CN1664106A

CN1664106A - 产l－谷氨酸细菌和生产l－谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN1664106A
Application number: CN2004101022358A
Authority: CN
Inventors: 大泷博美; 中村纯; 泉井裕; 中松亘
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2005-09-07
Also published as: EP1174508A2; MY134051A; ATE383427T1; PE20020212A1; DE60132277D1; EP1174508A3; JP4304837B2; RU2276189C2; AU5401901A; CN1763200A; CN1335394A; EP1174508B1; KR20020003519A; US20020137150A1; US20100124777A1; CN1935983A; AU784207B2; US7307160B1; PL348447A1; JP2002017364A

Abstract

L－谷氨酸可以通过培养具有L－谷氨酸生成能力的棒状细菌以在培养基中产生和积累L－谷氨酸并由培养基中收集L－谷氨酸来生产，其中，所述细菌中编码海藻糖－6－磷酸合酶的基因、编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因或二者被破坏，因而海藻糖合成能力降低或缺失。

Description

产L-谷氨酸细菌和生产L-谷氨酸的方法

本申请是申请日为2001年7月5日，申请号为01121741.3，发明名称为“产L-谷氨酸细菌和生产L-谷氨酸的方法”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

发明领域

本发明涉及L-谷氨酸产生菌和使用该细菌通过发酵方法生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的食用、医用氨基酸。

相关技术介绍

迄今，L-谷氨酸一直通过发酵方法生产，主要使用产L-谷氨酸的所谓棒状细菌，它们属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属或者其突变菌株(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan Center，pp.195-215，1986)。作为这种棒状细菌，从自然界中分离的野生型菌株和其突变体被用于提高产率。

已知，发酵生产L-谷氨酸时，也产生副产物海藻糖。因此，已经开发了降解或代谢产生的海藻糖的技术。这些技术包括使用其在海藻糖上的增殖能力已被诱发的棒状细菌发酵产生氨基酸的方法(日本专利公开(Kokai)5-276935)，以及使用其中编码海藻糖代谢酶的基因已被扩增的棒状细菌发酵审查氨基酸的方法(韩国专利公开(B1)号165836)。但是，在产L-氨基酸的细菌中已知海藻糖的形成的方法是已知的。

在大肠杆菌中，海藻糖的合成是通过海藻糖-6-磷酸合酶催化的。已知该酶由otsA基因编码。此外，也有otsA基因破坏的大肠杆菌菌株几乎不在高渗培养基中生长的报导(H.M.Glaver等，细菌学杂志，170(6)，2841-1849(1998))。但是，otsA基因破坏和物质产生之间的关系尚不清楚。

另一方面，尽管在属于短杆菌属的细菌中，已知微黄短杆菌有treY基因，但尚未发现短杆菌中存在otsA基因。对于属于分支杆菌属的细菌，已知存在一种由treS基因编码产物(海藻糖合酶(TreS))催化的反应介导的途径，该基因是一种与otsS基因和treY基因不同的编码海藻糖生物合成途径的酶的基因(De Smet K.A.等，微生物学，146(1)，199-208(2000))。但是，该途径利用麦芽糖作为底物，与一般的利用葡萄糖、果糖或蔗糖作为起始原料的L-谷氨酸发酵无关。

发明概述

本发明的目的是通过抑制副产物海藻糖的生成，提高使用棒状细菌发酵生产L-谷氨酸时L-谷氨酸的生产效率。

发明人进行了深入的研究以实现上述目的。结果，他们发现属于短杆菌属的细菌同结核分支杆菌一样含有otsA基因和treY基因，L-谷氨酸的生产效率通过破坏这些基因的至少一种得到提高。至此，完成了本发明。

即，本发明提供了：

(1)具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力降低或缺失。

(2)上述(1)中的棒状细菌，其中，海藻糖合成能力通过向编码海藻糖合成途径的酶的染色体基因引入突变或破坏该基因来降低或缺失。

(3)上述(2)中的棒状细菌，其中，编码海藻糖合成途径的酶的基因由编码海藻糖-6-磷酸合酶、编码麦芽寡糖基海藻糖(maltooligosyltrehalose)合酶的基因或二者组成。

(4)上述(3)中的棒状细菌，其中，编码海藻糖-6-磷酸合酶的基因编码SEQ ID NO：30的氨基酸序列，编码麦芽寡糖基海藻糖合酶的基因编码SEQ ID NO：32的氨基酸序列。

(5)生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养前述(1)到(4)中任一项的棒状细菌，以在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并由培养基中收集L-谷氨酸。

(6)编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA：

(A)具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白，

(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO：30氨基酸序列并具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。

(7)上述(6)的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA：

(a)含有包括SEQ ID NO：29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列的DNA，

(b)与包括SEQ ID NO：29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有55％或更大的同源性，并编码具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。

(8)编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA：

(A)具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的蛋白，

(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQ ID NO：32氨基酸序列并具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。

(9)上述(8)的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA：

(a)含有包括SEQ ID NO：31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列的DNA，

(b)与包括SEQ ID NO：31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列在严紧条件下可以杂交的DNA，与前述核苷酸序列具有60％或更大的同源性，并编码具有麦芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。

海藻糖-6-磷酸合酶活性是指催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸产生α，α-海藻糖-6-磷酸和UDP的反应的活性，麦芽寡糖基海藻糖合酶活性是指催化麦芽戊糖产生麦芽寡糖基海藻糖的反应的活性。

根据本发明，使用棒状细菌发酵生产L-谷氨酸时L-谷氨酸的生产效率可以通过抑制副产物海藻糖的生成得到提高。

优选实施方案

以下详述本发明。

本发明的棒状细菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌，其中海藻糖合成能力降低或缺失。

在本发明中属于棒杆菌属的细菌是伯杰氏鉴定细菌学手册第8版599页(1974)中限定的一组微生物。这些细菌是好气，革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽胞的杆菌，包括曾被分类为短杆菌属但现在已归入棒杆菌属的细菌(国际系统细菌学杂志，41，255(1981))，并包括与棒杆菌属密切相关、属于短杆菌属或微杆菌属的细菌。这些棒状细菌的实例如下。

嗜乙酰乙酸棒杆菌

醋谷棒杆菌

Corynebacterium alkanolyticum

美棒杆菌

谷氨酸棒杆菌

百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)

Corynebacterium melassecola

Corynebacyerium thermoaminogenes

力士棒杆菌

Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)

Brevibacterium immariophilum

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)

玫瑰色短杆菌

解糖短杆菌

生硫短杆菌

产氨短杆菌(产氨棒杆菌)

Brevibacterium album

Brevibacterium cerium

嗜氨微杆菌

具体而言，可举出下列菌株：

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

醋谷棒杆菌ATCC15806

Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511

美棒杆菌ATCC15991

谷氨酸棒杆菌ATCC13020，13032，13060

百合花棒杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC15990

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC13868

Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826，ATCC14067

Brevibacterium immariophilum ATCC14068

乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13655，ATCC13869

玫瑰色短杆菌ATCC13825

解糖短杆菌ATCC14066

生硫短杆菌ATCC19240

产氨棒杆菌(产氨短杆菌)ATCC6871

Brevibacterium album ATCC15111

Brevibacterium cerinum ATCC15112

嗜氨微杆菌ATCC15354

这些棒状细菌海藻糖合成能力的上述缺失或活性降低可以通过使用诱变处理或遗传重组技术突变或破坏编码海藻糖合成途径的酶的基因来实现。这种突变可以是抑制编码海藻糖合成途径的酶的基因转录或翻译的突变，或引起海藻糖合成途径的酶消除或减少的突变。海藻糖合成途径的酶的实例如海藻糖-6-磷酸合酶、麦芽寡糖基海藻糖合酶或两者。

编码海藻糖合成途径的酶的基因可以通过利用同源重组进行基因置换来破坏。棒状细菌染色体上的基因可以通过以下方法来破坏：用含有编码修饰的海藻糖合成途径的酶的基因(缺失型基因)的DNA转化棒状细菌，使缺失型基因和染色体上的正常基因之间发生重组，修饰酶中一部分序列缺失，因而功能不正常。这种利用同源重组的基因破坏技术是成熟的技术。可具体提及的有，利用在棒状细菌中不复制的线性DNA或环状DNA的方法，利用含有温度敏感型复制起点的质粒的方法。但优选利用在棒状细菌中不复制的环状DNA或含有温度敏感型复制起点的质粒的方法。

编码海藻糖合成途径的酶的基因的实例如otsA基因或treY基因，或者可以包括两者。由于本发明已经阐明了乳发酵短杆菌otsA基因和treY基因的核苷酸序列及其侧翼区，这些基因可以通过制备基于这些序列的引物并使用这些引物和作为模板的乳发酵短杆菌染色体DNA进行PCR(聚合酶链反应，见White，T.J.等，遗传学趋势，5，185(1989))方便地获得。

包括下文实施例中获得的乳发酵短杆菌的otsA基因的核苷酸序列和包括treY基因的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：29和31中。并且，由这些核苷酸序列编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：30和32。

otsA基因和treY基因也可以编码在一个或多个位置上有一个或几个氨基酸置换、缺失、插入或增加的蛋白，只要由其编码的海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶未被破坏即可。尽管“几个”氨基酸的数目取决于氨基酸残基在蛋白三维结构中的位置和类型，优选1-40个，更优选1-20个，更优选1-10个。

上述编码与海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA可以通过以下方法获得：利用定点突变方法修饰核苷酸序列，使得一个或多个氨基酸残基包括置换、缺失、插入、增加或倒转。如上所述修饰的DNA也可以通过常规的已知突变处理得到。突变处理包括体外用诸如羟胺处理编码海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的DNA的方法，和用紫外线或常用于诱变处理的诱变剂如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理属于埃希氏菌属、携带编码海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的DNA的细菌的方法。

如上所述的核苷酸置换、缺失、插入、增加或倒转也包括天然存在的突变体或变异体，它们是基于具有海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖的微生物的种或属间差异或个体差异。

上述编码与海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖基本相同蛋白的DNA可以通过在合适的细胞中表达具有上述突变的DNA并检查表达产物的海藻糖-6-磷酸合酶活性或麦芽寡糖基海藻糖活性得到。

编码与海藻糖-6-磷酸合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通过以下方法获得：分离在严紧条件下可以与具有相应于SEQ ID NO：29所示核苷酸序列的484-1938号核苷酸的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，或可以与由与前述核苷酸序列具有55％或更高、优选65％或更高、更优选75％或更高同源性的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，所述DNA具有来自编码海藻糖-6-磷酸合酶、具有一个突变的DNA或来自携带有该DNA的细胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。类似的，编码与麦芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通过以下方法获得：分离在严紧条件下可以与具有相应于SEQ ID NO：29所示核苷酸序列的82-2514号核苷酸的核苷酸序列的DNA杂交的DNA，或可以与由与前述核苷酸序列具有60％或更高、优选70％或更高、更优选80％或更高同源性的核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，所述DNA具有来自编码麦芽寡糖基海藻糖合酶、具有一个突变的DNA或来自携带有该DNA的细胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。

在本文中，“严紧条件”是指形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。要使用任何数值明确地表示该条件是困难的。但是，严紧条件包括具有高同源性的DNA如不低于55％的同源性优选不低于60％的同源性的DNA彼此杂交，而低于上述水平的同源性彼此不杂交的条件。或者，严紧条件可以是DNA在相当于DNA杂交的普通洗涤条件的盐浓度下彼此杂交的条件，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。

至于探针，也可使用各个基因的部分序列。这种探针也可以使用基于各个基因的核苷酸序列产生的寡核苷酸作为引物，含有各个基因的DNA片段作为模板，进行PCR制备。当长度约300bp的DNA片段用作探针时，杂交洗涤条件可以包括50℃，2×SSC和0.1％SDS。

如上所述在上述条件下可杂交的基因包括在基因编码区具有终止密码子的基因，由于活性中心突变没有活性的基因。但是，这些突变也可以将各个基因与可商购的表达载体连接并测定海藻糖-6-磷酸合酶活性或麦芽寡糖基海藻糖合酶活性来除去。

当otsA基因或treY基因被用来破坏棒状细菌染色体上的这些基因时，编码的海藻糖-6-磷酸合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶无需具有活性。另外，用于基因破坏的otsA基因或treY基因可以是来自其它微生物的基因，只要它们可以与棒状细菌的这些基因发生同源重组即可。例如，属于埃希氏菌属或分支杆菌属细菌的otsA基因或属于节杆菌属的细菌、微黄短杆菌或属于根瘤菌属的细菌的treY基因均为实例。

缺失型otsA基因或treY基因可以通过用限制酶切除含有这些基因之一的DNA片段或其部分的一定区域，以缺失编码区或启动子等表达调控序列的一部分。

而且，缺失型基因可以通过使用特别设计的引物进行PCR以缺失基因的一部分来获得。此外，缺失型基因也可通过单核苷酸突变如移码突变获得。

以下叙述otsA基因的基因破坏。treY基因的基因破坏类似进行。

宿主染色体上的otsA基因可以如下所述用缺失型otsA基因取代。即，将缺失型otsA基因和卡那霉素、氯霉素、四环素和链霉素等药物抗性标记基因插入在棒状细菌中不能自主复制的质粒，以制备重组DNA。棒状细菌可以用重组DNA转化，转化菌株在含有药物的培养基中培养，以获得重组DNA被导入染色体DNA的转化菌株。或者，可以使用稳定敏感型质粒作为质粒，在温度敏感型质粒不能复制的温度培养转化子，从而获得转化菌株。

在如上所述重组DNA被整合进入染色体的菌株中，重组DNA引起与原来存在于染色体上的otsA基因序列的重组，将包括染色体otsA基因和缺失型otsA基因的两个融合基因插入染色体，使得染色体DNA的其它部分(载体部分和药物抗性基因)位于它们中间。

然后，为了在染色体DNA上仅留下缺失型otsA基因，通过两个otsA基因的重组，从染色体DNA上消除一个拷贝的otsA基因和载体部分(包括药物抗性基因)。这样，正常otsA基因留在染色体DNA上，缺失型otsA基因被切除，或者相反，缺失型otsA基因留在染色体DNA上，而正常otsA基因被切除。通过PCR、杂交等检查染色体DNA上的otsA基因的结构，确认染色体DNA上留下的基因类型。

用于本发明的棒状细菌除了海藻糖合成活性缺失或降低之外，也可以具有较高的催化L-谷氨酸生物合成的酶活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、顺乌头酸水合酶、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶等。

并且，在用于本发明的棒状细菌中，通过从L-谷氨酸生物合成途径分支催化产生非L-谷氨酸化合物的反应的酶可以减少或缺失。这种酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、L-谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。

此外，通过向具有L-谷氨酸生成能力的棒状细菌中引入生物素活性抑制物如表面活性剂的温度敏感型突变，该细菌在不存在生物素活性抑制物时在含有过量生物素的培养基中可以产生L-谷氨酸(参见WO96/06180)。作为这种棒状细菌，可以提到WO 96/06180中公开的乳发酵短杆菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为独立管理法人，国立先进工业科技研究所，国际专利生物材料保藏机构，chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japen，邮政编码：305-5466)，保藏号为FERMP-14501。其后在1995年8月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-5189。

当具有L-谷氨酸生成能力海藻糖合成能力缺失或降低的棒状细菌在合适的培养基中培养时，培养基中可以积累L-谷氨酸。

用来生产L-谷氨酸的培养基是普通培养基，含有所需的碳源、氮源、无机盐以及其他痕量有机营养。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、blackstrap糖蜜和淀粉水解物；醇，如乙醇、肌醇；或有机酸，如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。

氮源可以是无机铵盐，如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，氨，有机氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆和大豆水解物，氨气，氨水等。

加入的无机离子(或其来源)是少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。至于微量有机营养，最好以合适的量加入所需的物质如维生素B₁、酵母提取物等。

优选通过振荡、搅拌通气在好气条件下培养16到72小时。培养温度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9。可以加入无机或有机酸性或碱性物质、氨气等调节pH。

从培养液中收集L-谷氨酸可以通过例如使用离子交换树脂的方法、结晶等实现。具体来说，L-谷氨酸可以通过阴离子交换树脂吸附或分离，或通过中和结晶。

实施例

以下将参照具体实施例更具体地阐明本发明。

实施例1.乳发酵短杆菌otsA基因破坏菌株的构建

(1)otsA基因的克隆

由于乳发酵短杆菌的otsA基因是未知的，通过利用其它微生物otsA基因的核苷酸序列为参考获得该基因。埃希氏菌和分支杆菌的otsA基因已经获得了完整的核苷酸序列(Kassen I.等，基因，145(1)，9-15(1994)；De Smet K.A.等，微生物学，146(1)，199-208(2000))。因此，参考由这些核苷酸序列推导的氨基酸序列，首先合成PCR引物P1(SEQID NO：1)和P2(SEQ ID NO：2)。DNA引物P1和P2分别相应于大肠杆菌otsA基因核苷酸序列(GenBank入藏号X69160)的核苷酸1894-1913和2531-2549。它们也分别相应于结核分支杆菌otsA基因(GenBank入藏号Z95390)的核苷酸40499-40518和41166-41184。

然后，使用引物P1和P2以及作为模板的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，50℃0.5分钟和72℃4分钟，重复30个循环。这样，获得了约0.6kbp的单一种类的扩增片段。该扩增片段使用Invitrogen生产的“原始TA克隆试剂盒”克隆进质粒载体pCR2.1，得到pCotsA。然后，确定克隆片段的核苷酸序列。

根据以上获得的otsA基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P10(SEQ ID NO：8)和P12(SEQ ID NO：10)，该部分片段侧翼的未知区域使用“反向PCR”扩增(Triglia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遗传学，120，621-623(1988))。乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA用限制酶BamHI，BglII，ClaI，HindIII，KpnI，MluI，MunL，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接。使用所得的DNA作为模板以及引物P10和P12进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃1分钟和72℃4分钟，重复30个循环。然后，使用ClaI或BglII作为限制酶，每种情况下均获得4kbp的扩增片段。这些扩增片段的核苷酸序列使用DNA引物P5到P9(SEQ ID NO：3-7)和P11到P15(SEQ ID NO：9-13)直接确定。这样，确定了乳发酵短杆菌ATCC13869otsA基因的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO：29所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：29和30。

上述otsA基因相对于大肠杆菌otsA基因(GenBank入藏号X69160)和结核分支杆菌otsA基因(GenBank入藏号Z95390)的序列同源性被分别确定，核苷酸序列的同源性分别为46.3％和55.9％，氨基酸序列的同源性分别为30.9％和51.7％。同源性使用“GENETIX-WIN”(Software Development)软件根据Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))计算。

(2)otsA基因破坏质粒的制备

为了通过破坏棒状细菌中编码海藻糖生物合成途径的酶的基因检查L-谷氨酸产率的改进效应是否存在，制备otsA基因破坏质粒。otsA基因破坏质粒按如下所述制备。使用otsA基因克隆中构建的质粒pCotsA作为模板以及包括ClaI位点的引物P29(SEQ ID NO：33)和P30(SEQ ID NO：34)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃8分钟，重复30个循环。扩增的片段用ClaI消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接，以构建含有在大约中间部位有一个移码突变(SEQ ID NO：29的1259-1300核苷酸缺失)的otsA基因的pCotsAC质粒。

(3)制备otsA基因破坏菌株

使用基因破坏质粒pCotsAC，通过电脉冲法转化L-谷氨酸产生菌乳发酵短杆菌ATCC13869，选择可以在含有20mg/L卡那霉素的CM2B培养基中生长的转化子。由于otsA基因破坏的质粒pCotsAC没有在乳发酵短杆菌中有功能的复制起点，所得的转化子是使用经历了乳发酵短杆菌染色体和基因破坏质粒pCotsAC上的otsA基因之间的同源重组的质粒得到的。由如上所述获得的同源重组菌株中，根据获得的卡那霉素敏感性作为标记，选择出由于再次发生的同源重组消除了基因破坏质粒pCotsAC的载体部分的菌株。

由如上所述获得的菌株中，选择出引入了所需的移码突变的菌株。选择过程如下：使用由卡那霉素敏感性菌株提取的染色体DNA作为模板以及引物P8(SEQ ID NO：14)和P13(SEQ ID NO：11)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃1分钟，重复30个循环，使用DNA引物对获得的扩增片段测序，以确证otsA基因的无功能是由于引入了移码突变。如上所述获得的菌株被称为ΔOA菌株。

实施例2：treY基因破坏菌株的构建

(1)treY基因的克隆

由于乳发酵短杆菌的treY基因是未知的，通过利用其它微生物treY基因的核苷酸序列为参考获得该基因。节杆菌、短杆菌和根瘤菌属的treY基因已经获得了完整的核苷酸序列(Maruta K.等，生物化学生物物理通报，1289(1)，10-13(1996)；Genbank入藏号AF039919；Maruta K.等，生物科学、生物技术与生物化学，60(4)，717-720(1996))。因此，参考由这些核苷酸序列推导的氨基酸序列，首先合成PCR引物P3(SEQID NO：14)和P4(SEQ ID NO：15)。DNA引物P3和P4分别相应于节杆菌属种treY基因核苷酸序列(GenBank入藏号D63343)的核苷酸975-992和2565-2584。它们也分别相应于微黄短杆菌treY基因(GenBank入藏号AF039919)的核苷酸893-910和2486-2505。此外，它们也分别相应于根瘤菌属种treY基因(GenBank入藏号D78001)的核苷酸862-879和2452-2471。

然后，使用引物P3和P4以及作为模板的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃4分钟，重复30个循环。这样，获得了约1.6kbp的单一种类的扩增片段。该扩增片段使用Invitrogen生产的“原始TA克隆试剂盒”克隆进质粒载体pCR2.1。然后，确定该核苷酸序列为约0.6kb。

根据以上获得的treY基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P16(SEQ ID NO：16)和P26(SEQ ID NO：26)，该部分片段侧翼的未知区域使用“反向PCR”扩增(Triglia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遗传学，120，621-623(1988))。乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA用限制酶BamHI，HindIII，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)自身连接。使用所得的DNA作为模板以及引物P16和P26进行PCR，反应循环条件为94℃0.5分钟，55℃1分钟和72℃4分钟，重复30个循环。然后，使用HindIII或SalI作为限制酶，分别获得0.6或1.5kbp的扩增片段。这些扩增片段的核苷酸序列使用DNA引物P16到P28(SEQ ID NO：16-28)直接确定。这样，确定了乳发酵短杆菌ATCC13869 treY基因的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO：31所示。该核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：31和32。

上述treY基因相对于节杆菌属种treY基因(GenBank入藏号D63343)、微黄短杆菌treY基因(GenBank入藏号AF039919)和根瘤菌属种treY基因(GenBank入藏号D78001)的序列同源性被分别确定，核苷酸序列的同源性分别为52.0％、52.3％和51.9％，氨基酸序列的同源性分别为40.9％、38.5％和39.8％。同源性使用“GENETIX-WIN”(Software Development)软件根据Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))计算。

(2)treY基因破坏质粒的制备

为了通过破坏棒状细菌中编码海藻糖生物合成途径的酶的基因检查L-谷氨酸产率的改进效应是否存在，制备treY基因破坏质粒。首先，使用引物P17(SEQ ID NO：17)和P25(SEQ ID NO：25)以及作为模板的ATCC 13869染色体DNA进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，60℃0.5分钟和72℃2分钟，重复30个循环。扩增的片段用EcoRI消化，用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo)连接至EcoRI消化的pHSG299(Takara Shuzo)，获得质粒pHtreY。然后，该pHtreY用AflII(TakaraShuzo)消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4连接酶(Takara Shuzo)自身连接，以构建含有在大约中间部位有一个移码突变(SEQ ID NO：31序列中1145核苷酸后插入4个核苷酸)的treY基因的pHtreYA质粒。

(3)制备treY基因破坏菌株

使用基因破坏质粒pCtreYA，通过电脉冲法转化L-谷氨酸产生菌乳发酵短杆菌ATCC13869，选择可以在含有20mg/L卡那霉素的CM2B培养基中生长的转化子。由于treY基因破坏质粒pCtreYA没有在乳发酵短杆菌中有功能的复制起点，所得的转化子是使用经历了乳发酵短杆菌染色体和基因破坏质粒pHtreYA上的treY基因之间的同源重组的质粒得到的。由如上所述获得的同源重组菌株中，根据获得的卡那霉素敏感性作为标记，选择出由于再次发生的同源重组消除了基因破坏质粒pCtreYA的载体部分的菌株。

由如上所述获得的菌株中，选择出引入了所需的移码突变的菌株。选择过程如下：使用DNA引物P19(SEQ ID NO：19)和P25(SEQ IDNO：25)进行PCR，反应循环为94℃0.5分钟，55℃0.5分钟和72℃1.5分钟，重复30个循环，使用DNA引物P21或P23对获得的扩增片段测序，以确证treY基因的无功能是由于引入了移码突变。如上所述获得的菌株被称为ΔTA菌株。

实施例3：ΔOA菌株和ΔTA菌株产生L-谷氨酸能力的评价

ATCC13869菌株、ΔOA菌株和ΔTA菌株各自如下培养以产生L-谷氨酸。这些菌株均通过培养在CM2B平板培养基上而更新，更新的菌株于31.5℃培养在每升纯水中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氢钾、0.4克硫酸镁、30克硫酸铵、0.01克七水硫酸亚铁、0.01克七水硫酸锰、15毫升大豆水解物溶液、200微克盐酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸钙的培养基(用KOH调节pH为8.0)中。培养后，测定培养基中积累的L-谷氨酸的量和培养液稀释51倍后在620纳米的吸收值。结果示于表1。

otsA或treY基因破坏的乳发酵短杆菌菌株与亲本菌株的生长情况类似，但与亲本菌株相比，L-谷氨酸产生增加。

表1

菌株	OD₆₂₀(×51)	L-谷氨酸(g/L)	产率(％)
菌株	OD₆₂₀(×51)	L-谷氨酸(g/L)	产率(％)	ATCC 13869	0.930	40.2	48.4
ΔOA	1.063	43.8	52.8	ATCC 13869	0.930	40.2	48.4
ΔOA	1.063	43.8	52.8	ΔTA	0.850	45.6	54.9

序列表说明

SEQ ID NO：1：otsA扩增引物P1

SEQ ID NO：2：otsA扩增引物P2

SEQ ID NO：3：引物P5

SEQ ID NO：4：引物P6

SEQ ID NO：5：引物P7

SEQ ID NO：6：引物P8

SEQ ID NO：7：引物P9

SEQ ID NO：8：引物P10

SEQ ID NO：9：引物P11

SEQ ID NO：10：引物P12

SEQ ID NO：11：引物P13

SEQ ID NO：12：引物P14

SEQ ID NO：13：引物P15

SEQ ID NO：14：treY扩增引物P3

SEQ ID NO：15：treY扩增引物P4

SEQ ID NO：16：引物P16

SEQ ID NO：17：引物P17

SEQ ID NO：18：引物P18

SEQ ID NO：19：引物P19

SEQ ID NO：20：引物P20

SEQ ID NO：21：引物P21

SEQ ID NO：22：引物P22

SEQ ID NO：23：引物P23

SEQ ID NO：24：引物P24

SEQ ID NO：25：引物P25

SEQ ID NO：26：引物P26

SEQ ID NO：27：引物P27

SEQ ID NO：28：引物P28

SEQ ID NO：29：otsA基因核苷酸序列

SEQ ID NO：30：OtsA氨基酸序列

SEQ ID NO：31：TreY基因核苷酸序列

SEQ ID NO：32：treY氨基酸序列

SEQ ID NO：33：引物P29

SEQ ID NO：34：引物P30

序列表

<110>Ajinomoto Co.，Inc.

<120>产L-谷氨酸细菌和生产L-谷氨酸的方法

<130>OP1195

<140>

<141>2000-07-

<150>JP 2000-204256

<151>2000-07-05

<160>34

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<220>

<221>misc_特征

<222>(3，9，18)

<223>n＝a或g或c或t

<400>1

canathggnt tyttyytnca 20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<220>

<221>misc_特征

<222>(3，11，19)

<223>n＝a或g或c或t

<400>2

canarrttca tnccrtcnc 19

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>3

gaatcatcca tataagatcc ggc 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>4

tagctttgta gttgttgcta accg 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>5

agcgaacttg aggtttactt cccg 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>6

tgctggttcc tggcattttg cgcc 24

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>7

tcgaacaatc tcttcacgcc 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>8

gaatcccacc aaatctgcgc c 21

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>9

tgatgttgaa atgtttgggg 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>10

gatgtcatgc tggttacgcc 20

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>11

caaagcacca gtgccgtcgc gg 22

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>12

tgttcgtttt cattcgcgtt gccg 24

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>13

atagtttcct ggattgtttg gcgc 24

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<220>

<221>misc_特征

<222>(9)

<223>n＝a或g或c或t

<400>14

caraayccnt ggtggtgg 18

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<220>

<221>misc_特征

<222>(3，6，15)

<223>n＝a或g或c或t

<400>15

ggncgncgrt trtcnggrtc 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>16

cgagctcttc attgatggcg 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>17

gcagctacac acgagttggg 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>18

gcaacaccta aatggttggg 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>19

gcaagaagtc tacaagcgcc 20

<210>20

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>20

gccaacgtat tcacgg 16

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>21

tgatgaacca ctcgatcccc 20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>22

aagacaccac cttctaccgc 20

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>23

caagtggaat tctgcagcgg 20

<210>24

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>24

cctcctacaa aacctgctgg g 21

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>25

tcgcggatag cttttagggc 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>26

tgagttttta gaagactccc 20

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>27

cgcttcagtg gtgttgtccc 20

<210>28

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>28

cgtaccactc cacggaaatt cccg 24

<210>29

<211>2369

<212>DNA

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(484)..(1938)

<400>29

acagaatcag cgccggcaga gaaacgtcca aagactaatc agagattcgg tataaaggta 60

aaaatcaacc tgcttaggcg tctttcgctt aaatagcgta gaatatcggg tcgatcgctt 120

ttaaacactc aggaggatcc ttgccggcca aaatcacgga cactcgtccc accccagaat 180

cccttcacgc tgttgaagag gaaaccgcag ccggtgcccg caggattgtt gccacctatt 240

ctaaggactt cttcgacggc gtcactttga tgtgcatgct cggcgttgaa cctcagggcc 300

tgcgttacac caaggtcgct tctgaacacg aggaagctca gccaaagaag gctacaaagc 360

ggactcgtaa ggctaccagc taagaaggct gctgctaaga aaacgaccaa gaagaccact 420

aagaaaacta ctaaaaagac caccgcaaag aagaccacaa agaagtctta agccggatct 480

tat atg gat gat tcc aat agc ttt gta gtt gtt gct aac cgt ctg cca 528

Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro

1 5 10 15

gtg gat atg act gtc cac cca gat ggt agc tat agc atc tcc ccc agc 576

Val Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser

20 25 30

ccc ggt ggc ctt gtc acg ggg ctt tcc ccc gtt ctg gaa caa cat cgt 624

Pro Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg

35 40 45

gga tgt tgg gtc gga tgg cct gga act gta gat gtt gca ccc gaa cca 672

Gly Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro

50 55 60

ttt cga aca gat acg ggt gtt ttg ctg cac cct gtt gtc ctc act gca 720

Phe Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala

65 70 75

agt gac tat gaa ggc ttc tac gag ggc ttt tca aac gca acg ctg tgg 768

Ser Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp

80 85 90 95

cct ctt ttc cac gat ctg att gtt act ccg gtg tac aac acc gat tgg 816

Pro Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp

100 105 110

tgg cat gcg ttt cgg gaa gta aac ctc aag ttc gct gaa gcc gtg agc 864

Trp His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser

115 120 125

caa gtg gcg gca cac ggt gcc act gtg tgg gtg cag gac tat cag ctg 912

Gln Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu

130 135 140

ttg ctg gtt cct ggc att ttg cgc cag atg cgc ctt gat ttg aag atc 960

Leu Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile

145 150 155

ggt ttc ttc ctc cac att ccc ttc cct tcc cct gat ctg ttc cgt cag 1008

Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln

160 165 170 175

ctg ccg tgg cgt gaa gag att gtt cga ggc atg ctg ggc gca gat ttg 1056

Leu Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu

180 185 190

gtg gga ttc cat ttg gtt caa aac gca gaa aac ttc ctt gcg tta acc 1104

Val Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr

195 200 205

cag cag gtt gcc ggc act gcc ggg tct cat gtg ggt cag ccg gac acc 1152

Gln Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr

210 215 220

ttg cag gtc agt ggt gaa gca ttg gtg cgt gag att ggc gct cat gtt 1200

Leu Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val

225 230 235

gaa acc gct gac gga agg cga gtt agc gtc ggg gcg ttc ccg atc tcg 1248

Glu Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser

240 245 250 255

att gat gtt gaa atg ttt ggg gag gcg tcg aaa agc gcc gtt ctt gat 1296

Ile Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp

260 265 270

ctt tta aaa acg ctc gac gag ccg gaa acc gta ttc ctg ggc gtt gac 1344

Leu Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp

275 280 285

cga ctg gac tac acc aag ggc att ttg cag cgc ctg ctt gcg ttt gag 1392

Arg Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu

290 295 300

gaa ctg ctg gaa tcc ggc gcg ttg gag gcc gac aaa gct gtg ttg ctg 1440

Glu Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu

305 310 315

cag gtc gcg acg cct tcg cgt gag cgc att gat cac tat cgt gtg tcg 1488

Gln Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser

320 325 330 335

cgt tcg cag gtc gag gaa gcc gtc ggc cgt atc aat ggt cgt ttc ggt 1536

Arg Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly

340 345 350

cgc atg ggg cgt ccc gtg gtg cat tat cta cac agg tca ttg agc aaa 1584

Arg Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys

355 360 365

aat gat ctc cag gtg ctg tat acc gca gcc gat gtc atg ctg gtt acg 1632

Asn Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr

370 375 380

cct ttt aaa gac ggt atg aac ttg gtg gct aaa gaa ttc gtg gcc aac 1680

Pro Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn

385 390 395

cac cgc gac ggc act ggt gct ttg gtg ctg tcc gaa ttt gcc ggc gcg 1728

His Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala

400 405 410 415

gcc act gag ctg acc ggt gcg tat tta tgc aac cca ttt gat gtg gaa 1776

Ala Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu

420 425 430

tcc atc aaa cgg caa atg gtg gca gct gtc cat gat ttg aag cac aat 1824

Ser Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn

435 440 445

ccg gaa tct gcg gca acg cga atg aaa acg aac agc gag cag gtc tat 1872

Pro Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr

450 455 460

acc cac gac gtc aac gtg tgg gct aat agt ttc ctg gat tgt ttg gcg 1920

Thr His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala

465 470 475

cag tcg gga gaa aac tca tgaaccgcgc acgaatcgcg accataggcg 1968

Gln Ser Gly Glu Asn Ser

480 485

ttcttccgct tgctttactg ctggcgtcct gtggttcaga caccgtggaa atgacagatt 2028

ccacctggtt ggtgaccaat atttacaccg atccagatga gtcgaattcg atcagtaatc 2088

ttgtcatttc ccagcccagc ttagattttg gcaattcttc cctgtctggt ttcactggct 2148

gtgtgccttt tacggggcgt gcggaattct tccaaaatgg tgagcaaagc tctgttctgg 2208

atgccgatta tgtgaccttg tcttccctgg atttcgataa acttcccgat gattgccaag 2268

gacaagaact caaagttcat aacgagctgg ttgatcttct gcctggttct tttgaaatct 2328

ccaggacttc tggttcagaa atcttgctga ctagcgatgt c 2369

<210>30

<211>485

<212>PRT

<213>乳发酵短杆菌

<400>30

Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val

1 5 10 15

Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser Pro

20 25 30

Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg Gly

35 40 45

Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro Phe

50 55 60

Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala Ser

65 70 75 80

Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp Pro

85 90 95

Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp Trp

100 105 110

His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser Gln

115 120 125

Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu Leu

130 135 140

Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile Gly

145 150 155 160

Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln Leu

165 170 175

Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu Val

180 185 190

Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr Gln

195 200 205

Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr Leu

210 215 220

Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val Glu

225 230 235 240

Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile

245 250 255

Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp Leu

260 265 270

Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp Arg

275 280 285

Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu Glu

290 295 300

Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu Gln

305 310 315 320

Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser Arg

325 330 335

Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Arg

340 345 350

Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys Asn

355 360 365

Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro

370 375 380

Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn His

385 390 395 400

Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala

405 410 415

Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu Ser

420 425 430

Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn Pro

435 440 445

Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr Thr

450 455 460

His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala Gln

465 470 475 480

Ser Gly Glu Asn Ser

485

<210>31

<211>2956

<212>DNA

<213>乳发酵短杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(82)..(2514)

<220>

<221>misc_特征

<222>(2953)

<223>n＝a或g或c或t

<400>31

ttttcccacg cagggaaggc gtgaacacta agatcgagga cgtaccgcac gattttgcct 60

aacttttaag ggtgtttcat c atg gca cgt cca att tcc gca acg tac agg 111

Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg

1 5 10

ctt caa atg cga gga cct caa gca gat agc gcc ggg cgt ttc ttt ggt 159

Leu Gln Met Arg Gly Pro Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Phe Phe Gly

15 20 25

ttt gcg cag gcc aaa gcc cag ctt ccc tat ctg aag aag cta ggc atc 207

Phe Ala Gln Ala Lys Ala Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile

30 35 40

agc cac ctg tac ctc tcc cct att ttt acg gcc atg cca gat tcc aat 255

Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn

45 50 55

cat ggc tac gat gtc att gat ccc acc gcc atc aat gaa gag ctc ggt 303

His Gly Tyr Asp Val Ile Asp Pro Thr Ala Ile Asn Glu Glu Leu Gly

60 65 70

ggc atg gag ggt ctt cga gat ctt gct gca gct aca cac gag ttg ggc 351

Gly Met Glu Gly Leu Arg Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly

75 80 85 90

atg ggc atc atc att gat att gtt ccc aac cat tta ggt gtt gcc gtt 399

Met Gly Ile Ile Ile Asp Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val

95 100 105

cca cat ttg aat cct tgg tgg tgg gat gtt cta aaa aac ggc aaa gat 447

Pro His Leu Asn Pro Trp Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp

110 115 120

tcc gct ttt gag ttc tat ttc gat att gac tgg cac gaa gac aac ggt 495

Ser Ala Phe Glu Phe Tyr Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly

125 130 135

tct ggt ggc aag ctg ggc atg ccg att ctg ggt gct gaa ggc gat gaa 543

Ser Gly Gly Lys Leu Gly Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu

140 145 150

gac aag ctg gaa ttc gcg gag ctt gat gga gag aaa gtg ctc aaa tat 591

Asp Lys Leu Glu Phe Ala Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr

155 160 165 170

ttt gac cac ctc ttc cca atc gcg cct ggt acc gaa gaa ggg aca ccg 639

Phe Asp His Leu Phe Pro Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro

175 180 185

caa gaa gtc tac aag cgc cag cat tac cgc ctg cag ttc tgg cgc gac 687

Gln Glu Val Tyr Lys Arg Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp

190 195 200

ggc gtg atc aac ttc cgt cgc ttc ttt tcc gtg aat acg ttg gct ggc 735

Gly Val Ile Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly

205 210 215

atc agg caa gaa gat ccc ttg gtg ttt gaa cat act cat cgt ctg ctg 783

Ile Arg Gln Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu

220 225 230

cgc gaa ttg gtg gcg gaa gac ctc att gac ggc gtg cgc gtc gat cac 831

Arg Glu Leu Val Ala Glu Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His

235 240 245 250

ccc gac ggg ctt tcc gat cct ttt gga tat ctg cac aga ctc cgc gac 879

Pro Asp Gly Leu Ser Asp Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp

255 260 265

ctc att gga cct gac cgc tgg ctg atc atc gaa aag atc ttg agc gtt 927

Leu Ile Gly Pro Asp Arg Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val

270 275 280

gat gaa cca ctc gat ccc cgc ctg gcc gtt gat ggc acc act ggc tac 975

Asp Glu Pro Leu Asp Pro Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr

285 290 295

gac ccc ctc cgt gaa ctc gac ggc gtg ttt atc tcc cga gaa tct gag 1023

Asp Pro Leu Arg Glu Leu Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu

300 305 310

gac aaa ttc tcc atg ttg gcg ctg acc cac agt gga tcc acc tgg gat 1071

Asp Lys Phe Ser Met Leu Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp

315 320 325 330

gaa cgc gcc cta aaa tcc acg gag gaa agc ctc aaa cga gtc gtc gcg 1119

Glu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala

335 340 345

caa caa gaa ctc gca gcc gaa atc tta agg ctc gcc cgc gcc atg cgc 1167

Gln Gln Glu Leu Ala Ala Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg

350 355 360

cgc gat aac ttc tcc acc gca ggc acc aac gtc acc gaa gac aaa ctt 1215

Arg Asp Asn Phe Ser Thr Ala Gly Thr Asn Val Thr Glu Asp Lys Leu

365 370 375

agc gaa acc atc atc gaa tta gtc gcc gcc atg ccc gtc tac cgc gcc 1263

Ser Glu Thr Ile Ile Glu Leu Val Ala Ala Met Pro Val Tyr Arg Ala

380 385 390

gac tac atc tcc ctc tca cgc acc acc gcc acc gtc atc gcg gag atg 1311

Asp Tyr Ile Ser Leu Ser Arg Thr Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Met

395 400 405 410

tcc aaa cgc ttc ccc tcc cgg cgc gac gca ctc gac ctc atc tcg gcc 1359

Ser Lys Arg Phe Pro Ser Arg Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile Ser Ala

415 420 425

gcc cta ctt ggc aat ggc gag gcc aaa atc cgc ttc gcc caa gtc tgc 1407

Ala Leu Leu Gly Asn Gly Glu Ala Lys Ile Arg Phe Ala Gln Val Cys

430 435 440

ggc gcc gtc atg gcc aaa ggt gtg gaa gac acc acc ttc tac cgc gca 1455

Gly Ala Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Thr Thr Phe Tyr Arg Ala

445 450 455

tct agg ctc gtt gca ctg caa gaa gtc ggt ggc gcg ccg ggc agg ttc 1503

Ser Arg Leu Val Ala Leu Gln Glu Val Gly Gly Ala Pro Gly Arg Phe

460 465 470

ggc gtc tcc gct gca gaa ttc cac ttg ctg cag gaa gaa cgc agc ctg 1551

Gly Val Ser Ala Ala Glu Phe His Leu Leu Gln Glu Glu Arg Ser Leu

475 480 485 490

ctg tgg cca cgc acc atg acc acc ttg tcc acg cac gac acc aaa cgc 1599

Leu Trp Pro Arg Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Arg

495 500 505

ggc gaa gat acc cgc gcc cgc atc atc tcc ctg tcc gaa gtc ccc gat 1647

Gly Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ile Ser Leu Ser Glu Val Pro Asp

510 515 520

atg tac tcc gag ctg gtc aat cgt gtt ttc gca gtg ctc ccc gcg cca 1695

Met Tyr Ser Glu Leu Val Asn Arg Val Phe Ala Val Leu Pro Ala Pro

525 530 535

gac ggc gca acg ggc agt ttc ctc cta caa aac ctg ctg ggc gta tgg 1743

Asp Gly Ala Thr Gly Ser Phe Leu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Trp

540 545 550

ccc gcc gac ggc gtg atc acc gat gcg ctg cgc gat cga ttc agg gaa 1791

Pro Ala Asp Gly Val Ile Thr Asp Ala Leu Arg Asp Arg Phe Arg Glu

555 560 565 570

tac gcc cta aaa gct atc cgc gaa gca tcc aca aaa acc acg tgg gtg 1839

Tyr Ala Leu Lys Ala Ile Arg Glu Ala Ser Thr Lys Thr Thr Trp Val

575 580 585

gac ccc aac gag tcc ttc gag gct gcg gtc tgc gat tgg gtg gaa gcg 1887

Asp Pro Asn Glu Ser Phe Glu Ala Ala Val Cys Asp Trp Val Glu Ala

590 595 600

ctt ttc gac gga ccc tcc acc tca tta atc acc gaa ttt gtc tcc cac 1935

Leu Phe Asp Gly Pro Ser Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His

605 610 615

atc aac cgt ggc tct gtg aat atc tcc tta ggt agg aaa ctg ctg caa 1983

Ile Asn Arg Gly Ser Val Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln

620 625 630

atg gtg ggc gct gga atc ccc gac act tac caa gga act gag ttt tta 2031

Met Val Gly Ala Gly Ile Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu

635 640 645 650

gaa gac tcc ctg gta gat ccc gat aac cga cgc ttt gtt gat tac acc 2079

Glu Asp Ser Leu Val Asp Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr

655 660 665

gcc aga gaa caa gtc ctg gag cgc ctg caa acc tgg gat tgg acg cag 2127

Ala Arg Glu Gln Val Leu Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln

670 675 680

gtt aat tcg gta gaa gac ttg gtg gat aac gcc gac atc gcc aaa atg 2175

Val Asn Ser Val Glu Asp Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met

685 690 695

gcc gtg gtc cat aaa tcc ctc gag ttg cgt gct gaa ttt cgt gca agc 2223

Ala Val Val His Lys Ser Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser

700 705 710

ttt gtt ggt gga gat cat cag gca gta ttt ggc gaa ggt cgc gca gaa 2271

Phe Val Gly Gly Asp His Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu

715 720 725 730

tcc cac atc atg ggc atc gcc cgc ggt aca gac cga aac cac ctc aac 2319

Ser His Ile Met Gly Ile Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn

735 740 745

atc att gct ctt gct acc cgt cga cca ctg atc ttg gaa gac cgt ggc 2367

Ile Ile Ala Leu Ala Thr Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly

750 755 760

gga tgg tat gac acc acc gtc acg ctt cct ggt gga caa tgg gaa gac 2415

Gly Trp Tyr Asp Thr Thr Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp

765 770 775

agg ctc acc ggg caa cgc ttc agt ggt gtt gtc cca gcc acc gat ttg 2463

Arg Leu Thr Gly Gln Arg Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu

780 785 790

ttc tca cat tta ccc gta tct ttg ttg gtt tta gta ccc gat agt gag 2511

Phe Ser His Leu Pro Val Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu

795 800 805 810

ttt tgatccctgc acaggaaagt tagcggcgct actatgaacg atcgatatgt 2564

Phe

ctgacaacac tctctcccaa tttggcagtt actaccacga attccgacgt gcccatccca 2624

tggccgacgt cgaattcctc ctagcaattg aagaattact cacagacggt ggtgtcacct 2684

tcgatcgcgt caccacacgc atcaaagaat ggtcaagcct gaaagccaag gctcgcaagc 2744

gtcgcgacga tggctcgttg atctaccctg atccgcgcaa agacatccac gacatgatcg 2804

gtgttcggat caccacgtac cactccacgg aaattcccgt ggccttaaaa gtgctccaag 2864

actccttcat cgtccacaaa tccgtagaca aagccgctga aactcgcatc tcaggcggct 2924

ttggttacgg ctcccaccac caaggattnt ag 2956

<210>32

<211>811

<212>PRT

<213>乳发酵短杆菌

<400>32

Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Met Arg Gly Pro

1 5 10 15

Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Phe Phe Gly Phe Ala Gln Ala Lys Ala

20 25 30

Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ser His Leu Tyr Leu Ser

35 40 45

Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn His Gly Tyr Asp Val Ile

50 55 60

Asp Pro Thr Ala Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly Met Glu Gly Leu Arg

65 70 75 80

Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly Met Gly Ile Ile Ile Asp

85 90 95

Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val Pro His Leu Asn Pro Trp

100 105 110

Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp Ser Ala Phe Glu Phe Tyr

115 120 125

Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly Ser Gly Gly Lys Leu Gly

130 135 140

Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu Asp Lys Leu Glu Phe Ala

145 150 155 160

Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr Phe Asp His Leu Phe Pro

165 170 175

Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro Gln Glu Val Tyr Lys Arg

180 185 190

Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp Gly Val Ile Asn Phe Arg

195 200 205

Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly Ile Arg Gln Glu Asp Pro

210 215 220

Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu Arg Glu Leu Val Ala Glu

225 230 235 240

Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Ser Asp

245 250 255

Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp Leu Ile Gly Pro Asp Arg

260 265 270

Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val Asp Glu Pro Leu Asp Pro

275 280 285

Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Pro Leu Arg Glu Leu

290 295 300

Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu Asp Lys Phe Ser Met Leu

305 310 315 320

Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp Glu Arg Ala Leu Lys Ser

325 330 335

Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala Gln Gln Glu Leu Ala Ala

340 345 350

Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg Arg Asp Asn Phe Ser Thr

355 360 365

Ala Gly Thr Asn Val Thr Glu Asp Lys Leu Ser Glu Thr Ile Ile Glu

370 375 380

Leu Val Ala Ala Met Pro Val Tyr Arg Ala Asp Tyr Ile Ser Leu Ser

385 390 395 400

Arg Thr Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Met Ser Lys Arg Phe Pro Ser

405 410 415

Arg Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile Ser Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gly

420 425 430

Glu Ala Lys Ile Arg Phe Ala Gln Val Cys Gly Ala Val Met Ala Lys

435 440 445

Gly Val Glu Asp Thr Thr Phe Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Val Ala Leu

450 455 460

Gln Glu Val Gly Gly Ala Pro Gly Arg Phe Gly Val Ser Ala Ala Glu

465 470 475 480

Phe His Leu Leu Gln Glu Glu Arg Ser Leu Leu Trp Pro Arg Thr Met

485 490 495

Thr Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Gly Glu Asp Thr Arg Ala

500 505 510

Arg Ile Ile Ser Leu Ser Glu Val Pro Asp Met Tyr Ser Glu Leu Val

515 520 525

Asn Arg Val Phe Ala Val Leu Pro Ala Pro Asp Gly Ala Thr Gly Ser

530 535 540

Phe Leu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Trp Pro Ala Asp Gly Val Ile

545 550 555 560

Thr Asp Ala Leu Arg Asp Arg Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Lys Ala Ile

565 570 575

Arg Glu Ala Ser Thr Lys Thr Thr Trp Val Asp Pro Asn Glu Ser Phe

580 585 590

Glu Ala Ala Val Cys Asp Trp Val Glu Ala Leu Phe Asp Gly Pro Ser

595 600 605

Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His Ile Asn Arg Gly Ser Val

610 615 620

Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Met Val Gly Ala Gly Ile

625 630 635 640

Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val Asp

645 650 655

Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr Ala Arg Glu Gln Val Leu

660 665 670

Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln Val Asn Ser Val Glu Asp

675 680 685

Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met Ala Val Val His Lys Ser

690 695 700

Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser Phe Val Gly Gly Asp His

705 710 715 720

Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu Ser His Ile Met Gly Ile

725 730 735

Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn Ile Ile Ala Leu Ala Thr

740 745 750

Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly Gly Trp Tyr Asp Thr Thr

755 760 765

Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp Arg Leu Thr Gly Gln Arg

770 775 780

Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu Phe Ser His Leu Pro Val

785 790 795 800

Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu Phe

805 810

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>33

ccaaaatcga taacatcaat cgagatcggg 30

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：PCR引物

<400>34

cttgatcgat taaaaacgct cgacgagccg 30

Claims

1.编码下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA：

(A)具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白，

(B)具有包括一个或几个氨基酸残基置换、缺失、插入或增加的SEQID NO：30氨基酸序列并具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。

2.权利要求1的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA：