JPWO2009093703A1 - L−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)微細藻類を培地で培養し、該培養物を、破砕、抽出、分画及び加水分解から選ばれる1以上の方法により処理して、L-アミノ酸生産能を有する細菌によるL−アミノ酸の生産蓄積を促進する該微細藻類の処理物を調製し、
(b)該細菌を、該微細藻類の処理物を含む培地に培養し、培養物中にL-アミノ酸を生産蓄積させ、
(c)該培養物からL-アミノ酸を採取することを特徴とするL-アミノ酸の製造法。
<1>本発明で使用する微細藻類とその培養法
本発明における微細藻類(microalgae)は、どのようなものでも用いることが出来るが、スターチ及び/または油脂を藻体内に蓄積する微細藻類であることが好ましい。
本発明において、微細藻類の処理物とは、破砕した微細藻類の細胞に由来する有機物の混合物を含む処理物であって、L-アミノ酸生産能を有する細菌によるL−アミノ酸の生産蓄積を促進するものを指し、具体的には、(1)該微細藻類の培養物の破砕物、(2)該微細藻類に由来する有機物の混合物を含む、該破砕物の抽出物もしくは分画物、又は、(3)該破砕物、該抽出物もしくは該分画物の加水分解物が挙げられる。
従って、処理物を添加していない条件に比べ、L-アミノ酸の生産蓄積量が増大している場合も本発明の処理物に含まれるが、含まれる炭素源と同量の精製された物質からなる炭素源を加えた場合と比べてL-アミノ酸生産蓄積量が向上していることが好ましい。
Burkholderia glumae由来のLipA(GenBank Accession No. X70354)をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号3に、アミノ酸配列を配列番号4に示す。
Pseudomonas aeruginosa由来のLipA(GenBank Accession No. D50587)をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号5に、アミノ酸配列を配列番号6に示す。
Staphylococcus aureus由来のリパーゼ(GenBank Accession No. M12715)の塩基配列を配列番号7に、アミノ酸配列を配列番号8に示す。
本発明においては、L-アミノ酸生産能を有する細菌を使用する。細菌としては、微細藻類により生産される有機物、特に、スターチの糖化物あるいは油脂の加水分解物からL-アミノ酸を効率よく製造し得るものであれば特に制限されず、例えばエシェリヒア属、パントエア属、エンテロバクター属等の腸内細菌科に属する細菌、及び、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。
パントエア・アナナティスAJ13356株(FERM BP-6615)(欧州特許出願公開0952221号明細書)
エルビニア・カロトボーラ ATCC15713株
クレブシエラ・プランティコーラAJ13399株(FERM BP-6600)(欧州特許出願公開955368号明細書)
クレブシエラ・プランティコーラAJ13410株(FERM BP-6617)(欧州特許出願公開955368号明細書)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス (コリネバクテリウム・エフィシエンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869)
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
L-スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、L-スレオニン生合成系酵素の1種又は2種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。L-スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII(lysC)、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI(thrA)、ホモセリンキナーゼ(thrB)、スレオニンシンターゼ(thrC)、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ(アスパルテートトランスアミナーゼ)(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である(以下の記載においても同様)。これらの酵素の中では、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼが特に好ましい。L-スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株(特開2001-346578号)等が挙げられる。
以下、L−リジン生産菌及びその構築方法を例として示す。
例えば、L−リジン生産能を有する株としては、L−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。L−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−L−システイン(以下、「AEC」と略記することがある。)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌やコリネ型細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。L−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株(FERM BP-1543、NRRL B-12185;特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号明細書参照)、エシェリヒア・コリ VL611株(特開2000-189180号公報)等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのL−リジン生産菌として、WC196株(国際公開第96/17930号パンフレット参照)を用いることも出来る。
L-システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (特開平11-155571号)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (国際公開第0127307号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
L-ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-2-チエニルアラニン、3-ヒドロキシロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、国際公開第96/06926号に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
L-ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945、ロシア特許第2003677号)、E. coli 80株 (VKPM B-7270、ロシア特許第2119536号)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (欧州特許出願公開第1085087号)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
L-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K-12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性のL-グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株(特開2006-340603号明細書)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株(国際公開95/34672号パンフレット)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP-4172;フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173;フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174;フランス特許公報9401748号明細書)
コリネバクテリウム・グルタミカムL30-2株(特開2006-340603号)
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632:特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736;特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355(FERM P-5007;特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368(FERM P-5020;特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217(FERM P-4318;特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218(FERM P-4319;特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564(FERM P-5472;特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439(FERM P-5136;特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684(FERM BP-3004;特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426(FERM P-5123;特開平56-048890号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440(FERM P-5137;特開平56-048890号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796(FERM P-6402;特開平58-158192号公報参照)
L-フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(国際公開03/044191号)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473号及び2003/0157667、国際公開03/044192号)。
L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473及び2003/0157667)。
L-プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、L-プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (欧州特許公開公報1,172,433号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
L-アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315号)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2,001,112,869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (欧州特許公開公報1,170,358号)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(欧州特許公開公報1,170,361号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
ノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
L-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるL-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
L-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び/または、H+-ATPaseを欠失している変異株(国際公開96/06926号)を親株として用いることができる。
例えば、L-イソロイシンおよびL-メチオニン要求性,ならびにD-リボ-ス,プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し,かつL-バリン生産能を有する変異株(FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034) や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314) 、更には酢酸を唯一の炭素源とする培地でL-バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ(フルオロピルビン酸等)に感受性を有する変異株(FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号)が挙げられる。
L-イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、6-ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び/またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
L-メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L-スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランスサクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのL-メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開2000-139471号)。
また、遺伝子の配列におけるそれぞれのコドンは、遺伝子が導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。
本発明のL-アミノ酸の製造法においては、微細藻類の前記処理物を含む培地で、L-アミノ酸生産能を有する細菌を培養して、培養物中にL-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からL-アミノ酸を採取する。あるいは、(a)微細藻類を培地で培養し、該培養物を、破砕、抽出、分画及び加水分解から選ばれる1以上の方法により処理して、L-アミノ酸生産能を有する細菌によるL−アミノ酸の生産蓄積を促進する該微細藻類の処理物を調製し、(b)該細菌を、該微細藻類の処理物を含む培地に培養し、培養物中にL-アミノ酸を生産蓄積させ、(c)該培養物からL-アミノ酸を採取する。前記処理物は炭素源として含まれることが好ましく、この場合には、特にスターチの糖化物あるいは油脂の加水分解物を含む処理物であることが好ましい。
Chlorella kessleri を、100 mLの0.2×ガンボーグB5培地(日本製薬)を入れた500 mL容三角フラスコにて30℃、光強度10,000 lux(TOMY社製培養装置CL-301)で6日間振とう培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。0.2×ガンボーグB5 培地800 mLを入れた1L容メディウムビンに、前培養液16 mLを添加し、培養温度30℃、光強度10,000 luxにて、500 mL/minで、CO2濃度が3%となるように空気とCO2の混合ガスを吹き込みながら、12日間培養を行った。
KNO3 500 mg/L
MgSO4・7H2O 50 mg/L
NaH2PO4・H2O 30 mg/L
CaCl2・2H2O 30 mg/L
(NH4)2SO4 26.8 mg/L
Na2-EDTA 7.46 mg/L
FeSO4・7H2O 5.56 mg/L
MnSO4・H2O 2 mg/L
H3BO3 0.6 mg/L
ZnSO4・7H2O 0.4 mg/L
KI 0.15 mg/L
Na2MoO2・2H2O 0.05 mg/L
CuSO4・5H2O 0.005 mg/L
CoCl2・6H2O 0.005 mg/L
120℃ 15分 オートクレーブ殺菌
実施例1(1)の培養液1 L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、その沈殿物に80 mLのエタノールを加え、藻体を懸濁させた後に30分煮沸した。その懸濁液を遠心分離し、藻体を沈殿させた後に、80 mLのエタノールで2回洗浄した後、デシケーター内で乾燥させた。その乾燥藻体に40 mLの0.2 M KOHを加え、30分煮沸し、さらに超音波装置(Kubota社INSONATOR 201MA)により15,000W、10分の処理を行い、細胞を破砕した。その破砕液に8 mLの1 M酢酸溶液、250 Uのアミログルコシダーゼ(シグマ-アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社A-9228)を加え、55℃にて18時間反応させた。反応終了後、反応物中のグルコースをバイオテックアナライザーAS210(サクラ精機)にて定量した。酵素濃度を2倍にしても、生成するグルコース量はほとんど変化がなかったことから、スターチのうち、大部分がグルコースに変換されていると推定された。藻体破砕物(残渣)を遠心分離によって除去し、その上清をアミノ酸発酵の炭素源として用いた。
L-リジン生産菌として国際公開第2006/078039号パンフレットに記載されているエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2を用いた。WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2をストレプトマイシン硫酸塩20mg/Lを含有するLB寒天培地(Tryptone 10 g/L、Yeast extract 5 g/L、NaCl 10g /L、寒天15g/L)にて37℃で20時間培養した。寒天培地上の細胞を掻き取り、ストレプトマイシン硫酸塩20 mg/Lを含有するL-リジン生産培地40 mLを入れた500 mL容三角フラスコに植菌し、培養温度37℃にて、24時間培養を行った。本培養においては、Chlorella kessleriが生産するスターチから調製した実施例1(2)の糖化液(グルコース量として2.75 g/L)とその調製の際に、バッファーとして利用した酢酸4.8 g/Lを炭素源とした。対照として、同濃度のグルコース、又は酢酸の一方を含む培地と、グルコースと酢酸の両方を炭素源として含む培地にて培養を実施した。
(A区)
炭素源
グルコース 2.75 g/L
酢酸 4.8 g/L
(B区)
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4・7H2O 10 mg/L
MnSO4・4H2O 10 mg/L
(C区)
炭酸カルシウム 15 g/L
A区、B区は115℃にて10分間、オートクレーブ殺菌し、C区は180℃にて3時間、乾熱滅菌した。室温に冷却後3者を混合して、MgSO4・7H2O溶液を終濃度1 g/Lとなるように加えた。
実施例1(1)の培養液3.6 L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、その沈殿物に100 mLのエタノールを加え、藻体を懸濁させた後、室温で24 時間静置した。その後、濾過を行って濾液を回収し、藻体残渣を100 mLのエタノールで2回抽出操作を行い、計300 mLのエタノール抽出液とした。そのエタノール抽出液をロータリーエバポレーターによりエタノール除去した後、滅菌水に溶解し、水酸化カリウム水溶液でpH7.0に合わせ、藻体由来の有機物液45 mLを調製した。その有機物液を、115℃にて10分間オートクレーブ滅菌した後、L-リジン発酵の培地成分の代替として用いた。本有機物液はスターチを含んでいないため、アミノ酸生産菌に利用できる炭素源は、含まれていない。
L-リジン生産菌であるエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2を、ストレプトマイシン硫酸塩20 mg/Lを含有するLB寒天培地にて37℃で20時間培養した。寒天培地上の細胞を掻き取り、ストレプトマイシン硫酸塩20 mg/Lを含有するL-リジン生産培地4 mLを入れた太試験管に植菌し、培養温度37℃にて、24時間培養を行った。本培養においては、L-リジン生産培地中のB区の成分を半減した培地(以下、本培地を「L-リジン生産培地(半量B区)」と呼ぶ)にChlorella kessleri藻体から抽出した実施例2(1)の有機物液75 μL(培養液に換算すると、6 mL分に相当)を加えて、培養を実施した。対照としては、L-リジン生産培地、L-リジン生産培地(半量B区)、及びグルコースが入っていないL-リジン生産培地(半量B区)培地に有機物液75 μLを添加した条件にて、培養を行った。
(A区)
グルコース 20 g/L
(B区)
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4・7H2O 10 mg/L
MnSO4・4H2O 10 mg/L
(C区)
炭酸カルシウム 30 g/L
室温に冷却後、3者を混合して、MgSO4・7H2O溶液を終濃度1 g/Lとなるように加えた。
Chlorella kessleri を、0.2×ガンボーグB5培地(日本製薬)500 mLを入れた2 L容ジャーファーメンター(ABLE社製)にて30℃、光強度20,000 luxで7日間攪拌培養し、これを前培養液とした。尚、本ジャーファーメンターは、光源として、白色光を発する環形蛍光灯がガラスベッセルの周りを取り囲む光照射型のジャーファーメンターである。0.2×ガンボーグB5 培地1.5 Lを入れた2 L容ミニジャーファーメンターに、前培養液30 mLを添加し、培養温度30℃、光強度20,000 luxにて、500 mL/minでCO2濃度を3%に保ちながら空気-CO2混合ガスを吹き込み、14日間培養を行った。
実施例3(1)の藻類培養液300 mLを高温反応装置内の反応容器に投入し、攪拌しつつ60分間かけて175℃もしくは215℃まで昇温させた後、それぞれの温度で5分間保持させた。
L-グルタミン酸生産菌としては、特開2006-340603号に記載のブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL30-2株を用いた。L30-2株をCM-Dexプレート培地に播種し31.5℃で24時間培養した。そのプレート培地上の細胞を1白金耳分掻き取り、L-グルタミン酸生産培地4 mLを入れた太試験管に植菌し、培養温度31.5℃にて、13時間培養を行った。本培養における炭素源として、Chlorella kessleriの藻類スターチ分解物から調製した実施例3(2)の糖化液(グルコース量として1.0 g/L)、ならびに対照として同濃度の試薬グルコースを用いた。また、L-グルタミン酸生産培地、およびL-グルタミン酸生産培地中のB区の成分を半減した培地(以下、本培地を「L-グルタミン酸生産培地(半量B区)」と呼ぶ)の2種類の培地成分にて、培養を実施した。
グルコース 5 g/L
ポリペプトン 10 g/L
酵母エキス 10 g/L
KH2PO4 1 g/L
MgSO4・7H2O 0.4 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・7H2O 0.01 g/L
尿素 3 g/L
大豆加水分解物 1.2 g/L
ビオチン 10 μg/L
NaOHを用いて、pH7.5に調整。120℃にて20分間オートクレーブ殺菌条件。
(A区)
炭素源
藻類由来のスターチ分解物 1.0 g/L(グルコース)
(B区)
(NH4)2SO4 15 g/L
KH2PO4 1 g/L
MgSO4・7H2O 0.4 g/L
FeSO4・7H2O 10 mg/L
MnSO4・4H2O 10 mg/L
VB1・HCl 200 μg/L
Biotin 300 μg/L
大豆加水分解物 0.48 g/L
(C区)
炭酸カルシウム 50 g/L
実施例3(2)にて調製した215℃の高温処理した藻体破砕液80 mLのpHを1N HClを用いて6.0に調整した後、400 Uのアミログルコシダーゼ単独(シグマ-アルドリッチ社A-9228)もしくは同量のアミログルコシダーゼと1000Uのリパーゼ(シグマ-アルドリッチ社 L1754)両酵素 を加え、50℃にて24時間反応させた。反応終了後の各反応液を10 mLまで濃縮した後、アミログルコシダーゼ単独処理液中の残渣を遠心分離で取り除き、その上清のpHを1N NaOHを用いて7.0に調整し、15mlにメスアップした後、120℃にて20分の条件にて、オートクレーブ処理した。一方、両酵素の処理液は、1.13mLの10%Tween80水溶液を加え、60℃に加温した後、ボルテックスにて攪拌した。次に、その両酵素の処理液中の残渣を遠心分離で取り除き、その上清のpHを1N NaOHを用いて7.0に調整し、15 mLにメスアップした後、120℃、20分の条件にて、オートクレーブ処理した。各炭素源中のグルコースと脂肪酸の量を測定し、培養評価に用いた。
エシェリヒア・コリの脂肪酸代謝を調節する転写因子FadRはfadR遺伝子(配列番号15)によってコードされている(DiRusso, C. C. et al. 1992. J. Biol. Chem. 267: 8685-8691)。本遺伝子破壊の親株は、エシェリヒア・コリのL-リジン生産株として、国際特許公報WO2006/078039に記載のWC196ΔcadAΔldcC株を用いた。
L-リジン生産菌であるエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcCΔfadR/pCABD22を、ストレプトマイシン硫酸塩20 mg/Lを含有するLB寒天培地にて37℃で20時間培養した。寒天培地上の細胞を掻き取り、ストレプトマイシン硫酸塩20mg/Lを含有するL-リジン生産培地4 mLを入れた太試験管に植菌し、培養温度37℃にて、24時間培養を行った。本培養においては、Chlorella kessleriが生産するスターチから調製した実施例4(1)の糖化液(グルコース量として1.33 g/L)とスターチと油脂から調製した実施例4(1)の加水分解液を炭素源とした。対照として、同濃度のグルコースを炭素源として含む培地にて培養を実施した。
(A区)
炭素源
藻類由来のスターチ分解物 1.33 g/L(グルコース)
(B区)
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1 g/L
Yeast Extract 2 g/L
FeSO4・7H2O 10 mg/L
MnSO4・4H2O 10 mg/L
(C区)
炭酸カルシウム 15 g/L
Neochloris oleoabundans UTEX 1185株を、100 mLのModified NORO培地を入れた500 mL容三角フラスコにて30℃、光強度10,000 lux(TOMY社製培養装置CL-301)で6日間振とう培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。Modified NORO培地800 mLを入れたL容メディウムビンに、前培養液32 mLを添加し、培養温度30℃、光強度10,000 luxにて、500 mL/minでCO2濃度が3%となるように空気とCO2の混合ガスを吹き込みながら、14日間培養を行った。
NaCl 29.22 g/L
KNO3 1.0 g/L
MgCl2・6H2O 1.5 g/L
MgSO4・7H2O 0.5 g/L
KCl 0.2 g/L
CaCl2・2H2O 0.2 g/L
K2HPO4 0.045 g/L
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 2.45 g/L
Na2-EDTA 1.89 mg/L
ZnSO4・7H2O 0.087 mg/L
H3BO3 0.61 mg/L
CoCl2・6H2O 0.015 mg/L
CuSO4・5H2O 0.06 mg/L
MnCl2 0.23 mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.38 mg/L
Fe(III)・EDTA 3.64 mg/L
Vitamin B1 0.1 mg/L
Vitamin B12 0.5 mg/L
Biotin 0.5 mg/L
pHを1N HClにて8.0に調整後、120℃にて10分間オートクレーブ殺菌
実施例5(1)の培養液3.6 L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、得られた藻体を用いて、下記の抽出操作を3回繰り返した。まず、藻体を100 mLのメタノール:クロロホルム=2:1に懸濁させた後に、超音波装置(Kubota社INSONATOR 201MA)により15,000W、10 分の処理を行い、細胞を破砕した。その破砕液を一晩、静置抽出した後、濾過により固形物を取り除き、抽出液を回収した。
L-リジン生産菌であるエシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて20時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地20 mLを入れた坂口フラスコに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。実施例5(2)の藻類由来の各サンプルを、蒸留水に懸濁させた後、1%濃度になるようにTween80を加え、pHを3N KOHを用いて7.0に調整し、120℃にて20分オートクレーブを行ったものを炭素源溶液として用いた。培養に用いた培地組成(終濃度)を以下に示す。藻類由来の粗抽出物の加水分解物、藻類由来の油脂画分の加水分解物、あるいは、藻類由来の水溶性画分を炭素源として用いた。それぞれの炭素源について、測定された脂肪酸濃度とグリセロール濃度の和が記載されている。また、対照として、試薬脂肪酸と試薬グリセロールを混合し、同濃度になるように調整した炭素源を用いた。微細藻類Neochloris oleoabundansより抽出した油脂の加水分解物の脂肪酸とグリセロールの分析を行い、主要な脂肪酸として含まれていたオレイン酸(純正化学社製一級)、リノール酸(ナカライテスク社製)及びパルミチン酸(ナカライテスク社製特級)を重量組成比4.2 : 3.8 : 1.0で含み、脂肪酸とグリセロールの重量組成比が11.4:1となるように調整した。
炭素源として
試薬脂肪酸+試薬グリセロール 1.09 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
藻類由来の粗抽出物の加水分解物 1.09 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
藻類由来の油脂画分の加水分解物 1.19 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
藻類由来の水溶性画分 0.04 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
のいずれか
MgSO4・7H2O 1.0 g/L
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1.0 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・7H2O 0.01 g/L
Yeast Extract 2.0 g/L
炭酸カルシウム 30 g/L
Neochloris oleoabundans UTEX 1185株を、100 mLのModified NORO培地を入れた500mL容三角フラスコにて30℃、光強度5,000 lux(TOMY社製培養装置CL-301)で6日間振とう培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。Modified NORO培地800mLを入れたL容メディウムビンに、前培養液32mLを添加し、培養温度30℃、光強度5,000 luxにて、500 mL/minにてCO2濃度が3%となるように空気とCO2の混合ガスを吹き込みながら、14日間培養を行った。
NaCl 29.22 g/L
KNO3 1.0 g/L
MgCl2・6H2O 1.5 g/L
MgSO4・7H2O 0.5 g/L
KCl 0.2 g/L
CaCl2・2H2O 0.2 g/L
K2HPO4 0.045 g/L
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 2.45 g/L
Na2-EDTA 1.89 mg/L
ZnSO4・7H2O 0.087 mg/L
H3BO3 0.61 mg/L
CoCl2・6H2O 0.015 mg/L
CuSO4・5H2O 0.06 mg/L
MnCl2 0.23 mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O 0.38 mg/L
Fe(III)・EDTA 3.64 mg/L
Vitamin B1 0.1 mg/L
Vitamin B12 0.5 μg/L
Biotin 0.5 μg/L
1N HClにてpH8.0に調整後、120℃にて10分 オートクレーブ殺菌
実施例6(1)の培養液1.8L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、その沈殿物に50 mLのメタノール:クロロホルム=2:1を加え、下記の抽出操作を3回繰り返した。まず、藻体を50 mLのメタノール:クロロホルム=2:1に懸濁させ、一晩、静置抽出した後、濾過により固形物を取り除き、抽出液を回収した。
エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて20時間培養した。得られたプレートのおよそ1/40量の菌体を、太試験管の、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の4 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。炭素源となる実施例6(2)の藻類由来の各サンプルは、加水分解後の溶液に、2%濃度になるようにTween80を加え、pHを3N KOHを用いて7.0に調整し、120℃にて20分オートクレーブを行ったものを炭素源溶液として用いた。培養に用いた培地組成を以下に示す。A区は炭素源であり、測定された脂肪酸濃度とグリセロール濃度の和が記載されている。
(A区)
藻類由来の油脂加水分解物 1.22 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
藻類由来の全脂質類の加水分解物 2.14 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
のいずれか
(B区)
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1.0 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・7H2O 0.01 g/L
Yeast Extract 2.0 g/L
(C区)
炭酸カルシウム 30 g/L
Nannochloris sp. UTEX LB 1999株を、100 mLのModified NORO培地を入れた500 mL容三角フラスコにて30℃、光強度10,000 lux(TOMY社製培養装置CL-301)で6日間振とう培養し、これを前培養液とした。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。Modified NORO培地800 mLを入れた1L容メディウムビンに、前培養液32mLを添加し、培養温度30℃、光強度10,000 luxにて、500 mL/minでCO2濃度が3%となるように空気とCO2の混合ガスを吹き込みながら、14日間培養を行った。
実施例7(2)の培養液3.6 L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、得られた藻体を用いて、下記の抽出操作を3回繰り返した。まず、藻体を100 mLのメタノール:クロロホルム=2:1に懸濁させた後に、超音波装置(Kubota社INSONATOR 201MA)により15,000Wにて10分間処理を行い、細胞を破砕した。その破砕液を一晩静置抽出した後、濾過により固形物を取り除き、抽出液を回収した。得られた抽出液を濃縮した後、80%メタノール100 mLに懸濁させ、その懸濁液とヘキサン100 mLを加えた分液ロート内で液々分配を3回行い、油脂を含むヘキサン層(油脂画分)と水溶性有機物を多く含む80%メタノール層(水溶性画分)を得た。次に、油脂画分を予め加温した40 mLの熱水に懸濁させた後に、500Uのリパーゼ (シグマ L1754)を加え、42℃にて20時間反応させた。その反応液と水溶性画分の脂肪酸濃度とグリセロール濃度を測定し、それぞれをアミノ酸発酵の炭素源として用いた。
エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて20時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地20 mLを入れた坂口フラスコに接種し、往復振とう培養装置で37℃において16もしくは20時間培養した。実施例7(2)の藻類由来の各サンプルを、蒸留水に懸濁させた後、1%濃度になるようにTween80を加え、pHを3N KOHを用いて7.0に調整し、120℃にて20分オートクレーブを行ったものを炭素源溶液として用いた。培養に用いた培地組成を以下に示す。藻類由来の油脂画分加水分解物あるいは藻類由来の水溶性画分を炭素源として用いた。それぞれの炭素源について測定された脂肪酸濃度とグリセロール濃度の和が記載されている。
炭素源として
藻類由来の油脂画分の加水分解物 1.06 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
藻類由来の水溶性画分 0.00 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
のいずれか
MgSO4・7H2O 1.0 g/L
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1.0 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・7H2O 0.01 g/L
Yeast Extract 2.0 g/L
炭酸カルシウム 30 g/L
実施例7(1)と同様にして培養したNannochloris sp. UTEX LB 1999株の培養液1.2L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、得られた藻体を用いて、下記の抽出操作を3回繰り返した。まず、藻体を100mLのメタノール:クロロホルム=2:1に懸濁させた後に、超音波装置(Kubota社INSONATOR 201MA)により15,000Wにて10分間処理を行い、細胞を破砕した。その破砕液を一晩静置抽出した後、濾過により固形物を取り除き、抽出液を回収し、濃縮した。次に、予め加温した40 mLの熱水に懸濁した後、リパーゼ (シグマ-アルドリッチ社 L1754)500Uを加え、42℃にて20時間反応させた。その反応液の脂肪酸濃度とグリセロール濃度を測定し、それぞれをアミノ酸発酵の炭素源として用いた。
エシェリヒア・コリWC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて20時間培養した。得られたプレートのおよそ1/8量の菌体を、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地20 mLを入れた坂口フラスコに接種し、往復振とう培養装置で37℃において16もしくは20時間培養した。炭素源となる実施例8(1)の藻類由来の各サンプルは、蒸留水に懸濁させた後、1%濃度になるようにTween80を加え、pHを3N KOHを用いて7.0に調整し、120℃にて20分オートクレーブを行ったものを炭素源溶液として用いた。培養に用いた培地組成を以下に示す。炭素源として用いた藻類由来の粗抽出物の加水分解物について測定された脂肪酸濃度とグリセロール濃度の和が記載されている。
藻類由来の粗抽出物の加水分解物 0.37 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
MgSO4・7H2O 1.0 g/L
(NH4)2SO4 24 g/L
KH2PO4 1.0 g/L
FeSO4・7H2O 0.01 g/L
MnSO4・7H2O 0.01 g/L
Yeast Extract 2.0 g/L
炭酸カルシウム 30 g/L
Thalassiosira pseudonana UTEX LB FD2株を、500 mLのF/2培地を入れた1L容メディウムビンにて、培養温度25℃、光強度7,000 luxにて、200 mL/minでCO2濃度が1%となるように空気とCO2の混合ガスを吹き込みながら、3日間培養し、これを前培養液とした。F/2培地の海水成分としては、人工海水であるアクアマリンS(八洲薬品 社(YASHIMA PURE CHEMICALS)製)を用いた。F/2培地800 mLを入れた1L容メディウムビンに、前培養液32mLを添加し、培養温度25℃、光強度7,000 luxにて、200 mL/minでCO2濃度が1%となるように空気との混合ガスを吹き込みながら、7日間培養を行った。尚、光源には、蛍光灯からの白色光を用いた。
NaNO3 75 mg/L
NaH2PO4・H2O 5 mg/L
Na2SiO3・9H2O 20 mg/L
FeCl3・6H2O 6.4 mg/L
MnSO4・H2O 0.304 mg/L
ZnSO4・7H2O 0.046 mg/L
Na2MoO4・2H2O 14.6 μg/L
CuCl2・2H2O 13.6 μg/L
Na2EDTA・2H2O 8.8 mg/L
CoCl2・6H2O 23.8 μg/L
Vitamin B12 0.135 mg/L
Biotin 0.025 mg/L
Vitamin B1 1.1 mg/L
アクアマリンS(人工海水) 40 g/L
120℃にて10分 オートクレーブ殺菌
実施例9(1)の培養液1.8L分の藻体を遠心分離にて沈殿させ、その沈殿物に50 mLのメタノール:クロロホルム=2:1を加え、下記の抽出操作を3回繰り返した。まず、藻体を50mLのメタノール:クロロホルム=2:1に懸濁させ、一晩、静置抽出した後、濾過により固形物を取り除き、抽出液を回収した。
得られた抽出液を濃縮した後、40 mLの熱水に懸濁させた後に、リパーゼ (シグマ L1754)500Uを加え、42℃にて18時間反応させた。その反応液の脂肪酸濃度とグリセロール濃度を測定し、それぞれをアミノ酸発酵の炭素源として用いた。
エシェリヒア・コリWC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを融解し、各100 μLを、25 mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて20時間培養した。得られたプレートのおよそ1/40量の菌体を、太試験管の、25 mg/Lのストレプトマイシンを含む以下に記載の発酵培地の4 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。炭素源となる実施例9(2)の藻類由来の各サンプルは、加水分解後の溶液に、2%濃度になるようにTween80を加え、pHを3N KOHを用いて7.0に調整し、120℃、20分オートクレーブを行ったものを炭素源溶液として用いた。培養に用いた培地組成を以下に示す。A区は炭素源であり、測定された脂肪酸濃度とグリセロール濃度の和が記載されている。
[A区]
藻類由来の粗抽出物の加水分解物 1.09 g/L(脂肪酸濃度+グリセロール濃度)
[B区]
(NH4)2SO4 24g/L
KH2PO4 1.0g/L
FeSO4・7H2O 0.01g/L
MnSO4・7H2O 0.01g/L
Yeast Extract 2.0g/L
[C区]
炭酸カルシウム 30g/L
配列番号1:Bacillus subtilis由来 LipA遺伝子の塩基配列
配列番号2:Bacillus subtilis由来 LipAのアミノ酸配列
配列番号3:Burkholderia glumae由来LipA遺伝子の塩基配列
配列番号4:Burkholderia glumae由来LipAのアミノ酸配列
配列番号5:Pseudomonas aeruginosa 由来LipA遺伝子の塩基配列
配列番号6:Pseudomonas aeruginosa 由来LipAのアミノ酸配列
配列番号7:Staphylococcus aureus由来リパーゼ遺伝子の塩基配列
配列番号8:Staphylococcus aureus由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号9:Candida antarctica由来リパーゼ遺伝子の塩基配列
配列番号10:Candida antarctica由来リパーゼのアミノ酸配列
配列番号11:Candida rugosa由来リパーゼ遺伝子lip1の塩基配列
配列番号12:Candida rugosa由来リパーゼLIP1のアミノ酸配列
配列番号13:Candida rugosa由来リパーゼ遺伝子lip2の塩基配列
配列番号14:Candida rugosa由来リパーゼLIP2のアミノ酸配列
配列番号15:Eschrichia coli転写因子遺伝子fadRの塩基配列
配列番号16:fadR増幅用プライマー
配列番号17:fadR増幅用プライマー
Claims (34)
- L-アミノ酸生産能を有する細菌を、微細藻類の処理物を含む培地に培養し、培養物中にL-アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からL-アミノ酸を採取することを特徴とするL-アミノ酸の製造法であって、該処理物が、前記細菌によるL−アミノ酸の生産蓄積を促進するものである、L−アミノ酸の製造法。
- 前記処理物が、(1)該微細藻類の培養物の破砕物、(2)該微細藻類に由来する有機物の混合物を含む、該破砕物の抽出物もしくは分画物、又は、(3)該破砕物、該抽出物もしくは該分画物の加水分解物である請求項1記載の方法。
- 前記処理物が、スターチを産生する微細藻類の藻体破砕物、又はスターチを含むその抽出物もしくは該抽出物の分画物を加水分解して得られる糖化物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記糖化物が、微細藻類の藻体破砕物又はスターチを含むその分画物から、アミラーゼを用いた酵素反応により得られた反応産物である、請求項3に記載の方法。
- 前記アミラーゼがグルコアミラーゼである請求項4に記載の方法。
- 前記処理物が、油脂を産生する微細藻類の藻体破砕物、又は油脂を含むその抽出物もしくは該抽出物の分画物を加水分解して得られる加水分解物である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記加水分解物が、微細藻類の藻体破砕物又は油脂を含むその分画物から、リパーゼを用いた酵素反応により得られた反応産物である、請求項6記載の方法。
- 前記加水分解物が乳化処理を施されたものであることを特徴とする請求項6〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類の破砕法が高温処理であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類の破砕法が100℃以上の温度にて処理することを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑色植物門、不等毛植物門に属する藻類である請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又は珪藻綱に属する藻類である、請求項11に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑藻綱(Chlorophyceae)に属する藻類である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腸内細菌科に属する細菌がエシェリヒア・コリである請求項14に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸がL-リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸からなる群より選ばれる1種又は2種以上のL-アミノ酸である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸がL-リジンであり、前記細菌がジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及び、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、リジンデカルボキシラーゼの活性が弱化されている、請求項15に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸がL-スレオニンであり、前記細菌がアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及び、スレオニンシンターゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素の活性が増強されている請求項15に記載の方法。
- 前記L-アミノ酸がL-グルタミン酸であり、前記細菌がグルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及び、メチルクエン酸シンターゼからなる群より選択される1種または2種以上の酵素の活性が増強されている、及び/または、α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性が弱化されている請求項15に記載の方法。
- 前記培地が前記処理物を炭素源として含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- L-アミノ酸の製造方法であって、
(a)微細藻類を培地で培養し、該培養物を、破砕、抽出、分画及び加水分解から選ばれる1以上の方法により処理して、L-アミノ酸生産能を有する細菌によるL−アミノ酸の生産蓄積を促進する該微細藻類の処理物を調製し、
(b)該細菌を、該微細藻類の処理物を含む培地に培養し、培養物中にL-アミノ酸を生産蓄積させ、
(c)該培養物からL-アミノ酸を採取することを特徴とするL-アミノ酸の製造法。 - 前記処理物が、(1)該微細藻類の培養物の破砕物、(2)該微細藻類に由来する有機物の混合物を含む、該破砕物の抽出物もしくは分画物、又は、(3)該破砕物、該抽出物もしくは該分画物の加水分解物である請求項21記載の方法。
- 前記破砕が、高温処理、有機溶媒処理、煮沸処理、強アルカリ処理からなる群から選択される1以上の方法によって行われる請求項21記載の方法。
- 前記処理物調製工程が、スターチを産生する微細藻類を破砕及び/または抽出・分画し、その処理物を加水分解することによって糖化する工程を含む請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖化する工程が、アミラーゼを用いた酵素反応を施すことを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 前記アミラーゼがグルコアミラーゼである請求項25に記載の方法。
- 前記処理物調製工程が、油脂を産生する微細藻類を破砕及び/または抽出・分画し、その油処理物を加水分解する工程を含む、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記加水分解工程が、リパーゼを用いた酵素反応を施すことを特徴とする、請求項27記載の方法。
- 前記加水分解物が乳化処理を施されたものであることを特徴とする請求項27または28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑色植物門、不等毛植物門に属する藻類である請求項21〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑藻綱、トレボキシア藻綱、又は珪藻綱に属する藻類である、請求項30に記載の方法。
- 前記微細藻類が緑藻綱(Chlorophyceae)に属する藻類である、請求項31に記載の方法。
- 前記細菌が腸内細菌科に属する細菌またはコリネ型細菌である請求項21〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腸内細菌科に属する細菌がエシェリヒア・コリである請求項33に記載の方法。
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