JP2002017364A

JP2002017364A - Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法

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Publication number: JP2002017364A
Application number: JP2000204256A
Authority: JP
Inventors: Hiromi Otaki; 博美大瀧; Jun Nakamura; 純中村; Yutaka Izui; 裕泉井; Wataru Nakamatsu; 亘中松
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-01-22
Anticipated expiration: 2020-07-05
Also published as: EP1174508A2; MY134051A; ATE383427T1; PE20020212A1; DE60132277D1; EP1174508A3; JP4304837B2; RU2276189C2; AU5401901A; CN1763200A; CN1335394A; EP1174508B1; KR20020003519A; US20020137150A1; US20100124777A1; CN1935983A; AU784207B2; US7307160B1; PL348447A1; DE60132277T2

Abstract

(57)【要約】【課題】コリネ型細菌を用いた発酵法によるＬ−グル
タミン酸の製造において、トレハロースの副生を抑制
し、Ｌ−グルタミン酸の生産効率を向上させること。【解決手段】トレハロース合成能を、例えば、トレハ
ロース−６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、又
はマルトオリゴシルトレハロースシンターゼをコードす
る遺伝子又はこれらの両方の遺伝子を破壊することによ
り低下又は欠失し、かつ、Ｌ−グルタミン酸生産能を有
するコリネ型細菌を培地に培養し、同培地中にＬ−グル
タミン酸を生成、蓄積させ、同培地からＬ−グルタミン
酸を採取することにより、Ｌ−グルタミン酸を製造す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なＬ−グルタ
ミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタ
ミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、
医薬品等として重要なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−グルタミン酸は、主としてブ
レビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバ
クテリウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン
酸生産菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製
造されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９
５〜２１５頁、１９８６年）。

【０００３】発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造にお
いては、トレハロースが副生することが知られている。
そこで、生成したトレハロースを分解又は代謝させる技
術が開発されている。そのような技術として、トレハロ
ース上での増殖能が誘発されたコリネ型細菌を用いてア
ミノ酸を発酵生産する方法（特開平5-276935）、及び、
トレハロース分解酵素遺伝子が増幅されたコリネ型細菌
を用いてアミノ酸を発酵生産する方法（大韓民国特許公
報（B1）特165836）が知られている。しかし、Ｌ−グル
タミン酸生産菌において、トレハロースの生成自体を抑
制することは知られていない。

【０００４】エシェリヒア・コリにおいては、トレハロ
ースの合成は、トレハロース−６−リン酸シンターゼに
よって触媒される。これらの酵素は、otsA遺伝子によっ
てコードされていることが知られている。また、エシェ
リヒア・コリのotsA遺伝子破壊株は、高浸透圧培地にて
ほとんど生育できなくなることが報告されている（H.M.
Glaever, et al., J. Bacteriol., 170(6), 2841-2849
(1998)）が、otsA遺伝子の破壊と物質生産との関係は知
られていない。

【０００５】一方、ブレビバクテリウム属細菌では、ブ
レビバクテリウム・ヘルボルムにおいてtreY遺伝子は知
られているが、otsA遺伝子は知られていない。尚、マイ
コバクテリウム属細菌では、トレハロース生合成系酵素
遺伝子として、otsA遺伝子及びtreY遺伝子とは別のtreS
遺伝子によってコードされる産物（トレハロースシンタ
ーゼ（TreS））による反応を経由する経路が知られてい
る（De Smet K. A., et al., Microbiology, 146(1), 1
99-208 (2000)）。しかし、この経路はマルトースを基
質としており、グルコース、フルクトース又はシューク
ロースを原料とする通常のＬ−グルタミン酸発酵には関
連性がない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題の一つ
は、コリネ型細菌を用いた発酵法によるＬ−グルタミン
酸の製造において、トレハロースの副生を抑制し、Ｌ−
グルタミン酸の生産効率を向上させることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、ブレビバクテリ
ウム属細菌はマイコバクテリウム・ツベルクロシスと同
様にotsA遺伝子及びtreY遺伝子を保持していること、及
び、少なくともこれらの遺伝子の一方を破壊することに
よって、Ｌ−グルタミン酸の生産効率が向上することを
見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明
は、以下のとおりである。

【０００８】（１）Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、か
つ、トレハロース合成能が低下又は欠失したコリネ型細
菌。（２）染色体上のトレハロース合成系酵素遺伝子に変異
が導入又は破壊されたことによりトレハロース合成能が
低下又は欠失した（１）のコリネ型細菌。（３）トレハロース合成系酵素遺伝子が、トレハロース
−６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、マルトオ
リゴシルトレハロースシンターゼをコードする遺伝子又
はこれらの両方の遺伝子である（２）のコリネ型細菌。（４）トレハロース−６−リン酸シンターゼをコードす
る遺伝子が配列番号３０に記載のアミノ酸配列をコード
し、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼをコード
する遺伝子が配列番号３２に記載のアミノ酸配列をコー
ドする（３）のコリネ型細菌。（５）（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌を培地
に培養し、同培地中にＬ−グルタミン酸を生成、蓄積さ
せ、同培地からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴
とするＬ−グルタミン酸の製造法。

【０００９】（６）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質
をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白
質。（Ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加
を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トレハロース−６
−リン酸シンターゼ活性を有する蛋白質。（７）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（６）
のＤＮＡ。（ａ）配列番号２９に記載の塩基配列のうち、少なくと
も塩基番号４８４〜１９３８からなる塩基配列を含むＤ
ＮＡ。（ｂ）配列番号２９に記載の塩基配列のうち、少なくと
も塩基番号４８４〜１９３８からなる塩基配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、同塩基配列と
５５％以上の相同性を有し、かつ、トレハロース−６−
リン酸シンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。（８）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコードする
ＤＮＡ。（Ａ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白
質。（Ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加
を含むアミノ酸配列からなり、かつ、マルトオリゴシル
トレハロースシンターゼ活性を有する蛋白質。（９）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（８）
のＤＮＡ。（ａ）配列番号３１に記載の塩基配列のうち、塩基番号
８２〜２５１４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。（ｂ）配列番号３１に記載の塩基配列のうち、塩基番号
８２〜２５１４からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、同塩基配列と６０％以上の相同性を有
し、かつ、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼ活
性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。

【００１０】尚、トレハロース−６−リン酸シンターゼ
活性とは、ＵＤＰ−グルコースとグルコース６−リン酸
からα，α−トレハロース６−リン酸とＵＤＰへの反応
を触媒する活性を、マルトオリゴシルトレハロースシン
ターゼ活性とは、マルトペンタオースからマルトトリオ
シルトレハロースの反応を触媒する活性をいう。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有
し、かつ、トレハロース合成能が低下又は欠失したコリ
ネ型細菌である。

【００１２】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用
いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示
すものが挙げられる。

【００１３】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ムコリネバクテリウム・アセトグルタミカムコリネバクテリウム・アルカノリティカムコリネバクテリウム・カルナエコリネバクテリウム・グルタミカムコリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）コリネバクテリウム・メラセコーラコリネバクテリウム・サーモアミノゲネスコリネバクテリウム・ハーキュリスブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ブレビバクテリウム・インマリオフィラムブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）ブレビバクテリウム・ロゼウムブレビバクテリウム・サッカロリティカムブレビバクテリウム・チオゲニタリスブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス）ブレビバクテリウム・アルバムブレビバクテリウム・セリヌムミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００１４】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ
１３８７０コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１
５８０６コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２
１５１１コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２
０、１３０３２、１３０６０コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６
５コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３
４０（ＦＥＲＭＢＰ−１５３９）コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６
８ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０
６７ブレビバクテリウム・インマリオフィラムＡＴＣＣ１
４０６８ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１３６６５、Ａ
ＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム・サッカロリティカムＡＴＣＣ１
４０６６ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２
４０ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス）ＡＴＣＣ６８７１ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムＡＴＣＣ１
５３５４

【００１５】上記のようなコリネ型細菌のトレハロース
合成能を低下又は欠失させることは、突然変異処理又は
遺伝子組換え技術を利用して、トレハロース合成系酵素
をコードする遺伝子を変異又は破壊することによって行
うことができる。前記変異は、トレハロース合成系酵素
をコードする遺伝子の転写又は翻訳を妨げる変異であっ
てもよいし、活性の消失又は低下したトレハロース合成
系酵素を産生するような変異であってもよい。トレハロ
ース合成系酵素としては、トレハロース−６−リン酸シ
ンターゼ、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼ、
又はこれらの両方が挙げられる。

【００１６】トレハロース合成系酵素をコードする遺伝
子の破壊は、相同組換えを利用した遺伝子置換によって
行うことができる。トレハロース合成系酵素をコードす
る遺伝子の一部を欠失し、トレハロース合成系酵素が正
常に機能しないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）
を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝
子と染色体上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせる
ことにより、染色体上の遺伝子を破壊することができ
る。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立
しており、直鎖状もしくはコリネ型細菌中で複製しない
環状のＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製開始点を含
むプラスミドを用いる方法などがあるが、コリネ型細菌
中で複製しない環状ＤＮＡ、もしくは温度感受性複製開
始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。

【００１７】トレハロース合成系酵素をコードする遺伝
子としては、例えば、otsA遺伝子、treY遺伝子又はこれ
らの両方の遺伝が挙げられる。ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムのotsA遺伝子及びtreY遺伝子は、本
発明によりそれらの遺伝子及びそれらの隣接領域の塩基
配列が明らかにされたので、同配列に基づいてプライマ
ーを作製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼチェ
インリアクション：polymerase chain reaction； Whit
e,T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)参照）を
行うことによって、容易に取得することができる。

【００１８】後記実施例で取得されたブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムのotsA遺伝子を含む塩基配列
及びtreY遺伝子を含む塩基配列を、それぞれ配列番号２
９及び配列番号３１に示す。また、これらの塩基配列が
コードし得るアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３０及
び配列番号３２に示す。

【００１９】otsA遺伝子及びtreY遺伝子は、コードされ
るトレハロース−６−リン酸シンターゼ又はマルトオリ
ゴシルトレハロースシンターゼの活性が損なわれない限
り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ
酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む蛋白質をコードす
るものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ
酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によ
っても異なるが、好ましくは１〜４０個、より好ましく
は１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。

【００２０】上記のようなトレハロース−６−リン酸シ
ンターゼ又はマルトオリゴシルトレハロースシンターゼ
と実質的に同一の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば
部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基
が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように塩基
配列を改変することによって得られる。また、上記のよ
うな改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理に
よっても取得され得る。変異処理としては、トレハロー
ス−６−リン酸シンターゼ又はマルトオリゴシルトレハ
ロースシンターゼをコードするＤＮＡをヒドロキシルア
ミン等でインビトロ処理する方法、及びトレハロース−
６−リン酸シンターゼ又はマルトオリゴシルトレハロー
スシンターゼをコードするＤＮＡを保持する微生物、例
えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチ
ル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしく
は亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によ
って処理する方法が挙げられる。

【００２１】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、トレハロース−６−リン酸
シンターゼ又はマルトオリゴシルトレハロースシンター
ゼを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場
合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）も含
まれる。

【００２２】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のトレハロース−６−リン
酸シンターゼ活性又はマルトオリゴシルトレハロースシ
ンターゼ活性を調べることにより、トレハロース−６−
リン酸シンターゼ又はマルトオリゴシルトレハロースシ
ンターゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。

【００２３】また、変異を有するトレハロース−６−リ
ン酸シンターゼをコードするＤＮＡまたはこれを保持す
る細胞から、例えば配列番号２９に記載の塩基配列のう
ち、塩基番号４８４〜１９３８からなる塩基配列を有す
るＤＮＡ、またはこの塩基配列から調製され得るプロー
ブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
同塩基配列と５５％以上、好ましくは６５％以上、より
好ましくは７５％以上の相同性を有し、かつ、トレハロ
ース−６−リン酸シンターゼ活性を有するタンパク質を
コードするＤＮＡを単離することによっても、トレハロ
ース−６−リン酸シンターゼと実質的に同一のタンパク
質をコードするＤＮＡが得られる。同様に、変異を有す
るマルトオリゴシルトレハロースシンターゼをコードす
るＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番
号３１に記載の塩基配列のうち、塩基番号８２〜２５１
４からなる塩基配列、またはこの塩基配列から調製され
得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、同塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％
以上、より好ましくは８０％以上の相同性を有し、か
つ、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼ活性を有
するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによ
っても、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼと実
質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られ
る。

【００２４】上記でいう「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異
的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件
を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５５％以上、好ま
しくは６０％の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダ
イズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダ
イズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼ
ーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．
１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げ
られる。

【００２５】プローブとして、各遺伝子の一部の配列を
用いることもできる。そのようなプローブは、各遺伝子
の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とする
ＰＣＲ反応によって作製することができる。プローブと
して、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合
には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０
℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。

【００２６】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎ、ト
レハロース−６−リン酸シンターゼ活性又はマルトオリ
ゴシルトレハロースシンターゼ活性を測定することによ
って容易に取り除くことができる。

【００２７】尚、otsA遺伝子又はtreY遺伝子を、コリネ
型細菌の染色体上のこれらの遺伝子の破壊に用いる場合
は、コードされるトレハロース−６−リン酸シンターゼ
又はマルトオリゴシルトレハロースシンターゼが活性を
有する必要はない。また、遺伝子破壊に用いるotsA遺伝
子又はtreY遺伝子は、コリネ型細菌のこれらの遺伝子と
の相同組換えが可能である限り、他の微生物に由来する
遺伝子であってもよい。例えば、エシェリヒア属細菌又
はマイコバクテリウム属細菌のotsA遺伝子、アースロバ
クター属細菌、ブレビバクテリウム・ヘルボルム、又は
リゾビウム属細菌のtreY遺伝子が挙げられる。

【００２８】otsA遺伝子もしくはtreY遺伝子又はこれら
の一部を含むＤＮＡ断片から、一定の領域を制限酵素に
より切り出し、コード領域又はプロモーター等の発現調
節配列の少なくとも一部を欠失させることによって、欠
失型遺伝子を作製することができる。

【００２９】また、遺伝子の一部を欠失するように設計
したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっても、
欠失型遺伝子を取得することができる。さらに、欠失型
遺伝子は、一塩基変異、例えばフレームシフト変異によ
るものであってもよい。

【００３０】以下に、otsA遺伝子の遺伝子破壊について
説明するが、treY遺伝子の遺伝子破壊も同様にして行う
ことができる。欠失型otsA遺伝子を、宿主染色体上のot
sA遺伝子と置換するには以下のようにすればよい。すな
わち、コリネ型細菌中で自律複製できないプラスミド
に、欠失型otsA遺伝子と、カナマイシン、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等の
薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して、組換え
ＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形
質転換し、形質転換株を薬剤を含む培地で培養すること
により、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形
質転換株が得られる。また、プラスミドとして、温度感
受性プラスミドを用い、形質転換株を温度感受性プラス
ミドが複製できない温度で培養してもよい。

【００３１】上記のようにして染色体に組換えＤＮＡが
組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するotsA遺
伝子配列との組換えを起こし、染色体otsA遺伝子と欠失
型otsA遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の
部分（ベクター部分及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状
態で染色体に挿入されている。

【００３２】次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型otsA遺伝子
のみを残すために、２個のotsA遺伝子の組換えにより１
コピーのotsA遺伝子を、ベクター部分（薬剤耐性マーカ
ーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その
際、正常なotsA遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失
型otsA遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型otsA
遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なotsA遺伝子が
切り出される場合がある。いずれの遺伝子が染色体ＤＮ
Ａ上に残されたかは、染色体上のotsA遺伝子の構造をPC
R又はハイブリダイゼーション等で調べることによっ
て、確認することができる。

【００３３】本発明に用いるコリネ型細菌は、トレハロ
ース合成能が低下又は欠失したことに加えて、Ｌ−グル
タミン酸生合成を触媒する酵素の活性が増強されていて
もよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する
酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタ
ミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエ
ン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、ク
エン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノー
ルピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロ
ムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン
酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、
ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラー
ゼ等がある。

【００３４】また、本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ
−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミ
ン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性
が低下あるいは欠損されていてもよい。このような酵素
としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソ
クエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラー
ゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ア
セト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラー
ゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボ
キシラーゼ、１−ピロリン酸デヒドロゲナーゼ等が挙げ
られる。

【００３５】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年9月2日付けで工業技術院生命工学工業技
術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、19
95年8月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、受託番号FERM BP-5189が付与されている。

【００３６】Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつ、ト
レハロース合成能が低下又は欠失したコリネ型細菌を好
適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積
する。Ｌ−グルタミン酸を製造するのに用いる培地は、
炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有
機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源とし
ては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラク
トース、シュクロース、マルトース、廃糖蜜、澱粉加水
分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなど
のアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の有機酸類を用いることができる。

【００３７】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
ができる。

【００３８】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ₁など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。

【００３９】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。

【００４０】発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は、
例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができ
る。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂
により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよ
い。

【００４１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４２】

【実施例１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムのotsA遺伝子破壊株の構築＜１＞otsA遺伝子のクローニングブレビバクテリウムラクトファーメンタムのotsA遺伝子
は知られていないため、他の微生物のotsA遺伝子の塩基
配列を利用して、その取得を行った。これまでに、エシ
ェリヒア属、マイコバクテリウム属のotsA遺伝子は全塩
基配列が明らかにされている（Kaasen, I., et al., Ge
ne, 145(1), 9-15 (1994); De Smet K.A., et al., Mic
robiology, 146(1), 199-208 (2000)）。そこでまず、
これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を参考に
して、PCR法のためのDNAプライマーP1（配列番号１）、
P2（配列番号２）を合成した。DNAプライマーP1、P2
は、それぞれエシェリヒア・コリのotsA遺伝子の塩基配
列（GenBank accession X69160）における塩基番号1894
から1913番目、2531から2549番目の位置に相当する。一
方、マイコバクテリウム・ツベルクロシスのotsA遺伝子
（GenBank accessionZ95390）においては、塩基番号404
99〜40518、41166〜41184の位置に相当する。

【００４３】続いてプライマーP1とP2を用いて、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色
体DNAを鋳型として、94℃ 0.5分、50℃ 0.5分、72℃ 4
分の反応30サイクルのPCRを行った。その結果、およそ
0.6Kbpのほぼ単一の増幅断片を取得した。この増幅断片
を、Invitrogen社製の「Original TA cloning Kit」を
用いて、プラスミドベクターpCR2.1にクローニングし、
pCotsAを得た。続いて、クローニング断片の塩基配列を
決定した。

【００４４】以上のようにして取得したotsA遺伝子の部
分断片の塩基配列をもとに、新たにDNAプライマーP10
（配列番号８）、P12（配列番号１０）を合成し、「inv
erse PCR」(Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res.,
16, 81-86 (1988), Ochman, H., et al., Genetics, 1
20, 621-623 (1988))により、前記部分断片に隣接する
未知領域を増幅した。ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム ATCC13869の染色体DNAを制限酵素BamHI, Bg
lII, ClaI, HindIII, KpnI, MluI, MunL, SalI,XhoIに
より切断後、T4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）製）を用い
て分子内結合させたものを鋳型として、DNAプライマーP
10、P12を用いて、94℃ 0.5分、55℃ 1分、72℃ 4分の
反応30サイクルのPCRを行った。その結果、制限酵素と
してClaIおよびBglIIを使用した場合に、それぞれ4Kb
p、4Kbpの増幅断片を得た。この増幅断片を、DNAプライ
マーP5〜9（配列番号３〜７）、P11〜15（配列番号９〜
１３）を用いて直接塩基配列を決定し、配列番号２９に
示すようなブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869のotsA遺伝子の全塩基配列を決定した。同塩
基配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号
２９及び３０に示す。

【００４５】前記otsA遺伝子の配列と、前記エシェリヒ
ア・コリのotsA遺伝子（GenBank accession X69160）、
及びマイコバクテリウム・ツベルクロシスのotsA遺伝子
（GenBank accession Z95390）の配列との相同性を調べ
たところ、塩基配列では各々46.3%、55.9%であり、アミ
ノ酸配列では各々30.9%、51.7%であった。尚、相同性の
算出は、プログラムとしてLipman-Person法（Science,
227, 1435-1441 (1985)を用い、ソフトウェア「GENETIX
-WIN」（ソフトウェア開発（株））を用いて行った。

【００４６】＜２＞otsA遺伝子破壊用プラスミドの作製コリネ型細菌のトレハロース生合成系酵素遺伝子破壊に
よる、Ｌ−グルタミン酸生産性向上効果の有無を検討す
るために、otsA遺伝子破壊プラスミドの作製を行った。
otsA遺伝子破壊用プラスミドの作製は、以下のようにし
て行った。先のotsA遺伝子のクローニングの際に構築し
たプラスミドpCotsAを鋳型として、ClaIサイトを挿入し
たプライマーP29（配列番号３３）とP30（配列番号３
４）を用いて、94℃ 0.5分、55℃ 0.5分、72℃ 8分の反
応30サイクルのPCRを行った。増幅断片をClaIで処理
し、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造（株）製）を用いて平
滑末端処理を行った後、T4 DNAリガーゼ（宝酒造（株）
製）を用いて分子内結合させ、otsA遺伝子のほぼ中央部
にフレームシフト変異（配列番号２９において1258〜13
00番目の塩基が欠失）が導入されたプラスミドpCotsAC
を構築した。

【００４７】＜３＞otsA遺伝子破壊株の作製遺伝子破壊用プラスミドpCotsACを用いて、Ｌ−グルタ
ミン酸生産菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム ATCC13869を電気パルス法により形質転換し、カナマ
イシンを20mg/L含有したCM2B培地にて生育できることを
指標に、形質転換体を取得した。このotsA遺伝子破壊用
プラスミドpCotsACは、ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム中で機能する複製起点を有さないため、同
プラスミドによって得られる形質転換体はブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム染色体上のotsA遺伝子
と、遺伝子破壊用プラスミドpCotsACとが相同組換えを
起こしたものである。こうして得られた相同組換え株よ
り、再度相同組換えを起こしたことによって、遺伝子破
壊用プラスミドpCotsACのベクター部分が除去された株
を、カナマイシンに対して感受性となったことを指標に
取得した。

【００４８】上記のようにして得られた株の中から、目
的のフレームシフト変異が導入された株を選択した。こ
のような菌株の選択は、カナマイシン感受性となった菌
株より抽出した染色体DNAを鋳型として、DNAプライマー
P8（配列番号１４）とP13（配列番号１１）を用いて、9
4℃ 0.5分、55℃ 0.5分、72℃ 1分の反応30サイクルのP
CRを行い、得られた増幅断片をDNAプライマーP8を用い
て塩基配列の決定を行い、フレームシフト変異が導入さ
れ、otsA遺伝子が機能しなくなっていることを確認する
ことによって行った。以上のようにして得られた菌株
を、ΔOA株と命名した。

【００４９】

【実施例２】 treY遺伝子破壊株の構築＜１＞treY遺伝子のクローニングブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのtreY遺伝
子は知られていないために、他の微生物のtreY遺伝子の
塩基配列を利用して、その取得を行った。これまでに、
アースロバクター属、ブレビバクテリウム属、リゾビウ
ム属のtreY遺伝子は塩基配列が明らかにされている（Ma
ruta, K., et al., Biochim. Biophys.Acta, 1289(1),
10-13 (1996); Genbank accession AF039919; Maruta,
K., etal., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60(4), 71
7-720 (1996)）。そこでまず、これらの塩基配列から推
定されるアミノ酸配列を参考にしてPCR法のためのDNAプ
ライマーP3（配列番号１４）、P4（配列番号１５）を合
成した。DNAプライマーP3、P4はそれぞれアースロバク
ター・スピーシーズのtreY遺伝子（GenBank accession
D63343）の塩基配列における塩基番号975〜992、2565〜
2584の位置に相当する。また、ブレビバクテリウム・ヘ
ルボルムのtreY遺伝子（GenBank accession AF039919）
の塩基配列においては、塩基番号893〜910、2486〜2505
の位置に相当する。一方、リゾビウム・スピーシーズの
treY遺伝子（GenBank accession D78001）の塩基配列に
おいては、塩基番号862〜879、2452〜2471の位置に相当
する。

【００５０】続いてプライマーP3とP4を用いて、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869の染色
体DNAを鋳型として、94℃ 0.5分、55℃ 0.5分、72℃ 2
分の反応30サイクルのPCRを行った。その結果、およそ
1.6Kbpのほぼ単一の増幅断片を取得した。この増幅断片
をInvitrogen社製の「Oriinal TA cloning Kit」を用い
てプラスミドベクターpCR2.1にクローニングし、続いて
約0.6Kbの塩基配列を決定した。

【００５１】以上のようにして取得したtreY遺伝子の部
分断片の塩基配列をもとに、新たにDNAプライマーP16
（配列番号１６）、P26（配列番号２６）を合成し、「i
nversePCR」(Triglia, T., et al. Nucleic Acids Re
s.,16,81-86(1988)、Ochman,H.,et al., Genetics,120,
621-623(1988))により、前記部分断片に隣接する未知領
域を増幅した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タム ATCC13869の染色体を制限酵素BamHI, HindIII, S
alI, XhoIにより切断後、T4 DNAリガーゼ（宝酒造
（株）製）を用いて分子内結合させたものを鋳型とし
て、DNAプライマーP16、P26を用いて、94℃ 0.5分、55
℃ 1分、72℃ 4分の反応30サイクルのPCRを行った。そ
の結果、制限酵素としてHindIIIおよびSalIを使用した
場合に、それぞれ0.6Kbp、1.5Kbpの増幅断片を得た。こ
の増幅断片をDNAプライマーP16〜28（配列番号１６〜２
８）を用いて直接塩基配列を決定し、配列番号３１に示
すようなブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム A
TCC13869のtreY遺伝子の全塩基配列を決定した。同塩基
配列によってコードされるアミノ酸配列を、配列番号３
１及び３２に示す。

【００５２】前記treY遺伝子の配列と、前記アースロバ
クター・スピーシーズのtreY遺伝子（GenBank accessio
n D63343）、ブレビバクテリウム・ヘルボルムのtreY遺
伝子（GenBank accession AF039919）、及びリゾビウム
・スピーシーズのtreY遺伝子（GenBank accession D780
01）の配列との相同性を調べたところ、塩基配列では各
々52.0%、52.3%、51.9%であり、アミノ酸配列では各々4
0.9%、38.5%、39.8%であった。尚、相同性の算出は、プ
ログラムとしてLipman-Person法（Science, 227, 1435-
1441 (1985)を用い、ソフトウェア「GENETIX-WIN」（ソ
フトウェア開発（株））を用いて行った。

【００５３】＜２＞treY遺伝子破壊用プラスミドの作製コリネ型細菌のトレハロース生合成系酵素遺伝子破壊に
よる、Ｌ−グルタミン酸生産性向上効果の有無を検討す
るために、treY遺伝子破壊プラスミドの作製を行った。
まず、DNAプライマーP17（配列番号１７）とP25（配列
番号２５）を用いて、ATCC13869の染色体DNAを鋳型にし
て、94℃ 0.5分、60℃ 0.5分、72℃ 2分の反応30サイク
ルのPCRを行った。増幅断片をEcoRIで消化し、EcoRIで
処理したpHSG299（宝酒造（株）製）とT4 DNAリガーゼ
（宝酒造（株）製）を用いて結合させ、プラスミドpHtr
eYを取得した。さらに、このpHtreYをAflII（宝酒造
(株)製）で処理し、T4 DNAポリメラーゼ（宝酒造（株）
製）を用いて平滑末端処理を行った後、T4 DNAリガーゼ
（宝酒造（株）製）を用いて分子内結合させ、treY遺伝
子のほぼ中央部にフレームシフト変異（配列番号３１に
おいて1145番目の後ろに４塩基挿入）が導入されたプラ
スミドpHtreYAを構築した。

【００５４】＜３＞treY遺伝子破壊株の作製遺伝子破壊用プラスミドpCtreYAを用いて、Ｌ−グルタ
ミン酸生産菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム ATCC13869を電気パルス法により形質転換し、カナ
マイシンを20mg/L含有したCM2B培地にて生育できること
を指標に、形質転換体を取得した。このtreY遺伝子破壊
用プラスミドpCtreYAは、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム中で機能する複製起点を有さないため、
同プラスミドによって得られる形質転換体はブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム染色体上のtreY遺伝子
と、遺伝子破壊用プラスミドpCtreYAとが相同組換えを
起こしたものである。こうして得られた相同組換え株よ
り、再度相同組換えを起こしたことによって、遺伝子破
壊用プラスミドpCtreYAのベクター部分が除去された株
を、カナマイシンに対して感受性となったことを指標に
取得した。

【００５５】上記のようにして得られた株の中から、目
的のフレームシフト変異が導入された株を選択した。こ
のような菌株の選択は、DNAプライマーP19（配列番号１
９）とP25（配列番号２５）を用いて、94℃ 0.5分、55
℃ 0.5分、72℃ 1.5分の反応30サイクルのPCRを行い、
得られた断片をDNAプライマーP21またはP23を用いて塩
基配列の決定を行い、フレームシフト変異が導入され、
treY遺伝子が機能しなくなっていることを確認すること
によって行った。以上のようにして得られた菌株を、Δ
TA株と命名した。

【００５６】

【実施例３】ΔOA株及びΔTA株のＬ−グルタミン酸生産
能の評価 ATCC13869株、ΔOA株及びΔTA株のＬ−グルタミン酸の
生産培養を、以下の様に行った。これらの菌株をCM2Bプ
レート培地にて培養してリフレッシュを行い、リフレッ
シュされた各菌株を、グルコース 80ｇ、KH₂PO₄ 1ｇ、M
gSO₄ 0.4ｇ、(NH₄)₂SO₄ 30ｇ、FeSO₄・7H_2O0.01ｇ、MnS
O₄・7H₂O 0.01ｇ、大豆加水分解液 15ml、サイアミン塩
酸塩 200μｇ、ビオチン 3μｇ、及びCaCO₃ 50ｇを純水
1L中に含む培地（KOHを用いてpHは8.0に調整されてい
る）において、31.5℃にて培養した。培養後に培地中の
Ｌ−グルタミン酸の蓄積量、及び51倍希釈した培養液の
620nmにおける吸光度を測定した結果を、表１に示す。

【００５７】otsA遺伝子又はtreY遺伝子を破壊したブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムは、親株と同程
度の生育を示す一方、Ｌ−グルタミン酸生産量は親株に
比べて増大した。

【００５８】

【表１】表１ ──────────────────────────── 菌株 OD₆₂₀(×51) L-グルタミン酸収率 (g/l) (％) ──────────────────────────── ATCC13869 0.930 40.2 48.4 ΔOA 1.063 43.8 52.8 ΔTA 0.850 45.6 54.9 ────────────────────────────

【００５９】〔配列表の説明〕配列番号１：otsA増幅用プライマーP1 配列番号２：otsA増幅用プライマーP2 配列番号３：プライマーP5 配列番号４：プライマーP6 配列番号５：プライマーP7 配列番号６：プライマーP8 配列番号７：プライマーP9 配列番号８：プライマーP10 配列番号９：プライマーP11 配列番号10：プライマーP12 配列番号11：プライマーP13 配列番号12：プライマーP14 配列番号13：プライマーP15 配列番号14：treY増幅用プライマーP3 配列番号15：treY増幅用プライマーP4 配列番号16：プライマーP16 配列番号17：プライマーP17 配列番号18：プライマーP18 配列番号19：プライマーP19 配列番号20：プライマーP20 配列番号21：プライマーP21 配列番号22：プライマーP22 配列番号23：プライマーP23 配列番号24：プライマーP24 配列番号25：プライマーP25 配列番号26：プライマーP26 配列番号27：プライマーP27 配列番号28：プライマーP28 配列番号29：otsA遺伝子塩基配列配列番号30：OtsAアミノ酸配列配列番号31：treY遺伝子塩基配列配列番号32：TreYアミノ酸配列配列番号33：プライマーP29 配列番号34：プライマーP30

【００６０】

【発明の効果】本発明によれば、コリネ型細菌を用いた
発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造において、トレハ
ロースの副生を抑制し、Ｌ−グルタミン酸の生産効率を
向上させることができる。

【００６１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc.（味の素株式会社） <120> Ｌ−グルタミン酸生産菌及びＬ−グルタミン酸の製造法 <130> P-7468 <140> <141> 2000-07-05 <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００６２】 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (3,9,18) <223> n=a or g or c or t <400> 1 canathggnt tyttyytnca 20

【００６３】 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (3,11,19) <223> n=a or g or c or t <400> 2 canarrttca tnccrtcnc 19

【００６４】 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 3 gaatcatcca tataagatcc ggc 23

【００６５】 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 4 tagctttgta gttgttgcta accg 24

【００６６】 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 5 agcgaacttg aggtttactt cccg 24

【００６７】 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 6 tgctggttcc tggcattttg cgcc 24

【００６８】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 7 tcgaacaatc tcttcacgcc 20

【００６９】 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 8 gaatcccacc aaatctgcgc c 21

【００７０】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 9 tgatgttgaa atgtttgggg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 10 gatgtcatgc tggttacgcc 20

【００７１】 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 11 caaagcacca gtgccgtcgc gg 22

【００７２】 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 12 tgttcgtttt cattcgcgtt gccg 24

【００７３】 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 13 atagtttcct ggattgtttg gcgc 24

【００７４】 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n=a or g or c or t <400> 14 caraayccnt ggtggtgg 18

【００７５】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <220> <221> misc_feature <222> (3,6,15) <223> n=a or g or c or t <400> 15 ggncgncgrt trtcnggrtc 20

【００７６】 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 16 cgagctcttc attgatggcg 20

【００７７】 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 17 gcagctacac acgagttggg 20

【００７８】 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 18 gcaacaccta aatggttggg 20

【００７９】 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 19 gcaagaagtc tacaagcgcc 20

【００８０】 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 20 gccaacgtat tcacgg 16

【００８１】 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 21 tgatgaacca ctcgatcccc 20

【００８２】 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 22 aagacaccac cttctaccgc 20

【００８３】 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 23 caagtggaat tctgcagcgg 20

【００８４】 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 24 cctcctacaa aacctgctgg g 21

【００８５】 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 25 tcgcggatag cttttagggc 20

【００８６】 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 26 tgagttttta gaagactccc 20

【００８７】 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 27 cgcttcagtg gtgttgtccc 20

【００８８】 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 28 cgtaccactc cacggaaatt cccg 24

【００８９】 <210> 29 <211> 2369 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (484)..(1938) <400> 29 acagaatcag cgccggcaga gaaacgtcca aagactaatc agagattcgg tataaaggta 60 aaaatcaacc tgcttaggcg tctttcgctt aaatagcgta gaatatcggg tcgatcgctt 120 ttaaacactc aggaggatcc ttgccggcca aaatcacgga cactcgtccc accccagaat 180 cccttcacgc tgttgaagag gaaaccgcag ccggtgcccg caggattgtt gccacctatt 240 ctaaggactt cttcgacggc gtcactttga tgtgcatgct cggcgttgaa cctcagggcc 300 tgcgttacac caaggtcgct tctgaacacg aggaagctca gccaaagaag gctacaaagc 360 ggactcgtaa ggctaccagc taagaaggct gctgctaaga aaacgaccaa gaagaccact 420 aagaaaacta ctaaaaagac caccgcaaag aagaccacaa agaagtctta agccggatct 480 tat atg gat gat tcc aat agc ttt gta gtt gtt gct aac cgt ctg cca 528 Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro 1 5 10 15 gtg gat atg act gtc cac cca gat ggt agc tat agc atc tcc ccc agc 576 Val Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser 20 25 30 ccc ggt ggc ctt gtc acg ggg ctt tcc ccc gtt ctg gaa caa cat cgt 624 Pro Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg 35 40 45 gga tgt tgg gtc gga tgg cct gga act gta gat gtt gca ccc gaa cca 672 Gly Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro 50 55 60 ttt cga aca gat acg ggt gtt ttg ctg cac cct gtt gtc ctc act gca 720 Phe Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala 65 70 75 agt gac tat gaa ggc ttc tac gag ggc ttt tca aac gca acg ctg tgg 768 Ser Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp 80 85 90 95 cct ctt ttc cac gat ctg att gtt act ccg gtg tac aac acc gat tgg 816 Pro Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp 100 105 110 tgg cat gcg ttt cgg gaa gta aac ctc aag ttc gct gaa gcc gtg agc 864 Trp His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser 115 120 125 caa gtg gcg gca cac ggt gcc act gtg tgg gtg cag gac tat cag ctg 912 Gln Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu 130 135 140 ttg ctg gtt cct ggc att ttg cgc cag atg cgc ctt gat ttg aag atc 960 Leu Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile 145 150 155 ggt ttc ttc ctc cac att ccc ttc cct tcc cct gat ctg ttc cgt cag 1008 Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln 160 165 170 175 ctg ccg tgg cgt gaa gag att gtt cga ggc atg ctg ggc gca gat ttg 1056 Leu Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu 180 185 190 gtg gga ttc cat ttg gtt caa aac gca gaa aac ttc ctt gcg tta acc 1104 Val Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr 195 200 205 cag cag gtt gcc ggc act gcc ggg tct cat gtg ggt cag ccg gac acc 1152 Gln Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr 210 215 220 ttg cag gtc agt ggt gaa gca ttg gtg cgt gag att ggc gct cat gtt 1200 Leu Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val 225 230 235 gaa acc gct gac gga agg cga gtt agc gtc ggg gcg ttc ccg atc tcg 1248 Glu Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser 240 245 250 255 att gat gtt gaa atg ttt ggg gag gcg tcg aaa agc gcc gtt ctt gat 1296 Ile Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp 260 265 270 ctt tta aaa acg ctc gac gag ccg gaa acc gta ttc ctg ggc gtt gac 1344 Leu Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp 275 280 285 cga ctg gac tac acc aag ggc att ttg cag cgc ctg ctt gcg ttt gag 1392 Arg Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu 290 295 300 gaa ctg ctg gaa tcc ggc gcg ttg gag gcc gac aaa gct gtg ttg ctg 1440 Glu Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu 305 310 315 cag gtc gcg acg cct tcg cgt gag cgc att gat cac tat cgt gtg tcg 1488 Gln Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser 320 325 330 335 cgt tcg cag gtc gag gaa gcc gtc ggc cgt atc aat ggt cgt ttc ggt 1536 Arg Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly 340 345 350 cgc atg ggg cgt ccc gtg gtg cat tat cta cac agg tca ttg agc aaa 1584 Arg Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys 355 360 365 aat gat ctc cag gtg ctg tat acc gca gcc gat gtc atg ctg gtt acg 1632 Asn Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr 370 375 380 cct ttt aaa gac ggt atg aac ttg gtg gct aaa gaa ttc gtg gcc aac 1680 Pro Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn 385 390 395 cac cgc gac ggc act ggt gct ttg gtg ctg tcc gaa ttt gcc ggc gcg 1728 His Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala 400 405 410 415 gcc act gag ctg acc ggt gcg tat tta tgc aac cca ttt gat gtg gaa 1776 Ala Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu 420 425 430 tcc atc aaa cgg caa atg gtg gca gct gtc cat gat ttg aag cac aat 1824 Ser Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn 435 440 445 ccg gaa tct gcg gca acg cga atg aaa acg aac agc gag cag gtc tat 1872 Pro Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr 450 455 460 acc cac gac gtc aac gtg tgg gct aat agt ttc ctg gat tgt ttg gcg 1920 Thr His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala 465 470 475 cag tcg gga gaa aac tca tgaaccgcgc acgaatcgcg accataggcg 1968 Gln Ser Gly Glu Asn Ser 480 485 ttcttccgct tgctttactg ctggcgtcct gtggttcaga caccgtggaa atgacagatt 2028 ccacctggtt ggtgaccaat atttacaccg atccagatga gtcgaattcg atcagtaatc 2088 ttgtcatttc ccagcccagc ttagattttg gcaattcttc cctgtctggt ttcactggct 2148 gtgtgccttt tacggggcgt gcggaattct tccaaaatgg tgagcaaagc tctgttctgg 2208 atgccgatta tgtgaccttg tcttccctgg atttcgataa acttcccgat gattgccaag 2268 gacaagaact caaagttcat aacgagctgg ttgatcttct gcctggttct tttgaaatct 2328 ccaggacttc tggttcagaa atcttgctga ctagcgatgt c 2369

【００９０】 <210> 30 <211> 485 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 30 Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val 1 5 10 15 Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser Pro 20 25 30 Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg Gly 35 40 45 Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro Phe 50 55 60 Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala Ser 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp Pro 85 90 95 Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp Trp 100 105 110 His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser Gln 115 120 125 Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu Leu 130 135 140 Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile Gly 145 150 155 160 Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln Leu 165 170 175 Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu Val 180 185 190 Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr Gln 195 200 205 Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr Leu 210 215 220 Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val Glu 225 230 235 240 Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile 245 250 255 Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp Leu 260 265 270 Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp Arg 275 280 285 Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu Glu 290 295 300 Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu Gln 305 310 315 320 Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser Arg 325 330 335 Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Arg 340 345 350 Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys Asn 355 360 365 Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro 370 375 380 Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn His 385 390 395 400 Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala 405 410 415 Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu Ser 420 425 430 Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn Pro 435 440 445 Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr Thr 450 455 460 His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala Gln 465 470 475 480 Ser Gly Glu Asn Ser 485

【００９１】 <210> 31 <211> 2956 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (82)..(2514) <220> <221> misc_feature <222> (2953) <223> n=a or g or c or t <400> 31 ttttcccacg cagggaaggc gtgaacacta agatcgagga cgtaccgcac gattttgcct 60 aacttttaag ggtgtttcat c atg gca cgt cca att tcc gca acg tac agg 111 Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg 1 5 10 ctt caa atg cga gga cct caa gca gat agc gcc ggg cgt ttc ttt ggt 159 Leu Gln Met Arg Gly Pro Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Phe Phe Gly 15 20 25 ttt gcg cag gcc aaa gcc cag ctt ccc tat ctg aag aag cta ggc atc 207 Phe Ala Gln Ala Lys Ala Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile 30 35 40 agc cac ctg tac ctc tcc cct att ttt acg gcc atg cca gat tcc aat 255 Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn 45 50 55 cat ggc tac gat gtc att gat ccc acc gcc atc aat gaa gag ctc ggt 303 His Gly Tyr Asp Val Ile Asp Pro Thr Ala Ile Asn Glu Glu Leu Gly 60 65 70 ggc atg gag ggt ctt cga gat ctt gct gca gct aca cac gag ttg ggc 351 Gly Met Glu Gly Leu Arg Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly 75 80 85 90 atg ggc atc atc att gat att gtt ccc aac cat tta ggt gtt gcc gtt 399 Met Gly Ile Ile Ile Asp Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val 95 100 105 cca cat ttg aat cct tgg tgg tgg gat gtt cta aaa aac ggc aaa gat 447 Pro His Leu Asn Pro Trp Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp 110 115 120 tcc gct ttt gag ttc tat ttc gat att gac tgg cac gaa gac aac ggt 495 Ser Ala Phe Glu Phe Tyr Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly 125 130 135 tct ggt ggc aag ctg ggc atg ccg att ctg ggt gct gaa ggc gat gaa 543 Ser Gly Gly Lys Leu Gly Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu 140 145 150 gac aag ctg gaa ttc gcg gag ctt gat gga gag aaa gtg ctc aaa tat 591 Asp Lys Leu Glu Phe Ala Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr 155 160 165 170 ttt gac cac ctc ttc cca atc gcg cct ggt acc gaa gaa ggg aca ccg 639 Phe Asp His Leu Phe Pro Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro 175 180 185 caa gaa gtc tac aag cgc cag cat tac cgc ctg cag ttc tgg cgc gac 687 Gln Glu Val Tyr Lys Arg Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp 190 195 200 ggc gtg atc aac ttc cgt cgc ttc ttt tcc gtg aat acg ttg gct ggc 735 Gly Val Ile Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly 205 210 215 atc agg caa gaa gat ccc ttg gtg ttt gaa cat act cat cgt ctg ctg 783 Ile Arg Gln Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu 220 225 230 cgc gaa ttg gtg gcg gaa gac ctc att gac ggc gtg cgc gtc gat cac 831 Arg Glu Leu Val Ala Glu Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His 235 240 245 250 ccc gac ggg ctt tcc gat cct ttt gga tat ctg cac aga ctc cgc gac 879 Pro Asp Gly Leu Ser Asp Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp 255 260 265 ctc att gga cct gac cgc tgg ctg atc atc gaa aag atc ttg agc gtt 927 Leu Ile Gly Pro Asp Arg Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val 270 275 280 gat gaa cca ctc gat ccc cgc ctg gcc gtt gat ggc acc act ggc tac 975 Asp Glu Pro Leu Asp Pro Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr 285 290 295 gac ccc ctc cgt gaa ctc gac ggc gtg ttt atc tcc cga gaa tct gag 1023 Asp Pro Leu Arg Glu Leu Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu 300 305 310 gac aaa ttc tcc atg ttg gcg ctg acc cac agt gga tcc acc tgg gat 1071 Asp Lys Phe Ser Met Leu Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp 315 320 325 330 gaa cgc gcc cta aaa tcc acg gag gaa agc ctc aaa cga gtc gtc gcg 1119 Glu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala 335 340 345 caa caa gaa ctc gca gcc gaa atc tta agg ctc gcc cgc gcc atg cgc 1167 Gln Gln Glu Leu Ala Ala Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg 350 355 360 cgc gat aac ttc tcc acc gca ggc acc aac gtc acc gaa gac aaa ctt 1215 Arg Asp Asn Phe Ser Thr Ala Gly Thr Asn Val Thr Glu Asp Lys Leu 365 370 375 agc gaa acc atc atc gaa tta gtc gcc gcc atg ccc gtc tac cgc gcc 1263 Ser Glu Thr Ile Ile Glu Leu Val Ala Ala Met Pro Val Tyr Arg Ala 380 385 390 gac tac atc tcc ctc tca cgc acc acc gcc acc gtc atc gcg gag atg 1311 Asp Tyr Ile Ser Leu Ser Arg Thr Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Met 395 400 405 410 tcc aaa cgc ttc ccc tcc cgg cgc gac gca ctc gac ctc atc tcg gcc 1359 Ser Lys Arg Phe Pro Ser Arg Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile Ser Ala 415 420 425 gcc cta ctt ggc aat ggc gag gcc aaa atc cgc ttc gcc caa gtc tgc 1407 Ala Leu Leu Gly Asn Gly Glu Ala Lys Ile Arg Phe Ala Gln Val Cys 430 435 440 ggc gcc gtc atg gcc aaa ggt gtg gaa gac acc acc ttc tac cgc gca 1455 Gly Ala Val Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Thr Thr Phe Tyr Arg Ala 445 450 455 tct agg ctc gtt gca ctg caa gaa gtc ggt ggc gcg ccg ggc agg ttc 1503 Ser Arg Leu Val Ala Leu Gln Glu Val Gly Gly Ala Pro Gly Arg Phe 460 465 470 ggc gtc tcc gct gca gaa ttc cac ttg ctg cag gaa gaa cgc agc ctg 1551 Gly Val Ser Ala Ala Glu Phe His Leu Leu Gln Glu Glu Arg Ser Leu 475 480 485 490 ctg tgg cca cgc acc atg acc acc ttg tcc acg cac gac acc aaa cgc 1599 Leu Trp Pro Arg Thr Met Thr Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Arg 495 500 505 ggc gaa gat acc cgc gcc cgc atc atc tcc ctg tcc gaa gtc ccc gat 1647 Gly Glu Asp Thr Arg Ala Arg Ile Ile Ser Leu Ser Glu Val Pro Asp 510 515 520 atg tac tcc gag ctg gtc aat cgt gtt ttc gca gtg ctc ccc gcg cca 1695 Met Tyr Ser Glu Leu Val Asn Arg Val Phe Ala Val Leu Pro Ala Pro 525 530 535 gac ggc gca acg ggc agt ttc ctc cta caa aac ctg ctg ggc gta tgg 1743 Asp Gly Ala Thr Gly Ser Phe Leu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Trp 540 545 550 ccc gcc gac ggc gtg atc acc gat gcg ctg cgc gat cga ttc agg gaa 1791 Pro Ala Asp Gly Val Ile Thr Asp Ala Leu Arg Asp Arg Phe Arg Glu 555 560 565 570 tac gcc cta aaa gct atc cgc gaa gca tcc aca aaa acc acg tgg gtg 1839 Tyr Ala Leu Lys Ala Ile Arg Glu Ala Ser Thr Lys Thr Thr Trp Val 575 580 585 gac ccc aac gag tcc ttc gag gct gcg gtc tgc gat tgg gtg gaa gcg 1887 Asp Pro Asn Glu Ser Phe Glu Ala Ala Val Cys Asp Trp Val Glu Ala 590 595 600 ctt ttc gac gga ccc tcc acc tca tta atc acc gaa ttt gtc tcc cac 1935 Leu Phe Asp Gly Pro Ser Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His 605 610 615 atc aac cgt ggc tct gtg aat atc tcc tta ggt agg aaa ctg ctg caa 1983 Ile Asn Arg Gly Ser Val Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln 620 625 630 atg gtg ggc gct gga atc ccc gac act tac caa gga act gag ttt tta 2031 Met Val Gly Ala Gly Ile Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu 635 640 645 650 gaa gac tcc ctg gta gat ccc gat aac cga cgc ttt gtt gat tac acc 2079 Glu Asp Ser Leu Val Asp Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr 655 660 665 gcc aga gaa caa gtc ctg gag cgc ctg caa acc tgg gat tgg acg cag 2127 Ala Arg Glu Gln Val Leu Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln 670 675 680 gtt aat tcg gta gaa gac ttg gtg gat aac gcc gac atc gcc aaa atg 2175 Val Asn Ser Val Glu Asp Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met 685 690 695 gcc gtg gtc cat aaa tcc ctc gag ttg cgt gct gaa ttt cgt gca agc 2223 Ala Val Val His Lys Ser Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser 700 705 710 ttt gtt ggt gga gat cat cag gca gta ttt ggc gaa ggt cgc gca gaa 2271 Phe Val Gly Gly Asp His Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu 715 720 725 730 tcc cac atc atg ggc atc gcc cgc ggt aca gac cga aac cac ctc aac 2319 Ser His Ile Met Gly Ile Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn 735 740 745 atc att gct ctt gct acc cgt cga cca ctg atc ttg gaa gac cgt ggc 2367 Ile Ile Ala Leu Ala Thr Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly 750 755 760 gga tgg tat gac acc acc gtc acg ctt cct ggt gga caa tgg gaa gac 2415 Gly Trp Tyr Asp Thr Thr Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp 765 770 775 agg ctc acc ggg caa cgc ttc agt ggt gtt gtc cca gcc acc gat ttg 2463 Arg Leu Thr Gly Gln Arg Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu 780 785 790 ttc tca cat tta ccc gta tct ttg ttg gtt tta gta ccc gat agt gag 2511 Phe Ser His Leu Pro Val Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu 795 800 805 810 ttt tgatccctgc acaggaaagt tagcggcgct actatgaacg atcgatatgt 2564 Phe ctgacaacac tctctcccaa tttggcagtt actaccacga attccgacgt gcccatccca 2624 tggccgacgt cgaattcctc ctagcaattg aagaattact cacagacggt ggtgtcacct 2684 tcgatcgcgt caccacacgc atcaaagaat ggtcaagcct gaaagccaag gctcgcaagc 2744 gtcgcgacga tggctcgttg atctaccctg atccgcgcaa agacatccac gacatgatcg 2804 gtgttcggat caccacgtac cactccacgg aaattcccgt ggccttaaaa gtgctccaag 2864 actccttcat cgtccacaaa tccgtagaca aagccgctga aactcgcatc tcaggcggct 2924 ttggttacgg ctcccaccac caaggattnt ag 2956

【００９２】 <210> 32 <211> 811 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 32 Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg Leu Gln Met Arg Gly Pro 1 5 10 15 Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Phe Phe Gly Phe Ala Gln Ala Lys Ala 20 25 30 Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile Ser His Leu Tyr Leu Ser 35 40 45 Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn His Gly Tyr Asp Val Ile 50 55 60 Asp Pro Thr Ala Ile Asn Glu Glu Leu Gly Gly Met Glu Gly Leu Arg 65 70 75 80 Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly Met Gly Ile Ile Ile Asp 85 90 95 Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val Pro His Leu Asn Pro Trp 100 105 110 Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp Ser Ala Phe Glu Phe Tyr 115 120 125 Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly Ser Gly Gly Lys Leu Gly 130 135 140 Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu Asp Lys Leu Glu Phe Ala 145 150 155 160 Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr Phe Asp His Leu Phe Pro 165 170 175 Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro Gln Glu Val Tyr Lys Arg 180 185 190 Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp Gly Val Ile Asn Phe Arg 195 200 205 Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly Ile Arg Gln Glu Asp Pro 210 215 220 Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu Arg Glu Leu Val Ala Glu 225 230 235 240 Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Ser Asp 245 250 255 Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp Leu Ile Gly Pro Asp Arg 260 265 270 Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val Asp Glu Pro Leu Asp Pro 275 280 285 Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Pro Leu Arg Glu Leu 290 295 300 Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu Asp Lys Phe Ser Met Leu 305 310 315 320 Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp Glu Arg Ala Leu Lys Ser 325 330 335 Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala Gln Gln Glu Leu Ala Ala 340 345 350 Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg Arg Asp Asn Phe Ser Thr 355 360 365 Ala Gly Thr Asn Val Thr Glu Asp Lys Leu Ser Glu Thr Ile Ile Glu 370 375 380 Leu Val Ala Ala Met Pro Val Tyr Arg Ala Asp Tyr Ile Ser Leu Ser 385 390 395 400 Arg Thr Thr Ala Thr Val Ile Ala Glu Met Ser Lys Arg Phe Pro Ser 405 410 415 Arg Arg Asp Ala Leu Asp Leu Ile Ser Ala Ala Leu Leu Gly Asn Gly 420 425 430 Glu Ala Lys Ile Arg Phe Ala Gln Val Cys Gly Ala Val Met Ala Lys 435 440 445 Gly Val Glu Asp Thr Thr Phe Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Val Ala Leu 450 455 460 Gln Glu Val Gly Gly Ala Pro Gly Arg Phe Gly Val Ser Ala Ala Glu 465 470 475 480 Phe His Leu Leu Gln Glu Glu Arg Ser Leu Leu Trp Pro Arg Thr Met 485 490 495 Thr Thr Leu Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Gly Glu Asp Thr Arg Ala 500 505 510 Arg Ile Ile Ser Leu Ser Glu Val Pro Asp Met Tyr Ser Glu Leu Val 515 520 525 Asn Arg Val Phe Ala Val Leu Pro Ala Pro Asp Gly Ala Thr Gly Ser 530 535 540 Phe Leu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Trp Pro Ala Asp Gly Val Ile 545 550 555 560 Thr Asp Ala Leu Arg Asp Arg Phe Arg Glu Tyr Ala Leu Lys Ala Ile 565 570 575 Arg Glu Ala Ser Thr Lys Thr Thr Trp Val Asp Pro Asn Glu Ser Phe 580 585 590 Glu Ala Ala Val Cys Asp Trp Val Glu Ala Leu Phe Asp Gly Pro Ser 595 600 605 Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His Ile Asn Arg Gly Ser Val 610 615 620 Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Met Val Gly Ala Gly Ile 625 630 635 640 Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val Asp 645 650 655 Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr Ala Arg Glu Gln Val Leu 660 665 670 Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln Val Asn Ser Val Glu Asp 675 680 685 Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met Ala Val Val His Lys Ser 690 695 700 Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser Phe Val Gly Gly Asp His 705 710 715 720 Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu Ser His Ile Met Gly Ile 725 730 735 Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn Ile Ile Ala Leu Ala Thr 740 745 750 Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly Gly Trp Tyr Asp Thr Thr 755 760 765 Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp Arg Leu Thr Gly Gln Arg 770 775 780 Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu Phe Ser His Leu Pro Val 785 790 795 800 Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu Phe 805 810

【００９３】 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 33 ccaaaatcga taacatcaat cgagatcggg 30

【００９４】 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 34 cttgatcgat taaaaacgct cgacgagccg 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/10 (Ｃ１２Ｐ 13/14 ＡＣ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者泉井裕神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者中松亘神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素株式会社発酵技術研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA11 BA10 BA74 CA04 DA10 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD02 4B064 AE19 CA02 CA19 CC24 DA03 DA10 DA13 4B065 AA22X AA24X AA32X AC14 BA02 CA17 CA29 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−グルタミン酸生産能を有し、かつ、
トレハロース合成能が低下又は欠失したコリネ型細菌。
【請求項２】染色体上のトレハロース合成系酵素遺伝
子に変異が導入又は破壊されたことによりトレハロース
合成能が低下又は欠失した請求項１記載のコリネ型細
菌。
【請求項３】トレハロース合成系酵素遺伝子が、トレ
ハロース−６−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、
マルトオリゴシルトレハロースシンターゼをコードする
遺伝子又はこれらの両方の遺伝子である請求項２記載の
コリネ型細菌。
【請求項４】トレハロース−６−リン酸シンターゼを
コードする遺伝子が配列番号３０に記載のアミノ酸配列
をコードし、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼ
をコードする遺伝子が配列番号３２に記載のアミノ酸配
列をコードする請求項３記載のコリネ型細菌。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、同培地中にＬ−グルタミン
酸を生成、蓄積させ、同培地からＬ−グルタミン酸を採
取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
【請求項６】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコ
ードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する蛋白
質。（Ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加
を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トレハロース−６
−リン酸シンターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項７】下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項６記載のＤＮＡ。（ａ）配列番号２９に記載の塩基配列のうち、少なくと
も塩基番号４８４〜１９３８からなる塩基配列を含むＤ
ＮＡ。（ｂ）配列番号２９に記載の塩基配列のうち、少なくと
も塩基番号４８４〜１９３８からなる塩基配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズし、同塩基配列と
５５％以上の相同性を有し、かつ、トレハロース−６−
リン酸シンターゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ。
【請求項８】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示す蛋白質をコ
ードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白
質。（Ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加
を含むアミノ酸配列からなり、かつ、マルトオリゴシル
トレハロースシンターゼ活性を有する蛋白質。
【請求項９】下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項８記載のＤＮＡ。（ａ）配列番号３１に記載の塩基配列のうち、塩基番号
８２〜２５１４からなる塩基配列を含むＤＮＡ。（ｂ）配列番号３１に記載の塩基配列のうち、塩基番号
８２〜２５１４からなる塩基配列又は同塩基配列から調
製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、同塩基配列と６０％以上の相同性を有
し、かつ、マルトオリゴシルトレハロースシンターゼ活
性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。