Die Gensequenzen für die kodierenden
Anteile der obenerwähnten
Genloci sind im Fachgebiet bekannt, z.B. aus WO 2001/00843 otsA
(SEQ ID NO:17); otsB (SEQ ID NO:1139); treZ (SEQ ID NO:1145) bzw. aus
WO 2002/51231 treS (SEQ ID NO:3) bzw. aus
EP 1108790 glgA (SEQ ID NO: 1238).
Erfindungsgemäß werden bestimmte, am Trehalosestoffwechsel
beteiligte Gene in einem Mikroorganismus der Gattung Corynebacterium
oder Brevibacterium, der bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen eine
Aminosäure
produzieren kann, moduliert, um die Trehalosesynthese in diesem
Mikroorganismus zu verhindern. Die Modulation wird so durchgeführt, daß der entstandene
modulierte Mikroorganismus einen Mangel an wenigstens einem der
Genloci der aus otsAB, treZ und treS gebildeten Gruppe aufweist.
Dabei kann es sich um einen teilweisen oder vollständigen Mangel
handeln.
Ein teilweise Mangel bedeutet, daß ein Teil
des Genlocus durch Insertion, Deletion oder Substitution eines oder
mehrerer Nucleotide dieses Genlocus verändert wurde. Ein Mangel bedeutet
hier, daß die
normale Funktion dieses Genlocus verändert wurde. Ein Mikroorganismus
mit einem teilweisen Mangel bezüglich
eines spezifischen Genlocus bedeutet, daß der betreffende Genlocus
einen Teil seiner ursprünglichen
Funktion behält,
während
ein Mikroorganismus mit vollständigem
Mangel bedeutet, daß der
betreffende Genlocus seine ursprüngliche
Funktion vollständig
verloren hat.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung
von einen Mangel an einem bestimmten Genlocus aufweisenden Mikroorganismen
besteht in der Deletion eines oder mehrerer Nucleotide dieses Locus
bis zur vollständigen
Deletion des gesamten Genlocus. Die Deletion kann im kodierenden
Bereich oder im regulatorischen Bereich, z.B. im Promotorbereich,
des betreffenden Genlocus erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen besitzen
eine reduzierte (bis zu 0%) Fähigkeit,
Trehalose zu produzieren. Als Folge davon wird die Produktivität dieser
Mikroorganismen bezüglich
Aminosäuren
verbessert.
Material und Methoden
Stämme, Medien und Kultivierung
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten
C. glutamicum-Stämme
und- Plasmide sind in Tabelle 1 aufgeführt. Zusätzlich wurden die E. coli-Stämme XL1-blue
(Bullock et al., 1987) und S17-1 (Simon et al., 1983) zur Plasmidkonstruktion
bzw. zur Mobilisierung von Integrationsvektoren in C. glutamicum
verwendet. Der restriktionsdefiziente Stamm C. glutamicum R163 (Liebl
et al., 1989a) wurde zur Herstellung von Plasmidkonstrukten vor
deren Elektroporation in dem C. glutamicum-Typ-Stamm eingesetzt. Die Stämme wurden
auf LB-Platten, die erforderlichenfalls mit Antibiotika supplementiert
waren, gehalten.
Zur Untersuchung der Trehalosesynthese
wurden C. glutamicum-Stämme
auf definierten BMC-Medien (Liebl et al., 1989b), die mit unterschiedlichen
Mengen an Saccharose oder anderen Kohlenstoffquellen, wie im Text
beschrieben, supplementiert waren, angezogen. Zellen von LB-Platten,
mit denen 5 ml LB angeimpft wurde und die über Nacht angezogen wurden
(30°C; 210
UpM), wurden als Vorkulturen zum Animpfen von Röhrchen mit 5 ml bzw. Kolben
mit 30 ml BMC-Brühe
verwendet. Die Zelldichte beim Animpfen der Hauptkulturen betrug
OD600 0,1-0,2. Falls erforderlich, wurde Kanamycin
mit einer Endkonzentration von 20 μg ml–1 zu
den Medien gegeben. Alle Kulturen wurden auf einem Rundschüttler angezogen
(30°C; 210
UpM). Es stellte sich heraus, daß ein schnelles Schütteln mit
mehr als 200 UpM für
das Wachstum von nicht trehaloseproduzierenden Mutanten wichtig
war (siehe Text). Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden
Proben entnommen. Das Wachstum der Kulturen wurde über OD-Messungen
bei 600 nm mit einem Ultrospec 3000-Spektrophotometer (Pharmacia,
Uppsala, Schweden) verfolgt. Falls notwendig, wurden die Proben
vor den Messungen auf eine OD von weniger als 0,3 verdünnt.
Rekombinante DNA-Techniken
Grundlegende Methoden, wie beispielsweise
Plasmidisolierung, DNA-Restriktion und -Ligation, wurden nach Sambrook
et al. (1989) durchgeführt.
Restriktionsendonucleasen und DNA-Modifikationsenzyme wurden von
MBI Fermentas (St. Leon-Rot,
Deutschland) oder New England Biolabs (Frankfurt, Deutschland) bezogen.
C. glutamicum-Plasmid-DNA wurde mittels des alkalischen Extraktionsverfahrens
(Birnboim & Doly, 1979)
nach 30minütiger
Vorbehandlung der Zellen mit 10 μg
ml–1 Lysozym
bei 37°C
isoliert. Genomische DNA wurde aus C. glutamicum wie bei Lewington
et al. (1987) beschrieben isoliert. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung
von Pfu-Polymerase (Promega, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Einige
PCR-Produkte wurden
unter Verwendung des TOPOR Cloning Kit (Invitrogen,
Karlsruhe, Deutschland) nach Angaben des Herstellers direkt in den
Vektor pCR4 kloniert.
Konstruktion von ΔotsAB-, ΔtreZ-, ΔtreS- und
glgA::Km-Mutanten von C. glutamicum DSM20300
Das Zwei-Stufen-Rekombinationssystem
(Schaefer et al., 1994), das auf der Unfähigkeit von das sacB-Gen tragenden
C. glutamicum-Bakterien zum Wachstum in Medien mit hohen Saccharosekonzentrationen
beruht, wurde zur chromosomalen Inaktivierung der C. glutamicum-Trehalosebiosynthesegene
verwendet. Für
jedes geplante Inaktivierungsexperiment wurde ein mobilisierbarer
C. glutamicum-Integrationsvektor konstruiert,
in dem das gewünschte
Gen jedoch mit einer internen Deletion enthalten war, so daß zwei homologe
Bereiche für
die Rekombination bereitgestellt wurden.
Zur Inaktivierung der otsA-otsB-Gene
wurden zwei chromosomale DNA-Bereiche getrennt amplifiziert und
religiert, was zur sich im Leserahmen befindenden Deletion beider
Gene führte.
Ein 1,5 kb großes,
den gesamten otsA-ORF tragendes Fragment wurde mit den Primern tre351_f
und tre351_r (Tabelle 2) amplifiziert und in die EcoRV-Restriktionsstelle
von pBluescript KS kloniert, wodurch sich pBlueKS::otsA ergab. Danach wurde
ein 0,65 kb großer,
einen Teil von otsB tragender Bereich mit den Primern otsAB_f und
otsAB_r amplifiziert. Das mit HindIII und SphI geschnittene PCR-Produkt
diente dazu, ein 0,90 kb großes
HindIII-SphI-Fragment des otsA-tragenden Plasmids zu ersetzen, was
zur sich im Leserahmen befindenden Fusion des 5'-Teils von otsA mit dem 3'-Teil von otsB-Genen
führte.
Unter Verwendung von XbaI wurde der entstandene ΔotsAB-ORF zur Inaktivierung
des chromosomalen otsAB-Locus in C. glutamicum in den mobilisierbaren
Integrationsvektor pCLiK8.2 kloniert.
Ein mobilisierbares treZ-Inaktivierungsplasmid
wurde wie folgt konstruiert: ein 2,5 kb großes treZ-Fragment wurde mit
den Primern treZ_f und treZ_r amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde
mit XbaI geschnitten und in pCLiK3 kloniert und anschließend eine
interne, sich im Leserahmen befindende, 0,65 kb große Deletion
mit Hilfe von SalI in treZ eingeführt. Das ΔtreZ-Gen wurde über XbaI
in den mobilisierbaren Integrationsvektor pCLiK8.2 kloniert.
Zur chromosomalen Inaktivierung von
treS wurden die Gene nach Amplifikation mit den PCR-Primern treS_f
und treS_r in pBluescriptKS kloniert. Nach Verdau des entstandenen
Plasmids mit EcoRV und StyI sowie Behandlung mit Klenow-Enzym wurde
das Plasmid religiert, was zu einer 0,65 kg großen, sich im Leserahmen befindenden
Deletion in dem klonierten treS-ORF führte. Das verkürzte Gen
wurde unter Verwendung von XbaI in das mobilisierbare Plasmid pKl8mobsac
(Schaefer et al., 1994) kloniert.
Die drei Endkonstrukte zur Inaktivierung
der OtsA-OtsB-, TreY-TreZ- und TreS-Stoffwechselwege, mit pCLiK8.2::ΔotsAB, pCLiK8.2::ΔtreZ bzw.
pK18ms::ΔtreS
bezeichnet, wurden in den Stamm E.coli S17-1 transformiert und nach
dem von Schäfer
et al. (1990) beschriebenen Verfahren in durch Hitze gestreßte C. glutamicum-Bakterien
mobilisiert. Erfolgreiche erste Rekombinanten (chromosomale Integrationsmutanten)
wurden durch Ausplattieren auf LB-Platten mit 20 μg ml–1 Kanamycin
selektioniert. Zur Selektion des zweiten Rekombinationsereignisses
wurde die Integrationsmutanten auf Agarplatten mit 5-10 % (w/v)
Saccharose ausplattiert. In einigen Fällen (siehe Ergebnisse) wurde
2 % (w/v) Trehalose zugegeben.
Ein putatives Glycogensynthasegen
(glgA) wurde durch eine einstufige chromosomale Integration inaktiviert.
Zu diesem Zweck wurde ein 0,6 kb großes internes glgA-Fragment
mit glg_f und glg_r als PCR-Primer amplifiziert. Das PCR-Produkt
wurde in den Integrationsvektor pCLiK6 unter Verwendung seiner einzigen XbaI-Stelle
kloniert. Das entstandene Plasmid wurde unter Verwendung von E.coli
S17-1 wie oben beschrieben mobilisiert. Die Integrationsmutanten
wurden auf mit Kanamycin supplementierten LB-Medien selektioniert.
Der Genotyp der erhaltenen Mutanten
wurde durch Southern-Blot-Analyse und mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen
bestätigt.
Konstruktion von pWLQ2::
otsAB, pWLQ2::otsA, pWLQ2::treZ und pWLQ2::treS
Expressionsplasmide, die die verschiedenen
Trehalosebiosynthesegene trugen, wurden unter Verwendung des C.
glutamicum-E. coli-Shuttle-Expressionsvektors pWLQ2 (Liebl et al.,
1992) konstruiert. Das Plasmid pBlueKS::otsA, in dem das otsA-Gen nach der PCR-Amplifikation
wie oben beschrieben ursprünglich kloniert
worden war, wurde zur Konstruktion eines das otsA-Gen tragenden
Expressionsplasmids verwendet. Ein 1,6 kb großes, das otsA-Gen tragendes
BamHI-SalI-Fragment von pBlueKS::otsA wurde mit dem mit denselben
Enzymen geöffneten
pWLQ2 ligiert. In dem entstandenen Plasmid (pWLQ2::otsA) befindet
sich das otsA-Gen unter der Kontrolle des Ptac-Promotors.
Zur Konstruktion von pWLQ2::otsAB wurde das otsB-Gen aus dem C.
glutamicum-Chromosom unter Verwendung der Primer otsB_f und otsB_r
amplifiziert. Nach Klonierung des PCR-Produkts in pCR4-TOPO wurde
das 1 kb große
BamHI-Fragment ausgeschnitten und in die BamHI-Stelle von pWLQ2::otsA
inseriert. In dem entstandenen, mit pWLQ::otsAB bezeichneten Plasmid
werden beide ots-Gene unter Regulation des Ptac-Promotors
coexprimiert.
Zur Konstruktion von pWLQ2:treZ wurde
ein mit den Primern treZ_f2 und treZ_r2 erzeugtes 2,5 kb großes PCR-Produkt
in pCR4-TOPO kloniert. Danach wurde das treZ-Gen mit BamHI ausgeschnitten und in
die BamHI-Stelle von pWLQ2 zurückkloniert.
Die erhaltenen Plasmide wurde über
Restriktionsanalyse auf die korrekte Orientierung von treZ in bezug
auf den Ptac-Promotor überprüft. Zur Konstruktion von pWLQ2::treS
wurde das chromosomale treS-Gen aus C. glutamicum mit den Primern
treS_f3 und treS_r3 als ein 2 kb großes Fragment amplifiziert.
Nachdem zunächst
in pCR4-TOPO kloniert wurde, wurde das treS-Gen ausgeschnitten und unter
Verwendung von künstlich
hinzugefügten
SalI-Stellen in pWLQ2 zurückkloniert.
Das Plasmid pWLQ2::treS, in dem treS kolinear zum Ptac-Promotor
orientiert ist, wurde isoliert. Alle Plasmide wurden dann durch
Elektroporation in C. glutamicum-Stämme transformiert (Liebl et
al., 1989a), normalerweise nachdem sie zunächst zur Erhöhung der
Effizienz durch einen restriktionsdefizienten Stamm passagiert worden
waren. Die Stämme
wurden unter Kanamycinselektion bei 20 μg ml–1 angezogen.
Die durch den Ptac-Promotor gesteuerte Genexpression
wurde durch Zugabe von IPTG mit einer Endkonzentration von 1 mM
induziert.
Isolation und Analyse
von Lipiden
Zellipide wurden wie bei Puech et
al. (2000) beschrieben isoliert. Die Zellen wurden nach ungefähr 10 h
Inkubation (Wachstum bei 210 UpM und 30°C) wie oben beschrieben geerntet
und gewaschen (siehe Probenpräparation).
Zur Lipidextraktion wurden die feuchten Zellen in CHCl3/CH3OH [1:1 (v/v)] suspendiert und 16 h bei
Raumtemperatur geschüttelt.
Die verbliebenen Bakterienreste wurden zweimal mit CHCl3/CH3OH [2:1 (v/v)] reextrahiert, und die organischen
Phasen wurden vereinigt und dann in einer Vakuumzentrifuge konzentriert.
Wasserlösliche
Verunreinigungen wurden durch zusätzliche Extraktion mit Wasser
[2:1 (v/v)] entfernt, und die organischen Phasen wurden unter Erhalt
der Rohlipidextrakte gefriergetrocknet. Die Lipidextrakte wurden
bei einer Endkonzentration von 50 μg μl–1 in
Chloroform gelöst
und mittels TLC-Analyse analysiert. Die Proben wurden auf Silikagel-beschichtete
Aluminiumplatten (Typ G-60, 5 × 10
cm, Merck) aufgetragen und mit CHCl3/CH3OH/H2O [30:8/1 (v/v)]
in einer fest verschlossenen Kammer bei 4°C entwickelt. Glycolipide wurden durch
Ansprühen
mit einer 0,2%igen (w/v) Anthronlösung in konz. HZSO4 und anschließendem Erhitzen (10-15 min
bei 100°C)
sichtbar gemacht.
Der Trehalosegehalt der Lipidextrakte
wurde nach Verseifung des Rohlipidextrakts gemäß Liu & Nikaido (1999) mit den folgenden
Modifikationen quantifiziert: Aliquots der Proben wurden vor der
Extraktion mit Wasser entnommen, gefriergetrocknet und in 5%igem
(w/v) Kaliumhydroxid gelöst.
Die Proben wurden 1 h bei 100°C
inkubiert, abgekühlt
und Aliquots dann direkt zur Trehalosebestimmung mit HPLC bei hohem
pH-Wert eingesetzt
(siehe unten).
Probenvorbereitung zur
Trehalose- und Glycogenbestimmung
Kulturproben (1,5 ml) wurden rasch
auf Eis abgekühlt
und dann zentrifugiert (13000 UpM, 4°C, 15 min). Alle nachfolgenden
Manipulationen wurden bei 4°C durchgeführt. Der Überstand
wurde gesammelt und bei –20°C zur nachfolgenden
extrazellulären
Trehalosebestimmung eingefroren. Die Zellen wurden mit BMC-Medium
gewaschen und ebenfalls als Pellet bei –20°C gelagert. Um Änderungen
in den extrazellulären osmotischen
Bedingungen so gering wie möglich
zu halten, wurden zum Waschen eiskalte Medien mit derselben Salz-
und Zuckerzusammensetzung wie die Wachstumsmedien verwendet. Aliquots
der gewaschenen Zellen wurden zur Bestimmung des Zelltrockengewichts
verwendet.
Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung
(Amplitude 40%, 0,5-s-Zyklus) in 500 μl 10 mM Natrium/Kalium-Phosphatpuffer
pH 6 aufgeschlossen. Zelltrümmer
wurden durch Zentrifugation (13000 UpM, 4°C, 15 min) abgetrennt, und der Überstand
wurde zur Trehalose- und/oder Glycogenbestimmung eingesetzt.
Trehalosebestimmung
Es wurde ein enzymatischer Trehalosebestimmungsassay
verwendet, der auf der quantitativen enzymatischen Hydrolyse von
Trehalose zu zwei Molekülen
Glucose beruht, wobei eine rekombinante Trehalase aus E. coli eingesetzt
wurde. Dazu wurde die E. coli-Trehalase TreA überexprimiert und wie bei De
Smet et al. (2000) beschrieben teilgereinigt. Danach wurde Glucose
mit einem Oxidase/Peroxidase-Verfahren bestimmt. Proben von 5 bis
20 μl wurden
mit oder ohne rekombinante Trehalase (5 U) in 90 ml 10 mM Natrium/Kalium-Phosphatpuffer
pH 6,0 1 h bei 37°C
inkubiert. Die freigesetzte Glucose wurde durch Zugabe von 900 μl frisch
hergestellter Enzym-Farbreagenslösung
aus einem käuflich
erhältlichen
Glucosenachweis-Kit (Sigma 510-DA) bestimmt. Nach 30minütiger Inkubation
bei 37°C
wurde Glucose spektrophotometrisch bei λ = 450 nm gemessen. Trehalose
wurde aus dem Unterschied der Glucosemengen in den Proben mit und
ohne Trehalasebehandlung berechnet. Während der Messung von extrazellulärer Trehalose
wurde ein signifikanter Hintergrund bei einer hohen Maltosekonzentration,
d.h. in Kulturüberständen mit
10% (w/v) Maltose enthaltender BMC-Brühe, beobachtet, der entweder
durch Verunreinigung der Maltose mit Trehalose oder durch nichtspezifische
Störung
des enzymatischen Trehaloseassays durch Maltose verursacht wird.
Der Hintergrund wurde über
den enzymatischen Assay von Proben von sterilem Maltose-BMC bestimmt und
von den für
die Kulturüberstände erhaltenen
Werten abgezogen.
Für
komplexere Proben, wie z.B. rohe Zellextrakte, bei denen ein hoher
Hintergrund an Glucose beobachtet wurde, wurde ein chromatographisches
Verfahren zur Trehalosebestimmung verwendet. In diesem Fall wurde
die Trehalose mit einer Ionenaustauschchromatographie bei hohem
pH-Wert (High-pH Ion Chromatography, HPIC) bei Raumtemperatur unter
Verwendung einer in einem mit einem gepulsten amperometrischen Detektor
ED40 ausgestatteten DX500-HPLC-System (DIONEX) installierten Carbo-Pak
PA1-Säule
gemessen. 25-μl-Proben
10fach verdünnter
Rohextrakte wurden auf die Säule
aufgetragen. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von
0 bis 80 mM Natriumacetat in einer 150 mM Natriumhydroxidlösung durchgeführt. Die
Säule wurde
durch 10minütiges
Waschen mit 500 mM Natriumacetat regeneriert und anschließend 10
min mit 150 mM Natriumhydroxid äquilibriert.
Trehalose wurde als einzelner Peak mit einer Retentionszeit von
ungefähr
3,3 min nachgewiesen. Die Trehalosequantifizierung beruhte auf einer
Kalibrierung mit definierten Mengen einer Trehalose-Standardlösung.
Glycogenbestimmung
Die Menge an intrazellulärem Glycogen
in C. glutamicum wurde durch Hydrolyse mit Amyloglucosidase bestimmt.
Dazu wurden Proben (200 μl)
von Zellrohextrakten (wie oben beschrieben hergestellt) mit 2 Volumen
97% (v/v) Ethanol versetzt, pelletiert und unter Erwärmen im
gleichen Volumen 10 mM Natrium/Kalium-Phosphatpuffer pH 6,0 wieder
gelöst.
Proben von 5 bis 50 μl
wurden mit Amyloglucosidase (60 mU; Boehringer Mannheim) in 90 ml
100 mM Natriumacetatpuffer pH 4,5 1 h bei 37°C inkubiert. Die Menge an freigesetzter
Glucose wurde wie oben beschrieben enzymatisch bestimmt. Die Menge
an Glycogen wurde aus dem Unterschied in der Glucosekonzentration
zwischen den mit Amyloglucosidase behandelten Proben und Kontrollproben
ohne Amyloglucosidase berechnet.
Ergebnisse
Analyse der C. glutamicum-Genom-Sequenzdaten
Die verfügbaren Sequenzen aus den rohen
C. glutamicum-Genomdaten (www.ncbi.nlm.nih.gov/PMGifs/Genomes/micr.html;
Zugangs-Nr. NC_003450) wurden auf die Anwesenheit von zu Genen,
die bekanntermaßen
am Trehalosestoffwechsel beteiligt sind, ähnlichen ORF durchsucht (in
Tabelle 3 zusammengefaßt). Für die erste
Identifizierung potentieller Kandidaten wurden die vorgeschlagenen
genomischen Bezeichnungen verwendet. Zusätzlich wurde eine BLAST-Suche
durchgeführt,
die auf den Enzymen für
die Trehalosesynthese in Mycobacterium tuberculosis, einem phylogenetisch
mit Corynebacterium-Bakterien verwandten Krankheitserreger in Menschen,
der alle drei bekannten Stoffwechselwege für die Trehalosebiosynthese
besitzt, beruhte (De Smet et al., 2000). ORFs mit großer Ähnlichkeit
zu allen 5 an den unterschiedlichen Stoffwechselwegen beteiligten
Genen wurden ebenfalls in C. glutamicum gefunden.
Die ORFs Cgl2573 und Cgl2575 wurden
mit otsA bzw. otsB bezeichnet, da sie vermutlich Polypeptide mit
einer signifikanten Ähnlichkeit
zu den Enzymen Trehalose-6-phosphat-Synthase
und Trehalose-6-phosphat-Phosphatase des OtsA-OtsB-Stoffwechselwegs
codieren. Beide Gene sind durch einen zusätzlichen ORF (Cgl2574) mit
derselben Orientierung wie otsA und otsB voneinander getrennt. Darüber hinaus
sind zwei identisch orientierte ORFs (Cgl2571, Cgl2572) stromaufwärts von
otsA vorhanden. Es konnte kürzlich
gezeigt werden, daß einer
von diesen (Cgl2571) einen Transmembran-Threoninexporter codiert (Simic et al.,
2001). Die Translationsprodukte der ORFs Cgl2572 und Cgl2574 besitzen
keine signifikante Ähnlichkeit
zu anderen Proteinen, so daß ihre
physiologische Rolle in C. glutamicum zur Zeit unbekannt ist. Jedoch
läßt ihre
enge Nachbarschaft zu den ots-Genen und ihre kolineare Orientierung
zu diesen Genen darauf schließen,
daß sie mit
otsA und otsB cotranskribiert werden und eine in Verbindung mit
otsA und otsB stehende physiologische Rolle spielen könnten. Schließlich wurde
ein entgegengesetzt orientierter ORF stromabwärts von otsB gefunden. Seine
vorhergesagte Aminosäuresequenz
zeigte große Ähnlichkeit
zur LacI-Familie von Transkriptionsregulatoren. Es ist nicht bekannt,
ob dieser ORF an der Regulation der otsA- und otsB-Gene beteiligt
ist.
Eine BLAST-Suche im C. glutamicum-Genom
mit den Sequenzen der Trehalosebiosyntheseenzyme aus M. tuberculosis
ergab zwei ORFs, Cgl2075 und Cgl2066, die signifikante Ähnlichkeiten
zu den TreY- bzw. TreZ-Enzymen, die an der Trehalosesynthese aus
Glycogen beteiligt sind, zeigten. Ihre chromosomale Anordnung in
C. glutamicum unterscheidet sich signifikant von derjenigen ähnlicher
Gene in anderen Organismen, wo beide Gene dicht zusammenliegen und
einander sogar häufig überlappen
(Maruta et al., 1996a-c; Cole et al., 1998). Obwohl die treY- und
treZ-Gene von C. glutamicum im selben Bereich des C. glutamicum-Chromosoms
lokalisiert sind, sind sie durch einen mehr als 8kb langen Abschnitt,
der sieben ORFs enthält,
voneinander getrennt. Der Vorschlag, daß eine physiologische Verbindung
zwischen den treY- und treZ-Genen und den dazwischenliegenden ORFs
bestehen soll, läßt sich
auf Basis der verfügbaren
Anmerkungen und eigenen Sequenzvergleiche nicht machen. In Sulfolobus
acidocaldarius, M. tuberculosis und Arthrobacter sp. Q36 bilden die
treY- und treZ-Gene zusammen mit einem dritten, als treX bezeichneten
Gen, von dem man annimmt, daß es
eine Glycogen-Verzweigungsfunktion bei der Trehalosebiosynthese
besitzt, ein Operon (Maruta et al., 1996c; Maruta et al., 2000;
Cole et al., 1998). Eine BLAST-Suche im C. glutamicum-Genom mit
der von Arthrobacter sp. treX abgeleiteten Sequenz ergab einen ORF
(Cgl2054) mit Ähnlichkeit
zu den Glycogen-Verzweigungsenzymen unterschiedlicher Bakterien,
der 10 kb stromaufwärts
vom trey-Gen lokalisiert ist (Daten nicht gezeigt). Die Tatsache,
daß treY,
treZ und Cgl2054 dieselbe Orientierung im C. glutamicum-Genom aufweisen und
voneinander durch nur einige kb getrennt sind, kann darauf hindeuten,
daß diese
Verteilung das Ergebnis von intragenomischen Umordnungen von ursprünglich dicht
zusammenliegenden Genen ist.
Im C. glutamicum-Genom wurde ebenfalls
ein ORF (Cgl2250) identifiziert, der in signifikanter Weise mit
den Trehalosesynthasegenen anderer Bakterien verwandt ist (Tabelle
3). Dieses Gen wurde, mit treS bezeichnet. Der unmittelbar stromabwärts von
treS (Cgl2251) liegende Start des offenen Leserasters überlappt mit
dem 3'-Ende des
treS-ORF um 4 bp. ORFs mit großer Ähnlichkeit
zu Cgl2251 wurden ebenfalls direkt stromabwärts von treS in Streptomyces
coelicolor und M. tuberculosis gefunden. In anderen Bakterien wie etwa
Ralstonia solanacearum, Pseudomonas aeruginosa und Chlorobium tepidum
sind die treS- und Cgl2251-Homologe in einem ORF fusioniert. Obwohl über die
Eigenschaften. und physiologische Rolle dieser putativen Cg12251-ähnlichen Proteine nichts bekannt
ist, deuten die Genomdaten auf eine enge funktionale Verbindung
mit Trehalosesynthase hin.
Um die Möglichkeit zu überprüfen, ob
Glycogen als Substrat für
die Trehalosebiosynthese über
den TreY-TreZ-Stoffwechselweg dient, wurde das C. glutamicum-Genom
auf putative Gene für
Enzyme, die an der Glycogensynthese beteiligt sein können, durchsucht
(Preiss & Greenberg,
1964). Es wurden zwei ORFs, Cgl1073 und Cgl1072, gefunden, deren
Translationsprodukte große Ähnlichkeit
mit den (putativen) Enzymen ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (GlgC)
und Glycogensynthase (GlgA) aufweisen (Tabelle 3). Beide ORFs liegen
unmittelbar nebeneinander, sind aber unterschiedlich orientiert,
wobei ihre Startkodons 5l by voneinander getrennt sind. Ein zusätzlicher
ORF, Cgl1071, der unmittelbar stromabwärts vom glgA-Gen liegt, weist Ähnlichkeit
mit bekannten β-Fructosidasen
und Levanasen auf. Ein weiterer ORF (Cgl0401) mit signifikanter Ähnlichkeit
zu (putativen) Glycogensynthaseenzymen wurde gefunden (Tabelle 3).
Aufgrund der genetischen Umgebung wurde jedoch Cgl1072 und nicht
Cgl0401 zur Untersuchung seiner Rolle bei der Glycogensynthese bevorzugt.
Zusammengefaßt deutet die Analyse der C.
glutamicum-Genomdaten darauf hin, daß alle drei in Bakterien beobachteten
Stoffwechselwege für
Trehalosebiosynthese vorhanden sind, und läßt somit auf ein ähnliches
Genensemble für
diesen Zweck wie in den verwandten M. Tuberculosis-Bakterien schließen. Zusätzlich lassen
die Genomdaten darauf schließen,
daß der
Stoffwechselweg für
Glycogensynthese in C. glutamicum vorhanden ist. Um die Rolle der
zahlreichen Trehalosesynthesewege für das Wachstum dieses Organismus zu
erforschen und die mögliche
Verbindung zwischen Glycogensynthese und Trehaloseproduktion in
C. glutamicum aufzuklären,
wurde eine Reihe von Experimenten entworfen.
Anreicherung freier Trehalose
durch C. glutamicum
Lysin-überproduzierende Mutanten von
C. glutamicum reichern unter Bedingungen, die den für die großtechnische
Lysinproduktion verwendeten Bedingungen ähneln, bis zu 6 g/l Trehalose
in der Kulturbrühe an.
Versuche, diese signifikante Trehaloseanreicherung mit Änderungen
der Osmolarität
des Wachstumsmediums in Verbindung zu bringen, wobei der C. glutamicum-Typstamm
verwendet und zur Erhöhung
der Osmolarität
NaCl zugegeben wurde, waren nicht erfolgreich. Wurde andererseits
anstelle von NaCl Saccharose zur Einstellung der Osmolarität des Mediums
eingesetzt, wurde ein signifikanter Langzeitanstieg der extrazellulären Trehalose
beobachtet.
Das Wachstum und die Trehaloseanreicherung
durch den C. glutamicum-Typstamm in BMC-Minimalmedium wurde bei
zwei unterschiedlichen Zuckerkonzentrationen, d.h. 0,5% (w/v) Saccharose
und 10% (w/v) Saccharose, beobachtet. Im Fall des Niedrigzuckermediums
wurde das Wachstum von C. glutamicum bei einer OD600 von
etwa 12 aufgrund der beschränkten
Menge an Substrat gestoppt. In diesem Fall ging die in der Kulturbrühe angereicherte
Trehalosemenge nicht über
0,1 g/l hinaus. Im Gegensatz dazu wurde bei Wachstum der Bakterien
mit einem Saccharoseüberschuß eine endgültige OD600 von mehr als 16 erreicht. Unter diesen Bedingungen
reicherte der Typstamm bis zu 0,9 g/l Trehalose während der
späten
logarithmischen und der stationären
Phase an. Die Beobachtung der intrazellulären Trehaloseniveaus zeigte,
daß bei
hoher Saccharosezufuhr intrazelluläre Niveaus von etwa 20 μg Trehalose
pro mg Zelltrockengewicht erreicht wurden, was etwa dem Vierfachen
des bei niedriger Saccharosezufuhr nachgewiesenen intrazellulären maximalen
Trehaloseniveaus entspricht. Sowohl unter Niedrig- als auch Hoch-Saccharose-Bedingungen
fiel die intrazelluläre Trehalosekonzentration
in Zellen in stationärer
Phase auf extrem niedrige Werte ab.
Die Tatsache, daß die extrazelluläre Trehaloseanreicherung
mit einem Zuckerüberschuß im Medium korreliert,
brachte uns, zusammen mit dem Wissen um die Anwesenheit putativer
Gene für
die Trehaloseproduktion aus Glycogen oder anderen Glucopolysacchariden
im C. glutamicum-Genom, dazu, die Anwesenheit von Glycogen als möglichem
Substrat für
die Trehaloseproduktion in den Zellen zu überprüfen. Tatsächlich konnte unter Verwendung
des von Brana et al. (1982) beschriebenen Verfahrens, das auf der
Bestimmung von Glycogen als Glucose nach Hydrolyse durch Amyloglucosidase
beruht, gezeigt werden, daß C.
glutamicum bei Zufuhr eines Überschusses
an Saccharose Glycogen produzieren kann. Unter Bedingungen eines
Saccharoseüberschusses
wurde gefunden, daß die
Glycogenanreicherung mit der Trehaloseanreicherung korreliert (3).
Inaktivierung der C. glutamicum-Trehalosebiosynthesewege
Um die Rolle der unterschiedlichen
von der Genomdatenanalyse vorgeschlagenen Stoffwechselwege in der
C. glutamicum-Trehalosebiosynthese in vivo zu bestimmen, wurden
drei Mutanten durch chromosomale Inaktivierung von wenigstens einem
Gen in jedem Stoffwechselweg konstruiert. Spezifische mobilisierbare Geninaktivierungsvektoren
wurden für
jeden der gewünschten
chromosomalen Loci konstruiert und für die Einführung von Deletionen in das
Chromosom von C. glutamicum DSM20300 über eine zweistufige, homologe rekombinationsabhängige Genaustauschstrategie,
wie in Material und Methoden beschrieben, eingesetzt. Zur Inaktivierung
des OtsA-OtsB-Stoffwechselwegs wurde ein 2,4 kb großes chromosomales
Fragment entfernt, was zur sich im Leseraster befindenden Fusion
der verkürzten
otsA- und otsB-Gene
führte.
In dieser Mutante, die als C. glutamicum ΔotsAB bezeichnet wurde, waren
mehr als 70% des otsA-Gens, der gesamte ORF Cgl2574 sowie mehr als
95% von otsB deletiert. Die Inaktivierung des TreY-TreZ-Stoffwechselwegs
wurde durch Deletion eines sich im Leseraster befindenden 645 bp
großen
Fragments des treZ-Gens erreicht. Vorhergehende Bemühungen zur
Inaktivierung des ersten Gens des Stoffwechselwegs (treY) wurden
nach vielleicht aufgrund polarer Effekte solcher Deletionen auf
das offene Leseraster von Cgl2067 mißlungenen Versuchen abgebrochen.
Der dritte vorgeschlagene Stoffwechselweg für Trehalosesynthese in C. glutamicum,
d.h. der TreS-Stoffwechselweg, in welchem Maltose als Vorstufe verwendet
wird, wurde durch Deletion eines sich im Leseraster befindenden
459 by großen
internen Fragments von treS, dem einzigen Gen, das direkt an diesem
Biosyntheseweg beteiligt ist, inaktiviert. Durch Vergleich der in-vitro-Trehalosesynthaseaktivität der intakten
und der verkürzten
Enzyme, die durch heterologe Expression in E. coli erhalten wurden,
war es in diesem Fall möglich
zu bestätigen,
daß das
verkürzte
Gen kein funktionales Trehalosesynthaseenzym mehr codieren konnte
(Daten nicht gezeigt), bevor das chromosomale treS-Gen ausgetauscht
wurde. Somit wurden drei Einzelmutanten von C. glutamicum DSM20300
erhalten und gemäß dem jeweils
für die
Inaktivierung vorgesehenen Stoffwechselweg mit ΔotsAB, ΔtreZ bzw. ΔtreS benannt.
Auf Basis der gerade beschriebenen
Einzelmutanten wurden alle möglichen
Kombinationen von Doppelmutanten (ΔotsAB/ΔtreZ, ΔotsAB/ΔtreS, ΔtreZ/ΔtreS) ebenso wie die Tripelmutante
(ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS), bei
der alle drei Trehalosesynthesewege inaktiviert sind, konstruiert.
Während
der Konstruktion der ΔotsAB/ΔtreZ- und
der ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutanten
ergaben sich Schwierigkeiten hinsichtlich der Gewinnung der die
gewünschte
Deletion tragenden Zweitschritt-(Vektorexzisions)Rekombinanten.
Anstatt etwa gleiche Anzahlen an den gewünschten Deletionsvarianten
sowie den durch Umkehr des Vektorintegrationsereignisses entstandenen
Klonen (Schäfer
et al., 1994) zu erhalten, wurde lediglich der letztere Typ von
Zweitschrittrekombinanten erhalten. Das Problem wurde nach Zugabe
von 2% (w/v) Trehalose zu dem Medium, das für die auf sacB beruhende Selektion
von das zweite Rekombinationsereignis tragenden Klonen verwendet wurde, überwunden.
Diese interessante Beobachtung war ein erster Hinweis darauf, daß diese
zwei Mutantenstämme
große
Schwierigkeiten hatten, ohne Trehalose im Medium zu wachsen.
Versuche, die ΔotsAB/ΔtreZ- und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutantenstämme jeweils
in flüssigen
Minimalmedien ohne Trehalose bei mäßigem Schütteln (etwa 150 UpM) anzuziehen,
zeigten, daß beide
Mutanten nicht dazu in der Lage waren, unter diesen Bedingungen
normal zu wachsen. Nach 2-3 Stunden Inkubation produzierten diese
Mutanten Zellaggregate, die sich schnell am Boden der Kultunöhrchen ablagerten,
was wahrscheinlich zu sauerstoff- und nährstofflimitierenden Bedingungen
führt und
damit weiteres Wachstum beeinträchtigt.
Zwar führte
verstärktes
Schütteln
der Kultur bei 210 UpM zu einer Verbesserung des Wachstums, doch
waren die Stämme,
die Mutationen sowohl im OtsA-OtsB- als auch im TreY-TreZ-Stoffwechselweg
trugen, im Vergleich zu den anderen Trehalosesynthesemutanten sowie
dem Typstamm in signifikanter Weise in ihrer Fähigkeit, in Minimalmedien zu
wachsen, beeinträchtigt.
Experimente zur Messung der intra-
und extrazellulären
Anreicherung von Trehalose durch den C. glutamicum-Typstamm und
die Mutanten wurden in Röhrchen
mit jeweils 5 ml 10% (w/v) Saccharose enthaltendem BMC-Medium durchgeführt. In
den Mutanten, die entweder die ΔotsAB-
oder die ΔtreZ-Mutation
trugen, wurde eine mehr als 50%ige Abnahme der intrazellulären Trehalosekonzentration
beobachtet, und in den beide Mutationen gleichzeitig tragenden Stämmen wurde
die vollständige
Abwesenheit intrazellulärer
Trehalose festgestellt. Ebenso zeigten die ΔotsAB-, ΔtreZ-, ΔotsAB/ΔtreS- und ΔtreZ/ΔtreS-Mutanten
im Vergleich zum Wildtypstamm eine signifikante (etwa 20 bis 50%ige)
Abnahme des Niveaus der extrazellulären Trehaloseanreicherung.
In der Doppelmutante ΔotsAB/ΔtreZ sowie
der Tripelmutante ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS wurde
keine signifikante Menge an extrazellulärer Trehalose nachgewiesen.
Im Gegensatz dazu zeigte die lediglich im TreS-Stoffwechselweg inaktivierte
Mutante nur eine geringe Abnahme bei den intrazellulären und
nahezu keine Änderung
bei den extrazellulären
Trehaloseniveaus verglichen mit dem Typstamm.
Die im Wachstum auf saccharosehaltigen
Minimalmedien beeinträchtigten
Mutanten, d.h. ΔotsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS, wurden
auf ihre Fähigkeit
hin überprüft, auf
unterschiedlichen Substraten, die bekanntermaßen von C. glutamicum genutzt
werden, zu wachsen (Tabelle 4). Zu diesem Zweck wurden die Zellen
in Röhrchen,
die jeweils 5 ml BMC-Medium, das mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen
bei einer Endkonzentration von 1 % (w/v) supplementiert war, enthielten,
angezogen. Die Kultivierung wurde bei 30°C und 150 UpM durchgeführt. In
diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, daß C. glutamicum DSM20300 nicht
auf Trehalose als einziger Quelle für Kohlenstoff und Energie wachsen
kann. Auf den meisten der getesteten Zuckersubstrate erreichte der
Wildtypstamm eine maximale optische Dichte von über 15, während die Mutantenstämme ein
in signifikanter Weise beeinträchtigtes
Wachstum zeigten. Im Gegensatz dazu war das Wachstum der Mutanten
auf Acetat oder Pyruvat nicht so stark betroffen wie das Wachstum
auf Zuckersubstraten. In mit Trehalose supplementierten Saccharosekulturen
zeigten beide Mutanten lediglich eine leichte Reduktion in ihrem
Wachstum, verglichen mit dem Wildtypstamm. Das Phänomen der
Komplementation der Mutanten durch Trehalosezugabe wurde durch die
Aufnahme von Wachstumskurven genauer untersucht.
Komplementation von ΔorsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS durch
Zugabe von Trehalose
Die Mutanten ΔotsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS waren in signifikanter
Weise hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
in BMC-Minimalmedien zu wachsen, beeinträchtigt, während bei Wachstum auf komplexen
LB-Medien sich ihre Wachstumsraten nicht signifikant von denen des
Typstamms unterschieden (nicht gezeigt). Bei der Suche nach dem
bzw. den für
das Normalwachstum der Mutanten benötigten Bestandteile bzw. Bestandteilen, die
offensichtlich in LB-Medien, jedoch nicht in Minimalmedien vorhanden
sind, wurde versucht, das BMC-Minimalmedium mit verschiedenen niedermolekularen
Komponenten, wie z.B. den Osmoprotektanten L-Prolin, Betain und
auch Trehalose, zu supplementieren. Durch Zugabe von Prolin und
Betain (20 mM) wurde das Mutantenwachstum nicht verbessert (Daten
nicht gezeigt), während
die Zugabe von jeweils 2% (w/v) Trehalose zu den BMC-Medien nahezu
die gleiche Wachstumsrate und Enddichte der Kultur ergab wie die
Wildtypkontrolle. Diese Daten zeigen, daß die gleichzeitige Inaktivierung
sowohl des OtsA-OtsB- als auch des TreY-TreZ-Stoffwechselwegs zur Trehaloseauxotrophie
von C. glutamicum führt.
Wachstum von ΔorsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS auf
Maltose
Die Tatsache, daß die Doppelmutante ΔorsAB/ΔtreZ und
die Tripelmutante ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS ein ähnliches
Wachstumsverhalten in Minimalmedien mit den meisten der getesteten
Substrate zeigten (Tabelle 4), deutet darauf hin, daß die Anwesenheit
eines intakten treS-Gens keinen signifikanten Einfluß auf das Wachstum
unter diesen Bedingungen hatte. Unter Berücksichtigung der Tatsache,
daß Trehalose
(TreS) die Trehaloseproduktion aus Maltose katalysiert, wurde der
Wachstumsphänotyp
beider Mutanten auf mit 1% (w/v) Maltose als einziger Kohlenstoffquelle
supplementiertem BMC-Minimalmedium untersucht (Tabelle 4). Während das
Wachstum der Tripelmutante ΔorsAB/ΔtreZ/ΔtreS in diesem
Medium in signifikanter Weise beeinträchtigt war, zeigte der ΔorsAB/ΔtreZ-Stamm,
in dem das treS-Gen noch intakt ist, eine mit dem Wildtypstamm vergleichbare
Wachstumsrate.
Darüber hinaus wurde die intra-
und extrazelluläre
Trehaloseanreicherung durch beide Mutanten und den Typstamm bei
Wachstum unter hohen Maltosekonzentrationen überprüft. Interessanterweise war
unter diesen Bedingungen die in der Mutante ΔotsAB/ΔtreZ gemessene intrazelluläre Trehalosekonzentration ähnlich zu
der im Typstamm gefundenen Konzentration, während die Tripelmutante ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS keine
intrazelluläre
Trehalose besaß.
Dieses Ergebnis läßt zusammen
mit den zwischen den auf Maltose gewachsenen ΔotsAB/ΔtreZ- und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutanten im Vergleich zum
Wachstum auf den anderen Substraten beobachteten Unterschieden (Tabelle
4) darauf schließen,
daß der
TreS-Stoffwechselweg nur in Gegenwart von Maltose funktionsfähig und
in der Lage ist, ausreichende Mengen an Trehalose für das Wachstum von
C. glutamicum zu liefern. Bemerkenswerterweise ergaben beide Mutanten
keine signifikante Anreicherung an extrazellulärer Trehalose, was darauf hindeutet,
daß im
Typstamm der OtsA-OtsB-Stoffwechselweg und/oder der TreY-TreZ-Stoffwechselweg für des extrazelluläre Auftreten
von Trehalose verantwortlich sind.
Plasmidkomplementation
von ΔotsAB-Mutationen
Expressionsplasmide, die das otsA-Gen
(pWLQ2::otsA) und beide ots-Gene (pWLQ2::otsAB) tragen, wurden konstruiert
und in die C. glutamicum-ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante transformiert.
Die Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von
Trehalose in 1% (w/v) saccharoseenthaltendem BMC-Medium zu wachsen, überprüft. Das
sowohl otsA als auch otsB tragende Plasmid komplementierte wirkungsvoll
den Wachstumsmangel der Mutante unter diesen Bedingungen. Diese
Beobachtung schließt
die Möglichkeit
aus, daß der Wachstumsphänotyp der
Mutante ein Ergebnis polarer Effekte ist, die durch die in das Chromosom
eingeführte Deletion
verursacht worden sein könnte,
und zeigt ebenfalls, daß der
ORF Cgl2574, der auf dem Chromosom zwischen otsA und otsB lokalisierte
ORF, der nicht auf dem Plasmid vorhanden war, für die Trehaloseproduktion und
normales Wachstum in Minimalmedien nicht essentiell ist. Die Transformation
der ΔotsAB/ΔtreZ-Doppelmutante
mit pWLQ2::otsA führte
zu einer signifikanten Verbesserung des Wachstums in 1% (w/v) Saccharose-BMC-Brühe, jedoch
nicht zur vollständigen
Komplementation des Wachstumsmangels der Mutante. Eine Erklärung dafür könnte die
in-vivo-Substitution der Funktion der Trehalosephosphat-Phosphatase
(OtsB) durch eine andere, eventuell nicht spezifische, Phosphatase
bzw. die Vermutung sein, daß die
Gegenwart von Trehalose-6-phosphat anstelle von Trehalose in der
C. glutamicum-Zelle für
eine teilweise Wiederherstellung des bakteriellen Wachstums ausreicht.
Lipidzusammensetzung der
nicht trehaloseproduzierenden Mutante C. glutamicum ΔotsAB/ΔtreZ
Wie hier gezeigt, zeigen in ihrer
Fähigkeit
zur Trehaloseproduktion beeinträchtigte
C. glutamicum-Mutanten ein in signifikanter Weise beeinträchtigtes
Wachstum auf Minimalmedien, und dieser Wachstumsmangel läßt sich
durch Zugabe von Trehalose zu den Medien komplementieren. Eine mögliche Erklärung für die Wichtigkeit
der Trehalose für
das Wachstum von C. glutamicum könnte
ihre strukturelle Rolle in der Zelle sein. Man findet Trehalose
in C. glutamicum-Zellen nicht nur in ihrer freien Form vor, sondern
auch als Mono- und Diester der Corynomycolsäuren, die eine wichtige Rolle
für die
Permeabilitätsschranke
der äußeren Zellwand in
coryneformen Bakterien spielen (Puech et al. 2001). Es konnte gezeigt
werden, daß Trehalose-Monocorynomycolat
(TMCM) und -Dicorynomycolat (TDCM) die Hauptbestandteile in der
nicht kovalent gebundenen corynomycolatenthaltenden Lipidfraktion
von C. glutamicum darstellen (Puech et al. 2000). Durch unsere Ergebnisse
wird nun gezeigt, daß die
Unfähigkeit
von C. glutamicum, Trehalose zu synthetisieren, einen signifikanten
Einfluß auf
die Zusammensetzung seiner Zellwand-Lipidfraktion hat.
Die ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante wurde in 30 ml
1% (w/v) saccharoseenthaltender BMC-Brühe
mit oder ohne Zugabe von 2% (w/v) Trehalose angezogen. Die Zellen
wurden nach 10stündigem
Wachstum geerntet und gleiche Mengen an Feuchtzellen für die Isolierung
der Zellwandlipide verwendet, wie in Material und Methoden beschrieben.
Die Lipidfraktionen der Mutantenzellen aus den mit Trehalose supplementierten
Kulturen bzw. den Kulturen ohne Trehalose wurden charakterisiert
und mit den aus dem unter denselben Bedingungen angezogenen Typstamm
isolierten Lipiden verglichen. Die Lipide wurden unter Verwendung
von Silikagel-DC-Platten, die mit einen Chloroform/Methanol/Wasser-Laufmittelsystem
entwickelt wurden, getrennt. Die nach Anthronfärbung nachgewiesenen Spots
wurden anhand des von Puech et al. (2000) beschriebenen C. glutamicum-Glycolipidprofils
identifiziert. Bei Wachstum in Abwesenheit von Trehalose fehlten
dem Mutantenstamm beide trehalosehaltigen Hauptglycolipide in seiner
Zellwand-Lipidfraktion. Die fehlenden Trehalose-Corynomycolate wurden
nicht durch andere, trehalosefreie Corynomycolate (wie z.B. Glucose-Monocorynomycolat,
GMCM, von dem gezeigt werden konnte, daß es in einer csp1-inaktivierten C.
glutamicum-Mutante angereichert wird; Puech et al., 2000) ersetzt.
In Gegenwart von Trehalose in der Kulturbrühe ist die ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante in der Lage, Trehalose-Corynomycolate
zu produzieren. Im Gegensatz zum Wildtypstamm enthält jedoch
die Trehalose-supplementierte Mutante TMCM als vorherrschendes Glycolipid,
wohingegen TDCM fehlte. Möglicherweise
führt die
im Medium vorhandene hohe Trehalosekonzentration zu einer Verschiebung
des Gleichgewichts in der TDCM-Synthesereaktion
in Richtung auf TMCM (Schimakata & Minatogawa,
2000).
Konstruktion und Charakterisierung
einer glgA-Mutante
C. glutamicum ist in der Lage, Glycogen
in Anwesenheit von überschüssiger Saccharose
im Kulturmedium anzureichern. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung
wurde ein Cluster von offenen Leserastern im C. glutamicum-Genom
gefunden (Cgl1073-Cgl1072), deren vorhergesagte Translationsprodukte
eine hochgradige Ähnlichkeit
mit Enzymen oder vorhergesagten Enzymen der Glycogenbiosynthese
aus manchen Bakterien zeigen (Tabelle 3). Es wurde entschieden,
den ORF Cgl1072, der eine putative Glucosyltransferase, von der
man annahm, daß sie
Glycogensynthase (glgA) repräsentiert,
codiert, zu unterbrechen, wobei zwei Ziele verfolgt wurden: (i)
zu untersuchen, ob der dieses Gen enthaltende Gencluster tatsächlich an
der Glycogenproduktion in C. glutamicum beteiligt ist, und (ii)
herauszufinden, ob die Glycogensynthese eine Rolle bei der Trehaloseproduktion
spielt.
Eine als glgA::Km bezeichnete Mutante
wurde erhalten, nachdem pCLiK6::glgA' in das Chromosom von C. glutamicum
stellenspezifisch integriert worden war, was zur Unterbrechung des
Cgl1072-ORF führte. Die
Mutante konnte kein Glycogen unter Saccharoseüberschußbedingungen anreichern. Zwei
zusätzliche
Mutanten wurden durch Unterbrechung des Cgl1072-ORF im Chromosom
der ΔotsAB-
und ΔorsAB/ΔtreS-Mutanten hergestellt.
Die Mutanten wurden mit ΔorsAB/glgA::Km
bzw. ΔotsAB/ΔtreS/glgA::Km
bezeichnet. Der phänotypische
Vergleich der C. glutamicum-ΔotsAB/ΔtreZ- und
-ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutanten
mit den zwei isogenen Mutanten, denen zusätzlich Glycogensynthase (GlgA)
fehlte, ergab keine Unterschiede zwischen den vier Mutantenstämmen bezüglich ihrer
Fähigkeit,
ohne Trehalose in Minimalmedien zu wachsen, und ihrer Fähigkeit,
Trehalose zu produzieren und anzureichern. Die Tatsache, daß die glgA::Km-
und ΔtreZ-Mutanten identische
Phänotypen
sowohl im ΔotsAB-
als auch im ΔotsAB/ΔtreS-Hintergrund
zeigten, stützt
in starker Weise die Überlegung,
daß TreZ
und GlgA an ein und demselben Stoffwechselweg für die Trehalosebiosynthese
beteiligt sind. Diese Ergebnisse liefern ebenfalls Beweise für die Wichtigkeit
der Trehalosesynthese aus Glycogen in C. glutamicum.
Diskussion
Genetische Analyse der
Trehalose- und Glycogenbiosynthesewege in C. glutamicum sowie ihre
Arbeitsweise unter verschiedenen Wachstumsbedingungen
Die Inaktivierung jedes der drei
Trehalosesynthesewege, deren Existenz in C. glutamicum anhand der Analyse
der verfügbaren
Genomsequenzdaten vorgeschlagen wurde, wurde mit chromosomaler Mutagenese durchgeführt, indem
Deletionen in ausgewählte
Gene der Stoffwechselwege eingeführt
wurden. Einige der Mutanten, in denen ein einziger Stoffwechselweg
ausgeschaltet worden war, zeigten eine Abnahme der Trehalosesynthese,
doch wurde in keiner von diesen ein totales Fehlen der Trehaloseproduktion
beobachtet, was darauf schließen
läßt, daß die Synthese
dieses Disaccharids in C. glutamicum nicht durch einen einzigen
Stoffwechselweg bewerkstelligt wird, sondern auf zwei oder mehr,
vermutlich in koordinierter Weise regulierten Stoffwechselwegen
beruht. Die nachfolgende Konstruktion von Doppelmutanten, in denen
nur einer der drei vorgeschlagenen Stoffwechselwege für die Trehalosesynthese
noch aktiv war, zeigte, daß entweder
der OtsA-OtsB-Stoffwechselweg oder TreY-TreZ-Stoffwechselweg allein
ausreichte, die Trehalosesynthese auf einem den Erfordernissen der
Bakterien gerecht werdenden Niveau sicherzustellen. Selbst die Trehaloseexkretion
aus den Zellen nach außen
nahm nicht dramatisch ab, solange die mutierten Bakterien einen
dieser beiden Biosynthesewege besaßen. Andererseits führte die
Inaktivierung sowohl des OtsA-OtsB- als auch des TreY-TreZ-Stoffwechselwegs
dazu, daß die
entsprechende Mutante nicht mehr in der Lage war, Trehalose zu synthetisieren
und effizient unter den meisten getesteten Bedingungen zu wachsen.
Dasselbe Ergebnis wurde mit einer Tripelmutante erhalten, in der
alle drei Trehalosesynthesewege inaktiviert waren. Somit deuten
die Stoffwechselweginaktivierungsexperimente auf die dominante Rolle
der beiden Stoffwechselwege, an denen OtsA-OtsB und TreY-TreZ beteiligt
sind, für
die in-vivo-Trehalosesynthese in C. glutamicum hin.
Es ist nicht bekannt, ob der OtsA-OtsB-Stoffwechselweg
und der TreY-TreZ-Stoffwechselweg
in Wildtypzellen gleichzeitig genutzt werden und ob, falls dem so
ist, der quantitative Beitrag der beiden Stoffwechselwege zur Trehaloseproduktion ähnlich ist.
Aus energetischer Hinsicht ist der OtsA-OtsB-Stoffwechselweg effizienter
als der TreY-TreZ-Stoffwechselweg. Die Synthese von 1 mol Trehalose
erfolgt über
den OtsA-OtsB-Stoffwechselweg
aus 1 mol Glucose-6-phosphat und 1 mol UDP-Glucose, wohingegen 1
mol der über
den TreY-TreZ-Stoffwechselweg produzierten Trehalose 2 mol ADP-Glucose
(für die
Glycogensynthese) verbraucht. Nimmt man an, daß Trehalose hauptsächlich für die Synthese
der Zellwandlipide TDCM und TMCM produziert wird und daß Trehalosephosphat
und nicht freie Trehalose als Vorstufe für diesen Zweck benötigt wird
(siehe auch unten; Shikimakata & Minatogawa,
2000), so liegt die Energiebilanz noch weiter auf der Seite des
OtsA-OtsB-Stoffwechselwegs, da phosphorylierte Trehalose zwar ein
Zwischenprodukt des OtsA-OtsB-Stoffwechselwegs, jedoch nicht des
TreY-TreZ-Stoffwechselwegs ist. Daher darf man vernünftigerweise
vermuten, daß unter
den Energie- und Substratüberschußbedingungen
der TreY-TreZ-Stoffwechselweg gegenüber dem
OtsA-OtsB-Stoffwechselweg bevorzugt sein könnte. Andererseits zeigen unsere
Ergebnisse, daß Glycogen,
das als Substrat für
den TreY-TreZ-Stoffwechselweg
dienen kann, in C. glutamicum-Zellen auch unter Bedingungen niedriger
Zuckerzufuhr vorhanden ist, obgleich nicht in denselben Mengen wie
unter Zuckerüberschußbedingungen.
Ebenso konnte beobachtet werden, daß der TreY-TreZ-Stoffwechselweg allein ausreicht,
das Wachstum von C. glutamicum nicht nur unter Zuckerüberschußbedingungen,
sondern auch unter Niedrigzuckerbedingungen (0,5% (w/v) Saccharose)
zu unterstützen
(Daten nicht gezeigt). Weitere Experimente sind notwendig, um jeweils
den individuellen Beitrag des OtsA-OtsB-Stoffwechselwegs bzw. des TreY-TreZ-Stoffwechselwegs
zur Trehalosebiosynthese in C. glutamicum-Wildtypzellen und unter unterschiedlichen
Wachstumsbedingungen zu bestimmen.
Unsere Daten deuten daraufhin, daß der TreS-Stoffwechselweg
nur eine Nebenrolle bei der Trehalosesynthese spielt. Die Analyse
der Wachstums- und Trehaloseanreicherungscharakteristiken der ΔotsAB/ΔtreZ- und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutanten zeigte,
daß dieser
Stoffwechselweg während
des Wachstums auf maltosehaltigen Medien an der Trehalosesynthese
beteiligt ist. Interessanterweise sollte angemerkt werden, daß, während der
Wildtypstamm und die ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante ähnliche
intrazelluläre
Trehaloseniveaus zeigten, die ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante
deutlich weniger extrazelluläre
Trehalose als der Wildtyp anreichert, dessen extrazelluläres Trehaloseniveau
nach Wachstum auf Maltose etwa das gleiche wie auf Saccharose war.
Zur Zeit ist nicht bekannt, ob der Wildtypstamm, der alle drei funktionalen
Trehalosebiosynthesewege enthält,
vorzugsweise den TreS-Stoffwechselweg während des Wachstums auf Maltose
nutzt. Jedoch läßt der Unterschied
in der extrazellulären
Trehaloseanreicherung zwischen dem Wildtypstamm und der den TreS-Stoffwechselweg
als einzigen Trehalosebiosyntheseweg noch besitzenden Mutante nach
Wachstum auf Maltose darauf schließen, daß im Wildtyp die beiden anderen
Stoffwechselwege eine dominante Rolle bei der Trehalosesynthese
spielen, auch bei Wachstum der Bakterien auf einem Maltoseüberschuß.
Unsere Experimente zeigen, daß der C.
glutamicum-Typstamm bei Wachstum unter Zuckerüberschußbedingungen signifikante Mengen
an Glycogen anreichert. Die Genomdaten sagen die Anwesenheit eines
Glycogensynthesewegs mit ADP-Glucose als Vorstufe in C. glutamicum
voraus, ähnlich
zu dem in anderen Bakterien beobachteten Stoffwechselweg (Preiss & Greenberg, 1965).
Unter Verwendung von chromosomaler Insertionsmutagenese konnte gezeigt
werden, daß der
ORF Cgl1072 (zusammen mit seinem Nachbarn Cgl1073) für die Glycogensynthese
in C. glutamicum verantwortlich ist. Ebenso konnte eine Verbindung
zwischen der Glycogensynthese und der Trehalosesynthese hergestellt
werden, wobei gezeigt wurde, daß otsAB-Mutanten,
bei denen gleichzeitig die Glycogensynthese beeinträchtigt war
(ΔotsAB/glgA::Km
und ΔotsAB/ΔtreS/glgA::Km),
ein identisches Wachstum und einen identischen Trehalosesynthesephänotyp zeigten
wie die otsAB-Mutanten mit einem inaktivierten TreY-TreZ-Trehalosebiosyntheseweg
(ΔotsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS). Der
Wachstumsmangel der Mutante, in der gleichzeitig die Glycogensynthese
und der OtsA-OtsB-Stoffwechselweg
blockiert waren, wurde unter den meisten Wachstumsbedingungen beobachtet, einschließlich niedriger
(1%) Saccharose, wodurch die wichtige Rolle der Trehalosebiosynthese
aus Glycogen nicht nur unter Zuckerüberschuß-Wachstumsbedingungen bestätigt wurde.
Effekt der Trehalosebiosynthese
auf die Wachstumsphysiologie sowie der Zellwand-Lipidzusammensetzung von C. glutamicum
Die Aufdeckung der Trehalosesynthesemechanismen
allein ergab keinen direkten Hinweis auf ihre physiologische Rolle
in C. glutamicum. Sowohl die ΔotsAB/ΔtreZ- als
auch die ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS-Mutante zeigten
eine starke Trehaloseabhängigkeit
ihres Wachstums auf der Mehrheit der getesteten Substrate. Dieses
Ergebnis, zusammen mit der Tatsache, daß in C. glutamicum und den
verwandten Mycobakterien (De Smet et al., 2000) während der
Evolution drei unabhängige
Stoffwechselwege für
Trehalosebiosynthese etabliert wurden, zeigt die Wichtigkeit dieses
Disaccharids für
diese Bakterien. Eine der möglichen
Rollen der Trehalose in C. glutamicum-Zellen ist ihre Wirkung als
ein kompatibler gelöster
Stoff zum Schutz der Zellen während
des osmotischen Schocks, eine Funktion, die für Trehalose in anderen Bakterien vorgeschlagen
wurde (Argüelles
et al., 2000). Diese Hypothese wird durch die Beobachtung unterstützt, daß freie
Trehalose in C. glutamicum- und Brevibacterium lactofermentum-Zellen
unter hyperosmotischen Bedingungen angereichert wird (Skjerdal et
al., 1996). Erste Experimente, die zur Analyse der intrazellulären und
extrazellulären
Anreicherung freier Trehalose als Reaktion auf Änderungen der Osmolarität der Medien.
durchgeführt
wurden, waren nicht erfolgreich, wenn NaCl zur Einstellung der Osmolarität des Mediums
verwendet wurde (eigene, unveröffentlichte
Ergebnisse). Ein signifikanter Anstieg der freien Trehaloseniveaus
wurde nur in Gegenwart hoher Zuckerkonzentrationen in den Wachstumsmedien
erhalten, ein Ergebnis, das mit der Beobachtung korreliert, daß signifikant
größere Mengen
an Trehalose durch den Typstamm angereichert wurden, wenn der hyperosmotische
Streß durch
Saccharose und nicht durch NaCl oder Glutamat induziert wurde (Skjerdal
et al., 1996). Um die Rolle der Trehalose weiter zu spezifizieren,
wurden die Mutanten ΔotsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS verwendet,
in denen die Trehalosesynthese defekt ist. Beide Mutanten waren
nicht in der Lage, in Abwesenheit von Trehalose auf den meisten
der überprüften Kohlenstoffquellen
in Minimalmedien effizient zu wachsen. Nur durch Zugabe von Trehalose,
jedoch nicht von anderen kompatiblen gelösten Stoffen wurde das Wachstum
der Mutanten wiederhergestellt. Alle diese Ergebnisse sprechen gegen
die Möglichkeit, daß Trehalose
als ein kompatibler gelöster
Stoff als Reaktion auf Änderungen
der Osmolarität
in C. glutamicum synthetisiert und angereichert wird. Es konnte
gezeigt werden, daß sowohl
die intrazelluläre
als auch die extrazelluläre
Trehaloseanreicherung mit einem Überschuß der Kohlenstoffquelle
in den Medien verbunden ist und in der späten logarithmischen und stationären Phase
beobachtet wurde. Alle diese Voraussetzungen für die Trehalosesynthese erinnern
an Bedingungen, von denen man weiß, daß sie die Anreicherung von
Kohlenstoff- und Energiespeicherverbindungen, wie z.B. Glycogen,
in anderen Bakterien begünstigen.
Die Möglichkeit,
daß Trehalose
selbst als eine Reserveverbindung in C. glutamicum gespeichert wird,
wie es in einigen höheren
Organismen beobachtet wird, ist unwahrscheinlich, da das intrazelluläre Trehaloseniveau
in Zellen in der stationären
Phase extrem niedrig ist. Die Möglichkeit,
daß es
sich bei der Trehaloseanreicherung nur um ein direktes Ergebnis
des Glycogenanstiegs in den corynebakteriellen Zellen handelt, stimmt
nicht mit der Tatsache überein,
daß in
ihrer Fähigkeit
zur Synthese von Trehalose aus Glycogen beeinträchtigte Mutanten (ΔtreZ, ΔtreZ/ΔtreS) immer
noch signifikante Mengen an Trehalose sowohl intrazellulär als auch
extrazellulär anreichern.
Die C. glutamicum-Mutanten ΔotsAB/ΔtreZ und ΔotsAB/ΔtreZ/ΔtreS sind
unter einer Vielfalt von Bedingungen nicht in der Lage, normal zu
wachsen, wobei das Wachstum nur durch die Zugabe von Trehalose wiederhergestellt
wird. Die Tendenz dieser Mutanten, große Zellaggregate zu bilden,
deutet darauf hin, daß ihre
Wachstumsprobleme mit ihrer Zelloberfläche oder einem Defekt in einer
späten
Phase der Zellteilung zusammenhängen
könnte.
Das läßt vermuten,
daß Trehalose
eine wichtige strukturelle Rolle in den C. glutamicum-Zellen spielt.
Sowohl in Mycobakterien als auch Corynebakterien sowie einigen anderen
nahe verwandten Gattungen konnte gezeigt werden, daß Trehalose
in Form von Corynomycolsäureestern
an einer zweiten Permeabilitätsschranke
außerhalb
der Cytoplasmamembran beteiligt ist (Puech et al. 2001, Sathyamoorthy & Takayama, 1987).
Die Charakterisierung der C. glutamicum-Glycolipidfraktion einer ΔotsAB/ΔtreZ-Mutante zeigt,
daß eine
auffallende Folge der Unfähigkeit,
Trehalose zu synthetisieren, die Abwesenheit von trehalosehaltigem
TMCM und TDCM ist, von denen angenommen wird, daß sie wichtige Bestandteile
der äußeren Lipiddoppelschicht
in C. glutamicum darstellen. Die Wachstumsprobleme der Trehalosemangel-Mutanten könnten mit
ihrer Unfähigkeit,
eine solche Zellwand-Lipidschicht zu bilden, zusammenhängen. Es
konnte gezeigt werden, daß Trehalose
nicht nur bei der Endstufe des Corynomycolsäureesterstoffwechsels essentiell ist,
sondern auch, wie Trehalosephosphat, eine Schlüsselrolle bei dem gesamten
Prozeß der
Corynomycolsäuresynthese
in C. matruchotii (Shimakata & Minatogawa,
2000) spielt, d.h. es wurde vorgeschlagen, daß Trehalose-6-phosphat als
Akzeptor für
die frisch synthetisierte Corynomycolsäure dient. Der entstandene TMCM
ist dann eine gemeinsame Vorstufe für die Synthese aller veresterten
Corynomycolate der Zellwand, TDCM, und freier Corynomycolsäure (Shimakata & Minatogawa, 2000;
Puech et al., 2000). Somit könnte,
ausgehend von diesem Vorschlag von Shikimakata und Minatogawa (2000)
zur Mycolatbiosynthese, die Unfähigkeit
einiger der hier konstruierten C. glutamicum-Mutanten, Trehalose
bzw. Trehalose-6-phosphat zu synthetisieren, nicht nur zur Abwesenheit
beider trehalosehaltiger Glycolipide, sondern auch aller anderen
Corynomycolsäureester
führen.
Der gerade beschriebene Mechanismus, in dem Trehalose als Träger für die Corynomycolsäure eingesetzt
und danach (teilweise) außerhalb
der Zellen freigesetzt wird, könnte
eine Erklärung
für die Anwesenheit
extrazellulärer
Trehalose liefern.
Interessanterweise sollte angemerkt
werden, daß die
C. glutamicum-Trehalosemangel-Mutanten auf einigen Substraten, wie
z.B. Acetat und Pyruvat, relativ normal wachsen konnten, wobei ähnliche
Kulturenddichten wie beim Wildtypstamm erreicht wurden, was in Gegensatz
zu dem stark beeinträchtigten
Wachstum auf Zuckersubstraten steht. Dieses Phänomen läßt sich mit unterschiedlichen
Auswirkungen, die eine veränderte
Zellwand-Lipiddoppelschicht auf die Aufnahme von unterschiedlichen
Substraten haben könnte,
erklären.
Interessanterweise wurde im Fall von Acetat berichtet, daß eine 50%ige
Abnahme der Zellwand-gebundenen Corynomycolate die Acetataufnahme
erleichtert (Puech et al., 2000).
Wichtig erscheint hier, daß die hier
ausgeführten
Ergebnisse der genetischen und physiologischen Analyse der Trehalosebiosynthese
in C. glutamicum von allgemeiner Bedeutung für die gesamte phylogenetische
Gruppe der mycolsäurehaltigen
coryneformen Bakterien, die eine Anzahl unterschiedlicher Gattungen, einschließlich medizinisch
und biotechnologisch wichtiger Spezies, enthält, sind (siehe Liebl, 2001).
Zusätzliche
Transkriptions- und Enzymaktivitätsuntersuchungen
sind erforderlich, um die Regulation der Trehalosesynthesewege aufzuklären. Von
den Untersuchungen zur Regulation wird erwartet, daß sie weitere
Informationen über
die physiologische Rolle der in C. glutamicum während des Wachstums unter Zuckerüberschußbedingungen
angereicherten freien extrazellulären und intrazellulären Trehalose
ergeben.
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Sathyamoorthy, N. & Takayama, K.
(1987) Purification and characterization of a novel mycolic acid
exchange enzyme from Mycobacterium smegmatis. J Biol Chem 262, 13417-23. Tabelle
1. Liste der verwendeten C. glutamicum-Stämme.
Tabelle 2. PCR-Primer. Die Bereiche,
die zu den ursprünglichen
Gensequenzen nicht homolog sind, sind kursiv dargestellt, und die
Bereiche, die nur in der ursprüngichen
Sequenz, jedoch nicht im Primer vorhanden sind, stehen in Klammern.
Die zu Klonierungszwecken verwendeten Restriktionsstellen sind unterstrichen.
Tabelle 3. Ähnlichkeit der vorhergesagten
C. glutamicum-Enzyme mit den bekannten Enzymen oder Enzymen, bei
denen eine Beteiligung an einer Trehalosebiosynthese vorhergesagt
wird. Es wurde eine Datenbanksuche mit einem auf BLAST beruhenden
Vergleichsprogramm durchgeführt,
das on-line auf dem National Center for Biotechnology Information-Server
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) zur Verfügung steht, wobei PBLAST, die
BLOSUM62-Matrix mit einem EXPECT-Wert von 10 sowie der Niederkomplexitätsfilter
verwendet wurden.
Tabelle 4. Vergleich des Wachstums
der Doppelmutante ΔotsAB/ΔtreZ und
der Tripelmutante ΔorsAB/ΔtreZ/ΔtreS mit
dem Typstamm. Die Stämme
wurden bei 30°C,
150 UpM, in Röhrchen
mit 5 ml BMC-Brühe,
die mit unterschiedlichen Substraten, wie angegeben, mit einer Endkonzentration
von 1% (w/v) (falls nicht anders angegeben) supplementiert war,
angezogen.
