KR20220049217A

KR20220049217A - 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주

Info

Publication number: KR20220049217A
Application number: KR1020200132581A
Authority: KR
Inventors: 오민규; 김덕균
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-04-21

Abstract

본 발명은 매크로라이드 계열 항생제에 대한 민감도를 증가시킨 바이오센서 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 {Biosensors for the detection of macrolide}

세포 기반 바이오센서는 살아있는 세포를 이용하여, 분석하고자 하는 피분석물(analyte)의 농도에 따라 전사인자에 의해 조절되는 리포터 단백질의 발현 정도로 피분석물의 농도를 측정하는 시스템이다. 이는 환경의 오염정도나 생의학 진단 및 검출에 대하여 큰 잠재력을 보여주고 있으며, 끊임없이 연구되고 활용되고 있다. 또한, 다양한 물질의 측정을 위해 널리 활용되고 있는데, 일 예로, E. coli, D. radiodurans, B. sartisoli 등의 균주를 이용하여 카드뮴, 나프탈렌, C6-C10의 알켄 물질, 매크로라이드 항생제 등을 분석할 수 있다고 보고되고 있다.

종래, 전사인자 중 특정물질과의 결합 정도에 따라 유전자의 발현정도를 조절하는 조절 시스템 중, 테트라사이클린(Tetracycline)에 의해 발현이 조절되는 전사인자 TetR은 테트라사이클린이 없는 환경에서 leak expression이 적어 전사인자가 조절되는 유전자의 발현이 거의 없으며, 테트라사이클린이 존재하는 환경에서 그 발현 정도가 크게 상승하여, 다양한 실험 및 연구에서 활용되고 있다. 이 밖에도 비슷한 예로 다양한 매크로라이드 인듀서(inducer)에 조절되는 전사인자인 MphR 등이 존재한다고도 보고된다.

그러나, 이들을 세포 기반 바이오센서로의 이용을 위해, 다양한 광 단백질 유전자를 TetR 패밀리 전사인자가 부착되는 유전서열 뒤에 삽입하여 매크로라이드 항생제의 농도를 측정한 결과, 그 민감도가 높지 않아 사용에 한계가 있었다.

또한, 기존의 항생제 대량생산 균주 구축방법은 기존의 타종 균주와 고체 배지 배양을 통해 억제영역(inhibition zone)의 크기를 비교해야 해서 오염의 문제가 있었으며, 액체배지 배양은 민감도가 매우 낮아 분석이 용이하기 않고 배양 후 액체 배지의 성분을 HPLC를 통해 분석하기 위해서는 샘플 준비를 위한 전처리와 분석 시간이 필요하다는 단점이 존재하였다.

한편, 면역력이 낮아진 경우, 특히 에이즈 환자나 노인은 박테리아에 의한 감염에 매우 취약하다. 따라서 박테리아 감염을 막기위해 다양한 항생제를 처방을 받는데 이러한 항생제는 사람마다 이뇨작용과 간 기능 차이에 의해 다양한 혈중농도를 나타내게 된다. 너무 높은 혈중 농도는 각종 과다복용 부작용을 겪게 할 수 있으며, 또한 체내 이로운 세균들까지 모두 사멸하게 만든다. 이와 반대로 너무 낮은 항생제 혈중 농도는 체내에 항생제 저항성 균주의 생존을 유발하여 점점 항생제에 저항성을 갖는 균주가 발생하도록 만든다.

따라서 혈중 항생제 농도는 주기적으로 확인하고 그에 맞춰 항생제를 처방하는 것이 가장 좋으나, 아직까지 정확하고 빠른 시간에 저렴한 비용으로 많은 혈액 샘플을 측정할 수 있는 방법이 부족하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 매크로라이드 계열 항생제를 높은 민감도로 탐지할 수 있는 세포 기반 바이오센서 균주와 이를 이용한 바이오센서 균주의 대량 제조방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질(TolC)의 활성을 내재적 활성에 비해 약화시킨 바이오센서 균주에서 매크로라이드 계열 항생제에 대한 민감도가 현저히 향상되고, 나아가 이러한 바이오센서 균주를 이용할 시 전처리 과정 없이 다수의 샘플을 동시에 분석할 수 있으며, 또한 정확하고 빠른 시간 내 경제적으로 많은 혈액 샘플을 측정할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 매크로라이드(macrolide) 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형된, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 이용한 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 이용한 매크로라이드 계열 항생제의 탐지방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제의 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 조성물을 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 키트를 제공하는 것이다.

본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

아울러, 본원의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.

본 발명은 매크로라이드 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 활성을 내재적 활성에 비해 약화시킨 바이오센서 균주에서 매크로라이드 계열 항생제에 대한 민감도가 현저히 향상되고, 나아가 이러한 바이오센서 균주를 이용할 시 액체 배양 시에도 전처리 과정 없이 많은 양의 샘플을 동시에 분석할 수 있다는 것을 발견한 것에 기초한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제1양태는 매크로라이드(macrolide) 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형된, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 제공한다.

또한, 제2양태로서 매크로라이드 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 발현 수준을 내재적 발현 수준에 비하여 약화되도록 변형시키는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, “바이오센서”란 특정한 환경 조건을 검출 또는 정량하기 위해 생물인식 요소가 포함된 것을 의미하는 것으로, 여기에서는 매크로라이드 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형됨으로써, 매크로라이드 계열 항쟁제를 효과적으로 탐지할 수 있는 바이오센서 균주는 의미한다.

본 발명에서 용어, “매크로라이드(macrolide)”는 다수의 키토기 및 수산기를 함유하는 락톤환을 특징으로 하는 화합물로서, 한 개 이상의 당에 배당 결합된 매크로라이드환을 함유하는 1군의 항균성 항생물질 또는 항생제를 의미한다. 매크로라이드는 스트렙토마이세스 속의 특정한 종에 의해서 산생되며, 70S라이보솜의 50S아단위에 결합함으로써 단백합성을 억제한다고 보고되고 있다.

상기 매크로라이드는 마크로라이드 또는 마크롤라이드 등의 용어와 혼용되어 사용될 수 있으며, 구체적인 예로는 에리트로마이신, 아지트로마이신, 록시트로마이신 또는 피크로마이신 등이 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에서 “매트로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)”이란, 세포 내에서 생성된 매크로라이드를 세포 외부로 배출하는 역할을 수행하는 단백질로서 기계수용 채널(mechanosensitive channels)의 일종을 의미한다.

본 발명에서는 매크로라이드 탐지능이 향상된 바이오센서 균주를 제공하며, 이를 위하여 상기 매크로라이드를 세포 외부로 방출하는 단백질을 코딩하는 유전자를 결실시켜서, 세포내 매크로라이드의 농도를 높은 수준으로 유지할 수 있는 형질전환 균주를 제조하였다.

이때, 결실된 매크로라이드 배출에 관여하는 단밸질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 단백질일 수 있다.

상기 단백질의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 또는 4) 이의 조합 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 일부 핵산서열이 결실된 폴리뉴클레오타이드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오타이드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 보다 바람직하게는 1 내지 50개이다.

또한, 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명의 단백질을 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오타이드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오타이드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어, “내재적 활성”이란 균주가 천연의 상태로 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미하는 것으로, 본 발명에서는 균주가 천연적으로 가지고 있는 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질(TolC)의 활성 상태를 의미하고, 본 발명에서 "내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형" 되었다는 것은, 유전자의 결손 또는 돌연변이에 의해 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질(TolC)이 정상적으로 작용하지 않아 균주가 천연의 상태로 가지고 있는 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질(TolC)의 활성이 약해진 상태를 의미한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 상기 바이오센서 균주는 도 1에 도시된 Efflux pump 제거를 통하여 바이오센서 민감도를 증가시킨 바이오센서 균주이다.

한편, 상기 바이오센서 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 바이오센서 균주는 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질(TolC)의 활성을 나타내는 에스케리키아 속(Escherichia sp.), 데이노코커스 속(Deinococcus sp.) 또는 부르크홀데리아 속(Burkholderia sp.)에 속하는 균주를 형질전환시킨 균주일 수 있다.

구체적으로는 매크로라이어 배출 단백질(TolC)의 활성을 감소시키거나 또는 불활성화시켜 세포 내 매크로라이드 양이 증가됨으로써, 매크로라이드가 세포 내 축적됨으로써 매크로라이드에 대한 탐지능이 현저히 증가된 형질전환된 바이오센서 균주일 수 있다.

보다 구체적으로는, 에스케리키아 속 미생물일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 이콜라이 (E. coli)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

또한, 야생형 균주인 그람음성 대장균 BL21 균주를 이용하여 매크로라이드 배출 관여 단백질 TolC를 코딩하는 유전자를 결실시켜 제작한 CCBLt 균주일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

본 발명은 상기 매크로라이드 배출에 관여하는 단백질의 활성이 약화되도록 변형된 바이오센서 균주에 추가로 MphR 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형할 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, “MphR 단백질”은 조절 단백질로서 본 발명에서는 형광 단백질과 결합된 상태로 존재하며 매크로라이드와 결합 시 형광 단백질의 발현이 유도된다.

상기 MphR 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%, 보다 더 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 단백질일 수 있다.

상기 추가로 MphR 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형된 바이오센서 균주는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 상동성 있는 서열의 N-말단으로부터 106번째 세린이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 구체적으로는 세린이 프롤린으로 치환된 것일 수 있으며, 세린이 다른 아미노산으로 치환됨으로써 MphR 단백질의 매크로라이드에 대한 기질특이성이 약화되는 것이면, 제한 없이 포함될 수 있다.

한편, 상기 단백질의 활성 약화와 내재적 활성에 대한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 매크로라이드 배출 관여 단백질의 활성을 내재적 활성 대비 약화시킨 바이오센서 균주(CCBLt 균주)에 추가로 MphR 단백질의 아미노산 서열의 N-말단에서 106번째 세린을 프롤린으로 치환함으로써, 매크로라이드에 대한 기질 특이성을 약화시킨 바이오센서 균주(CCBLt with S106F MphR 균주)를 제작하였고, 이러한 CCBLt with S106F MphR 균주가 MphR 단백질을 변형시키지 않은 CCBL 균주와 CCBLt 균주 대비 민감성이 현저히 우수하다는 것을 확인하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제3양태는, 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 제4양태로서 야생 균주 또는 이의 무작위 돌연변이주를 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주와 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, “매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주”, “단백질 활성 약화”, “내재적 활성”, “매크로라이드 계열 항생제” 및 “바이오센서”는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, “야생 균주 또는 이의 무작위 돌연변이주”는 아무런 변형을 가하지 않은 야생형 균주와 상기 야생형 균주를 무작위 돌연변이를 통하여 돌연변이를 유발시킨 균주를 의미하는 것으로서, 상기 돌연변이 균주는 유전자를 구성하는 DNA 염기서열에 비가역적인 변이를 일으킨 균주로, 돌연변이 방법은 점 돌연변이, 결실 변이, 삽입 변이, 불현성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이 등 공지된 방법이라면 제한 없이 이용될 수 있고, 방사선이나 화학물질 등을 처리하여 돌연변이를 일으킨 균주를 말한다.

구체적으로는, Streptomyces venezuelae 균주 또는 이를 무작위로 돌연변이시킨 돌연변이 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 바이오센서 균주나 Streptomyces venezuelae 균주 또는 이를 무작위로 돌연변이시킨 돌연변이 균주를 배양하는 방법을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 배양방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

구체적으로 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 수행할 수 있다. 또한, 상기 바이오센서 균주를 배양하기 위하여는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 또는 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 생존요건을 충족시킬 수 있다.

사용될 수 있는 탄소원으로는 주로 CO2와 카보네이트이며, 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 탄소원으로 사 용할 수 있고, 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양용 배지로는 NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, 구연산, EDTA Na2, 암모늄 페릭 시트레이트 그린(Ammonium ferric citrate green), Na2CO3 및 트레이스 금속용액(H3BO3, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O, Co(NO3)2.6H2O)을 포함하는 BG11 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, “이의 배양액”은 본 발명의 바이오센서 균주를 배양하여 얻어진 결과물을 의미하는 것으로 배양물이라 할 수도 있다. 넓은 의미로 상기 배양액 또는 배양물은 전체 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있다. 이 때, 상기 배양상등액은 상기 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 상기 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있다.

본 발명에서 용어, “배지”는 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하는 액체 또는 고형의 재료를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 액체 배지일 수 있으며, 일 예로 SCM 배지, LB 배지일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.

상기에서 야생 균주 또는 돌연변이 균주를 본원발명의 바이오센서 균주와 배양하는 것은 먼저 동시 또는 순차적으로 배양할 수 있으며, 구체적으로는 야생 균주 또는 돌연변이 균주를 배양 후 상기 균주들을 배양한 액체 배지를 추출하여 S106F MphR 조절 시스템을 가지고 있는 CCBLt 균주와 함께 배양하는 것을 말한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, Streptomyces venezuelae 야생 균주 또는 이의 돌연변이 균주를 배양한 액체 배지를 추출 후, 이를 본 발명의 바이오센서 균주 S106F MphR 조절 시스템을 가지고 있는 CCBLt 균주와 배양함으로써, 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주를 대량으로 제조할 수 있음을 확인하였다.

특히, 상기 바이오센서 균주의 대량 제조방법은 종래 고체 배지를 이용하여 배양 시 오염 발생 문제를 해결하였고, 액체 배지를 이용하여 배양 시 필요한 전처리 과정 없이도 다수의 샘플을 동시에 분석할 수 있다는 장점이 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 제5양태는 메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제의 탐지방법을 제공한다.

제6양태로서, 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 조성물을 제공한다.

제7양태로서, 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어, “메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주”, “내재적 활성”, “단백질 활성 약화”, “매크로라이드 계열 항생제”, “바이오센서”, 및 “이의 배양액”은 상술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, “키트”는 본 발명의 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함함으로써 매크로라이드 계열 항생제를 민감도가 높게 탐지할 수 있는 키트를 말한다.

상기 목적을 달성하기 위한 제8양태는 메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제의 측정방법을 제공한다.

제9양태로서, 본 발명은 메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 조성물을 제공한다.

제10양태로서, 본 발명은 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 조성물을 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 키트를 제공한다.

본 발명에서 용어, “메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주”, “내재적 활성”, “단백질 활성 약화”, “매크로라이드 계열 항생제”, “바이오센서”, “배양” 및 “항생제 측정”은 상술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, “분리된 시료”는 공지된 분리된 시료이면 제한 없이 이용이 가능하며, 구체적으로는 혈액, 소변 또는 폐수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 바이오 센서 균주를 분리된 혈액 및 매크로라이드 계열 항생제와 함께 배양하여, 혈액 내 항생제를 효과적으로 측정하였다.

본 발명은 매크로라이어 배출 활성을 가지는 단백질(TolC)의 활성을 내재적 활성에 비해 약화시킨 바이오센서 균주를 이용 시 매크로라이드 계열 항생제에 대한 민감도가 현저히 향상되어, 적은 양에서도 효과적으로 매크로라이드 계열 항생제를 확인할 수 있고, 나아가 상기 바이오센서 균주를 이용할 시 액체 배양 시에도 전처리 과정 없이 다수의 샘플을 동시에 분석할 수 있다.

도 1은 매크로라이드 배출 단백질을 코딩하는 tolC 유전자를 결실시켜 민감도를 증가시킨 바이오센서 균주의 원리를 설명한 간략도이다.
도 2는 에리트로마이신(A), 아지트로마이신(B), 록시트로마이신(C), 피크로마이신(D)의 농도에 따른 MphR 바이오센서 균주의 활성을 측정한 것이다.
도 3은 아지트로마이신(A), 록시트로마이신(B), 피크로마이신(C)의 농도에 따른 S106F MphR 바이오센서 균주의 활성을 측정한 것이다.
도 4는 바이오센서 균주를 이용한 피크로마이신 생산능이 향상된 Streptomyces venezuelae의 구축과정을 설명한 간략도이다.
도 5는 균주 배양액과 바이오센서 균주를 플레이트 리더를 이용하여 광량 분석한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 도 (A) 바이오센서 균주 없이 야생형 균주와 이의 무작위 돌여변이 균주의 배양액을 광량 분석한 결과이고, 도 (B)는 바이오센서 균주를 포함하여 배양한 배양액의 광량 분석한 결과이다. 참고로, 야생형 균주는 푸른 실선으로 생산능이 증가된 돌연변이 균주는 붉은 실선으로 표시하였다.
도 6은 본 발명의 바이오센서 균주와 배양액의 광량 분석과 HPLC 분석 결과를 비교한 것이다. 도 6의 가운데에 위치한 선은 추세선으로 어느 정도 광량의 발생과 피코마이신 농도 사이에 linear한 비례관계가 있음을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 바이오센서 균주의 실제 혈액 내 항생제 양을 확인한 것으로, 구체적으로 7(A)는 100nm 이하의 낮은 농도의 아지트로마이신 환경에서의 아지트로마이신 센싱 결과를 나타내고, 7(B)는 혈청이 포함된 경우와 포함되지 않은 경우의 반응성을 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: TolC 단백질 활성 약화 균주의 제작

1-1. tolC 유전자 결실 균주의 제작

본 연구에서 사용한 균주는 그람음성 균인 Escherichia coli로 단백질 발현에 효율적인 BL21 균주를 사용했으며 이를 CCBL이라 명명하였다. 매크로라이드를 cell 내에 고농도로 유지하고자 세포 안에서 밖으로 세포내 물질을 배출하는 efflux pump를 제거하였으며 축적된 매크로라이드는 세포 내에 eGFP 유전자 발현을 유도하여 녹색광이 발현되도록 하였다(도 1). 여기에서 Efflux pump 유전자가 제거된 균주는 CCBLt라 명명하였다.

먼저, TolC 단백질의 활성 약화가 매크로라이드 배출 활성을 약화시키는 것을 확인하기 위하여, tolC 유전자가 결실된 TolC 단백질 약화 균주를 제작하였다.

구체적으로, 대장균 내 MphR에 의해 조절되는 리포터 시스템을 발현시키기 위해, pJKR-H-MphR 플라스미드(Addgene에서 구매)를 사용하였으며, CCBL 균주와 CCBLt 균주에 전기천공법으로 형질전환하였다. 이 때, 1 mm 큐벳을 이용하고 1800 V의 전기 충격을 가하였다.

이 후, 균주 내 tolC 유전자를 제거하기 위하여 상동 재조합의 방법을 이용하였으며, 이때 재조합효소를 발현시키기 위해 pKD46 플라스미드(Addgene에서 구매)를 사용하여 형질전환하였다. 또한, 재조합된 균주에 카나마이신 저항성을 부여하기 위해 pKD4 플라스미드 내 유전자를 하기 표 1의 올리고머를 사용하여 PCR 증폭시켜 카세트 유전자를 제작하였다.

올리고머 명칭	서열 (5' - 3')	특징
tolC_del_FW	AATTTTACAGTTTGATCGCGCTAAATACTGCTTCACCACAAGGAATGCAAggagctgcttcgaagttccta	tolC 유전자 제거를 위한 cassette 유전자 증폭
tolC_del_RV	taggaacttcggaataggaagaaTTTAACGGCTTCTACCGGGATTTCTGACACCTCTTATAGCGGTTCGAAAA	tolC 유전자 제거를 위한 cassette 유전자 증폭

상기 카세트 유전자는 대장균 내에 전기천공법을 이용하여 형질전환에 의해 도입하였다. 이후, 재조합된 카세트 유전자를 제거하기 위해, 707flp 플라스미드를 형질전환하여 플립파아제를 발현시켰다.

1-2. S106F MphR 균주의 제작

MphR의 기질 특이성을 낮추기 위하여, 상기 실시예 1-1의 CCBL 균주와 tolC 유전자 결실 균주인 CCBLt 균주에 추가적으로 MphR의 아미노산 서열에서 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 S106F MphR 균주를 제작하였다.

먼저, tolC 유전자 결실 균주의 제작은 상기 1-1의 실시예와 같다. 이후, MphR 단백질의 기질 특이성을 낮추기 위하여 MphR의 106번째 아미노산을 세린에서 프롤린으로 치환하는 점 돌연변이를 실시하고자, MphR과 다른 서열의 올리고머 MphR_S106F_FW 및 MphR_S106F_RV를 이용해 PCR로 증폭하여 균주 내에서 플라스미드 형태로 구축되는 방법으로 제작하였다(Kasey et al., 2019 참조). 올리고머 MphR_S106F_FW 및 MphR_S106F_RV의 구체적인 서열은 하기 표 2와 같다.

MphR_S106F_FW	gaacctgcagttcgtaccagaagatcaggtagttaacagag	S106F mphR 유전자 증폭
MphR_S106F_RV	ctctgttaactacctgatcttctggtacgaactgcaggttc	S106F mphR 유전자 증폭

제작된 균주는 각각, CCBL S106F MphR 균주, CCBLt S106F MphR 균주로 명명하였다.

실시예 2: CCBL 및 CCBLt 균주의 매크로라이드 계열 항생제 탐지능 확인

상기 CCBL 균주와 CCBLt 균주를 LB 배지에서 4시간 동안 배양하여 log-phase의 세포들을 원심분리로 모았다. 구체적으로 전날 50mL tube에 5mL LB와 50ug/mL carbenicillin을 추가하여 상기 균주를 접종하였으며, overnight동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양한 균주는 250mL flask에서 50ug/mL의 carbenicillin을 포함한 25mL LB media에 250uL 넣어 4시간 동안 추가로 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.

그 후, 96 웰 플레이트에 흡광도 5.0에 맞춰 각 농도별로 매크로라이드를 첨가한 후, 플레이트 리더(미국 BioTek 회사의 SYNERGY H1 플레이트 리더) 내에서 37℃로 맞춰 12시간 동안 배양 후 광량을 측정한 후, 이를 도 2에 나타내었다.

구체적으로, 광량은 485nm의 파장을 사용하여 GFP를 excitation 시켰으며 510nm의 파장을 측정하였다.

한편, 본 실험에서는 기존 MphR 조절 시스템에서 활성을 나타내는 에리트로마이신과 구조가 유사한 피크로마이신, 아지트로마이신, 및 록시트로마이신 4가지의 매크로라이드가 사용되었다.

그 결과, 매크로라이드 배출 tolC 유전자가 결실된 바이오센서 균주는 대조군 균주에 비해 에리트로마이신이 적은 환경에서도 활성을 나타내는 것을 확인하였는바, 이를 통해 본 발명의 바이오센서 균주의 민감도가 크게 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 2(A)).

또한, 구조가 유사한 아지트로마이신과 록시스로마이신에서도 대조군이 활성을 거의 보이지 못한 것에 비해, 본 발명의 바이오센서 균주는 훨씬 효율적으로 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 2(B) 및(C)). 다만, 피크로마이신의 경우 대조군과 본원발명의 바이오센서 균주 모두 활성을 확인할 수 없었다(도 2(D)).

실시예 3: S106F MphR 균주의 매크로라이드 계열 항생제 탐지능 확인

구체적인 분석 방법은 실시예 2와 동일하다.

분석 결과, CCBLt S106F MphR 균주에서 대조군 균주 대비, 더 낮은 농도의 아지트로마이신과 록시트로마이신에서 더 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 3(A) 및 3(B)). 특히, 야생형 MphR을 가지는 균주에서는 활성을 보이지 않던 피크로마이신에 대해서도, 대조군과 다르게 CCBLt S106F MphR 균주에서 높은 민감도를 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 3(C)).

이는 매크로라이드 배출 단백질의 활성 약화가 매크로라이드 계열 항생제에 대해 높은 민감도를 가짐으로써 바이오센서 균주로서 사용될 수 있음을 나타내는 것이며, 특히, S106F MphR 가지는 매크로라이드 배출 단백질 활성 약화 바이오센서 균주에서는 피크로마이신에 대해서까지 높은 민감도를 가질 정도로 우수한 탐지능을 가지는 것을 나타내는 것이다.

실시예 4: 바이오센서 균주 대량 제조

상기 실시예 1에서 구축한 바이오센서 균주의 탁월한 민감도를 기반으로, 이러한 바이오센서 균주의 대량 제조를 위하여 Streptomyces venezuelae 균주를 기반으로 무작위 돌연변이를 진행하였다.

구체적으로, 무작위 돌연변이는 NTG를 1시간 동안 처리한 후, 245nm 자외선을 15cm 거리에서 15초간 조사하는 방법으로 진행되었다. 이렇게 제작된 돌연변이 균주들을 SCM 배지에서 일주일간 배양하였다. 구체적으로, 상기 SCM 배지는 soluble starch 15g, soytone 20g, yeast extract 1.5g, CaCl₂ 0.1g, 및 Morpholinepropanesulfonic acid 10.5g을 distilled water 1L에 넣어 제작하였으며, 상기 SCM 배지 2mL를 15mL tube에 넣어 앞서 제작한 돌연변이주와 야생형 균주를 모두 접종 후 28℃ 인큐베이터 내에서 배양하였다.

이후, 돌연변이 균주를 배양한 액체 배지를 추출하여 96 웰 플레이트에 S106F MphR 조절 시스템을 갖고 있는 CCBLt 균주와 함께 3시간 동안 배양한 후, 광량을 분석하였다(도 4). 구체적으로, 배양온도는 37℃로 유지하였으며 방선균 배양 배지 135uL를 마이크로-웰 플레이트에 넣고, CCBLt 균주를 50 optical density가 되도록 농축하여 15uL를 넣어 optical density 5.0에 맞추었다.

그 결과, 3개의 야생형 균주와 77개의 돌연변이 균주의 배양액은 CCBLt 균주가 없는 경우, 어떠한 광량도 보이지 않은 것을 확인할 수 있었다(도 5(A)).

반면, CCBLt 균주와 3시간 배양 후 광량을 분석하였을 때는 7개의 균주에서 야생형 균주의 배양액에 비해 증가된 광량을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 5(B) 붉은 실선).

또한, 상기 7개 균주의 배양액과 3개 야생형 균주 배양액을 에틸 아세테이트 전처리 과정을 진행 후, UV 디텍터를 이용해 HPLC 분석 결과, 플레이트 리더를 통한 광량 분석과 유사한 경향성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예 5: 바이오센서 균주의 실제 혈액 내 항생제 양 확인

상기 실시예 1에서 구축한 바이오센서 균주가 실제 혈액 내 항생제의 양을 확인할 수 있는지 확인하였다. 추가 실험에서 사용된 매크로라이드 항생제는 다양한 박테리아의 성장을 저해할 수 있어 현재까지도 면역력이 낮아진 환자들에게 구강 섭취 항생제로 많이 사용되고 있는 아지트로마이신을 사용하였다. 바이오센서로 사용될 균주는 이전과 같이 5mL LB 배지에서 카르베니실린 50ug/mL를 넣고 37℃ 인큐베이터에서 overnight하여 준비하였다. Overnight 동안 배양한 균주는 플라스크에서 4시간 초기 log phase에 다시 수집되었고, 광량 5.0에 맞춰 농축하였다. 이후, 96 micro-well plate에 혈청(Sigma Aldrich 사에서 구입)을 10%, 15uL, 농축된 균주를 135uL 넣어준 후, 아지트로마이신을 다양한 농도로 첨가하였다. 플레이트는 마이크로웰 플레이트 리더에서 37℃ 환경으로 12시간동안 배양하였으며, 485nm의 빛을 조사하여 510nm 파장의 광량을 확인하는 방법으로 eGFP 단백질 발현을 확인하였다. 이때, 상기 실시예에서와 마찬가지로, tolC 유전자가 제거되지 않은 균주를 CCBL으로, 제거된 경우를 CCBLt로 명명하였으며, 야생형 MphR 플라스미드를 포함한 경우 -1, S106F 변이가 일어난 MphR 플라스미드를 포함하는 경우 -2로 표시하였다.

실험 결과, 100nm 이하의 낮은 농도의 아지트로마이신 환경에서도 tolC 유전자 결손과 MphR 내 점 돌연변이를 통해 구축된 바이오센서 균주는 센싱(sensing)을 효율적으로 하는 것으로 확인할 수 있었다 (도 7(A)).

반면, 다른 바이오센서 균주들은 낮은 농도의 아지트로마이신을 감지하지 못하였다. 에이즈 환자나 노인과 같이 면역력이 감소된 경우, 아지트로마이신을 혈중 농도 60nm에 맞춰 먹도록 처방을 받으므로, 본 발명의 구축된 바이오센서 균주로 충분히 검출 가능한 농도임을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 구축된 바이오센서 균주가 실험실 장비 없이도 실제 환자들 혈액 내에서 아지트로마이신 농도 측정이 가능한지 확인해 보았다.

먼저 상기 실시예에서 확인한 바와 같이, 세포를 optical density 5.0에 맞춰 농축하고, 1.5mL tube에 넣어 각각 아지트로마이신만 첨가하거나 15uL 혈청과 함께 아지트로마이신을 넣는 두가지 방법으로 진행하였다. 또한, 실제 반응이 일어나지 않는 균주의 경우도 확인하고자, tolC가 제거되지 않고 S106F 돌연변이가 일어난 MphR 플라스미드를 포함하고 있는 CCBL 균주를 위와 같이 준비하고, 다양한 아지트로마이신 농도에서 추가 실험 진행하였다. 이렇게 준비된 균주들은 37℃ 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 배양한 균주들은 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, 시중에 판매되는 blue LED 램프로 불빛을 비춘 후 스마트 폰으로 사진을 촬영하였다. 이때 사용된 스마트폰은 Galaxy note 9이며 찍은 사진은 ImageJ 프로그램을 이용하여 컴퓨터를 통해 초록색 광량을 분석하였다.

그 결과, tolC 유전자가 제거되지 않은 균주는 반응성이 전혀 보이지 않았으나, 본 발명의 tolC가 제거된 바이오센서 균주는 혈청이 포함된 경우와 포함되지 않은 경우 모두 일정하게 반응성을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (도 7(B)).

이를 통해, 본 발명의 바이오센서 균주를 이용하면 낮은 함량의 매크로라이드 계열 항생제를 센싱(sensing)할 수 있으며, 실험실 장비가 없이도 실제 환자들의 혈액 내에서 농도를 효과적으로 측정할 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Biosensors for the detection of macrolide <130> JKP-1526 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of TolC <400> 1 Met Lys Lys Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe 1 5 10 15 Ser Ser Leu Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala 20 25 30 Arg Leu Ser Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala 35 40 45 Ala Phe Glu Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu 50 55 60 Gly Leu Gly Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn 65 70 75 80 Gly Ile Asn Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser 85 90 95 Ile Phe Asp Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala 100 105 110 Ala Gly Ile Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile 115 120 125 Leu Asn Thr Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val 130 135 140 Leu Ser Tyr Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp 145 150 155 160 Gln Thr Thr Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val 165 170 175 Gln Asn Ala Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr 180 185 190 Ala Arg Asn Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr 195 200 205 Gly Asn Tyr Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys 210 215 220 Thr Asp Lys Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys 225 230 235 240 Arg Asn Leu Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg 245 250 255 Glu Gln Ile Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu 260 265 270 Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr 275 280 285 Arg Gly Ala Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn 290 295 300 Lys Val Gly Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val 305 310 315 320 Asn Ser Gln Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu 325 330 335 Gln Leu Glu Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser 340 345 350 Phe Asn Asn Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln 355 360 365 Ala Val Val Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr 370 375 380 Ser Val Gly Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr 385 390 395 400 Leu Tyr Asn Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu 405 410 415 Ile Asn Gln Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln 420 425 430 Asp Leu Leu Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn 435 440 445 Pro Glu Asn Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp 450 455 460 Gly Tyr Ala Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala 465 470 475 480 Arg Thr Thr Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn 485 490 <210> 2 <211> 1482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene sequence of TolC <400> 2 atgaagaaat tgctccccat tcttatcggc ctgagccttt ctgggttcag ttcgttgagc 60 caggccgaga acctgatgca agtttatcag caagcacgcc ttagtaaccc ggaattgcgt 120 aagtctgccg ccgatcgtga tgctgccttt gaaaaaatta atgaagcgcg cagtccatta 180 ctgccacagc taggtttagg tgcagattac acctatagca acggctaccg cgacgcgaac 240 ggcatcaact ctaacgcgac 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Ser Val Asn Tyr Leu Ile Ser Trp Tyr Glu Leu Gln Val 100 105 110 Pro Glu Leu Arg Thr Leu Ala Ile Gln Arg Asn Arg Ala Val Val Glu 115 120 125 Gly Ile Arg Lys Arg Leu Pro Pro Gly Ala Pro Ala Ala Ala Glu Leu 130 135 140 Leu Leu His Ser Val Ile Ala Gly Ala Thr Met Gln Trp Ala Val Asp 145 150 155 160 Pro Asp Gly Glu Leu Ala Asp His Val Leu Ala Gln Ile Ala Ala Ile 165 170 175 Leu Cys Leu Met Phe Pro Glu His Asp Asp Phe Gln Leu Leu Gln Pro 180 185 190 His Ala <210> 4 <211> 1551 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cassette sequence <400> 4 aattttacag tttgatcgcg ctaaatactg cttcaccaca aggaatgcaa ggagctgctt 60 cgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaacttca agatcccctc 120 acgctgccgc aagcactcag ggcgcaaggg ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc 180 cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag 240 ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct 300 agactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg 360 taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg 420 gcgcagggga tcaagatctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca 480 agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg 540 ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg 600 cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc 660 agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt 720 cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc 780 atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca 840 tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc 900 acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg 960 gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct 1020 cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc 1080 tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc 1140 tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta 1200 cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt 1260 ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga 1320 gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac 1380 gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccagc 1440 ttcaaaagcg ctctgaagtt cctatacttt ctagagaata ggaacttcgg aataggaaga 1500 atttaacggc ttctaccggg atttctgaca cctcttatag cggttcgaaa a 1551

Claims

매크로라이드(macrolide) 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화되도록 변형된, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 상기 단백질의 활성 약화는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 및 4) 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 상기 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)은 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드의 서열로 코딩되는 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 에스케리키아 속, 데이노코커스 속 또는 벌코데리아 속 균주인 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제5항에 있어서, 상기 에스케리키아 속 균주는 대장균인 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 상기 매크로라이드 계열 항생제는 에리트로마이신, 아지트로마이신, 록시트로마이신 및 피크로마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 추가적으로 MphR 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 약화된, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제8항에 있어서, 상기 MphR 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제8항에 있어서, 상기 바이오센서 균주는 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 106번째 세린이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제10항에 있어서, 다른 아미노산은 프롤린인 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제1항에 있어서, 상기 바이오센서 균주는 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제를 탐지하는 것이 특징인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
제12항에 있어서, 상기 분리된 시료는 혈액, 소변, 또는 폐수인 것인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주.
매크로라이드 배출 관여 단백질(TolC)의 발현 수준을 내재적 발현 수준에 비하여 약화되도록 변형시키는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주의 제조방법.
매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 내재적 활성보다 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조용 조성물.
야생 균주 또는 이의 무작위 돌연변이주를 매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주와 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지능이 향상된 바이오센서 균주의 대량 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 배지는 액체 배지인 것인, 대량 제조방법.
제17항에 있어서, 상기 액체 배지는 LB 배지인 것인, 대량 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 방법은 오염 발생이 없고, 전처리 과정 없이도 다수의 샘플을 동시에 분석할 수 있는 것이 특징인, 대량 제조방법.
메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제의 탐지방법.
제20항에 있어서, 상기 방법은 배지에 매크로라이드를 추가하여 추가 배양 후 형광단백질의 발현정도를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 매크로라이드 계열 항생제의 탐지방법.
매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 조성물.
매크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주 또는 이의 배양액을 포함하는, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 키트.
제21항에 있어서, 상기 키트는 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제를 탐지하는 것이 특징인, 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 키트.
메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 배양하는 단계를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제의 측정방법.
제25항에 있어서, 상기 방법은 광량을 측정함으로써 형광 단백질 발현을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제의 측정방법.
제25항에 있어서, 상기 분리된 시료는 혈액, 소변 또는 폐수인 것인, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제의 측정방법.
메크로라이드 배출 활성을 나타내는 단백질(TolC)의 활성이 약화되도록 변형된 매크로라이드 계열 항생제 탐지용 바이오센서 균주, 분리된 시료 및 매크로라이드 계열 항생제를 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 조성물.
제28항의 조성물을 포함하는, 분리된 시료 내 매크로라이드 계열 항생제 측정용 키트.