ES2708839T3 - Procedimiento de enriquecimiento en proteínas de la biomasa de microalgas - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de enriquecimiento en proteínas de una microalga cultivada en heterotrofía, microalga del género Chlorella, caracterizado por que el cultivo heterotrófico comprende una etapa que tiene como objetivo limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una deficiencia en fosfato del medio de fermentación, permitiendo así alcanzar un contenido en proteínas de la biomasa de más del 50% en peso, caracterizado por que el fosfato está en deficiencia de manera que se obtenga una velocidad de crecimiento disminuida de 10 a 60% con respecto a la velocidad de crecimiento sin limitación de fosfato.
Description
DESCRIPCION
Procedimiento de enriquecimiento en protemas de la biomasa de microalgas
La presente invencion esta relacionada con un procedimiento de enriquecimiento en protemas de la biomasa de microalgas, mas particularmente del genera Chlorella, mas particularmente aun de la especie Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides.
Las algas, macro y micro, tienen una riqueza espedfica en gran parte inexplorada. Su explotacion con fines alimenticios, qmmicos o bioenergeticos es todavfa muy marginal. Contienen, sin embargo, componentes de gran valor, cuya riqueza y abundancia solo la fauna marina, que se alimenta de ellas, es verdaderamente capaz de apreciar.
Las microalgas son, en efecto, fuentes de vitaminas, lfpidos, protemas, azucares, pigmentos y antioxidantes.
Las algas y microalgas interesan asf al sector industrial, que las utiliza para la fabricacion de complementos alimenticios, de alimentos funcionales, de cosmeticos, de medicamentos o para la acuicultura.
Las microalgas son, ante todo, microorganismos fotosinteticos que colonizan todos los biotopos expuestos a la luz.
A escala industrial, su cultivo monoclonal se realiza en fotobiorreactores (condiciones autotroficas: a la luz con CO2) o para algunas de entre ellas, tambien en fermentadores (condiciones heterotroficas: en la oscuridad en presencia de una fuente carbonada).
Algunas especies de microalgas son en efecto capaces de crecer en ausencia de luz: Chlorella, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.
De hecho, se estima que el cultivo en condiciones heterotroficas cuesta 10 veces mas barato que en condiciones fototroficas ya que, para el experto en la materia, estas condiciones heterotroficas permiten:
- la utilizacion de fermentadores identicos a los utilizados para las bacterias y las levaduras y permiten el control de todos los parametros de cultivo,
- la produccion de biomasas en cantidad mucho mas elevada que la que se obtiene mediante cultivo basado en la luz.
La explotacion rentable de las microalgas necesita generalmente el control de las condiciones de fermentacion que permiten acumular sus componentes de interes, tales como:
- los pigmentos (clorofila a, b y c, p-caroteno, astaxantina, lutema, ficocianina, xantofilos, ficoeritrina, etc.) cuya demanda es creciente, tanto por sus notables propiedades antioxidantes, como por su aporte de colores naturales en la alimentacion,
- las protemas, con el fin de optimizar sus cualidades nutritivas; o
- los lfpidos, con el fin de optimizar su contenido en acidos grasos (hasta el 60%, incluso el 80% en peso de su materia seca) en particular para:
• las aplicaciones biocarburantes, pero tambien
• las aplicaciones en alimentacion humana o animal, cuando las microalgas seleccionadas producen acidos grasos poliinsaturados o PUFAs denominados “esenciales” (es decir, aportados por la alimentacion ya que no son producidos de manera natural por el hombre o el animal).
Para alcanzar este resultado, se han trabajado asf ampliamente primeros procedimientos de fermentacion que permiten obtener altas densidades celulares (acronimo ingles: HCD por High-Cell-Density), con el fin de obtener rendimientos y productividades maximos en protemas o en lfpidos.
El objetivo de estos cultivos HCD era la obtencion de la concentracion mas elevada posible del producto deseado en el lapso de tiempo mas corto.
Este precepto se verifica por ejemplo para la biosmtesis de astaxantina por Chlorella zofingiensis, en la que el crecimiento de la microalga se mostro correlacionado directamente con la produccion de este compuesto (Wang y Peng, 2008, World J Microbiol, Biotechnol., 24(9), 1915-1922).
Sin embargo, el hecho de mantener el crecimiento en su tasa maxima (|i, en h-1) no esta siempre correlacionado con la produccion elevada del producto deseado.
En efecto, se revelo rapidamente a los especialistas del campo que es necesario, por ejemplo, someter a las microalgas a un estres nutricional que limita su crecimiento cuando se desea hacerlas producir importantes reservas lipfdicas.
Por lo tanto, se precede a partir de ahora al desacoplamiento crecimiento/produccion en los procedimientos de fermentacion.
Por ejemplo, para favorecer la acumulacion de acidos grasos poliinsaturados (aqu el acido docosahexaenoico o DHA), la solicitud de patente WO 01/54510 recomienda disociar el crecimiento celular y la produccion de acidos grasos poliinsaturados.
En la microalga Schizochytrium sp cepa ATCC 20888, se procede asf a una primera fase de crecimiento sin limitacion en oxfgeno, a fin de favorecer la obtencion de una alta densidad celular (mas de 100 g/l) despues, en una segunda fase, de ralentizar progresivamente el aporte de oxfgeno, a fin de estresar a la microalga, ralentizar su crecimiento e iniciar la produccion de los acidos grasos de interes.
En la microalga Crypthecodinium cohnii, el contenido mas elevado en acido docosahexaenoico (DHA, acido graso poliinsaturado) se obtiene a baja concentracion en glucosa (del orden de 5 g/l), y asf a baja tasa de crecimiento (Jiang y Chen, 2000, Process Biochem., 35(10), 1205-1209).
Estos resultados ilustran bien el hecho de que las cineticas de formacion de los productos pueden tambien estar asociadas tanto de manera positiva como de manera negativa con el crecimiento de las microalgas, incluso con una combinacion de las dos.
Por este motivo, en los casos en los que la formacion de los productos no esta correlacionada con un crecimiento celular elevado, es juicioso controlar la tasa de crecimiento celular.
En general, el experto en la materia elige controlar el crecimiento de las microalgas mediante el control de las condiciones de fermentacion (Tp, pH...), o mediante la alimentacion regulada en componentes nutricionales del medio de fermentacion (condiciones semicontinuas denominadas “fed-batch”).
Si elige controlar el crecimiento de las microalgas en heterotroffa mediante el aporte de fuentes carbonadas, el experto en la materia elige generalmente adaptar la fuente carbonada (glucosa pura, acetato, etanol...) a la microalga (C. cohnii, Euglena gracilis...) en funcion del metabolito producido (por ejemplo, un acido graso poliinsaturado de tipo DHA).
La temperatura puede ser tambien un parametro clave:
- por ejemplo, se ha informado de que la smtesis de acidos grasos poliinsaturados en algunas especies de microalgas, tal como la EPA por Chlorella minutissima, se ve favorecida a una temperatura mas baja que la requerida para el crecimiento optimo de dicha microalga;
- por el contrario, el rendimiento en lutema es mas elevado en Chlorella protothecoides cultivada en heterotroffa, cuando se aumenta la temperatura de produccion de 24 a 35°C.
Chlorella protothecoides esta reconocida justamente como una de las mejores microalgas productoras de aceite.
En condiciones heterotroficas, ella transforma rapidamente los hidratos de carbono en trigliceridos (mas del 50% de su materia seca).
Para optimizar esta produccion de trigliceridos, el experto en la materia se ve obligado a optimizar el flujo carbonado hacia la produccion de aceite, actuando sobre el entorno nutricional del medio de fermentacion.
Asf, se conoce que la acumulacion de aceite se produce durante un aporte carbonado suficiente, pero en condiciones de deficiencia de nitrogeno.
Por lo tanto, la relacion C/N es aqu determinante, y se admite que los mejores resultados se obtienen actuando directamente sobre el contenido en nitrogeno, no siendo limitante el contenido en glucosa.
De manera no sorprendente, esta deficiencia de nitrogeno afecta al crecimiento celular, lo que produce como resultado una tasa de crecimiento del 30% mas baja que la tasa de crecimiento normal de la microalga (Xiong et al., Plant Physiology, 2010, 154, pp1001-1011).
Para explicar este resultado, Xiong et al., en el arffculo citado anteriormente, demuestran en efecto que si se divide la biomasa de Chlorella en sus 5 componentes principales, es decir hidratos de carbono, ffpidos, protemas, ADN y ARN (representando el 85% de su materia seca), si la relacion C/N no tiene ningun impacto sobre el contenido en a Dn , en ARN y en hidratos de carbono, se vuelve preeminente para el contenido en protemas y en ffpidos.
Es asf que las celulas de Chlorellas cultivadas con una relacion C/N baja contienen un 25,8% de protemas y un 25,23% en ffpidos, mientras que una relacion C/N elevada permite la smtesis de 53,8% de ffpidos y 10,5% de protemas.
Para optimizar su produccion en aceite, es por lo tanto primordial para el experto en la materia controlar el flujo carbonado desviandolo hacia la produccion de aceite, en detrimento de la produccion de protemas; el flujo carbonado
se redistribuye y se acumula en sustancias de reserva lip^dicas cuando las microalgas se colocan en un medio con deficiencia de nitrogeno.
Apoyandose en esta ensenanza, para la produccion de biomasas ricas en protemas, el experto en la materia es inducido, por lo tanto, a realizar lo contrario de este control metabolico, es decir, trabajar las condiciones de fermentacion favoreciendo, en su lugar, una relacion C/N baja, y asf:
- realizar un aporte importante de fuente de nitrogeno al medio de fermentacion, manteniendo al mismo tiempo constante la carga en fuente carbonada que se convertira en protemas, y
- estimular el crecimiento de la microalga.
Se trata de modificar el flujo carbonado hacia la produccion de protemas (y por lo tanto de biomasas), en detrimento de la produccion de ffpidos de reserva.
SANSAWA et al. (2004, Journal of Bioscience and Bioengineering, 98, 437-444) y DOUCHA et al. (2012, Journal of Applied Phycology, 24, 35-43) describen un procedimiento de cultivo en heterotroffa de una microalga de tipo Chlorella que comprende una etapa de deficiencia total de alimentacion en glucosa del medio de fermentacion.
YongCheng et al (2008, Limnology and Oceanography, 53, 1790-1804) y Avakyan et al (1993, Prikladnaa Biohimia I Mikrobiologia -Applied Biochemistry and Microbiology, 29, 723-727) describen condiciones limitantes en fosfato sobre algas en fototroffa.
Dentro del ambito de la invencion, la empresa solicitante ha elegido explorar una via original proponiendo una solucion alternativa a la clasicamente contemplada por el experto en la materia.
La invencion se refiere asf a un procedimiento de enriquecimiento en protemas de una microalga cultivada en heterotroffa, microalga del genero Chlorella, mas particularmente aun Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides, procedimiento de cultivo heterotrofico que comprende una etapa que tiene como objetivo limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una deficiencia en fosfato del medio de fermentacion.
Esta etapa es una etapa de cultivo heterotrofico en la que el fosfato se aporta en cantidad insuficiente en el medio para permitir el crecimiento de la microalga. Cabe senalar que por cantidad insuficiente no se entiende un aporte nulo en este factor nutritivo. Esta fase de deficiencia nutritiva conduce entonces a ralentizar (limitar) el metabolismo celular, sin inhibirlo totalmente.
En el sentido de la invencion, “el enriquecimiento” se entiende un aumento del contenido en protemas de la biomasa de al menos el 15%, preferentemente de al menos el 20% en peso, a fin de alcanzar un contenido en protemas de la biomasa de mas del 50% en peso.
La invencion se refiere mas precisamente un procedimiento de cultivo heterotrofico de dichas microalgas que comprende una etapa que tiene como objetivo limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una deficiencia del medio de fermentacion en fosfato.
Asf, la presente invencion se refiere a un procedimiento de enriquecimiento en protemas de una microalga cultivada en heterotroffa, microalga del genero Chlorella, mas particularmente aun Chlorella sorokinianana o Chlorella protothecoides, comprendiendo el procedimiento el cultivo heterotrofico que comprende una etapa que tiene como objetivo limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una deficiencia del medio de fermentacion en fosfato, permitiendo asf alcanzar un contenido en protemas de la biomasa de mas de 50% en peso, estando el fosfato en deficiencia de manera que se obtenga una velocidad de crecimiento disminuida de 10 a 60 % con respecto a la velocidad de crecimiento sin limitacion de fosfato.
Por “deficiencia del medio de fermentacion en fosfato” se entiende un cultivo en el cual el fosfato se aporta a la microalga en cantidad insuficiente para permitir su crecimiento.
La duracion de la fase de cultivo deficiente en fosfato es al menos 1 h, preferentemente de al menos 10 h, mas preferiblemente de al menos 20 h, en particular entre 30 y 60 h.
Esto se traduce en una ausencia de fosfato residual en el medio de cultivo, consumiendo la microalga este factor nutritivo a medida que se aporta. Sin embargo, la ausencia de fosfato residual en el medio de cultivo se debe distinguir de una situacion en la cual la microalga esta totalmente privada de fosfato.
En el sentido de la invencion, el criterio esencial es, por lo tanto, la limitacion del crecimiento celular inducido por un estres, estres celular provocado por la deficiencia en fosfato del medio de fermentacion.
Por lo tanto, esta estrategia va en contra del prejuicio tecnico segun el cual, para aumentar el contenido en protemas de la biomasa, se necesita inevitablemente incrementar esta biomasa y, por lo tanto, el crecimiento celular.
Como se ejemplificara a continuacion, se puede elegir ventajosamente limitar el crecimiento de Chlorella
protothecoides mediante una deficiencia en fosfatos del medio de fermentacion.
En particular, para estas cepas, el fosfato se aporta a fin de obtener una velocidad de crecimiento comprendida entre 0. 06.h-1 y 0,09 h-1.
En un modo muy particular, la cepa de Chlorella sorokiniana es la cepa UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA. En un modo muy particular, la cepa de Chlorella protothecoides es la cepa CCAP211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK.
De manera opcional, la limitacion del crecimiento de dicha microalga se puede obtener mediante la adicion en el medio de cultivo de sustancias inhibidoras del crecimiento celular, como los sulfatos.
Por otro lado, sin estar atada a ninguna teona, la empresa solicitante ha encontrado que el flujo de glucosa se utiliza normalmente en las microalgas del genero Chlorella sorokiniana segun un orden de prioridad bien preciso:
1. el metabolismo basal,
2. el crecimiento, es decir, formacion de una biomasa rica en protemas,
3. las sustancias de reserva (lfpidos e hidratos de carbono como el almidon).
Este principio permite explicar las variaciones naturales de contenido en protemas durante el crecimiento de la microalga, a pesar del aporte constante de nitrogeno.
La empresa solicitante ha encontrado asf que, para enriquecer la biomasa de microalgas en protemas, es necesario limitar el crecimiento de la microalga y controlar su consumo de fuente nutritiva diferente del nitrogeno, a fin de: - dedicar el consumo total de glucosa a las vfas de produccion de protemas,
- evitar la acumulacion de sustancia de reserva como los lfpidos.
En efecto, evitar una deficiencia de nitrogeno permite impedir la desviacion de los flujos metabolicos hacia la produccion de lfpidos.
De manera opcional, puede ser ventajoso llegar a bloquear completamente cualquier smtesis de material de reserva, actuando por medio de inhibidores espedficos.
En efecto, se conoce un cierto numero de inhibidores de las vfas de smtesis de los lfpidos, incluso del almidon (hidrato de carbono de reserva por excelencia de las microalgas verdes):
- para los lfpidos, la cerulenina se describe como inhibidor de la smtesis de los acidos grasos, o la lipstatina, sustancia natural producida por Streptomyces toxytricini, como inhibidor de las lipasas...
- para el almidon, los iminoazucares (obtenido por simple sustitucion del atomo de oxfgeno endodclico de los azucares por un atomo de nitrogeno) son historicamente conocidos como inhibidores potentes de las glicosidasas, de las glicosiltransferasas, de los glicogenos fosforilasas, o de la UDP-Galp mutasa.
Asf, el procedimiento comprende la fermentacion de una biomasa de microalgas en condiciones heterotroficas con una primera etapa de crecimiento de la biomasa y con una segunda etapa de deficiencia del medio de fermentacion en fosfato.
Esta segunda etapa permite enriquecer la biomasa en protema. En particular, permite alcanzar un contenido en protemas de la biomasa de mas del 50% en peso (en peso de materia seca).
El procedimiento de cultivo heterotrofico de dichas microalgas, en particular Chlorella protothecoides, comprende una etapa de crecimiento de las microalgas en la cual una limitacion del aporte de fosfatos limita la velocidad de crecimiento y provoca un incremento del contenido en protemas. Asf, el cultivo heterotrofico de las microalgas de la especie Chlorella protothecoides comprende una etapa de cultivo heterotrofico con una deficiencia en fosfatos, reduciendose asf la velocidad de crecimiento y provocando un incremento del contenido en protemas.
La invencion se comprendera mejor con la ayuda de los ejemplos que siguen, los cuales pretenden ser ilustrativos y no limitativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 (comparativo): produccion de Chlorella sorokiniana en fermentacion de tipo «lote secuencial» sin limitacion del aporte de medio nutritivo
La cepa utilizada es una Chlorella sorokiniana (cepa UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA).
Precultivo:
- 600 ml de medio dentro de un Erlenmeyer de 2 l;
- Composicion del medio (tabla 1 siguiente)
Tabla 1.
El pH se ajusta a 7 antes de la esterilizacion por adicion de NaOH 8N.
La incubacion se desarrolla en las condiciones siguientes:
- duracion: 72h;
-temperature: 28°C;
- agitacion: 110 rpm (Incubador Infors Multitron).
El precultivo se transfiere a continuacion al interior de un fermentador de 30l de tipo Sartorius. Cultivo para produccion de biomasa:
El medio es identico al del precultivo, pero la urea se sustituye por NH4CL
Tabla 2
El volumen inicial (Vi) del fermentador se ajusta a 13,5l despues de la inoculacion.
Se lleva a 16 - 20 l al final.
Los parametros de realizacion de la fermentacion son los siguientes:
Tabla 3
Cuando la glucosa aportada inicialmente se consume, se realiza un aporte de medio identico al medio inicial, sin el antiespumante, en forma de una disolucion concentrada que contiene 500 g/l de glucosa y los otros elementos en las mismas proporciones con respecto a la glucosa que en el medio inicial, a fin de obtener un contenido en glucosa de 20 g/l dentro del fermentador.
Se realizan otras dos adiciones identicas de la misma manera cada vez que la concentracion residual en glucosa se vuelve nula.
Se anade antiespumante Clerol FBA 3107 a demanda para evitar un espumado excesivo.
Resultados:
Despues de 46h de cultivo, se obtienen 38 g/l de biomasa con un contenido en protemas (evaluado por el N 6,25) del 36,2%.
Ejemplo 2: Produccion de Chlorella protothecoides en fermentacion de tipo discontinuo (tipo batch) con o sin limitacion del aporte de fosfato
La cepa utilizada es una Chlorella protothecoides (cepa CCAP 211/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).
Precultivo:
• 150 ml de medio dentro de Erlenmeyer de 500 ml;
• Composicion del medio: 40 g/l de glucosa 10 g/l de extracto de levadura.
La incubacion se desarrolla en las condiciones siguientes: duracion: 72 h; temperature: 28°C; agitacion: 110 rpm (Incubador Infors Multitron).
El precultivo se transfiere a continuacion al interior de un fermentador de 2 l de tipo Sartorius Biostat B.
Cultivo para produccion de biomasa:
La composicion del medio de cultivo es la siguiente (en g/l):
Tabla 7.
El aporte de fosfato esta calculado para ser limitante en el ensayo 1 y para estar en exceso en el ensayo 2. Se anade antiespumante Clerol FBA 3107 a demanda para evitar un espumado excesivo. El volumen inicial (Vi) del fermentador se ajusta a 1 l despues de la inoculacion.
Los parametros de realizacion de la fermentacion son los siguientes:
Tabla 8
Resultados:
Tabla 9.
Estos resultados muestran que una limitacion del aporte de fosfato, confirmada por la ausencia de fosfato residual al final de la fermentacion, limita la velocidad de crecimiento (medida mediante el p acumulado) y, como la limitacion por la glucosa en los ejemplos precedentes, provoca un incremento del contenido en protemas para alcanzar valores netamente mayores que el 50 %.
Claims (5)
1. Procedimiento de enriquecimiento en protemas de una microalga cultivada en heterotroffa, microalga del genera Chlorella, caracterizado por que el cultivo heterotrofico comprende una etapa que tiene como objetivo limitar el crecimiento de dicha microalga mediante una deficiencia en fosfato del medio de fermentacion, permitiendo as^ alcanzar un contenido en protemas de la biomasa de mas del 50% en peso, caracterizado por que el fosfato esta en deficiencia de manera que se obtenga una velocidad de crecimiento disminuida de 10 a 60% con respecto a la velocidad de crecimiento sin limitacion de fosfato.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la microalga del genero Chlorella se selecciona del grupo constituido por Clorella sorokiniana y Chlorella protothecoides.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que la microalga del genero Chlorella es Chlorella protothecoides.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 2 o 3, caracterizado por que la substancia nutritiva se aporta a fin de obtener una velocidad de crecimiento comprendida entre 0,06 h-1 y 0,09 h-1.
5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la duracion de la fase de cultivo en deficiencia es de al menos 1 h, preferentemente de al menos 10 h, mas preferiblemente de al menos 20 h, en particular entre 30 y 60 h.
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