008-135265 <151> 2008-05-23 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 639 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(639) <400> 1 atg aaa ttt gta aaa aga agg atc att gca ctt gta aca att ttg atg 48 Met Lys Phe Val Lys Arg Arg Ile Ile Ala Leu Val Thr Ile Leu Met 1 5 10 15 ctg tct gtt aca tcg ctg ttt gcg ttg cag ccg tca gca aaa gcc gct 96 Leu Ser Val Thr Ser Leu Phe Ala Leu Gln Pro Ser Ala Lys Ala Ala 20 25 30 gaa cac aat cca gtc gtt atg gtt cac ggt att gga ggg gca tca ttc 144 Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser Phe 35 40 45 aat ttt gcg gga att aag agc tat ctc gta tct cag ggc tgg tcg cgg 192 Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser Arg 50 55 60 gac aag ctg tat gca gtt gat ttt tgg gac aag aca ggc aca aat tat 240 Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn Tyr 65 70 75 80 aac aat gga 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Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp Gly 165 170 175 Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu Tyr 180 185 190 Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly Gly 195 200 205 Gln Asn Thr Asn 210 <210> 3 <211> 1077 <212> DNA <213> Burkholderia glumae <220> <221> CDS <222> (1)..(1077) <400> 3 atg gtc aga tcg atg cgt tcc agg gtg gcg gcg agg gcg gtg gca tgg 48 Met Val Arg Ser Met Arg Ser Arg Val Ala Ala Arg Ala Val Ala Trp 1 5 10 15 gcg ttg gcg gtg atg ccg ctg gcc ggc gcg gcc ggg ttg acg atg gcc 96 Ala Leu Ala Val Met Pro Leu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Thr Met Ala 20 25 30 gcg tcg ccc gcg gcc gtc gcg gcg gac acc tac gcg gcg acg cgc tat 144 Ala Ser Pro Ala Ala Val Ala Ala Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Arg Tyr 35 40 45 ccg gtg atc ctc gtc cac ggc ctc gcg ggc acc gac aag ttc gcg aac 192 Pro Val Ile Leu Val His Gly Leu Ala Gly Thr Asp Lys Phe Ala Asn 50 55 60 gtg gtg gac tat tgg tac gga atc cag agc gat ctg caa tcg cat ggc 240 Val Val Asp Tyr Trp Tyr Gly 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Claims (34)

1. L-아미노산 생산능을 갖는 세균을, 미세조류의 처리물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법으로서, 당해 처리물이, 상기 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진하는 것인, L-아미노산의 제조법.
2. 제1항에 있어서, 상기 처리물이, (1) 당해 미세조류의 배양물의 파쇄물, (2) 당해 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는, (3) 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 처리물이, 전분을 생산하는 미세조류의 조체 파쇄물, 또는 전분을 포함하는 그 추출물 또는 당해 추출물의 분획물을 가수분해하여 수득되는 당화물인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 당화물이, 미세조류의 조체 파쇄물 또는 전분을 포함하는 그 분획물로부터, 아밀라제를 사용한 효소 반응에 의해 수득된 반응 산물인, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 아밀라제가 글루코아밀라제인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 처리물이, 유지를 생산하는 미세조류의 조체 파쇄물, 또는 유지를 포함하는 그 추출물 또는 당해 추출물의 분획물을 가수분해하여 수득되는 가수분해물인, 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 가수분해물이, 미세조류의 조체 파쇄물 또는 유지를 포함하는 그 분획물로부터, 리파제를 사용한 효소 반응에 의해 수득된 반응 산물인, 방법.
8. 제6항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해물이 유화 처리가 가해진 것임을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류의 파쇄법이 고온 처리인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류의 파쇄법이 100℃ 이상의 온도에서 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 녹색 식물문, 부등모 식물문에 속하는 조류인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 미세조류가 녹조강, 트레복시조강, 또는 규조강에 속하는 조류인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 녹조강(Chlorophyceae)에 속하는 조류인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 장내세균과에 속하는 세균 또는 코리네형 세균인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 장내세균과에 속하는 세균이 에스케리키아 콜라이인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-리신, L-트레오닌, L-글루탐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인, 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-리신이며, 상기 세균이 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 디아미노피멜산 데카르복실라제, 디아미노피멜산 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 디아미노피멜산 에피머라제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 및 석시닐 디아미노피멜산 데아실라제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있고, 및/또는, 리신 데카르복실라제의 활성이 약화되어 있는, 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-트레오닌이며, 상기 세균이 아스파라긴산 세미알데히드 데하이드로게나제, thr 오페론으로 암호화되는 아스파르토키나제 I, 호모세린 키나제, 아스파라긴산 아미노트랜스퍼라제, 및 트레오닌 신타제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있는 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산이며, 상기 세균이 글루타메이트 데하이드로게나제, 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카르복실라제, 및 메틸 시트르산 신타제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있고, 및/또는, α-케토글루타르산 데하이드로게나제의 활성이 약화되어 있는 방법.
20. 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 상기 처리물을 탄소원으로서 포함하는 방법.
21. L-아미노산의 제조 방법으로서,
    (a) 미세조류를 배지에서 배양하고, 당해 배양물을, 파쇄, 추출, 분획 및 가수분해로부터 선택되는 1 이상의 방법에 의해 처리하고, L-아미노산 생산능을 갖는 세균에 의한 L-아미노산의 생산 축적을 촉진하는 당해 미세조류의 처리물을 조제하고,
    (b) 당해 세균을, 당해 미세조류의 처리물을 포함하는 배지에 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시키고,
    (c) 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법.
22. 제21항에 있어서, 상기 처리물이, (1) 당해 미세조류의 배양물의 파쇄물, (2) 당해 미세조류에 유래하는 유기물의 혼합물을 포함하는, 당해 파쇄물의 추출물 또는 분획물, 또는, (3) 당해 파쇄물, 당해 추출물 또는 당해 분획물의 가수분해물인 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 파쇄가, 고온 처리, 유기 용매 처리, 자비 처리, 강알칼리 처리로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 방법에 의해 실시되는 방법.
24. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 처리물 조제 공정이, 전분을 생산하는 미세조류를 파쇄 및/또는 추출·분획하고, 그 처리물을 가수분해 함으로써 당화하는 공정을 포함하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 당화하는 공정이, 아밀라제를 사용한 효소 반응을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 아밀라제가 글루코아밀라제인 방법.
27. 제21항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 처리물 조제 공정이, 유지를 생산하는 미세조류를 파쇄 및/또는 추출·분획하고, 그 유처리물을 가수분해하는 공정을 포함하는, 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 가수분해 공정이, 리파제를 사용한 효소 반응을 가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
29. 제27항 또는 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 가수분해물이 유화 처리가 가해진 것임을 특징으로 하는 방법.
30. 제21항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미세조류가 녹색 식물문, 부등모 식물문에 속하는 조류인 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 미세조류가 녹조강, 트레복시조강, 또는 규조강에 속하는 조류인, 방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 미세조류가 녹조강(Chlorophyceae)에 속하는 조류인, 방법.
33. 제21항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 장내세균과에 속하는 세균 또는 코리네형 세균인 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 장내세균과에 속하는 세균이 에스케리키아 콜라이인 방법.