KR20190026851A - 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 발효적 생산을 위한 방법 - Google Patents

당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (pts)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 발효적 생산을 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효적 공정에서의 탄소의 공급원의 전환에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 신규한 방법이며, 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하고, 여기서 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 단백질의 발현은 하향-조절된 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용되는 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.

Description

당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)을 코딩하는 유전자를 포함하는 미생물에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 발효적 생산을 위한 방법
본 발명은 발효적 공정에서의 탄소의 공급원의 전환에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 신규한 방법으로서, 상기 관심 분자의 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하고, 여기서 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 단백질의 발현은 하향-조절된 것인 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 사용되는 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.
박테리아에서, 외부 탄수화물 (당)은 세포 내로 수송되고 포스포엔올피루베이트: 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 의해 인산화된다. 포스포엔올피루베이트 (PEP)는 중추 대사의 중대한 분자이다. 많은 미생물에서, 성장을 지원하는 탄수화물은 탄수화물의 분자당 PEP의 1개 분자를 소비하는 PTS에 의해 흡수되고 동시에 인산화된다 (Postma & Roseman 1976). PTS는 2종의 세포질 단백질, 효소 I (EI) 및 HPr, 및 가변적 개수의 흡수될 탄수화물에 특이적인 막 단백질 복합체 (효소 II, EII)로 구성된다. 모두 함께, 이들 EI, HPr 및 EII 단백질은 PEP 및 탄수화물 사이의 포스포릴 전달 사슬로서 작용하며, 상기 탄수화물은 세포 막을 횡단할 때 인산화된다:
EI + PEP ⇒ EI-P + 피루베이트
EI-P + Hpr ⇒ Hpr-P + EI
Hpr-P + EII ⇒ EII-P + Hpr
EII-P + 탄수화물 (외부) ⇒ 탄수화물-P (내부) + EII
PTS에 대한 포스페이트 공여자로서의 그의 역할 이외에도, PEP는 또한 피루베이트 키나제 효소를 통해 피루베이트를 생성하는 당분해의 최종 단계에 참여한다 (Kornberg & Malcovati 1973):
PEP + ADP ⇒ 피루베이트 + ATP
게다가, PEP는, PEP 카르복실라제 효소에 의해 촉매된, 옥살로아세테이트를 생성하는 보충 대사 반응을 통해 당분해 및 시트르산 사이클을 연결한다 (Canovas & Kornberg 1965):
PEP + HCO3- ⇒ 옥살로아세테이트 + Pi
PEP는 또한, 코리스메이트 경로를 통한, 방향족 아미노산, 퀴논 및 C1 대사물의 전구체이다 (Pittard & Wallace 1966):
2 PEP + 에리트로스-4-포스페이트 + ATP + NAD(P)+ ⇒ 코리스메이트 + 4 Pi + ADP + NAD(P)H + H+
여러 연구 그룹은 목적하는 산물의 생산 및 수율을 증진시키기 위해 PEP의 생체이용률을 증가시키기 위한 전략을 개발하여 왔다: PTS 및/또는 피루베이트 키나제 효소의 불활성화 (Gosset et al. 1996, Meza et al. 2012), 총괄적 조절제 CsrA의 불활성화 (Tatarko & Romeo 2001), 글루코스신생 효소 PEP 카르복시키나제의 과다발현 (Kim et al. 2004) 또는 PEP 신타제의 과다발현 (Patnaik et al. 1992).
효소 PEP 신타제 (PPS, EC 2.7.9.2)는 ATP의 AMP로의 가수분해로 피루베이트의 PEP로의 인산화를 촉매한다 (Cooper & Kornberg, 1965):
피루베이트 + ATP + H2O ⇒ PEP + AMP + Pi
많은 미생물에서, PPS는 DUF299 패밀리에 속하는 PPS 조절 단백질 (PRPP)에 의해 매개되는 인산화/탈인산화 메카니즘에 의해 조절된다 (Burnell, 2010).
버넬(Burnell)의 연구의 목적은 단백질 DUF299 및 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 구조 및 기능을 특징규명하는 것이다. 그러나, 이러한 논문은 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 증가시키는 것과 같은 특정한 효과를 수득하기 위해 이러한 단백질의 발현을 조절할 가능성을 시사하고 있지 않다.
본 출원인은 놀랍게도, PPS 발현을 조절하는 단백질의 발현의 불활성화가, 통상적으로 미생물에서 발효 공정에 의해 생산되는 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산이 증가되도록 한다는 것을 밝혀내었다.
본 발명자들의 발견은, 이것이 특허 출원 WO2004033471에 시사된 바와 같은 대사 산물의 생산을 증가시키기 위해 알려진 다른 선행 기술 방법의 수많은 결점이 극복되도록 하므로 유리하다.
실제로, 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 증가시키기 위해, 여러 유전적 변형을 수행함으로써 생산자 미생물에서 탄소 공급원 흡수를 개선시키는 것이 종종 필요하다. 그러나, 탄소 공급원 흡수 및 보다 특히 탄수화물 유입에 수반되는 유전자는 조절의 복잡한 시스템에 관여된다 (Gabor et al., 2011; Kotrba et al., 2001). 따라서, 이러한 유전적 변형은 예측불가능한 결과로 이어지고, 수득된 균주는 불안정할 수 있다. 더욱이, 이들 방법은 고비용이다.
결과적으로, 안정한 미생물 균주를 사용하여 저비용으로 관심 분자를 생산하는 것을 가능하게 하는 신규한 방법을 제공할 필요가 있다.
본 발명에 따르면, 단지 PPS 조절 단백질 (PRPP)을 불활성화시킴으로써 목적하는 산물의 생산을 증가시키는 것이 가능하다.
제1 측면과 관련하여, 본 발명은 따라서 하기 단계를 포함하는, 발효적 공정에서의 탄소의 공급원의 전환에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 방법이며:
- 탄소의 공급원으로서 탄수화물을 포함하는 적절한 배양 배지에서 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계; 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태를 회수하는 단계,
여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하고,
여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물에서, 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 발현은 감소된 것인
방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 사용되는 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자 및 PPS의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 감소된 발현을 갖는 것과 같은 특정한 특징을 갖는다. 이러한 미생물은, 탄수화물 흡수의 전체 캐스케이드의 기능성에는 영향을 미치지 않으면서 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현에는 영향을 미치는 유전적으로 변형된 미생물을 수득하는 것이 명백하지 않았으므로 특이적이고 놀라운 것으로 간주될 수 있다.
제2 측면과 관련하여, 본 발명은 따라서 탄소의 공급원으로서의 탄수화물로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 증진된 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물로서, 여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자 및 PPS의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 감소된 발현을 포함하는 것인 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.
본 발명을 상세하게 기재하기 전에, 본 발명이 특별히 예시된 방법에 제한되지 않으며, 물론, 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정한 실시양태를 기재할 목적일 뿐이지 제한할 의도는 아니며, 이는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것으로 또한 이해되어야 한다.
본원에 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은, 상기한 것이든 하기한 것이든, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러나, 본원에 언급된 공개물은 공개물에 보고되고, 본 발명과 연계하여 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기재 및 개시하기 위한 목적으로 인용된다.
게다가, 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내의 통상적인 미생물학 및 분자 생물학 기술을 이용한다. 이러한 기술은 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고, 문헌에 충분히 설명되어 있다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "미생물"이라고 언급하는 것은 복수의 이러한 미생물을 포함하고, "효소"라고 언급하는 것은 하나 이상의 효소를 언급하는 것 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 임의의 물질 및 방법이 본 발명을 실시하거나 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 이제 기재된다.
본원에 사용된 바와 같은 하기 용어들은 청구범위 및 명세서를 해석하는데 사용될 수 있다.
하기 청구범위에서 및 상기 본 발명의 설명에서, 문맥상 명료한 표현 또는 필요한 암시로 인해 달리 요구하는 경우를 제외하고는, 단어 "포함하다" 또는 변형 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 포괄적 의미로, 즉, 본 발명의 다양한 실시양태에서 추가의 특색의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니라 언급된 특색의 존재를 명시하는데 사용된다.
본 발명의 명세서에서, 유전자 및 단백질은 이. 콜라이(E. coli) 내의 상응하는 유전자의 명칭을 사용하여 식별된다. 그러나, 그리고 달리 명시하지 않는 한, 이들 명칭의 사용은 본 발명에 따른 보다 일반적인 의미를 갖고, 다른 유기체, 보다 특히 미생물 내의 모든 상응하는 유전자 및 단백질을 포괄한다.
PFAM (protein families database of alignments and hidden Markov models: 정렬 및 히든 마르코프 모델의 단백질 패밀리 데이터베이스)은 단백질 서열 정렬의 대규모 컬렉션을 나타낸다. 각각의 PFAM은 다중 정렬을 가시화하고, 단백질 도메인을 확인하고, 유기체간 분포를 평가하고, 다른 데이터베이스에 대한 접근을 획득하고, 알려진 단백질 구조를 가시화하는 것이 가능하다.
COG (clusters of orthologous groups of proteins: 단백질의 오르토로거스 그룹의 클러스터)는 38개의 주요 계통발생학적 계통을 나타내는 66개의 완전히 서열분석된 게놈으로부터의 단백질 서열을 비교함으로써 수득된다. 각각의 COG는 적어도 3개의 계통으로부터 정의되며, 이는 이전에 보존된 도메인의 식별을 허용한다.
상동 서열 및 그의 퍼센트 상동성을 식별하는 수단은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고, 특히, BLAST 프로그램을 포함한다 (Altschul et al., 1990). 이어서, 수득된 서열은, 예를 들어, 프로그램 CLUSTALW 또는 MULTALIN을 사용하여 활용될 (예를 들어, 정렬될) 수 있다.
알려진 유전자에 대한 진뱅크(GenBank) 상에 주어진 기준을 사용하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유동물, 식물 등에서 등가의 유전자를 결정할 수 있다. 이러한 상용 작업은 다른 미생물로부터 유래되는 유전자와 함께 서열을 정렬을 수행하고, 또 다른 유기체에서 상응하는 유전자를 클로닝하기 위한 축중성 프로브를 디자인함으로서 결정될 수 있는 컨센서스 서열을 사용하여 유리하게 수행된다. 분자 생물학의 이들 상용 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (2001)]에서 청구된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함하는, 발효적 공정에서의 탄소의 공급원의 전환에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 가능하게 하며:
- 탄소의 공급원으로서 탄수화물을 포함하는 적절한 배양 배지에서 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계 및
- 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태를 회수하는 단계,
상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자, 및 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 감소된 발현을 포함한다.
용어 "발효적 공정", "발효", 또는 "배양"은 본원에서 미생물의 성장을 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다. 발효는 일반적으로, 적어도 1종의 단순 탄소 공급원, 및 필요한 경우에 대사물의 생산에 필요한 공동-기질을 함유하는, 사용되는 미생물에 대해 적합화된 기지의, 정의된 조성의 무기 배양 배지를 갖는 발효기에서 수행된다. 특히, 이. 콜라이에 대한 무기 배양 배지는 M9 배지 (Anderson, 1946), M63 배지 (Miller, 1992) 또는 문헌 [Schaefer et al., (1999)]에 의해 정의된 바와 같은 배지와 동일하거나 또는 유사한 조성의 것일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "발효적 전환"이란, 탄소 공급원의 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태로의 전환이, 미생물이 적절한 발효 조건 하에 배양될 때 발생한다는 것을 의미한다.
"배양 배지"는 본원에서 미생물의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 또는 유익한 영양소 예컨대 탄소 공급원 또는 탄소 기질; 질소 공급원, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄; 인 공급원, 예를 들어 인산일칼륨 또는 인산이칼륨; 미량 원소 (예를 들어, 금속 염) 예를 들어 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망가니즈 염; 뿐만 아니라 성장 인자 예컨대 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지 (예를 들어, 멸균, 액체 배지)를 의미한다.
본 발명에 따른 용어 "탄소의 공급원", "탄소 공급원", 또는 "탄소 기질"은 미생물이 대사할 수 있고 적어도 1개의 탄소 원자를 함유하는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 바람직한 탄소 공급원의 예는, 비제한적으로, 탄수화물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 탄소 공급원은 재생가능한 공급-스톡으로부터 유래된다. 재생가능한 공급-스톡은 단기 지연 내에서 및 목적하는 산물로의 그의 형질전환을 허용하기에 충분한 양으로 재생될 수 있는 특정 산업 공정에 요구되는 원료로서 정의된다. 전처리되거나 또는 그렇지 않은 식물의 바이오매스는 특히 바람직한 재생가능한 탄소 공급원이다.
용어 "탄수화물"은 본원에서 미생물에 의해 대사될 수 있고 적어도 1개의 탄소 원자, 2개의 수소 원자 및 1개의 산소 원자를 함유하는 임의의 탄소 공급원을 지칭한다. 본 발명의 탄수화물은 바람직하게는 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 만노스, 키토비오스, 셀로비오스, 트레할로스, 갈락티톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락토사민, N-아세틸-D-갈락토사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸뮤람산, 락토스, 갈락토스, 소르보스, 말토스, N,N'-디아세틸키토비오스, 아스코르베이트, β-글루코시드로부터 선택된다. 본 발명의 보다 바람직한 실시양태에서, 탄소의 공급원은 글루코스, 프룩토스, 만노스, 셀로비오스, 수크로스, 및 그의 임의의 조합으로부터 선택된다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 방법에서 미생물을 성장시키는데 필요한 배양 조건을 용이하게 결정할 수 있다. 특히, 박테리아가 20℃ 내지 55℃, 우선적으로 25℃ 내지 40℃로 구성된 온도에서 발효될 수 있는 것으로 널리 알려져 있다. 이. 콜라이는 보다 특히 약 30℃ 내지 약 37℃로 구성된 온도에서 배양될 수 있다.
이러한 배양 공정은 회분식 공정으로, 유가식 공정으로 또는 연속식 공정으로, 및 호기성, 마이크로-호기성 또는 혐기성 조건 하에 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 특정한 실시양태에 따르면, PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자는 유전적으로 변형된 미생물에 대해 이종 (재조합 미생물) 또는 천연 (야생형 미생물)이다.
"유전자"란, 본원에서 특정한 단백질 (즉 폴리펩티드)을 코딩하거나, 또는 특정한 경우에, 기능적 또는 구조적 RNA 분자를 코딩하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 본원에서 지칭된 유전자는 단백질, 예컨대 효소, 유출 시스템 또는 흡수 수송체를 코딩한다. 본 발명에 따른 유전자는 내인성 유전자 또는 외인성 유전자이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전적으로 변형된 미생물"은 천연에서 발견되지 않는 박테리아, 효모 또는 진균을 지칭하고, 천연에서 발견되는 그의 등가물과는 유전적으로 상이하다. 본 발명에 따르면, 용어 "변형"은 미생물에 도입되거나 또는 그에서 유도된 임의의 유전적 변화를 나타낸다. 미생물은 신규한 유전적 요소의 도입, 내인성 또는 외인성 유전자의 발현의 증가 또는 감쇠 또는 내인성 유전적 요소의 결실을 통해 변형될 수 있다. 추가로, 미생물은 특정한 선택압 하에 지정 돌연변이유발 및 진화를 조합함으로써 신규한 대사 경로의 발생 및 진화를 강제함으로써 변형될 수 있다 (예를 들어, WO 2004076659 참조).
본 발명의 맥락에서, 용어 "외인성 유전자" (또는 대안적으로, "이종 유전자" 또는 "트랜스진")는 미생물에서 천연적으로 발생하지 않은 유전자를 지칭한다. 이는 인공적이거나 또는 이는 또 다른 미생물로부터 기원할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 관심 단백질을 코딩하는 외인성 유전자가 특정한 미생물에서 발현되어야 하는 경우에, 이러한 유전자의 합성 버전이 바람직하게는 비-바람직한 코돈 또는 덜 바람직한 코돈을 동일한 아미노산을 코딩하는 상기 미생물의 바람직한 코돈으로 대체함으로써 구축된다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 실제로 코돈 용법이 미생물 종 사이에 달라지며, 이는 관심 단백질의 재조합 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 것으로 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 이러한 이슈를 극복하기 위해, 코돈 최적화 방법이 개발되어 있고, 광범위하게 문헌 [Graf et al. (2000), Deml et al. (2001) 또는 Davis & Olsen (2011)]에 기재되어 있다. 코돈 최적화 결정을 위한 여러 소프트웨어 예컨대 진옵티마이저(GeneOptimizer)® 소프트웨어 (라이프테크놀로지스(Lifetechnologies)) 또는 옵티멈진(OptimumGene)™ 소프트웨어 (진스크립트(GenScript))가 개발되어 있다. 다시 말해서, 관심 단백질을 코딩하는 외인성 유전자는 바람직하게는 특정한 미생물에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에 따르면, 유전적으로 변형된 미생물은 발현이 감쇠 또는 결실된 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질을 코딩하는 천연 유전자를 포함한다. 다시 말해서, 상기 유전적으로 변형된 미생물에서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질을 코딩하는 천연 유전자의 발현은 비변형된 미생물과 비교하여 감쇠 또는 결실된다. 바람직하게는 본 발명의 미생물에서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질을 코딩하는 천연 유전자는 결실된다.
"천연 유전자" 또는 "내인성 유전자"란 본원에서 상기 유전자가 미생물에 천연적으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 미생물이 1종 이상의 내인성 유전자의 발현 수준을 "조정하도록" 유전적으로 변형되는 경우에, 본원에서 상기 유전자의 발현 수준이 그의 천연 발현 수준과 비교하여 상향-조절, 하향조절 (즉 감쇠), 또는 심지어 완전히 무효화된다는 것을 의미한다. 이러한 조정은 따라서 이론적으로 유전자 산물의 활성의 증진, 또는 대안적으로, 내인성 유전자 산물의 더 낮은 또는 무효 활성을 야기한다.
내인성 유전자 활성 및/또는 발현 수준은 또한 돌연변이를 그의 코딩 서열 내로 도입하여 유전자 산물을 변형함으로써 변형될 수 있다. 내인성 유전자의 결실은 또한 미생물 내에서 그의 발현을 전적으로 억제하기 위해 수행될 수 있다. 내인성 유전자의 발현을 조정하는 또 다른 방식은 이러한 유전자의 발현 수준을 상향- 또는 하향-조절하기 위해 더 강한 또는 더 약한 프로모터로 그의 프로모터 (즉 야생형 프로모터)를 교환하는 것이다. 이러한 목적에 적합한 프로모터는 동종 또는 이종일 수 있고 관련 기술분야에 널리 알려져 있다. 내인성 유전자의 발현을 조정하기 위한 적절한 프로모터를 선택하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 미생물은 기능적 PTS 당 시스템을 발현하는 미생물로부터 선택된다. 우선적으로, 미생물은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae), 데이노코카세아에(Deinococcaceae), 니트로소모나다세아에(Nitrosomonadaceae), 비브리오나세아에(Vibrionaceae), 슈도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 사카로미세타세아에(Saccharomycetaceae) 및 효모를 포함하는 군으로부터 선택된다. 보다 우선적으로, 미생물은 시트로박터(Citrobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 판토에아(Pantoea), 클레브시엘라(Klebsiella), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 포토랍두스(Photorhabdus), 포토박테리움(Photobacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella) 및 예르시니아(Yersinia)의 종이다. 보다 더 우선적으로, 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 옥시토카(Klebisella oxytoca), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 데이노코쿠스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 써모아나에로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 및 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 선택된다.
특히, 실시예는 변형된 이. 콜라이 균주를 제시하지만, 이들 변형은 동일한 과의 다른 미생물에서도 용이하게 수행될 수 있다.
이. 콜라이는 그람-음성이고, 막대-형상이며, 포자를 형성하지 않고, 전형적으로 1-5 μm 길이인 구성원을 포함하는 엔테로박테리아세아 과에 속한다. 대부분의 구성원은 이동하는데 편모를 사용하지만, 몇몇 속은 비-이동성이다. 이러한 과의 많은 구성원은 인간 및 다른 동물의 장에서 발견되는 장 균총의 정상적인 부분이지만, 다른 것은 물 또는 토양에서 발견되거나, 또는 다양한 상이한 동물 및 식물의 기생충이다. 이. 콜라이는 가장 중요한 모델 유기체 중 하나이지만, 엔테로박테리아세아에 과의 다른 중요한 구성원은 클레브시엘라, 특히 클레브시엘라 뉴모니아에, 및 살모넬라를 포함한다.
본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에 따르면, 서열식별번호: 2의 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF299 단백질을 코딩하는 서열식별번호: 1의 유전자 ppsR은 결실된다 (이는 "ΔppsR"로서 지칭될 수 있음).
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결실된"은 유전자의 발현의 완전 저해를 지칭한다. 발현의 이러한 저해는 유전자의 발현의 억제, 유전자 발현에 필요한 프로모터 영역의 전부 또는 부분의 결실, 또는 유전자의 코딩 영역에서의 결실일 수 있다. 결실된 유전자는 본 발명에 따른 균주의 식별, 단리 및 정제를 용이하게 하는 선택 마커 유전자에 의해 대체될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 저해는 상동 재조합의 기술에 의해 달성될 수 있다 (Datsenko & Wanner, 2000).
또 다른 실시양태에서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF299 단백질을 코딩하는 유전자 ppsR은 감쇠될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "감쇠된"은 유전자의 발현의 부분적 저해를 지칭한다. 이러한 발현의 감쇠는 야생형 프로모터의 더 약한 천연 또는 합성 프로모터로의 교환 또는 안티센스 RNA 또는 간섭 RNA (iRNA), 및 보다 특히 소형 간섭 RNA (siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNAS (shRNA)를 포함한, ppsR 유전자 발현을 감소시키는 작용제의 사용일 수 있다. 예를 들어, 프로모터 교환은 상동 재조합의 기술에 의해 달성될 수 있다 (Datsenko & Wanner, 2000).
단백질, 및 특히 상기 단백질의 발현 또는 기능의 억제에 적합한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다른 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태를 다량으로 생산하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산이 증가되도록 한다.
보다 특히, 본 발명의 방법은 메티오닌 또는 그의 유도체의 생산을 개선시키는 것을 가능하게 한다.
용어 "개선된 메티오닌 생산"은 그의 모체 균주, 즉 ppsR 유전자의 결실 또는 감쇠 이전의 미생물과 비교하여 메티오닌의 증가된 생산성 및/또는 메티오닌의 증가된 역가 및/또는 증가된 메티오닌/탄소 공급원 수율 및/또는 메티오닌의 증가된 순도를 지칭한다. 배양 브로쓰에서의 미생물에 의한 메티오닌의 생산은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 알려진 표준 분석 수단에 의해 및 특히 HPLC로 명료하게 기록될 수 있다. 메티오닌 생산을 증가시키는 일부 유전적으로 변형된 미생물은 메티오닌을 생산하는 이. 콜라이 균주의 예에 대해 특허 출원 WO2016034536, WO2014029592 및 WO2012091479에 및 메티오닌을 생산하는 코리네박테리움 균주의 예에 대해 특허 출원 WO2008080900 및 WO2012098042에 개시되어 있다. 이들 개시내용 모두는 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 메티오닌을 생산하는 미생물은 에스케리키아 콜라이 균주이고 적어도 하기를 포함한다:
- 서열식별번호: 3의 유전자 metA 또는 특허 출원 WO2005108561, US2010041108 또는 WO2008127240에 개시된 바와 같은 메티오닌 또는 그의 유도체에 대한 감소된 피드백 억제를 갖는 효소를 코딩하는 돌연변이체 유전자, 서열식별번호: 5의 유전자 metH, 서열식별번호: 7-9-11-13-15의 유전자 cysPUWAM, 서열식별번호: 17-19-21의 유전자 cysJIH, 서열식별번호: 23-25-27의 유전자 gcvTHP, 서열식별번호: 29의 유전자 metF, 서열식별번호: 31의 유전자 serA, 서열식별번호: 33의 유전자 serB, 서열식별번호: 35의 유전자 serC, 서열식별번호: 37의 유전자 cysE, 서열식별번호: 39의 유전자 thrA 또는 특허 출원 WO2005111202에 기재된 바와 같은 트레오닌에 대한 감소된 피드백 감수성을 갖는 효소를 코딩하는 돌연변이체 유전자, 서열식별번호: 41의 유전자 ptsG, 서열식별번호: 43 및 45의 유전자 ygaZH 또는 특허 출원 WO2016034536에 개시된 그의 상동 유전자 및 서열식별번호: 47의 유전자 pyc로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자의 발현은 증진됨, 및
- 서열식별번호: 49의 metJ, 서열식별번호: 51의 pykA, 서열식별번호: 53의 pykF, 서열식별번호: 55의 purU, 서열식별번호: 57의 metE, 서열식별번호: 59의 dgsA 및 서열식별번호: 61의 yncA로부터 선택되는 유전자 중 적어도 1종의 발현은 감쇠됨.
표 1: 본 발명에 따른 효소 및 유전자 (n/a: 이용가능하지 않음)
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 논의된 바와 같이, 당은 박테리아 세포 내로 수송되고 포스포엔올피루베이트: 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)에 의해 인산화된다. 인산화된 당 및 특히, 인산화된 글루코스는 고농도에서 세포에 독성이고 결과로서 PTS 시스템은 고도로 조절된다. 이는, 시스템이 복잡하다는 사실과 함께, 시스템의 조작을 매우 어렵게 만든다. 그러나, 하기 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 PPS 발현을 조절하는 적어도 1종의 단백질이 결여되지만 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 미생물을 생산해내었다.
제2 측면에서, 본 발명은 따라서 탄소의 공급원으로서의 탄수화물로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 증진된 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물로서, 상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자, 및 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 감소된 발현을 포함하는 것인 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다.
이러한 유전적으로 변형된 미생물은 본 발명의 방법에 사용된 것들과 동일한 유전적 특징을 갖는다. 특히, 이러한 미생물에서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF229를 코딩하는 유전자 ppsR은 결실 또는 감쇠된다. 보다 우선적으로 유전자 ppsR은 본 발명의 미생물에서 결실된다.
결과적으로, 이는 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 발효적 방법에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 미생물은 메티오닌의 생산을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 발효적 방법에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 균주 구축을 위한 방법
하기 주어진 실시예에서, 관련 기술분야에 널리 알려진 방법을 사용하여 이. 콜라이에 대해 문헌 [Datsenko & Wanner, (2000)]에 의해 잘 기재된 상동 재조합을 이용하여 복제 벡터 및/또는 다양한 염색체 결실, 및 치환을 함유하는 이. 콜라이 균주를 구축하였다. 동일한 방식으로, 재조합 미생물에서 1종 또는 수종의 유전자를 발현 또는 과다발현하기 위한 플라스미드 또는 벡터의 사용은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 널리 알려져 있다. 적합한 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc, pACYC184n pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236 등을 포함한다.
하기 실시예에서 여러 프로토콜이 사용되었다. 본 발명에 사용된 프로토콜 1 (상동 재조합에 의한 염색체 변형, 재조합체의 선택), 프로토콜 2 (파지 P1의 형질도입) 및 프로토콜 3 (항생제 카세트 절제, 내성 유전자는 필요한 경우에 제거하였음)은 특허 출원 EP 2532751에 충분히 기재되어 있다. 항생제 내성 카세트는 pKD3, pKD4, pKD13, 또는 FRT 부위에 의해 둘러싸인 또 다른 항생제 내성 유전자를 함유하는 임의의 다른 플라스미드 상에서 증폭될 수 있다. 염색체 변형을 관련 기술분야의 통상의 기술자가 디자인할 수 있는 적절한 올리고뉴클레오티드로의 PCR 분석에 의해 검증하였다.
실시예 2: 균주 1 및 2의 구축
균주 1의 구축
균주 1을 구축하기 위한 전체 프로토콜은 특허 출원 번호 WO2012055798: 균주 번호 10에 제공되어 있다.
균주 2의 구축
ppsR 유전자에 의해 코딩되는 PEP 신타제 조절 단백질 PSRP를 불활성화시키기 위해, 상동 재조합 전략을 사용하였다 (프로토콜 1 및 3에 따름). DppsR: 서열식별번호: 63 및 64에 대한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 내성 카세트를 PCR 증폭시켰다. 잔류된 균주를 MG1655 DppsR::Km 또는 MG1655 DppsR::Gt로 지정하였다. 마지막으로, DppsR::Km 또는 MG1655 DppsR::Gt 결실을 P1 파지 형질도입에 의해 (프로토콜 2에 따름) 균주 1 내로 전달하였다.
실시예 3: 진탕 플라스크 배양 및 수율
메티오닌 생산 균주를 소형 에를렌마이어 플라스크에서 평가하였다. 5.5 mL 예비배양물을 30℃에서 21시간 동안 혼합 배지 (10% LB 배지 (시그마(Sigma) 25%) + 2.5 g.L-1 글루코스 및 90% 최소 배지 PC1, WO2012055798에 기재됨)에서 성장시켰다. 이를 사용하여, PC1 배지의 50 mL 배양물에 OD600 0.2로 접종하였다. 배양물의 온도는 2시간 동안 37℃, 2시간 동안 42℃ 및 배양 종료까지 37℃였다. 배양물이 5 내지 7의 OD600에 도달했을 때, 메티오닌 (Met) 및 호모란티오닌 (HLA)을 OPA/Fmoc 유도체화 및 GCMS-실릴화 후 HPLC에 의해 정량화하고 글루코스를 굴절계 검출로 HPLC에 의해 정량화하였다.
모든 배양물에 대해, 필요한 경우에, 항생제를 카나마이신 및 스펙티노마이신의 경우에 50 mg.L-1의 농도로, 클로람페니콜의 경우에 30 mg.L-1의 농도로 및 겐타마이신의 경우에 10 mg.L-1의 농도로 첨가하였다.
표 2: 상기 기재된 균주의 수율 (g 산물 / g 소비된 당)
= : 대조군 균주와 차이 없음, + : 대조군 균주보다 더 높은 수율 (110%-120%),
++ : 대조군 균주보다 더 높은 수율 (120%-150%), +++ : 대조군 균주보다 더 높은 수율 (>150%)
Figure pct00003
균주 2는 상응하는 대조군 균주 1보다 더 우수한 수율을 가졌다.
결론
상기 실시예에 의해 입증된 바와 같이, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF299 단백질을 코딩하는 ppsR의 결실은 메티오닌의 생산이 증가되도록 한다.
참고문헌
Figure pct00004
SEQUENCE LISTING <110> METABOLIC EXPLORER <120> METHOD FOR THE FERMENTATIVE PRODUCTION OF METHIONINE OR ITS HYDROXY ANALOG FORM BY MICROORGANISMS COMPRISING GENES CODING SUGAR PHOSPHOTRANSFERASE SYSTEM (PTS) <130> B372757D36346 <150> IB2016/001123 <151> 2016-07-08 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 834 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atggataatg ctgttgatcg ccacgttttt tatatttctg atggtacggc aataactgcg 60 gaggtattag gacacgcagt aatgtcacaa tttcccgtca ctatcagcag catcacgctg 120 ccgtttgtcg aaaatgagag ccgtgcacgg gcagtgaagg atcagattga cgcaatttat 180 caccagacag gcgtgcgccc gctggtcttc tactccatcg tgttgccgga gattcgcgcc 240 atcatcttgc aaagtgaagg cttttgccag gatatcgttc aggcgctggt tgccccgcta 300 caacaagaga tgaaactgga tccaacgccg attgctcatc gtacccatgg ccttaaccct 360 aataatctca ataaatatga tgcgcgcatt gcggcgattg attacaccct cgcccacgat 420 gacggcattt cgttgcgcaa tctggaccag gctcaggtga tcctgctcgg tgtttctcgc 480 tgtggtaaaa cccccaccag tctgtatctg gcaatgcagt ttggtatccg cgcggcaaac 540 taccccttta ttgccgacga tatggataat ctggtgctac ccgcgtcgct caaaccgctt 600 cagcataaat tgttcggcct gactatcgac ccggaacgtc tggcggcgat tcgcgaggaa 660 cgtcgggaga acagtcgcta tgcctcgctt cgtcagtgca ggatggaagt cgcggaagtg 720 gaagccttgt accgtaaaaa tcagatcccg tggattaaca gtaccaatta ttcggtagaa 780 gagattgcca ccaagatcct cgatatcatg ggccttagtc gccgaatgta ctag 834 <210> 2 <211> 277 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Asp Asn Ala Val Asp Arg His Val Phe Tyr Ile Ser Asp Gly Thr 1 5 10 15 Ala Ile Thr Ala Glu Val Leu Gly His Ala Val Met Ser Gln Phe Pro 20 25 30 Val Thr Ile Ser Ser Ile Thr Leu Pro Phe Val Glu Asn Glu Ser Arg 35 40 45 Ala Arg Ala Val Lys Asp Gln Ile Asp Ala Ile Tyr His Gln Thr Gly 50 55 60 Val Arg Pro Leu Val Phe Tyr Ser Ile Val Leu Pro Glu Ile Arg Ala 65 70 75 80 Ile Ile Leu Gln Ser Glu Gly Phe Cys Gln Asp Ile Val Gln Ala Leu 85 90 95 Val Ala Pro Leu Gln Gln Glu Met Lys Leu Asp Pro Thr Pro Ile Ala 100 105 110 His Arg Thr His Gly Leu Asn Pro Asn Asn Leu Asn Lys Tyr Asp Ala 115 120 125 Arg Ile Ala Ala Ile Asp Tyr Thr Leu Ala His Asp Asp Gly Ile Ser 130 135 140 Leu Arg Asn Leu Asp Gln Ala Gln Val Ile Leu Leu Gly Val Ser Arg 145 150 155 160 Cys Gly Lys Thr Pro Thr Ser Leu Tyr Leu Ala Met Gln Phe Gly Ile 165 170 175 Arg Ala Ala Asn Tyr Pro Phe Ile Ala Asp Asp Met Asp Asn Leu Val 180 185 190 Leu Pro Ala Ser Leu Lys Pro Leu Gln His Lys Leu Phe Gly Leu Thr 195 200 205 Ile Asp Pro Glu Arg Leu Ala Ala Ile Arg Glu Glu Arg Arg Glu Asn 210 215 220 Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Arg Gln Cys Arg Met Glu Val Ala Glu Val 225 230 235 240 Glu Ala Leu Tyr Arg Lys Asn Gln Ile Pro Trp Ile Asn Ser Thr Asn 245 250 255 Tyr Ser Val Glu Glu Ile Ala Thr Lys Ile Leu Asp Ile Met Gly Leu 260 265 270 Ser Arg Arg Met Tyr 275 <210> 3 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60 tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120 cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180 tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240 cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300 gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg agtttaatga tgtcgcttac 360 tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgttt 420 gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480 accgaaaaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540 cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cattcgcgct atgctgactt tccggcagcg 600 ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660 ctgtttgcca gtaaagataa gcgcattgcc tttgtgacgg gccatcccga atatgatgcg 720 caaacgctgg cgcaggaatt tttccgcgat gtggaagccg gactagaccc ggatgtaccg 780 tataactatt tcccgcacaa tgatccgcaa aatacaccgc gagcgagctg gcgtagtcac 840 ggtaatttac tgtttaccaa ctggctcaac tattacgtct accagatcac gccatacgat 900 ctacggcaca tgaatccaac gctggattaa 930 <210> 4 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg 1 5 10 15 Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu 20 25 30 Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile 35 40 45 Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln 50 55 60 Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala 130 135 140 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val 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gcggcttatc gagagtccac caaagcgctg gtggaaggtg gcgcggatct gatcctgatt 540 gaaaccgttt tcgacaccct taacgccaaa gcggcggtat ttgcggtgaa aacggagttt 600 gaagcgctgg gcgttgagct gccgattatg atctccggca ccatcaccga cgcctccggg 660 cgcacgctct ccgggcagac caccgaagca ttttacaact cattgcgcca cgccgaagct 720 ctgacctttg gcctgaactg tgcgctgggg cccgatgaac tgcgccagta cgtgcaggag 780 ctgtcacgga ttgcggaatg ctacgtcacc gcgcacccga acgccgggct acccaacgcc 840 tttggtgagt acgatctcga cgccgacacg atggcaaaac agatacgtga atgggcgcaa 900 gcgggttttc tcaatatcgt cggcggctgc tgtggcacca cgccacaaca tattgcagcg 960 atgagtcgtg cagtagaagg attagcgccg cgcaaactgc cggaaattcc cgtagcctgc 1020 cgtttgtccg gcctggagcc gctgaacatt ggcgaagata gcctgtttgt gaacgtgggt 1080 gaacgcacca acgtcaccgg ttccgctaag ttcaagcgcc tgatcaaaga agagaaatac 1140 agcgaggcgc tggatgtcgc gcgtcaacag gtggaaaacg gcgcgcagat tatcgatatc 1200 aacatggatg aagggatgct cgatgccgaa gcggcgatgg tgcgttttct caatctgatt 1260 gccggtgaac cggatatcgc tcgcgtgccg attatgatcg actcctcaaa atgggacgtc 1320 attgaaaaag gtctgaagtg tatccagggc aaaggcattg ttaactctat ctcgatgaaa 1380 gagggcgtcg atgcctttat ccatcacgcg aaattgttgc gtcgctacgg tgcggcagtg 1440 gtggtaatgg cctttgacga acagggacag gccgatactc gcgcacggaa aatcgagatt 1500 tgccgtcggg cgtacaaaat cctcaccgaa gaggttggct tcccgccaga agatatcatc 1560 ttcgacccaa acatcttcgc ggtcgcaact ggcattgaag agcacaacaa ctacgcgcag 1620 gactttatcg gcgcgtgtga agacatcaaa cgcgaactgc cgcacgcgct gatttccggc 1680 ggcgtatcta acgtttcttt ctcgttccgt ggcaacgatc cggtgcgcga agccattcac 1740 gcagtgttcc tctactacgc tattcgcaat ggcatggata tggggatcgt caacgccggg 1800 caactggcga tttacgacga cctacccgct gaactgcgcg acgcggtgga agatgtgatt 1860 cttaatcgtc gcgacgatgg caccgagcgt ttactggagc ttgccgagaa atatcgcggc 1920 agcaaaaccg acgacaccgc caacgcccag caggcggagt ggcgctcgtg ggaagtgaat 1980 aaacgtctgg aatactcgct ggtcaaaggc attaccgagt ttatcgagca ggataccgaa 2040 gaagcccgcc agcaggctac gcgcccgatt gaagtgattg aaggcccgtt gatggacggc 2100 atgaatgtgg tcggcgacct gtttggcgaa gggaaaatgt tcctgccaca ggtggtcaaa 2160 tcggcgcgcg tcatgaaaca ggcggtggcc tacctcgaac cgtttattga agccagcaaa 2220 gagcagggca aaaccaacgg caagatggtg atcgccaccg tgaagggcga cgtccacgac 2280 atcggtaaaa atatcgttgg tgtggtgctg caatgtaaca actacgaaat tgtcgatctc 2340 ggcgttatgg tgcctgcgga aaaaattctc cgtaccgcta aagaagtgaa tgctgatctg 2400 attggccttt cggggcttat cacgccgtcg ctggacgaga tggttaacgt ggcgaaagag 2460 atggagcgtc agggcttcac tattccgtta ctgattggcg gcgcgacgac ctcaaaagcg 2520 cacacggcgg tgaaaatcga gcagaactac agcggcccga cggtgtatgt gcagaatgcc 2580 tcgcgtaccg ttggtgtggt ggcggcgctg ctttccgata cccagcgtga tgattttgtc 2640 gctcgtaccc gcaaggagta cgaaaccgta cgtattcagc acgggcgcaa gaaaccgcgc 2700 acaccaccgg tcacgctgga agcggcgcgc gataacgatt tcgcttttga ctggcaggct 2760 tacacgccgc cggtggcgca ccgtctcggc gtgcaggaag tcgaagccag catcgaaacg 2820 ctgcgtaatt acatcgactg gacaccgttc tttatgacct ggtcgctggc cgggaagtat 2880 ccgcgcattc tggaagatga agtggtgggc gttgaggcgc agcggctgtt taaagacgcc 2940 aacgacatgc tggataaatt aagcgccgag aaaacgctga atccgcgtgg cgtggtgggc 3000 ctgttcccgg caaaccgtgt gggcgatgac attgaaatct accgtgacga aacgcgtacc 3060 catgtgatca acgtcagcca ccatctgcgt caacagaccg aaaaaacagg cttcgctaac 3120 tactgtctcg ctgacttcgt tgcgccgaag ctttctggta aagcagatta catcggcgca 3180 tttgccgtga ctggcgggct ggaagaggac gcactggctg atgcctttga agcgcagcac 3240 gatgattaca acaaaatcat ggtgaaagcg cttgccgacc gtttagccga agcctttgcg 3300 gagtatctcc atgagcgtgt gcgtaaagtc tactggggct atgcgccgaa cgagaacctc 3360 agcaacgaag agctgatccg cgaaaactac cagggcatcc gtccggcacc gggctatccg 3420 gcctgcccgg aacatacgga aaaagccacc atctgggagc tgctggaagt ggaaaaacac 3480 actggcatga aactcacaga atctttcgcc atgtggcccg gtgcatcggt ttcgggttgg 3540 tacttcagcc acccggacag caagtactac gctgtagcac aaattcagcg cgatcaggtt 3600 gaagattatg cccgccgtaa aggtatgagc gttaccgaag ttgagcgctg gctggcaccg 3660 aatctggggt atgacgcgga ctga 3684 <210> 6 <211> 1227 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 6 Met Ser Ser Lys Val Glu Gln Leu Arg Ala Gln Leu Asn Glu Arg Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Asp Gly Gly Met Gly Thr Met Ile Gln Ser Tyr Arg Leu 20 25 30 Asn Glu Ala Asp Phe Arg Gly Glu Arg Phe Ala Asp Trp Pro Cys Asp 35 40 45 Leu Lys Gly Asn Asn Asp Leu Leu Val Leu Ser Lys Pro Glu Val Ile 50 55 60 Ala Ala Ile His Asn Ala Tyr Phe Glu Ala Gly Ala Asp Ile Ile Glu 65 70 75 80 Thr Asn Thr Phe Asn Ser Thr Thr Ile Ala Met Ala Asp Tyr Gln Met 85 90 95 Glu Ser Leu Ser Ala Glu Ile Asn Phe Ala Ala Ala Lys Leu Ala Arg 100 105 110 Ala Cys Ala Asp Glu Trp Thr Ala Arg Thr Pro Glu Lys Pro Arg Tyr 115 120 125 Val Ala Gly Val Leu Gly Pro Thr Asn Arg Thr Ala Ser Ile Ser Pro 130 135 140 Asp Val Asn Asp Pro Ala Phe Arg Asn Ile Thr Phe Asp Gly Leu Val 145 150 155 160 Ala Ala Tyr Arg Glu Ser Thr Lys Ala Leu Val Glu Gly Gly Ala Asp 165 170 175 Leu Ile Leu Ile Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Ala Lys Ala Ala 180 185 190 Val Phe Ala Val Lys Thr Glu Phe Glu Ala Leu Gly Val Glu Leu Pro 195 200 205 Ile Met Ile Ser Gly Thr Ile Thr Asp Ala Ser Gly Arg Thr Leu Ser 210 215 220 Gly Gln Thr Thr Glu Ala Phe Tyr Asn Ser Leu Arg His Ala Glu Ala 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gly Leu Asn Cys Ala Leu Gly Pro Asp Glu Leu Arg Gln 245 250 255 Tyr Val Gln Glu Leu Ser Arg Ile Ala Glu Cys Tyr Val Thr Ala His 260 265 270 Pro Asn Ala Gly Leu Pro Asn Ala Phe Gly Glu Tyr Asp Leu Asp Ala 275 280 285 Asp Thr Met Ala Lys Gln Ile Arg Glu Trp Ala Gln Ala Gly Phe Leu 290 295 300 Asn Ile Val Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Pro Gln His Ile Ala Ala 305 310 315 320 Met Ser Arg Ala Val Glu Gly Leu Ala Pro Arg Lys Leu Pro Glu Ile 325 330 335 Pro Val Ala Cys Arg Leu Ser Gly Leu Glu Pro Leu Asn Ile Gly Glu 340 345 350 Asp Ser Leu Phe Val Asn Val Gly Glu Arg Thr Asn Val Thr Gly Ser 355 360 365 Ala Lys Phe Lys Arg Leu Ile Lys Glu Glu Lys Tyr Ser Glu Ala Leu 370 375 380 Asp Val Ala Arg Gln Gln Val Glu Asn Gly Ala Gln Ile Ile Asp Ile 385 390 395 400 Asn Met Asp Glu Gly Met Leu Asp Ala Glu Ala Ala Met Val Arg Phe 405 410 415 Leu Asn Leu Ile Ala Gly Glu Pro Asp Ile Ala Arg Val Pro Ile Met 420 425 430 Ile Asp Ser Ser Lys Trp Asp Val Ile Glu Lys Gly Leu Lys Cys Ile 435 440 445 Gln Gly Lys Gly Ile Val Asn Ser Ile Ser Met Lys Glu Gly Val Asp 450 455 460 Ala Phe Ile His His Ala Lys Leu Leu Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Val 465 470 475 480 Val Val Met Ala Phe Asp Glu Gln Gly Gln Ala Asp Thr Arg Ala Arg 485 490 495 Lys Ile Glu Ile Cys Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Thr Glu Glu Val 500 505 510 Gly Phe Pro Pro Glu Asp Ile Ile Phe Asp Pro Asn Ile Phe Ala Val 515 520 525 Ala Thr Gly Ile Glu Glu His Asn Asn Tyr Ala Gln Asp Phe Ile Gly 530 535 540 Ala Cys Glu Asp Ile Lys Arg Glu Leu Pro His Ala Leu Ile Ser Gly 545 550 555 560 Gly Val Ser Asn Val Ser Phe Ser Phe Arg Gly Asn Asp Pro Val Arg 565 570 575 Glu Ala Ile His Ala Val Phe Leu Tyr Tyr Ala Ile Arg Asn Gly Met 580 585 590 Asp Met Gly Ile Val Asn Ala Gly Gln Leu Ala Ile Tyr Asp Asp Leu 595 600 605 Pro Ala Glu Leu Arg Asp Ala Val Glu Asp Val Ile Leu Asn Arg Arg 610 615 620 Asp Asp Gly Thr Glu Arg Leu Leu Glu Leu Ala Glu Lys Tyr Arg Gly 625 630 635 640 Ser Lys Thr Asp Asp Thr Ala Asn Ala Gln Gln Ala Glu Trp Arg Ser 645 650 655 Trp Glu 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Gly Gly Leu Asp Val 100 105 110 Glu Ile Ala Ala Val Ile Gly Asn His Asp Thr Leu Arg Ser Leu Val 115 120 125 Glu Arg Phe Asp Ile Pro Phe Glu Leu Val Ser His Glu Gly Leu Thr 130 135 140 Arg Asn Glu His Asp Gln Lys Met Ala Asp Ala Ile Asp Ala Tyr Gln 145 150 155 160 Pro Asp Tyr Val Val Leu Ala Lys Tyr Met Arg Val Leu Thr Pro Glu 165 170 175 Phe Val Ala Arg Phe Pro Asn Lys Ile Ile Asn Ile His His Ser Phe 180 185 190 Leu Pro Ala Phe Ile Gly Ala Arg Pro Tyr His Gln Ala Tyr Glu Arg 195 200 205 Gly Val Lys Ile Ile Gly Ala Thr Ala His Tyr Val Asn Asp Asn Leu 210 215 220 Asp Glu Gly Pro Ile Ile Met Gln Asp Val Ile His Val Asp His Thr 225 230 235 240 Tyr Thr Ala Glu Asp Met Met Arg Ala Gly Arg Asp Val Glu Lys Asn 245 250 255 Val Leu Ser Arg Ala Leu Tyr Lys Val Leu Ala Gln Arg Val Phe Val 260 265 270 Tyr Gly Asn Arg Thr Ile Ile Leu 275 280 <210> 57 <211> 2262 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 57 atgacaatat tgaatcacac cctcggtttc cctcgcgttg gcctgcgtcg cgagctgaaa 60 aaagcgcaag aaagttattg ggcggggaac tccacgcgtg aagaactgct ggcggtaggg 120 cgtgaattgc gtgctcgtca ctgggatcaa caaaagcaag cgggtatcga cctgctgccg 180 gtgggcgatt ttgcctggta cgatcatgta ctgaccacca gtctgctgct gggtaacgtt 240 ccggcgcgtc atcagaacaa agatggttcg gtagatatcg acaccctgtt ccgtattggt 300 cgtggacgtg cgccgactgg cgaacctgcg gcggcagcgg aaatgaccaa atggtttaac 360 accaactatc actacatggt gccggagttc gttaaaggcc aacagttcaa actgacctgg 420 acgcagctgc tggacgaagt ggacgaggcg ctggcgctgg gccacaaggt gaaacctgtg 480 ctgctggggc cggttacctg gctgtggctg gggaaagtga aaggtgaaca atttgaccgc 540 ctgagcctgc tgaacgacat tctgccggtt tatcagcaag tgctggcaga actggcgaaa 600 cgcggcatcg agtgggtaca gattgatgaa cccgcgctgg tactggaact accacaggcg 660 tggctggacg catacaaacc cgcttacgac gcgctccagg gacaggtgaa actgctgctg 720 accacctatt ttgaaggcgt aacgccaaat ctcgacacga ttactgcgct gcctgttcag 780 ggtctgcatg ttgacctcgt acatggtaaa gatgacgttg ctgaactgca caagcgcctg 840 ccttctgact ggttgctgtc tgcgggtctg atcaatggtc gtaacgtctg gcgcgccgat 900 cttaccgaga aatatgcgca aattaaggac 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490 495 His Leu Asp Gly Phe Val Phe Thr Gln Asn Gly Trp Val Gln Ser Tyr 500 505 510 Gly Ser Arg Cys Val Lys Pro Pro Ile Val Ile Gly Asp Ile Ser Arg 515 520 525 Pro Ala Pro Ile Thr Val Glu Trp Ala Lys Tyr Ala Gln Ser Leu Thr 530 535 540 Asp Lys Pro Val Lys Gly Met Leu Thr Gly Pro Val Thr Ile Leu Cys 545 550 555 560 Trp Ser Phe Pro Arg Glu Asp Val Ser Arg Glu Thr Ile Ala Lys Gln 565 570 575 Ile Ala Leu Ala Leu Arg Asp Glu Val Ala Asp Leu Glu Ala Ala Gly 580 585 590 Ile Gly Ile Ile Gln Ile Asp Glu Pro Ala Leu Arg Glu Gly Leu Pro 595 600 605 Leu Arg Arg Ser Asp Trp Asp Ala Tyr Leu Gln Trp Gly Val Glu Ala 610 615 620 Phe Arg Ile Asn Ala Ala Val Ala Lys Asp Asp Thr Gln Ile His Thr 625 630 635 640 His Met Cys Tyr Cys Glu Phe Asn Asp Ile Met Asp Ser Ile Ala Ala 645 650 655 Leu Asp Ala Asp Val Ile Thr Ile Glu Thr Ser Arg Ser Asp Met Glu 660 665 670 Leu Leu Glu Ser Phe Glu Glu Phe Asp Tyr Pro Asn Glu Ile Gly Pro 675 680 685 Gly Val Tyr Asp Ile His Ser Pro Asn Val Pro Ser Val Glu Trp Ile 690 695 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atggcagagg ccttgtttgg tgcctcacgc ggggcgcgcg atgtgattca ggtggttatc 660 gatcacaacg tgggggcggg cgtcattacc gatggtcatc tgctacacgc aggcagcagt 720 agtctcgtgg aaataggcca cacacaggtc gacccgtatg ggaaacgctg ttattgcggg 780 aatcacggct gcctcgaaac catcgccagc gtggacagta ttcttgagct ggcacagctg 840 cgtcttaatc aatccatgag ctcgatgtta catggacaac cgttaaccgt ggactcattg 900 tgtcaggcgg cattgcgcgg cgatctactg gcaaaagaca tcattaccgg ggtgggcgcg 960 catgtcgggc gcattcttgc catcatggtg aatttattta acccacaaaa aatactgatt 1020 ggctcaccgt taagtaaagc ggcagatatc ctcttcccgg tcatctcaga cagcatccgt 1080 cagcaggccc ttcctgcgta tagtcagcac atcagcgttg agagtactca gttttctaac 1140 cagggcacga tggcaggcgc tgcactggta aaagacgcga tgtataacgg ttctttgttg 1200 attcgtctgt tgcagggtta a 1221 <210> 60 <211> 406 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 60 Met Val Ala Glu Asn Gln Pro Gly His Ile Asp Gln Ile Lys Gln Thr 1 5 10 15 Asn Ala Gly Ala Val Tyr Arg Leu Ile Asp Gln Leu Gly Pro Val Ser 20 25 30 Arg Ile Asp Leu Ser Arg Leu Ala Gln Leu Ala Pro Ala Ser Ile 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Gly Ile Glu Ser Gln Asn Gln Ala Ser Leu 115 120 125 His Leu His Gln Ser Leu Gly Phe Val Val Thr Ala Gln Met Pro Gln 130 135 140 Val Gly Thr Lys Phe Gly Arg Trp Leu Asp Leu Thr Phe Met Gln Leu 145 150 155 160 Gln Leu Asp Glu Arg Thr Glu Pro Asp Ala Ile Gly 165 170 <210> 63 <211> 100 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligo DppsR <400> 63 cgttctacgc ttctgtgcgt ttttaattta tgctttcata gaattatgtc tgcatcacgg 60 gaagaacaaa atgattccgg ggatccgtcg acctgcagtt 100 <210> 64 <211> 100 <212> DNA <213> artificial <220> <223> oligo DppsR <400> 64 gtcacacctc gccgggtggt tagcatgata acaaaaaaat aagctaatgc actagttctc 60 tagtacattc ggcgactaag tgtaggctgg agctgcttcg 100

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 발효적 공정에서의 탄소의 공급원의 전환에 의한 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 방법이며:
    - 탄소의 공급원으로서 탄수화물을 포함하는 적절한 배양 배지에서 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물을 배양하는 단계 및
    - 배양 배지로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태를 회수하는 단계,
    여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하고,
    여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물에서, 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 발현은 감소된 것인
    방법.
  2. 제1항에 있어서, PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자가 유전적으로 변형된 미생물에 대해 이종인 방법.
  3. 제1항에 있어서, PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자가 유전적으로 변형된 미생물에 대해 천연인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질을 코딩하는 천연 유전자가 상기 유전적으로 변형된 미생물에서 감쇠 또는 결실된 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 바실라세아에(Bacillaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 스트렙토미세타세아에(Streptomycetaceae), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 사카로미세타세아에(Saccharomycetaceae) 및 효모로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 써모아나에로박테리움 써모사카로리티쿰(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum), 클로스트리디움 스페노이데스(Clostridium sphenoides) 또는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF299 단백질을 코딩하는 유전자 ppsR이 감쇠 또는 결실된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 증진된 생산을 위해 유전적으로 변형된 것인 방법.
  10. 탄소의 공급원으로서의 탄수화물로부터 메티오닌 또는 그의 히드록시 유사체 형태의 증진된 생산을 위한 유전적으로 변형된 미생물로서,
    여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물은 PTS 탄수화물 활용 시스템을 코딩하는 기능적 유전자를 포함하고,
    여기서 상기 유전적으로 변형된 미생물에서, 포스포엔올피루베이트 신타제 (PPS)의 발현을 조절하는 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 단백질의 발현은 감소된 것인
    유전적으로 변형된 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 유전적으로 변형된 미생물이 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이 변형된 것인 유전적으로 변형된 미생물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 이중기능적 ADP-의존성 키나제-Pi-의존성 피로포스포릴라제 DUF229를 코딩하는 유전자 ppsR이 감쇠 또는 결실된 것인 유전적으로 변형된 미생물.
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