CN107636148A - 细胞中代谢物的生产和检测 - Google Patents

Abstract

提供了制备和监测代谢物的方法。

Description

细胞中代谢物的生产和检测

相关申请数据

本申请要求于2015年4月13日提交的美国临时申请62/146,478号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明在美国能源部授予的DE-FG02-02ER63445的政府支持下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本发明一般涉及遗传修饰的细菌和检测遗传修饰的细菌中代谢物生产的方法。

背景技术

小分子诱导型系统是遗传编码的生物传感器，其响应于小分子诱导剂的存在而调节基因表达。最广泛使用的生物传感器之一是变构DNA结合蛋白LacI，其通过在转录起始位点附近结合并抑制转录起始天然地调节大肠杆菌中的乳糖分解代谢操纵子。当诱导分子如异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)存在于细胞中时，它与LacI蛋白结合并且LacI-IPTG复合物与DNA解离，允许转录进行。工程改造的LacI诱导系统的构建和表征导致广泛用于从蛋白质过表达到信号处理甚至染色体可视化的应用。

由于其普遍适用性和广泛表征，一小组规范的诱导型调节物(LacI，TetR，AraC，LuxR)被重复用于多种应用。其他充分表征的诱导型系统是可用的(PrpR，RhaRS，CymR，XylS)，但是除了CymR以外，它们受困于代谢物抑制和/或弱诱导。其他表达控制范例包括提供配体介导的翻译控制的核糖开关和光调控的光遗传系统，这是对化学诱导的补充。

发明内容

本公开的实施方式涉及鉴定对于从细菌菌株群产生代谢物优化的细菌菌株的方法。本文所述的方法可用于从数百万个效力较低的菌株中快速鉴定出用于化学生产的最佳菌株。本文描述的实施方式旨在适用于广泛范围的化学物质，所述化学物质可由具有经遗传修饰以包含所需化学物质的合成途径的基因组的微生物合成。

根据一个方面，微生物的基因组被经遗传修饰以包括编码代谢物结合分子(在本文中可被称为“传感器”，使得代谢物结合分子结合代谢物并直接或间接“感知”代谢物的存在)的DNA序列，例如合成的或外来的DNA序列。当DNA被包括或插入到微生物的基因组中时，所得到的微生物可以被称为重组微生物。根据一个方面，传感器或代谢物结合分子是变构生物分子，其在结合所需的化学物质或代谢物时经历构象变化，导致基因调节变化。传感器及其相应的结合伴侣是本领域技术人员已知的，并且包括变构分子，如转录因子(其结合DNA以调节结合的DNA序列的表达)，核糖开关，双组分信号传导蛋白和核激素受体。

微生物的基因组也被遗传修饰以包括编码可检测分子或报告物，例如荧光化合物，蛋白质或分子的DNA。表达时，传感器调节微生物中报告物的产生。根据传感器的性质，其可以通过在不存在代谢物的情况下抑制，在存在代谢物的情况下激活，在不存在代谢物的情况下封闭核糖体结合位点等，以及本领域技术人员已知的其他方法来调节报告物的产生。如果在微生物内产生诸如荧光分子的报告物，则可以通过本领域技术人员已知的方法对其进行检测。根据一个方面，荧光水平与所产生的代谢物的量成比例。可以实时检测荧光水平以提供随时间产生的代谢物的量的指示。

根据一个方面，代谢物生产是荧光的函数，其可以实时检测并且随时间监测以确定荧光的增加和减少。因此，可以检测到最佳荧光以允许从减少的产量或不需要量的代谢物的细胞中分离和分选产生所需量的代谢物的细胞。根据一个方面，提供了一种用于确定从群内产生不需要量的代谢物或不产生代谢物的细胞中分离该群内产生所需量的代谢物的细胞的最佳所需时间的方法。然后可以鉴定分离的细胞内的酶和细胞过程并将其用于细胞(即，相同或不同种类的细胞)或无细胞系统如固定化酶反应器中以产生所需量的代谢物。

微生物也已被遗传修饰以包括编码基因的DNA以产生作为传感器的结合伴侣的代谢物。或者，微生物中的内源基因可以产生代谢物。代谢物是需要由微生物产生的目标化学物质。可以是DNA结合分子的传感器在表达时将与代谢物结合。以这种方式，遗传修饰的微生物可以感知其自身的化学物质生产水平，只要传感器能够感知代谢物在微生物内的存在即可。当代谢物由细胞产生时，代谢物以调节报告物基因的方式与传感器结合，结果，微生物产生的报告物与微生物产生的代谢物结合伴侣的量成比例。

根据一个方面，选择的菌株经历旨在优化代谢物生产的遗传修饰，其中通过用大量半随机化学生产设计使微生物群(通常约10亿量级)多样化来优化代谢物的产生。可以筛选遗传修饰的菌株产生报告物并因此产生代谢物的能力。通过检测报告物确定产生所需量的代谢物的群内的细胞可以被选择、分离和生长以产生具有所需的代谢物生产的细胞群(原始群的亚群)。一种选择的菌株可以进行重复轮次的遗传修饰和筛选以产生具有优化的代谢物生产的菌株。因此，另外的方面包括通过鉴定产生增加量的报告物的菌株来鉴定针对代谢物的产生而优化的菌株。

根据一个方面，提供了选择用于产生代谢物的微生物亚组的方法，其中所述微生物群已经遗传修饰以包括编码报告物分子的外源或外来DNA，其中所述微生物群已经遗传修饰以包括编码传感器的外源或外来DNA，所述传感器在表达时调节由微生物产生报告物，其中所述微生物群已经遗传修饰以包括传感器的代谢物结合伴侣的外源或外来DNA编码途径基因或其可能已经将DNA编码途径基因包括到代谢物结合伴侣中，所述代谢物结合伴侣在表达时与DNA结合分子结合，以依赖于表达的代谢物浓度的方式诱导报告物分子，并且基于报告物的检测选择产生足够代谢物的微生物亚组。

根据一个方面，传感器是转录因子，核糖开关，双组分信号传导蛋白或核激素受体。

根据一个方面，代谢物与传感器的结合激活基因表达，以依赖于表达的代谢物浓度的方式诱导报告物的产生。

根据一个方面，代谢物与DNA结合蛋白的结合抑制基因表达，以依赖于表达的代谢物浓度的方式诱导报告物的产生。

根据一个方面，遗传修饰微生物亚组以改变产生代谢物的基因的步骤包括多重自动化基因组工程改造。

根据一个方面，提供了选择用于产生代谢物的微生物亚群的方法，其中所述微生物群已经遗传修饰以包括编码报告物的外源或外来DNA，其中所述微生物群已经遗传修饰以包括编码传感器的外源或外来DNA，所述传感器在表达时调节微生物产生报告物，其中所述微生物群可以经或可以不经遗传修饰以包括途径基因以产生传感器的代谢物结合伴侣，其当表达时与传感器结合，从而以依赖于表达的代谢物的浓度的方式诱导报告物产生，基于报告物的检测筛选微生物，重复遗传修饰微生物以改变产生代谢物的基因并基于报告物的检测筛选微生物，产生一个所需的微生物汇集。

根据一个方面，提供了选择用于产生代谢物的微生物亚组的方法，其包括提供微生物群，其中微生物群已经遗传修饰以包括编码报告物的外源DNA，其中微生物群已经遗传修饰以包括编码传感器生物分子的外源DNA，其当表达时调节微生物表达该报告物，其中微生物群已经遗传修饰以包括外源DNA编码基因以产生传感器的代谢物结合伴侣，并且其中所述微生物产生与所述传感器结合的代谢物结合伴侣，以依赖于产生的代谢物浓度的方式诱导报告物的表达，并且通过检测报告物来筛选微生物群以鉴定微生物亚组。根据一个方面，报告物是一种荧光蛋白。根据一个方面，筛选通过荧光激活细胞分选进行。根据一个方面，传感器生物分子和代谢物结合伴侣是本领域技术人员已知的成员对。根据一个方面，该方法还包括遗传修饰微生物亚组以改变直接或间接影响代谢产物产生的基因，并通过检测报告物筛选微生物亚组以鉴定后续的微生物亚组。

根据一个方面，提供了修饰微生物以包含对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括遗传修饰微生物以包括编码传感器生物分子的外源DNA，所述外源DNA调节编码微生物表达蛋白质的基因，遗传修饰所述微生物以包括外源DNA编码基因以产生对应于所述传感器的代谢物，并且其中所述微生物产生与所述传感器结合的代谢物，以依赖于所产生的代谢物的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达，并且其中所述传感器是AcuR并且代谢物是丙烯酸盐或者其中传感器是ttgR并且代谢物是苯酚。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

根据一个方面，提供微生物，其中所述微生物经遗传修饰以包含编码传感器生物分子的外源DNA，所述传感器生物分子调节微生物表达编码蛋白质的基因，并且其中所述微生物经遗传修饰以包含外源DNA编码基因以产生代谢物，并且其中所述微生物产生与所述传感器生物分子结合的代谢物，以依赖于产生的丙烯酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达，并且其中所述传感器是AcuR并且所述代谢物是丙烯酸盐或者其中所述传感器是ttgR并且所述代谢物是苯酚。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

根据一个方面，提供了修饰微生物以包含对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括遗传修饰所述微生物以包括编码prpR传感器生物分子的外源DNA，所述生物分子调节编微生物表达码蛋白质的基因，遗传修饰微生物以包括编码外源DNA的基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成2-甲基柠檬酸盐，并且其中微生物产生与prpR传感器结合的2-甲基柠檬酸盐，以依赖于2-甲基柠檬酸盐浓度的方式诱导蛋白质的表达。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

根据一个方面，提供了微生物，其中微生物经遗传修饰以包含编码prpR传感器生物分子的外源DNA，所述prpR传感器生物分子调节微生物表达编码蛋白质的基因，并且其中所述微生物经遗传修饰以包含外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成2-甲基柠檬酸盐，并且其中微生物产生结合prpR传感器生物分子的2-甲基柠檬酸盐，以依赖于产生的2-羟基丙酸盐浓度的方式诱导蛋白质的表达。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

根据一个方面，提供了修饰微生物以包含对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括遗传修饰所述微生物以包括编码acuR传感器生物分子的外源DNA，所述生物分子调节编微生物表达码蛋白质的基因，遗传修饰微生物以包括编码外源DNA的基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成丙烯酸盐，并且其中微生物产生与acuR传感器结合的丙烯酸盐，以依赖于丙烯酸盐的浓度的方式诱导蛋白质的表达。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

根据一个方面，提供了微生物，其中微生物经遗传修饰以包含编码acuR传感器生物分子的外源DNA，所述prpR传感器生物分子调节微生物表达编码蛋白质的基因，并且其中所述微生物经遗传修饰以包含外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成丙烯酸盐，并且其中微生物产生结合acuR传感器生物分子的丙烯酸盐，以依赖于产生的丙烯酸盐浓度的方式诱导蛋白质的表达。根据一个方面，微生物经遗传修饰以包括编码蛋白质的外源DNA。根据一个方面，蛋白质是一种荧光蛋白。根据一个方面，蛋白质是毒素的解毒剂。

本发明的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图简要说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1A和图1B描述了诱导型系统的诱导动力学。对于诱导型系统的高拷贝(图1A)和低拷贝(图1B)的实施，荧光响应与诱导剂浓度之间的关系以95％置信带(n＝3)表示。这些图是对数标度以捕获诱导剂浓度和生物传感器响应的广泛范围。诱导剂浓度对于高拷贝和低拷贝的实施都是相同的。每条曲线都与诱导剂浓度范围的颜色编码表相匹配。

丙烯酸盐和无水四环素(aTC)以2倍递增增加，而阿拉伯糖，葡糖二酸盐，红霉素和柚皮素以3倍递增增加。诱导化学物质和生物传感器名称分别在表格的左侧和右侧显示。灰色带是不含荧光报告物的对照菌株的荧光响应。加入诱导化学物质15小时后进行荧光测量。

图2描绘了低拷贝葡糖二酸盐(CdaR)，红霉素(MphR)，丙烯酸盐(AcuR)和柚皮素(TtgR)生物传感器的诱导和生长动力学。化学物质诱导剂在0时加入，并观察荧光8小时。下图显示随时间推移的诱导培养物的光密度。诱导水平以阴影表示，较暗的颜色表示较高的诱导剂浓度。葡糖二酸盐诱导水平是40mM，13mM，4.4mM，1.5mM，0.49mM，和无诱导剂添加。红霉素诱导水平为1400μM，450μM，150μM，51μM，17μM，和无诱导剂添加。丙烯酸盐诱导水平是5mM，2.5mM，1.3mM，0.63mM，0.31mM，和无诱导剂添加。柚皮素诱导水平是9mM，3mM，0.33mM，0.11mM，0.037mM，和无诱导剂添加。荧光和光密度如本文所述进行标准化。平均值的标准误差用95％置信区间表示(n＝3)。

图3描绘了拟合诱导型基因表达模型的高拷贝启动子活性。各诱导型启动子的最大表达速度在各种诱导水平(点)下确定。数据拟合至Hill函数，其经修改以说明基础和最大启动子活性(绿线)。无水四环素(TetR)，丙烯酸盐(AcuR)和柚皮素(TtgR)生物传感器均显示出高诱导协同性。阿拉伯糖(AraC)，葡糖二酸盐(CdaR)和红霉素(MphR)生物传感器显示低或中等水平的协同性。由于高毒性(红点)，从模型数据中省略了10mM丙烯酸盐诱导条件。误差棒反映了测量的表达速度的95％置信区间。

图4描绘了通过流式细胞术评估的单个细胞响应化学诱导的行为。对于每个高拷贝生物传感器，观察到来自未诱导(灰色)，部分诱导(绿色)和完全诱导(蓝色)群的100,000个细胞。图中显示了诱导剂的具体浓度。用双指数标度绘制柱状图以呈现宽范围的生物传感器激活。没有大的，充分分散的双峰分布表明大量荧光测量反映了单个细胞的诱导行为。

图5描绘了在宽范围浓度下评估的每种诱导剂化学物质的毒性。在指数生长阶段，测量每种化学物质和浓度组合的生长速率。将比率标准化至没有任何添加的化学物质的细胞的生长速率并以棒高度作图。表中显示了每种诱导剂的浓度，对应于条形图的顺序和颜色。包括乙醇和DMSO，因为它们分别是aTC和柚皮素的溶剂。红霉素进行了两次评估：有和没有红霉素抗性基因，eryR。诱导剂浓度反映了诱导实验中使用的浓度。

图6描述了化学诱导剂激活非目标传感器的评估潜力。新诱导剂的交叉反应性以及其他常用的诱导剂和诱导剂溶剂的选择对六种可诱导系统中的每一种进行评估。在每个可诱导系统的基础关闭状态之上的倍数诱导被绘制为高度(n＝3)。没有观察到交叉反应性。

图7描述了转化到相同细胞中的相容性CdaR-GFP，AcuR-CFP和MphR-mCherry生物传感器。通过流式细胞术评估独立控制这些生物传感器的潜力。等基因细胞群暴露于无诱导剂(橙色)，葡糖二酸盐(浅蓝色)，丙烯酸盐(深绿色)，红霉素(深蓝色)，葡糖二酸盐和丙烯酸盐(红色)，葡糖二酸盐和红霉素(棕褐色)，红霉素和丙烯酸盐(粉红色)，或葡糖二酸盐、丙烯酸盐和红霉素(浅绿色)。当在三个荧光通道中表征时，八个二元诱导组合导致八个不同的细胞群。点云(每个点代表10,000个细胞中的1个)被投影到立方体的面上以辅助3D空间的可视化。所有的轴都是对数刻度来捕捉大范围的荧光响应。

图8描绘了与葡糖二酸盐滴度高度相关的CdaR生物传感器的激活。可以通过酶MIOX和Udh由肌醇产生葡糖二酸盐。将MIOX直系同源物转化成含有Udh和CdaR生物传感器的细胞。加入肌醇48小时后观察到荧光。在没有葡糖二酸生物传感器的相同菌株中在相同时间段后测量葡糖二酸盐滴度。所有变异系数均小于10％(n＝3)。

图9描绘了正在评估的TtgR生物传感器辅助酶促酚生产的定向进化的能力。在0.1％苯酚存在下观察到荧光响应，而当用前体分子苯诱导传感器时观察到背景水平的荧光。儿茶酚是苯酚生产的副产物，并没有激活传感器。所有的试验重复三次。

图10描绘了低拷贝葡糖二酸盐(CdaR)，红霉素(MphR)，丙烯酸盐(AcuR)和柚皮素(TtgR)生物传感器的诱导和生长动力学。化学物质诱导物在0时加入，并观察荧光8小时。下图显示随时间推移的诱导培养物的光密度。诱导水平以阴影表示，较暗的颜色表示较高的诱导剂浓度。葡糖二酸盐诱导水平是13mM，4.4mM，1.5mM，0.49mM，0.17mM和无诱导剂添加。红霉素诱导水平为150μM，51μM，17μM，5.6μM，1.9μM，和无诱导剂添加。丙烯酸盐诱导水平是5mM，2.5mM，1.3mM，0.63mM，0.31mM，和无诱导剂添加。柚皮素诱导水平是9mM，3mM，0.33mM，0.11mM，0.037mM，和无诱导剂添加。荧光和光密度如本文所述进行标准化。平均值的标准误差用95％置信区间表示(n＝3)。

图11描绘了高拷贝和低拷贝阿拉伯糖(AraC)和无水四环素(TetR)生物传感器的诱导和生长动力学。化学物质诱导物在0时加入，并观察荧光8小时。下图显示随时间推移的诱导培养物的光密度。诱导水平以阴影表示，较暗的颜色表示较高的诱导剂浓度。阿拉伯糖诱导水平为490μM，170μM，55μM，18μM，和无诱导剂添加。无水四环素诱导水平为430nM，210nM，110nM，53nM，和无诱导剂添加。荧光和光密度如本文所述进行标准化。平均值的标准误差用95％置信区间表示(n＝3)。

图12描绘了低拷贝启动子活性拟合至诱导型基因表达模型。各诱导型启动子的最大表达速度在各种诱导水平(点)下确定。数据拟合至Hill函数，其经修改以说明基础和最大启动子活性(绿线)。无水四环素(TetR)和柚皮素(TtgR)生物传感器显示出高诱导协同性。阿拉伯糖(AraC)，葡糖二酸盐(CdaR)，丙烯酸盐(AcuR)和红霉素(MphR)生物传感器显示低或中等水平的协同性。由于高毒性(红点)，从模型数据中省略了10mM丙烯酸盐，1400μM和450μM红霉素诱导条件。误差棒反映了测量的表达速度的95％置信区间。

图13描绘了通过流式细胞术评估的单个细胞响应化学诱导的行为。对于每个低拷贝生物传感器，观察到来自未诱导(灰色)，部分诱导(绿色)和完全诱导(蓝色)群的100,000个细胞。图中显示了诱导剂的具体浓度。用双指数标度绘制柱状图以呈现宽范围的生物传感器激活。没有大的，充分分散的双峰分布表明大量荧光测量确实反映了单个细胞的诱导行为。

图14是显示从葡萄糖到3HP的一种生物途径以及将3hP转化成用于感测的化合物所必需的酶促反应的示意图。

图15A，图15B和图15C描述了基于prpR的3-羟基丙酸盐(3HP)生物传感器的发展。图15A描绘了来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的pcs和内源性prpC的两种辅助酶将3HP转化为prpR-结合化合物2-甲基柠檬酸盐。图15B是描绘外源提供的3HP在含有生物传感器的细胞(绿色条)中触发荧光应答的图。增加3HP的浓度导致更高的荧光输出。在没有辅助酶pcs(灰色条)的情况下，没有观察到生物传感器激活。图15C是描绘生物传感器的荧光响应在一小时后开始并在十小时后达到90％饱和(绿线)的图。基础诱导随时间增加，但保持较低(灰线)。误差棒和置信带代表95％置信区间(n＝3)。

图16A，图16B和图16C描述了基于acuR的3-羟基丙酸盐(3HP)生物传感器的发展。图16A描绘了两种异源辅助酶，即pcs的截短形式(pcs^Δ3)和丙烯酰-CoA水解酶ach，将3HP转化成acuR-结合化合物丙烯酸盐。图16B是描绘外源提供的3HP在含有生物传感器的细胞(蓝色条)中触发荧光应答的图。更高浓度的3HP导致更高的荧光输出。在没有辅助酶pcs^Δ3和ach(灰色条)的情况下，没有观察到生物传感器激活。图16C是描绘生物传感器对3HP的荧光响应立即开始并在8小时后达到90％饱和(蓝线)的图。丙烯酸盐的诱导最初更快，但达到相同的最终荧光(绿线)。在实验期间，基础诱导是低的(灰线)。误差棒和置信带代表95％置信区间(n＝3)。

图17是描述不含辅助质粒的含有丙烯酸盐生物传感器的细胞响应丙烯酸盐而不响应3HP的图。

图18是描绘基于prpR的3HP生物传感器对递增3HP浓度的响应的图。绿色条显示响应3HP的完整系统，而灰色条显示单独的prpR传感器不能检测到3HP。

图19是描绘基于acuR的3HP生物传感器对递增3HP浓度的响应的图。蓝色条显示对3HP量的增加有响应的完整系统，而灰色条显示acuR传感器本身针对3HP的存在发生反应。

图20A，图20B，图20C，图20D，图20E和图20F描绘了通过荧光观察到的3-羟基丙酸盐的形成。图20A是描绘3HP可由葡萄糖通过将丙二酰-CoA转化为丙二酸半醛然后转化为3HP而产生的示意图。丙二酰-CoA还原酶(mcr)既进行这些反应，又与脂肪酸生物合成竞争丙二酰-CoA。图20B是描述基于prpR的3HP生物传感器实时报告3HP生产过程的图。浅蓝菌素的加入增加了丙二酰-CoA集，带来了3HP产生的突增(紫线)。IPTG的添加增加mcr活性并进一步增加3HP产生(蓝线)。浅蓝菌素和IPTG对没有mcr(灰线和黑线)的细胞的荧光响应没有影响。图20C是描述基于prpR的生物传感器的终点荧光的图。图20D是描述基于acuR的3HP生物传感器实时报告3HP生产过程的图。加入50mM葡萄糖(棕褐线)导致荧光相比背景(灰线)略微增加。IPTG的加入增加了mcr的活性和生物传感器的活化(橙线)。一起提供葡萄糖，IPTG和浅蓝菌素导致最高速率的生物传感器激活(红线)。图20E是描绘当与未优化的培养条件(葡萄糖，紫色条)相比时，基于acuR的生物传感器的终点荧光显示在优化的培养条件(葡萄糖，IPTG，浅蓝菌素)下荧光增加约5倍。在没有mcr的情况下，培养条件对生物传感器活化(蓝色条)没有影响。图20F是描述评估通过生物传感器活化评估的培养条件的3HP产生的图。通过LC/MS测量滴度，并发现对应于生物传感器激活。用葡萄糖，IPTG和浅蓝菌素实现了4.2g/L的3HP的纪录。误差棒和置信带代表95％置信区间(n＝3)。荧光测量以任意单位进行，不同组图不应该进行定量比较。

图21A，图21B和图21C描绘了葡糖二酸盐产生的实时观察。图21A是描述可以通过表达三种具有各种活性的异源酶从葡萄糖产生葡糖二酸盐的示意图。Udh具有高活性，MIOX具有低活性，Ino1与糖酵解竞争葡萄糖-6-磷酸。葡糖二酸盐的存在激活了生物传感器。图21B是描述加入到培养基中的葡糖二酸盐生物合成中间体的图。随着中间体被转化成葡糖二酸盐，随时间推移观察到荧光。葡萄糖醛酸盐(蓝线)的生物传感器活化滞后于葡糖二酸盐(绿线)的活化。葡糖二酸盐和葡糖醛酸盐的活化速度都比肌醇(紫线)或葡萄糖(棕褐线)活化要快，反映了生物合成途径的动力学。终点荧光与LC/MS测定葡糖二酸盐滴度的趋势一致。图21C是描绘在不存在葡糖二酸盐生物合成途径的情况下，不存在来自任何途径中间体的生物传感器活化或葡糖二酸盐产生(通过LC/MS测定)。葡糖二酸盐的添加导致生物传感器激活(绿线)。误差棒和置信带代表95％置信区间(n＝3)。

图22是描绘作为生物传感器输出的函数绘制的葡糖二酸盐滴度的图。低荧光是低滴度的良好指标，而高荧光则表示高生产滴度。

图23A，图23B和图23C描绘了黏康酸盐产生的实时观察。图23A是描述通过表达三种异源酶从葡萄糖产生黏康酸盐的示意图。黏康酸盐生物合成的关键步骤是3-脱氢莽草酸盐(DHS)向原儿茶酸盐(PC)的转化。图23B是描绘1小时后添加黏康酸盐途径中间体并随时间监测荧光的图。每个晚期途径中间体在一小时内激活生物传感器。葡萄糖向黏康酸盐的转化要慢得多(粉红线)。图23C是描绘荧光的终点测量的图，该测量显示黏康酸盐生物合成途径是途径中间体的生物传感器激活所必需的图(上组图)。途径的存在使得前体能够触发生物传感器。与处于代谢途径上游远处的位置一致，葡萄糖是实现较低荧光的唯一底物(粉红色条-中间组图)。在没有葡萄糖的情况下观察到背景荧光(灰色条-中间组图)。通过HPLC测定黏康酸盐上清滴度。DHS(紫色条-底组图)产生的黏康酸盐少于随后的中间体(蓝色，绿色条-底组图)。从葡萄糖(粉红色条-底组图)产生的黏康酸盐低于通过HPLC定量的极限。误差棒和置信带代表95％置信区间(n＝3)。

具体实施方式

本公开的方面涉及确定和/或观察细胞中的目标化合物或代谢物生产，所述细胞经遗传修饰以包含传感器(其在本文中也可称为“生物传感器”)和报告物或检测物系统。细胞还可以经遗传修饰以包括用于产生目标化合物或代谢物的途径。生物传感器是一种产生蛋白质，例如与细胞内目标化合物或代谢物的量成比例的可检测蛋白质的小分子诱导系统。该途径由从所需起点(通常是低成本原料如葡萄糖或生物质)产生目标化合物或代谢物所必需的所有基因组成。目标化合物或代谢物形成的速率根据所供应的中间体的量，从该中间体到最终产物的反应数量以及这些反应发生的速度而变化。最终滴度取决于这些因素以及分流到副产物中或被细胞用作能量的起始材料的量。目标化合物或代谢物生产的途径可以在文献中获得，或者可以由本领域技术人员确定。

本公开的实施方式涉及可用于使用筛选方法(例如荧光检测和测量或选择方法，如抗生素抗性)鉴定产生细胞代谢物的细胞的方法，系统和化合物。筛选和选择方法都被考虑用于本文所述的实施方式。如本文所述的荧光筛选方法提供了对代谢物生产的实时观察。随时间可以观察到荧光的增加或减少，并且荧光的增加或减少与由细胞产生的代谢物的量成比例。根据一个方面，细胞经遗传修饰以包括当表达时产生代谢物的一种或多种核酸。细胞经遗传修饰以包括当表达时产生代谢物传感器的一种或多种核酸。细胞经遗传修饰以包括当表达时产生报告物的一种或多种核酸。本公开范围内的报告物包括本领域技术人员已知的那些。报告物可以提供可以检测到的光。报告物在表达时可能对细胞有毒性导致细胞死亡。这里描述的传感器也可以被称为生物传感器。这些术语可以互换使用。根据某些方面，传感器是变构传感器。根据某些方面，传感器是例如荧光蛋白生产或解毒剂或毒素生产的调节物。根据报告物是荧光分子的一个方面，细胞内代谢物的存在导致传感器诱导产生可被检测的荧光分子。根据一个方面，检测到的荧光的量或强度与由细胞产生的代谢物的量成比例。以这种方式，可以鉴定产生更大量代谢物的细胞，并任选地分离，并进一步任选地生长，从而可以产生具有显着的或所需的或增加的代谢物生产的细胞群。根据这个方面，可以结合或“感知”代谢物的存在并且还调节荧光分子的产生的传感器可以用于产生所需量的代谢物的细胞的高通量筛选方法中。使用例如，在Dietrich,J.A.,McKee,A.E.和Keasling,J.D.(2010)高通量代谢工程改造：小分子筛选和选择进展(High-ThroughputMetabolic Engineering:Advances in Small-Molecule Screening and Selection).Annu Rev Biochem,79,563-590中描述的方法，在高通量单细胞测量或由遗传修饰产生的代谢物生产的多重鉴定方法中将传感器与荧光报告物基因表达偶联，在此通过引用全文纳入本文。

根据本文所述的方面，代谢物响应性生物传感器调节荧光报告物并提供代谢物生产和内部细胞状态的实时观察。

根据某些方面，提供了将基因表达置于目标化合物或代谢物浓度控制下的方法。转录因子与待控基因的启动子区域结合，促进或抑制该基因的转录。转录因子又由效应分子如目标化合物或代谢物的结合来控制。当存在更多的效应分子时，转录因子促进转录，并产生更多的目标蛋白。在简单的情况下，效应分子是目标化合物或感兴趣的代谢物，并且目标化合物或感兴趣的代谢物的产生直接调节转录因子。根据一个方面，感兴趣的化学物质不具有与其结合的已知转录因子。因此，目标化合物或代谢物被化学或酶促转化成为衍生分子，其是具有转录因子的效应分子。以这种方式，目标化合物或感兴趣的代谢物的产生间接调节转录因子。然而，转录因子的调节与所产生的目标化合物或代谢物的量成比例。

根据一个方面，提供了使用与细胞荧光偶联的遗传编码的生物传感器来鉴定代谢物的方法。遗传编码的生物传感器通过使用变构转录因子将荧光蛋白的表达与目标代谢物的细胞内浓度联系起来。

本文所用的荧光监测方法利用，例如许多常见的代谢中间体已知的变构转录调节剂，例如丙酮酸(Ogasawara,H.,Ishida,Y.,Yamada,K.,Yamamoto,K.和Ishihama,A.(2007)PdhR(丙酮酸脱氢酶复合物调节物)控制大肠杆菌中的呼吸电子传递系统(PdhR(pyruvatedehydrogenase complex regulator)controls the respiratory electron transportsystem in Escherichia coli).J Bacteriol,189,5534-55410)，磷酸烯醇丙酮酸(Cortay,J.C.,Negre,D.,Galinier,A.,Duclos,B.,Perriere,G.和Cozzone,A.J.(1991)大肠杆菌中乙酸操纵子的调节-Icir阻遏物的纯化和功能表征(Regulation of the AcetateOperon in Escherichia-Coli-Purification and Functional-Characterization ofthe Icir Repressor).Embo J,10,675-679)，柠檬酸盐(Martin,M.G.,Magni,C.,deMendoza,D.和Lopez,P.(2005)CitI，一种参与调节乳酸细菌中柠檬酸盐代谢的转录因子(CitI,a transcription factor involved in regulation of citrate metabolism inlactic acid bacteria).J Bacteriol,187,5146-5155)，乳酸盐(Gao,C.,Hu,C.H.,Zheng,Z.J.,Ma,C.Q.,Jiang,T.Y.,Dou,P.P.,Zhang,W.,Che,B.,Wang,Y.J.,Lv,M.等，(2012)乳酸利用受到铜绿假单胞菌中FadR型调节物LldR的调节(Lactate Utilization Is Regulatedby the FadR-Type Regulator LldR in Pseudomonas aeruginosa).J Bacteriol,194,2687-2692)，不饱和脂肪酸(Henry，MF和Cronan，JE(1991)同时激活脂肪酸合成和抑制脂肪酸降解的大肠杆菌转录因子(Escherichia-Coli Transcription Factor That BothActivates Fatty-Acid Synthesis and Represses Fatty-Acid Degradation).J MolBiol,222,843-849)和NADH(Wang,E.,Bauer,M.C.,Rogstam,A.,Linse,S.,Logan,D.T.和von Wachenfeldt,C.(2008)枯草芽孢杆菌转录阻遏物的结构和功能性质(Structure andfunctional properties of the Bacillus subtilis transcriptional repressorRex).Mol Microbiol,69,466-478)。如本文所述的细胞内遗传编码的生物传感器允许检测目标化合物(例如从葡萄糖或其他起始材料)的产生。每个细胞以与其产生目标化合物的能力成比例的速率表达荧光蛋白或其他报告物，由此提供筛选具有所需的目标化合物产生特性的细胞的方法。示例性的筛选方法包括流式细胞术方法和在Sint Fiet,S.,van Beilen,J.B.和Witholt,B.(2006)选择用于化学合成的生物催化剂(Selection of biocatalystsfor chemical synthesis).Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,103,1693-1698或Dietrich,J.A.,Shis,D.L.,Alikhani,A.和Keasling,J.D.(2013)用于微生物小分子生物合成的基于转录因子的筛选和合成选择(Transcription factor-based screens and synthetic selections for microbialsmall-molecule biosynthesis).ACS synthetic biology,2,47-58中公开的那些，其各自通过引用全文纳入本文。

传感器/代谢物对

根据某些方面，已知的传感器/代谢物对可以用于本文所述的荧光监测方法中，其中传感器与代谢物的结合导致由细胞产生荧光分子。示例性的已知传感器/代谢物对包括下表1中显示的那些。其它则是本领域已知的。

表1

根据本文所述的某些方面，可以基于以下考虑来选择传感器/代谢物对：(1)刺激强度和电路激活之间的关系；(2)生物传感器对刺激的响应时间；(3)同基因群中细胞之间生物传感器激活的异质性和/或(4)与其他生物传感器的刺激的交叉反应性。示例性的生物传感器是有用的DNA结合蛋白，其具有同源启动子/操纵子并且由目标化合物，例如可以通过代谢工程改造酶促产生的代谢物诱导。

应该理解的是，传感器及其相应的代谢物结合伴侣的实施例仅是示例性的，并且本领域技术人员可以容易地鉴定用于本公开的其他传感器及其相应的代谢物结合伴侣。意图使转化的微生物在合适的条件下表达传感器和代谢物。

用于产生任何特定代谢物结合伴侣的生物合成途径是本领域技术人员已知的。传感器序列是本领域技术人员已知的，例如，基于公开的文献检索。例如，上述代谢物结合伴侣和传感器的生物合成途径完全描述于以下：cdaR(Monterrubio等，2000J.Bacteriol 182(9):2672-4)，tetR(Lutz和Bujard Nucleic Acids Res.1997 25(6):1203-10)，alkS(Canosa等，Mol Micriobiol 2000 35(4):791-9)，ttgR(Teran等，Antimicrob AgentsChemother.47(10):3067-72(2003))，btuB核糖开关(Nahvi等，Nucleic Acids Res.32:143-150(2004))；葡糖二酸(Moon等，Appl Env Microbiol.75:589-595(2009))，柚皮素(Santos等，Metabolic Engineering.13:392-400(2011))，烷烃(Steen等，463:559-562(2009))，钴胺素(Raux等，Cell Mol Life Sci.57:1880-1893.(2000))，黏康酸(Niu等，Biotechnol Prog.18:201-211.(2002))，其各自通过引用全文纳入本文。本文所述的方法可用于将所述核酸插入有利于生成传感器和代谢物结合伴侣的微生物的基因组。

根据某些方面，细胞可以经遗传工程改造或修饰以包括当表达时产生一种或多种目标化合物或目标代谢物的一种或多种核酸。根据某些方面，细胞可以经遗传工程改造或修饰以包括当表达时产生一种或多种传感器分子的一种或多种核酸。根据某些方面，细胞可以经遗传工程改造或修饰以包括当表达时产生一种或多种报告物分子或系统的一种或多种核酸。

根据某些方面，细胞可以经遗传工程改造或修饰以包括当表达时产生一种或多种目标化合物或目标代谢物的一种或多种核酸，当表达时产生一种或多种传感器分子的一种或多种核酸，和/或当表达时产生一种或多种报告物分子或系统的一种或多种核酸。

根据某些方面，细胞可以经遗传工程改造或修饰以包括一种或多种当表达时产生多种目标化合物或目标代谢物的核酸，当表达时产生多种传感器分子的一种或多种核酸，和/或当表达时产生多种报告物分子或系统的一种或多种核酸。根据一个方面，一种或多种报告物分子可以是具有代表一种或多种给定代谢物的特定荧光分子的荧光分子。

根据某些方面，可以对细胞进行遗传工程改造或修饰以表达多种代谢物和相应的多种传感器分子。细胞还可以经遗传工程改造或修饰以表达多种荧光分子，其具有代表一种或多种给定代谢物的特定荧光分子。根据一个方面，每种代谢物具有相应的独特荧光分子，从而可以检测到不同的荧光分子，表明不同的代谢物正由细胞产生。根据这个方面，每个传感器与其他传感器正交，并与其他常见的可诱导系统正交。单细胞可以经遗传修饰以表达不同的代谢物，每种代谢物被相应的不同荧光分子检测。

本文中所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的，并且描述于Sambrook,J.、Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)，第2版；冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)：纽约州冷泉港，(1989)，和Silhavy,T.J.、Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusions)；冷泉港实验室：纽约州冷泉港，(1984)；和Ausubel,F.M.等，《新编分子生物学方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，格林出版和韦利科学公司(Greene Publishing and Wiley-Interscience)(1987)，其各自通过引用其全文纳入本文。

其它有用的方法在多种手册中描述，包括《先进细菌遗传学》(AdvancedBacterial Genetics)(Davis,Roth和Botstein，冷泉港实验室，1980)，《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusions)(Silhavy，Berman和Enquist，冷泉港实验室，1984)，《分子遗传学实验》(Experiments in Molecular Genetics)(Miller，冷泉港实验室，1972)，细菌遗传学实验技术(Experimental Techniques in Bacterial Genetics)(Maloy，刊于Jones和Bartlett，1990)，和《细菌遗传学短期课程》(A Short Course inBacterial Genetics)(Miller，冷泉港实验室，1992)，其各自通过引用其全文纳入本文。

微生物可经遗传修饰以通过本领域技术人员已知的方法删除基因或引入基因。可用于转化多种宿主细胞的载体和质粒是常见的，并且可市售购自如下公司，例如英杰公司(Invitrogen Corp.)(加利福尼亚卡尔斯巴德)、司查塔基公司(Stratagene)(加利福尼亚拉荷亚)、新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs,Inc.)(马萨诸塞州贝弗利)和艾德基因公司(Addgene)(马萨诸塞州剑桥)。

载体或质粒通常包含引导相关的一种或多种基因的转录和翻译的序列，可选择的标志物，和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录启示控制的基因的5'区域和控制转录终止的DNA片段的3'区域。这两种控制区域可源自与转化的宿主细胞同源的基因，但是应理解，所述控制区域也可源自并非原始来自选作生产宿主的物种的基因。

用于驱动所需宿主细胞中相关通路编码区域表达的起始控制区或启动子众多，并且为本领域技术人员熟悉。实际上，能够驱动这些遗传元件的任何启动子均适于本发明，包括但不限于，lac、ara、tet、trp、IP_L、IP_R、T7、tac和trc(有利于大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas)中的表达)；amy、apr、npr启动子和多种噬菌体启动子，其有利于在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中表达；nisA(有利于在革兰氏阳性细菌中表达，Eichenbaum等Appl.Environ.Microbiol.64(8):2763-2769(1998))；和合成的P11启动子(有利于在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中表达，Rud等，Microbiology152:1011-1019(2006))。终止控制区域也可源自原始来自优选的宿主的多种基因。

某些载体能够在广泛范围的宿主细菌中复制，并且可通过偶联转移。pRK404的完全和标注的序列以及三种相关的载体s-pRK437、pRK442和pRK442(H)是可得的。证实这些衍生物是革兰氏阴性细菌的遗传操作中的有价值的工具(Scott等，Plasmid 50(1):74-79(2003))。广泛宿主范围的若干质粒衍生物Inc P4质粒RSF1010也可用于能够在一定范围的革兰氏阴性细菌中行使功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37，具有活性启动子，以及多个克隆位点，以允许革兰氏阴性细菌中的异源基因表达。

染色体基因替代工具也是广泛可得的。例如，广泛宿主范围复制子pWV101的热敏性变体已被修饰以构建质粒pVE6002，其可用于在一定范围的革兰氏阳性细菌中产生基因替代(Maguin等，J.Bacteriol.174(17):5633-5638(1992))。此外，体外转座体(transposome)可用于在来自市售来源(例如EPICENTRE.RTM.(威斯康星州麦迪逊))的多种基因组中产生随机突变。

可用于大肠杆菌转化的载体是常见且市售可得的。例如，所需的基因可从多种来源分离，克隆至修饰的pUC19载体上，并转化进入大肠杆菌宿主细胞。或者，可将编码所需的生物合成通路的基因分成多个操纵子，克隆至表达载体，并转化进入多个大肠杆菌菌株。

乳杆菌(Lactobacillus)属属于乳杆菌目家族，并且用于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和链球菌(Streptococcus)的多种质粒和载体可用于乳杆菌(Lactobacillus)。合适载体的非限制示例包括pAMβ1及其衍生物(Renault等，Gene 183:175-182(1996)；和O'Sullivan等，Gene 137:227-231(1993))；pMBB1和pHW800、pMBB1的衍生物(Wyckoff等Appl.Environ.Microbiol.62:1481-1486(1996))；pMG1，偶联型质粒(Tanimoto等，J.Bacteriol.184:5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等，Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等，Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等，Antimicrob.Agents Chemother.38:1899-1903(1994))。已经报道了来自植物乳杆菌的若干质粒(van Kranenburg R,Golic N,Bongers R,Leer R J,de Vos W M,Siezen R J,Kleerebezem M.Appl.Environ.Microbiol.2005March；71(3):1223-1230)，其可用于转化。

有用于驱动所需的乳杆菌宿主细胞中的相关通路编码区域的表达的起始控制区或启动子可获自乳杆菌或其它乳酸细菌，或其它革兰氏阳性生物体。非限制示例是来自乳球菌(Lactococcus)的nisA启动子。终止控制区也可源自原始来自优选宿主或相关细菌的多种基因。

用于所需的生物合成或其它所需通路的多种基因可被组装进入任意一种或多种合适载体，例如上文所述那些。单个载体不需要包括编码完整途径的所有遗传物质。如本文所述，可以在遗传修饰细胞的任何方面使用一种或多种或大量载体。密码子可经优化以用于基于从宿主菌株的基因组序列推测的密码子指数的表达，例如，用于植物乳杆菌或亚利桑那沙漠乳杆菌(Lactobacillus arizonensis)。可采用本领域已知的方法将质粒引入宿主细胞，例如，电穿孔，如下述参考文献中的任一项所述：Cruz-Rodz等(MolecularGenetics and Genomics 224：1252-154(1990))，Bringel和Hubert(Appl.Microbiol.Biotechnol.33：664-670(1990))，和Teresa Alegre，Rodriguez和Mesas(FEMS Microbiology Letters 241：73-77(2004))。也可通过偶联将质粒引入植物乳杆菌(Shrago，Chassy和Dobrogosz Appl.Environ.Micro.52：574-576(1986))。也可采用整合载体将所需的生物合成通路基因整合进入乳杆菌(Lactobacillus)的染色体(Hols等，Appl.Environ.Micro.60:1401-1403(1990)；Jang等，Micro.Lett.24:191-195(2003))。

可作为宿主细胞并且可经遗传修饰以产生本文所示的重组微生物的微生物可包括但不限于，埃希氏杆菌(Escherichia)、红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳杆菌(Lactobacillus)、酵母(Saccharomyces)、肠球菌(Enterococcus)和梭菌(Clostridium)属。特别合适的微生物包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

使用报告物筛选细胞的方法

本文描述的方法利用细胞表达的可检测报告物的检测和测量。示例性的可检测报告物包括荧光分子或荧光蛋白。示例性的荧光报告物包括在Shaner等，Nature methods，卷2，第12期，第905-909页(2005)中鉴定的那些，其全部内容通过引用并入本文。本领域技术人员已知的荧光报告物的示例性列表包括mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean和T-Sapphire等。

示例性的非荧光但发光的报告物包括萤光素酶及其衍生物，例如Thorne等Chemistry and Biology，卷17，第6期，第646-657页(2010)中公开的那些，其全部内容通过引用并入本文。本领域技术人员已知的非荧光报告物的示例性列表包括萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，介形类甲壳动物(CLuc)等。

遗传编码的生物传感器将细胞内代谢物水平与荧光蛋白表达联系起来，并使基于荧光的筛选成为可能。结合荧光激活细胞分选(FASC)，基于生物传感器的筛选可以提供高达1x10⁹设计/天的评估率。根据某些方面，可以设想任何评估细胞荧光的方法。细胞组可用96或384孔板中的荧光酶标仪进行评估，并可用于原型制造筛选系统。流式细胞术可以用于单独评估数百万个细胞。荧光激活细胞分选可用于分离具有最高荧光的细胞。这些高度荧光的细胞将产生最高量的目标化合物或代谢物。这些细胞可用于下一轮设计或选择用于商业化生产系统。

检测和/或测量荧光细胞的方法包括荧光激活细胞分选，如Herzenberg等，Clin.Chem.2002年10月；48(10):1819-27中所述，其全部内容通过引用并入本文。其他方法包括显微镜检查，例如可以使用显微镜观察大量细胞，并且可以鉴定和选择和分离荧光细胞，或者可以选择性地破坏非荧光细胞。其他方法包括微量滴定板测定法，例如在微量滴定板(如1536孔板或9600孔板)中通过自动完成的荧光顺序进行筛选。这种方法可以结合机器人处理和高通量筛选的典型高级酶标仪。其他方法包括乳液测定，例如，其中细胞可以被捕获在乳液中并使用微流体测定，如在Wang等，Nature Biotechnology，第32卷，第473-478页(2014)中所述，其全部内容通过引用并入本文。可以使用其他微流体测定来评估细胞，诸如在Guo等，Lab Chip,2012,12,2146-2155中所述的那些细胞，其全部内容通过引用并入本文。

不依赖于荧光或发光报告物的其他方法和测定可以用于根据本文所述的方法检测细胞。这样的方法包括那些使用转录但不一定是荧光或发光的那些方法。示例性方法包括下拉测定法，例如转录读出驱动细胞表面标记物的产生，其使得细胞粘附于表面，从而仅保留具有高代谢产物生产能力的细胞。其他方法包括萤光素酶高通量筛选，如Fan等，ASSAYand Drug Development Technologies，第5卷，第1期，第127-136页(2007)中所述，其全部内容通过引用并入本文。

使用解毒剂/毒素系统选择细胞的方法

根据本公开的使用传感器及其结合代谢物的选择方法允许展现特定表型的细胞存活。本文所述的方法利用解毒剂/毒素系统选择响应于目标化合物或代谢物而产生针对毒素的解毒剂的细胞。产生大量目标化合物或代谢物的细胞的选择通过用抗生素处理细胞群(通常高达100亿个)来完成。细胞只有在其产生解毒剂以响应大量的目标化合物或代谢物的情况下才能存活下来。产生最高量的目标化合物或代谢物的细胞将比产生稍低量的目标化合物或代谢物的细胞生长得快，并将主导该群。其结果是在产生目标化合物或代谢物方面表现优异的细胞的新培养物。根据某些方面，微生物经遗传修饰以包括编码针对毒素的解毒剂的一种或多种外源核酸。解毒剂和毒素对是本领域技术人员已知的并且包括SDS：tolC，大肠菌素：tolC(阴性选择)，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA(阴性选择)，5-氟乳清酸：URA3(阴性选择)。意图使转化的微生物在合适的条件下表达所述解毒剂。

用于生成任何具体解毒剂的基因是本领域技术人员已知的。例如，用于上述解毒剂的基因详细描述于：tetA(Postle等.Nucleic Acid Research 1984 12(12)4849-4863)、tolC(Fralick J.Bacteriol.1996 178(19)5803-5805)、氯霉素乙酰基转移酶(Shaw等J.Bacteriol.1970 104(3):1095-1105)。本文所述的方法可用于将所述核酸插入有利于生成DNA结合分子和代谢物结合伴侣的微生物的基因组。

根据一方面，所述转化的、重组微生物表达变构蛋白，所述传感器调节所述解毒剂的生成。表达时，所述传感器阻止细胞表达所述解毒剂基因，这通过阻断所述解毒剂的表达(即，阻遏物)或无法活化所述解毒剂的表达(即，活化物)来实现，除非所述传感器被目标代谢物结合，其通过改变传感器功能导致解毒剂表达。可采用数种调节机制：对于作为阻遏物的变构转录因子，阻遏蛋白通过将DNA 5'区域与解毒剂基因结合来阻断解毒剂基因的转录，除非所需的代谢物结合阻遏物；对于作为活化物的变构转录因子，只有当所需的代谢物结合活化物时，活化物才将RNA聚合酶募集至解毒剂基因的DNA 5'区域；对于减毒核糖开关，核糖开关在调节解毒剂基因转录的阻遏物的5'非翻译区中编码，并在与目标代谢物结合时减弱该阻遏物的翻译。根据另一方面，转化的重组微生物表达产生代谢物的生物合成基因，其以促进解毒剂产生的方式与传感器结合。根据一个方面，解毒剂的产生与由微生物产生并结合至传感器的代谢物结合伴侣的量成比例。在没有代谢物的情况下，传感器阻止解毒剂的产生。许多单独的传感器分子在细胞中表达。代谢物与传感器分子的结合是可逆事件，并且将单个传感器分子从其防止解毒剂表达的状态切换到允许解毒剂表达的状态。当代谢物浓度低时，与代谢物结合的传感器分子的比例在任何给定的时间是低的，因此解毒剂不表达或仅稍稍表达。随着代谢物浓度的增加，与代谢物结合的传感器分子的比例增加，导致解毒剂的较高表达。这引起解毒剂产生和代谢物水平的剂量依赖性。也就是说，由细胞产生的代谢物结合伴侣越多，传感器分子与代谢物分子结合的比例就越高，以产生更多的解毒剂。低于不产生解毒剂的浓度的代谢物浓度是检测阈值，并且高于解毒剂不会进一步产生的浓度的该代谢产物浓度是饱和点；这些限制引起了传感器-解毒剂系统的动态范围。

以下实施例是本发明的代表。这些实施例并不构成对本发明范围的限制，因为这些和其他等价实施方式将对于本发明、附图和所附权利要求而言是显而易见的。

实施例1

化学物质和试剂

除非另有说明，所有试剂都从西格玛公司(Sigma)(密苏里州圣路易斯)获得。从金生物技术(Gold Biotechnology)(密苏里州圣路易斯)获得抗生素和IPTG。无水四环素(aTC)获自克隆泰克实验室公司(Clontech)(加利福尼亚州山景城)。聚合酶链式反应(PCR)混合物购自卡帕生物系统公司(Kapa Biosystems)(马萨诸塞州威尔明顿)。将红霉素和aTC溶解在乙醇中，而柚皮素溶解在二甲亚砜中。所有其他诱导剂溶于去离子水中。

实施例2

质粒构建

使用Gibson等温装配方法构建质粒(参见Gibson,D.G.,Young,L.,Chuang,R.Y.,Venter,J.C.,Hutchison,C.A.,3rd和Smith,H.O.(2009)多达数百个千碱基的DNA分子的酶促组装(Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases)Nat Methods,6,343-345，通过引用将其全部内容并入本文)并转化到DH5α电感受态细胞(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司)中。所有标准的诱导质粒都含有rrnB强终止子(参见Orosz,A.,Boros,I.和Venetianer,P.(1991)大肠杆菌rrnB基因的复合转录终止区的分析(Analysis of the complex transcription termination region of theEscherichia coli rrnB gene.)European journal of biochemistry/FEBS,201,653-659，其全部内容通过引用并入本文)，随后是诱导型启动子和强g10RBS(参见Olins,P.O.,Devine,C.S.,Rangwala,S.H.和Kavka,K.S.(1988)T7噬菌体基因10前导RNA，在大肠杆菌中显着增强外来基因表达的核糖体结合位点(The T7phage gene 10leader RNA,aribosome-binding site that dramatically enhances the expression of foreigngenes in Escherichia coli).Gene,73,227-235，其全部内容通过引用并入本文中)驱动sfGFP表达的“tttaactttaagaaggagatatacat”(SEQ ID NO：1)(参见Pedelacq,J.D.,Cabantous,S.,Tran,T.,Terwilliger,T.C.和Waldo,G.S.(2006)超折叠绿色荧光蛋白的工程改造和表征(Engineering and characterization of a superfolder greenfluorescent protein).Nature biotechnology,24,79-88，其全部内容通过引用并入本文)(除了使用天然RBS的CdaR情况)。(参见Davis,J.H.,Rubin,A.J.和Sauer,R.T.(2011)一组绝缘细菌启动子的设计、构建和表征(Design，construction and characterization ofa set of insulated bacterial promoters).Nucleic acids research，39,1131-1141，其全部内容通过引用并入本文)和促进转录调节物表达的强RBS‘gaaataaggaggtaatacaa,’(SEQ ID NO：2)。每个诱导系统在高拷贝质粒和低拷贝质粒上实施。用来自pUC19(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司)的pUC起点和β内酰胺酶抗生素抗性标记构建高拷贝pJKR-H质粒。除了用从美国典型培养物保藏中心(ATCC#37032)获得的来自pSC101的SC101来源(包括repA)替代pUC来源之外，以相同的方式构建低拷贝pJKR-L质粒。在MphR诱导系统的情况下，也包括eryR红霉素抗性盒。表2中提供了转录调节物及其同源启动子的序列。设计质粒MphR-p15a-SPEC-mCherry和AcuR-colA-KAN-CFP与pJKR-H-CdaR兼容维持。在这两种质粒中，用p15a-aadA和colA-kanR代替抗生素抗性基因和复制起点。表3中提供了每种MIOX酶的序列和生物体名称。每种酶被克隆到组成型启动子P2(Mutalik,V.K.,Guimaraes,J.C.,Cambray,G.,Lam,C.,Christoffersen,M.J.,Mai,Q.A.,Tran,A.B.,Paull,M.,Keasling,J.D.,Arkin,A.P.等，(2013)通过标准转录和翻译启动元件的精确和可靠基因表达(Precise and reliable gene expression via standard transcriptionand translation initiation elements).Nat Methods,10,354-360，其全文通过引用并入本文)和g10RBS的下游以产生pJKR-MIOX变体。这些表达质粒使用colA复制起点和卡那霉素抗性基因来维持。序列和质粒可获自艾德基因公司(Addgene)(质粒编号62557-62570)。

实施例3

诱导和毒性

在诱导测定中使用用pJKR质粒转化并用羧苄青霉素维持的DH5α细胞。对于每个诱导评估实验，将细胞生长过夜至饱和，然后以1:100稀释到新鲜的LB培养基中并在200RPM和37℃下孵育。4小时后，将150μl对数生长期细胞转移到96孔板中，加入储存诱导剂以达到所需的诱导浓度范围。接种三个分开的孔并独立补充适量的诱导化学物质用于各诱导水平。在相同的Biotek(佛蒙特州威努斯基)HT酶标仪上使用相同的设置进行测量：激发485/20，发射528/20，37℃和快速振荡。每10分钟测量荧光和吸光度持续15小时。以任意单位(AFU)测量荧光，而由吸光度(OD)测定光密度。对于给定的测量，通过将荧光除以光密度来确定标准化的荧光。孵育包括含有用pUC19转化的对照菌株的五个独立的孔以提供背景自发荧光的测量。使用经修改以观察90分钟后荧光的相同方案来评估用苯酚和相关化合物对TtgR生物传感器的诱导。

使用600nm处的荧光与吸光度的比率来补偿细胞密度随着时间和实验的变化(AFU/OD)。使用第15小时的标准化的荧光来确定诱导剂浓度和荧光响应之间的关系。该转化函数在图1A和图1B中以对数-对数坐标绘制，以捕获宽范围的诱导剂浓度和所得荧光值。使用Mathematica假设检验包装函数MeanCI基于来自三个诱导重复的斯氏t-分布来计算估计均值的95％置信区间。将细胞生长和生物传感器激活的时程标准化，并用Python模块Seaborn使用拔靴法(bootstrapping)对三个独立诱导重复的样品平均值的标准误差(假设正态误差分布)产生95％置信区间(参见图2，图10和图11)。为了可视化目的，通过将图中的所有数据除以最高值的110％来对荧光时程数据进行标准化，使得可以在共同轴上观察每个图中的趋势。为了可视化目的，将生长时程数据标准化，使得每个生长曲线除以其中点值并在零时刻偏移到零。

诱导15小时后测定诱导比率。从诱导，未诱导和对照样品均值的平均值的标准误差(假设正态误差分布)确定衍生倍数-诱导值的标准误差，使得倍数-诱导的标准误差为：

是倍数诱导的平均幅度，σ_i、和是诱导的、未诱导的和对照细胞的荧光的SEM，而和是扣除平均背景荧光的诱导的和未诱导的细胞的平均荧光。对于未诱导的细胞的平均荧光在菌株的背景荧光内的情况，通过将95％置信区间下限除以95％置信区间上限确定了倍数-诱导的下限。95％置信区间的范围近似于扣除背景的荧光的标准误差的两倍。

测定在评估诱导反应的每个浓度下的诱导剂化学物质及其溶剂的毒性。在这些实验中，将DH5α细胞从过夜生长中以1:100稀释到新鲜的选择性LB中，并在200RPM和37℃下生长2小时。除了使用pJKR-H-MphR来提供eryR表达的红霉素评价外，在每种情况下使用pUC19作为对照质粒。将150μl细胞转移到96孔板中，并立即一式三份加入测定的化学物质，然后在600RPM和37℃下进一步孵育。15小时后，测量600nm处的吸光度，并标准化至对照孔中观察到的吸光度，其中没有化学物质被加入细胞。

交叉反应性矩阵通过诱导含有靶向和脱靶生物传感器的细胞来确定。按照诱导评估实验中所述的相同方式制备和评估细胞。使用以下诱导剂浓度：丙烯酸盐(5mM)，阿拉伯糖(165μM)，葡糖二酸盐(4.4mM)，红霉素(37μg/ml)，柚皮素(9mM)，IPTG(1mM)，鼠李糖(10mM)，苯甲酸异丙酯(cumate)(20μM)，DMSO(1％)，乙醇(1％)。

实施例4

数学建模

用公式ΔGPP/OD计算每个时间点的GFP表达率。用Scipy使用Hill函数进行最大GFP表达率与相应诱导剂浓度的非线性最小二乘拟合

V_max是GFP表达的最大速率，V_min是GFP表达的基础速率，I是诱导剂的浓度，h是hill系数，K_L是结果中描述的集总半最大参数。每个参数的方差由最小二乘协方差矩阵确定。方差的平方是下表4中报告的参数误差。

表4

图3和图12中的点反映了三个独立诱导重复的平均值，误差棒对应于通过拔靴法确定的平均值的标准误差的95％置信区间。线反映了拟合至数据的模型。

实施例5

流式细胞术

将含有待评价的质粒的D5Hα细胞生长过夜至饱和，并在1mL选择性LB培养基中以1:100稀释，并在900RPM和37℃下的96孔深孔板中孵育。4小时后，将诱导剂加至所需的最终浓度，并恢复孵育15小时。将诱导的培养物在冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以1:100稀释并保持在冰上，直到在LSRFortessa流式细胞仪(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BDBiosciences))上进行评估。每个样本至少捕获10万个事件。对前向和侧向散射进行门选以避免碎片和团块细胞。数据被导出到FloJo进行可视化，和Mathematica进行后续分析。

用pJKR-H-CdaR，MphR-p15a-SPEC-mCherry(命名为pJKR-O-MphR)和AcuR-colA-KAN-CFP(命名为pJKR-O-AcuR)转化的细胞维持在含有全部三种抗生素的LB中。以与上述相同的方式用5mM丙烯酸盐，40mM葡糖二酸盐和37μg/mL红霉素的诱导浓度诱导细胞。收集和门选如上所述进行。图7绘制了10,000个事件。

实施例6

葡糖二酸盐产生

为了通过荧光观察葡糖二酸盐的产生，用饱和的培养物以1:100将pJKR-H-CdaR和pJKR-MIOX双重转化的BL21DE3(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司)细胞稀释至羧苄青霉素和卡那霉素选择性LB。4小时后，将细胞一式三份地转移到96孔板中，并向培养基中加入50mM肌醇。用Biotek HT酶标仪以15分钟的间隔测量荧光和吸光度(600nm)持续48小时，同时在37℃下快速摇动。

为了直接测量葡糖二酸盐滴度，如上制备用pJKR-MIOX变体转化的BL21DE3细胞，除了生产发生在900RPM和37℃下孵育48小时的96孔深孔孔板内的1mL培养物内以外。通过离心和过滤收集上清液，并通过质谱测定葡糖二酸盐。

实施例7

通过荧光报告物鉴定代谢物

研究了以下传感器：AcuR，CdaR，MphR和TtgR。AcuR结合丙烯酸盐以调节类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中的二甲基硫代丙酸(DMSP)分解代谢(参见Sullivan,M.J.,Curson,A.R.,Shearer,N.,Todd,J.D.,Green,R.T.和Johnston,A.W.(2011)参与在类球红细菌中二甲基硫代丙酸的分解代谢的无前导操纵子的非常见调节(Unusualregulation of a leaderless operon involved in the catabolism ofdimethylsulfoniopropionate in Rhodobacter sphaeroides).PloS one,6,e15972)。CdaR是来自大肠杆菌的转录活化物，其已经显示出响应几种二酸：葡糖二酸，半乳糖二酸和甘油酸来调节转录(参见Monterrubio,R.,Baldoma,L.,Obradors,N.,Aguilar,J.和Badia,J.(2000)参与大肠杆菌中D-半乳糖二酸、D-葡糖二酸、和D-甘油酸利用的酶的操纵子的共同调节物(A common regulator for the operons encoding the enzymes involved theenzymes involved D-galactarate，D-glucarate，and D-glycerate utilization inEscherichia coli).J Bacteriol,182,2672-2674)。MphR在存在红霉素和其他大环内酯类抗生素如交沙霉素和阿奇霉素时介导转录(参见Noguchi,N.,Takada,K.,Katayama,J.,Emura,A.和Sasatsu,M.(2000)大肠杆菌中的大环内酯2'-磷酸转移酶I的mph(A)基因的转录调控：调节基因mphR的表征(A)(Regulation of transcription of the mph(A)genefor macrolide 2'-phosphotransferase I in Escherichia coli:characterization ofthe regulatory gene mphR(A)).J Bacteriol,182,5052-5058)。MphR首先在大肠杆菌的大环内酯抗性菌株中鉴定，并随后用于哺乳动物的转基因活化(参见Kramer,B.P.,Viretta,A.U.,Daoud-El-Baba,M.,Aubel,D.,Weber,W.和Fussenegger,M.(2004)哺乳动物细胞中的工程改造的表观遗传转基因开关(An engineered epigenetic transgeneswitch in mammalian cells).Nature biotechnology,22,867-870和Weber,W.,Fux,C.,Daoud-el Baba,M.,Keller,B.,Weber,C.C.,Kramer,B.P.,Heinzen,C.,Aubel,D.,Bailey,J.E.和Fussenegger,M.(2002)哺乳动物细胞和小鼠中基于大环内酯的转基因对照(Macrolide-based transgene control in mammalian cells and mice).Naturebiotechnology,20,901-907)和微生物的转基因活化(参见Mohrle,V.,Stadler,M.和Eberz,G.(2007)生物传感器引导的对大环内酯类的筛选(Biosensor-guided screeningfor macrolides).Analytical and bioanalytical chemistry,388,1117-1125)。在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中，TtgR响应类黄酮如柚皮素，根皮素和染料木黄酮而调节多药外排泵的表达(参见Teran,W.,Felipe,A.,Segura,A.,Rojas,A.,Ramos,J.L.和Gallegos,M.T.(2003)由药物结合阻遏物TtgR介导的抗生素依赖性诱导恶臭假单胞菌DOT-T1E TtgABC外排泵(Antibiotic-dependent induction of Pseudomonas putida DOT-T1ETtgABC efflux pump is mediated by the drug binding repressor TtgR).Antimicrobial agents and chemotherapy,47,3067-3072)，并且也已经用于哺乳动物转基因活化(参见Rossger,K.,Charpin-El-Hamri,G.和Fussenegger,M.(2013)用于治疗小鼠中饮食诱导的肥胖的闭环合成基因回路(A closed-loop synthetic gene circuit forthe treatment of diet-induced obesity in mice).Nature communications,4,2825)。AcuR，MphR和TtgR是TetR转录阻遏物家族的成员。纳入调节物TetR和AraC进行比较。

生物传感器被构建为编码变构转录调节物和荧光报告物的单个质粒。报告物mRNA是由变构转录调节物控制的启动子/操纵子序列转录的。对于转录阻遏物，中等强度的组成型启动子(参见Davis,J.H.,Rubin,A.J.和Sauer,R.T.(2011)一组绝缘细菌启动子的设计、构建和表征(Design,construction and characterization of a set of insulatedbacterial promoters).Nucleic acids research,39,1131-1141)用于驱动调节物转录。对于转录活化物，使用活化物的天然启动子序列以保持AraC和CdaR调节物的自我调节行为(参见Monterrubio,R.,Baldoma,L.,Obradors,N.,Aguilar,J.和Badia,J.(2000)编码在大肠杆菌中涉及D-半乳糖二酸，D-葡糖二酸和D-甘油酸利用的酶的操纵子的共同调节物(Acommon regulator for the operons encoding the enzymes involved in D-galactarate,D-glucarate,and D-glycerate utilization in Escherichia coli).JBacteriol,182,2672-2674以及Hahn,S.和Schleif,R.(1983)大肠杆菌araC启动子的体内调节(In vivo regulation of the Escherichia coli araC promoter).J Bacteriol,155,593-600)。在常用的高拷贝质粒和低拷贝质粒中构建生物传感器以评估它们在不同环境中的行为。高拷贝质粒采用pUC复制起点(约100-500个拷贝)，而低拷贝质粒编码SC101复制起点(2-5个拷贝)。所有质粒都表达β-内酰胺酶，使得能够使用羧苄青霉素来维持质粒。在MphR生物传感器的情况中，还包括红霉素抗性基因以保护细胞免受诱导所需的高浓度大环内酯。

如图1A和图1B所示，评价了6个可诱导系统中诱导剂浓度与荧光报告物表达之间的关系。由此产生的生物传感器转化函数涵盖了完整的传感器输出范围，从而可以确定每个生物传感器的动态范围。转化函数的评估还揭示了在每个生物传感器实现中可获得的最小和最大表达水平。如表4中所示，高拷贝生物传感器的计算的倍数-诱导(最大荧光除以未诱导的荧光)为63-210。指示超过一定数目的倍数-诱导值是在细胞自体荧光强度以内或者非常接近其的平均未诱导荧光的结果。在这种情况下，倍数-诱导的真实数值是不确定的，所以使用95％置信区间的界限来确定最小倍数-诱导。高拷贝生物传感器的最大诱导程度是用AraC，然后用CdaR和MphR实现的，如图1A所示。对于低拷贝的生物传感器，倍数诱导范围从3到78。AcuR生物传感器表现出最低的未诱导的GFP累积，在没有丙烯酸盐的情况下高和低拷贝系统都没有高于背景的荧光。这与TtgR生物传感器形成对比，TtgR生物传感器在低拷贝配置中显示更高的未诱导的GFP累积。对于TetR生物传感器观察到相反的效果，其表现出较低的未诱导的GFP累积，使得荧光低拷贝设置中的背景以内，如图1B所示。

如图2，图10和图11所示，评价每种生物传感器所需的诱导时间。用广泛的诱导剂浓度监测报告物表达8小时。所有高拷贝生物传感器在30分钟内开始产生高于背景的荧光，并且在最高诱导条件下在五小时内达到最大荧光水平。低拷贝生物传感器在50分钟内开始产生可测量的荧光，但在最高诱导水平下可能需要超过8小时才能达到最大荧光。尽管表达迅速开始并且生物传感器之间没有太多变异，但最大荧光是传感器依赖性的。例如，CdaR生物传感器在近一小时内从中度诱导获得最大荧光，而最高的葡糖二酸盐诱导条件需要六个小时达到最大荧光。这与高拷贝MphR生物传感器形成对比，不管诱导强度如何，其在3小时左右达到最大荧光。MphR生物传感器的低拷贝变体显示出类似的趋势，但是需要额外的时间来实现最大荧光，如图10所示。诱导动力学的变化可能与调节的启动子的内在强度，传感器-DNA平衡，或生物传感器活性与生长期之间的关系相关。除了AcuR之外，每个阻遏物在静止期开始时不再累积额外的荧光。这与活化物相反，其刚好在稳定期之前获得最大荧光。与其他阻遏物的表现相反，丙烯酸盐对AcuR的强烈诱导是通过进入静止期进行的。

复杂的合成回路可以通过数学建模来辅助组件选择和系统设计。如本文所述应用基因活化模型以将启动子活性与诱导剂浓度相关联。启动子活性定义为针对细胞生长校正的荧光的时间导数。考虑荧光团成熟所需的时间并且发现小于2分钟(参见Pedelacq,J.D.,Cabantous,S.,Tran,T.,Terwilliger,T.C.和Waldo,G.S.(2006)超折叠绿色荧光蛋白的工程改造和表征(Engineering and characterization of a superfolder greenfluorescent protein).Nature Biotechnology,24,79-88)。类似地，GFP的降解被忽略，因为大肠杆菌中的半衰期大于24小时(参见Andersen,J.B.,Sternberg,C.,Poulsen,L.K.,Bjorn,S.P.,Givskov,M.和Molin,S.(1998)用于研究细菌中的瞬时基因表达的绿色荧光蛋白的新不稳定变体(New unstable variants of green fluorescent protein forstudies of transient gene expression in bacteria).Applied and EnvironmentalMicrobiology,64,2240-2246)。将基因表达率拟合到适用于同时考虑基因表达的最大速度和未诱导的细胞的基础表达的Hill函数。活化物，AraC和CdaR，具有表示低协同性的Hill系数。阻遏物TetR，AcuR和TtgR均表现出高协同性。阻遏物MphR是例外，其具有较低的Hill系数。参见表4。高拷贝传感器的活性诱导曲线的检查揭示MphR的诱导行为与活化物AraC和CdaR的诱导行为更相似，而不是其他阻遏物TetR，AcuR和TtgR。参见图3。低拷贝传感器的活性诱导曲线也具有相同的趋势，除了AcuR在该实施方式中显示出较少的协同性，潜在由于其依赖于生长阶段的激活。参见图12。由于10mM的丙烯酸盐的毒性，从用于建模的数据中省略了该诱导条件。同样地，从低拷贝MphR生物传感器模型中省略了最高浓度的红霉素，因为它们显示出显着的毒性，可能是由于红霉素抗性基因的较低表达。高拷贝传感器的最大速度总是大于低拷贝形式。然而，阻遏物的变化幅度大于活化物。基于活化物的传感器控制它们自己的表达，并且这种反馈可以在拷贝数变化的情况下提供一些表达稳定性。每个高拷贝生物传感器的基础启动子活性小于最大启动子活性的3％。低拷贝生物传感器具有较高的和更可变的基础启动子活性，这是由于较低的最大活性，并且在一些情况下，较低效的转录抑制。

通过流式细胞术评估单个细胞以确定整体诱导动力学是否指示单细胞行为，或者是单个细胞中随机的全或无响应的平均结果。参见图4和图13。这种类型的表征是有用的，因为已经观察到一些可诱导系统由于正反馈或诱导剂转运性质而产生双峰或其他异质感应模式。过夜诱导后测量基础、低和高诱导水平。对于每个生物传感器，显示大多数单个细胞响应诱导剂浓度而呈现荧光。在一小部分细胞不发荧光的情况下，该群占总细胞群的不到2％，并且可能由死细胞或含有功能异常的质粒的细胞组成。尽管如此，单个细胞响应反映了在整体测量中观察到的群平均行为。高拷贝的AraC和CdaR生物传感器在批量评估时都具有高的基础报告物表达水平。参见图1A。这些传感器在单细胞水平上评估时表现出最宽的未诱导的荧光分布。参见图4。当部分诱导时，TetR生物传感器具有广泛的荧光分布。当部分诱导时，低拷贝MphR和高拷贝TtgR荧光分布针对检测限压缩。参见图13。这可能表明分布的左尾低于检测极限，或者一些细胞不响应于诱导剂而活化。如在整体测量中观察到的，TtgR诱导是弱的。在低拷贝TtgR质粒的情况下，诱导的和未诱导的群在通过流式细胞术观察时几乎完全重叠。参见图13。

测量诱导剂化学物质的毒性以帮助指导生物传感器应用的诱导剂浓度的选择。参见图5。在目标是最大蛋白质产生的应用中，毒性将被更少考虑。相反，亚毒性诱导对于需要细胞维持健康细胞状态的复杂回路是重要的。正如所料，红霉素在低至50μM的浓度下对大肠杆菌有毒性。然而，红霉素抗性基因(eryR)的表达在红霉素浓度达到1.4mM时仅观察到轻微的毒性。用430nM脱水四环素(aTC)观察到类似的生长缺陷。生长缺陷可能是由于溶剂，在这种情况下是乙醇。在330μM及以上的浓度下，柚皮素显示出显着的毒性。这种毒性可能是由于类黄酮本身，而不是溶剂二甲亚砜(DMSO)。丙烯酸盐在5mM和10mM下显示出显着的毒性。由于大肠杆菌使用糖作为碳源的能力，高浓度的阿拉伯糖导致更高的生长速率。在最高浓度的葡糖二酸盐和低水平的乙醇补充下观察到相似但更适度的生长益处。

实施例8

传感器正交性

用一组诱导化合物评估每个生物传感器的交叉反应性：丙烯酸盐，阿拉伯糖，葡糖二酸盐，红霉素，aTC，柚皮素，IPTG，鼠李糖，苯甲酸异丙酯，和溶剂，DMSO和乙醇。包括未被评估的诱导化合物以提供未来生物传感器实施的正向兼容性。观察到没有传感器响应除了其同源诱导剂之外的任何评估的化合物。参见图6。苯甲酸异丙酯、葡糖二酸盐和丙烯酸盐都具有羧酸盐的特征，但是由它们各自的传感器进行区分。TtgR不被苯甲酸异丙酯激活，虽然它结合许多类似的分子，其中之一是氯霉素。通过氯霉素的TtgR活化排除了含有TtgR的工程化系统以及由氯霉素乙酰转移酶维持的质粒。

虽然生物传感器的交叉反应性是使用单个传感器/细胞来评估的，但是本文提供的方法在单个细胞内使用多个正交传感器。根据这个方面，构建了几个传感器并将其引入到相同的细胞中以允许稳定维持和不重叠的荧光读出。重构MphR生物传感器，使得红霉素控制mCherry在编码p15a复制起点和壮观霉素抗性的载体骨架中的表达。类似地，AcuR生物传感器在编码colA起点和卡那霉素抗性的载体骨架中重建，以促进丙烯酸盐介导的CFP表达。将这些质粒与pJKR-H-CdaR质粒(编码GFP)共转化并稳定保持在DH5α细胞中。用葡糖二酸盐，红霉素和丙烯酸诱导剂的每种组合过夜诱导该菌株导致八种不同的细胞状态，如通过三种通道中的荧光所测量。参见图7。为每个正交诱导通道选择高但无毒的诱导剂水平。

使用流式细胞术来评估单个细胞的行为。在没有诱导的情况下，在所有通道中都有低荧光，如图7中的橙色群所示。只有葡糖二酸盐的诱导导致单个细胞通过产生而没有CFP或RFP表达来改变它们的细胞状态(图7中的浅蓝色群)。趋势如下继续，红霉素诱导产生深蓝色细胞群，其在红色通道中呈现高荧光，但在蓝色和绿色通道中呈现低荧光。类似地，深绿色点表示在蓝色通道中具有高荧光的丙烯酸盐诱导的细胞。全部三种配体的诱导导致浅绿色细胞群在所有三个通道中表现出高荧光。

原则上，可以用四个正交可诱导系统定义16种不同的细胞状态，并且可以用五个可诱导系统定义32种不同的细胞状态。在这些情况下，输出通道可能会受到限制，因为可能存在有限的不同荧光蛋白。如果考虑三个水平的诱导(无，中和高)，而不是以二元情况为例，则对于三个正交生物传感器，系统的细胞状态数量从8增加到27，对于四个正交的生物传感器的理论系统，从16增加到81。

实施例9

用于代谢流监测的传感器

CdaR生物传感器用于监测从肌醇产生的葡糖二酸盐。作为尼龙和其他塑料的可再生替代物，可以从生物质生产葡糖二酸盐(参见Werpy,T.a.P.,G.(2004)In Energy,U.S.D.o.(编))，然而高滴度当权受到肌醇加氧酶(MIOX)的限制(参见Moon,T.S.,Yoon,S.H.,Lanza,A.M.,Roy-Mayhew,J.D.和Prather,K.L.(2009)从重组大肠杆菌的合成途径中产生葡糖二酸(Production of glucaric acid from a synthetic pathway inrecombinant Escherichia coli).Applied and environmental microbiology,75,589-595，其将肌醇转化成葡萄糖醛酸盐。葡萄糖醛酸盐又通过快速作用的葡萄糖醛酸脱氢酶(Udh)氧化成葡糖二酸盐。通过共转化含有CdaR生物传感器的质粒，组成性表达的Udh基因和五种组成型表达的MIOX直系同源物的文库，鉴定了在大肠杆菌中产生更高的葡糖二酸盐滴度的酶。16个小时后，四种MIOX变体产生了20倍的荧光范围(参见图8)。质谱法用于测定实际的葡糖二酸盐滴度以确定生物传感器读数是否可预测酶的葡糖二酸盐生产的潜力。葡糖二酸盐滴度与荧光密切相关(见图8)，使得在高通量发现和优化酶活性中使用生物传感器成为可能。小家鼠MIOX直向同源物产生了最高的荧光和滴度。从约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)MIOX直向同源物获得非常相似的葡糖二酸盐滴度和生物传感器响应，其与小家鼠变体仅有45％的同一性。

实施例10

TtgR作为苯酚的传感器

苯酚是一种重要的商品化学物质，新型生产途径将为其提供经济和环境效益。在苯酶促转化为苯酚的过程中已经显示出一些成功(参见FFarinas,E.T.,Alcalde,M.和Arnold,F.(2004)由细胞色素P450BM-3 139-3催化的烯烃环氧化(Alkene epoxidationcatalyzed by cytochrome P450BM-3 139-3).Tetrahedron,60,525-528以及Karich,A.,Kluge,M.,Ullrich,R.和Hofrichter,M.(2013)通过茶树菇的环化酶的苯加氧和氧化(Benzene oxygenation and oxidation by the peroxygenase of Agrocybe aegerita).AMB Express,3,5)，然而，这些酶在低k_cat下发挥功能，并且在一些情况下继续将苯酚氧化成邻苯二酚，一种不希望的副产物。将TtgR生物传感器菌株的单独群与0.1％苯酚，0.1％儿茶酚和至多0.4％苯一起孵育。如图9所示，只有苯酚激活了传感器，表明TtgR对苯酚，而不是苯酚产生的副产物有选择性的响应。根据这个方面，使用TtgR传感器将苯酚产生与单个细胞中的荧光蛋白或抗生素选择标记物的表达偶联。

实施例11

3-羟基丙酸盐的间接感测

3-羟基丙酸盐(3-HP)是例如丙烯酸盐生产中的重要商业试剂。根据一个方面，可以对细胞进行遗传修饰以产生3-HP，然而，对于3-HP，没有已知的转录传感器。根据本文所述的方法，将细胞遗传修饰以将3-HP转化为具有转录传感器的效应分子。图14描述了显示从葡萄糖到3-HP的一种生物学途径和用于将3-HP转化成具有转录因子的效应分子的酶促反应的示意图。

根据第一方面，在2-甲基柠檬酸盐传感器的存在下将3-HP转化成2-甲基柠檬酸盐。由此产生的系统是3-HP生物传感器。使用来自大肠杆菌的转录调节物prpR来控制与细胞内的2-甲基柠檬酸盐浓度成比例的基因表达。之前已经描述了该可诱导系统，其目的是感测丙酸盐-与3HP不同的化学物质(WO 2007005837A3，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16269719)。内源性酶，2-甲基柠檬酸合酶(prpC)和来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的固碳途径的异源多功能酶丙酰基-CoA合酶(pcs)(参见Mattozzi,M.,Ziesack,M.,Voges,M.J.,Silver,P.A.和Way,J.C.(2013)在大肠杆菌中表达橙色绿屈挠菌3-羟基丙酸盐碳固定双循环的子途径：向自养生长水平转化(Expression ofthe sub-pathways of the Chloroflexus aurantiacus 3-hydroxypropionate carbonfixation bicycle in E.coli:Toward horizontal transfer of autotrophic growth).Metab Eng,16,130-139，其全部内容通过引用并入本文)用于从3-HP生产2-甲基柠檬酸盐。三种基因(pcs，prpC，prpR)的系统一起包含基于prpR的3HP生物传感器(参见图15A)。评估在存在和不存在pcs时，基于prpR的生物传感器对浓度达到25mM的3HP的荧光响应(参见图15B)。对于3-HP的荧光响应而言，pcs是必需的。响应随着3-HP浓度的增加而增加，表明3HP和2-甲基柠檬酸盐的细胞内浓度是关联的。作为这种关联的结果，3-HP浓度控制绿色荧光蛋白(GFP)的表达。当用12mM 3-HP诱导时，基于prpR的3-HP生物传感器产生比未诱导的荧光大2.4倍的荧光响应。基于prpR的生物传感器对3-HP诱导的荧光响应在5小时时是最大的一半，并且需要大约8小时达到90％的诱导(参见图15C)。以这种方式产生的2-甲基柠檬酸盐的比例与细胞内3-HP的量成比例。受控基因的表达因此是细胞内3-HP浓度的度量。

根据第二方面，在丙烯酸盐生物传感器的存在下，将3-HP转化为丙烯酸盐。转录调节物acuR用于与存在于细胞中的丙烯酸盐的量成比例地调节靶基因的转录。因此，丙烯酸盐生物传感器报告了细胞内3HP浓度。使用截短形式的多功能酶pcs将3HP转化为丙烯酰-CoA，其随后通过来自贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的丙烯酰-CoA水解酶(ach)水解成丙烯酸盐(参见Valle F.,A.,N.J.,Noriega,C.(2013)。在橙色绿屈挠菌中，pcs催化三个后续反应：3HP至3HP-CoA至丙烯酰-CoA至丙酰基-CoA(参见Mattozzi,M.,Ziesack,M.,Voges,M.J.,Silver,P.A.和Way,J.C.(2013)在大肠杆菌中表达橙色绿屈挠菌3-羟基丙酸盐碳固定双循环的子途径：向自养生长水平转化(Expression of the sub-pathways ofthe Chloroflexus aurantiacus 3-hydroxypropionate carbon fixation bicycle inE.coli:Toward horizontal transfer of autotrophic growth).Metab Eng,16,130-139，其全部内容通过引用并入本文)。三种反应对于基于prpR的生物传感器均是有用的，但是对于基于acuR的生物传感器，丙烯酰-CoA而不是丙酰基-CoA的累积是必要的。已经显示将pcs分离到其功能结构域中增加单个反应的速率(参见Alber,B.E.和Fuchs,G.(2002)来自橙色绿屈挠菌的丙酰基-辅酶A合酶-一种用于自养CO₂固定的3-羟基丙酸循环的关键酶(Propionyl-coenzyme A synthase from Chloroflexus aurantiacus,a key enzyme ofthe 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic CO2fixation).The Journal ofbiological chemistry,277,12137-12143)。因此，去除了负责将丙烯酰-CoA转化为丙酰基-CoA的结构域，同时保留了另外两个结构域的活性。截短的酶被称为pcs^Δ3，并且其与ach和acuR的共表达构成基于acuR的3HP生物传感器(参见图16A)。当pcs^Δ3和ach存在时，培养基中3HP的浓度增加导致荧光水平增加，但是在其不存在的情况下导致没有生物传感器激活(参见图16B)，表明3-HP正被转化为丙烯酸盐并被acuR感测。当用10mM 3HP诱导基于acuR的生物传感器时，获得90倍的荧光增加。通过实时监测生物传感器激活来比较3HP和可靠活化物丙烯酸盐的诱导动力学。3HP介导的诱导只稍微落后于丙烯酸盐诱导的时程(参见图16C)。在不存在pcs^Δ3和ach的情况下，荧光保持在背景水平超过16小时(参见图17)。

因此，得到的系统保持与3HP浓度成比例的水平的丙烯酸盐，和与丙烯酸盐浓度成比例的水平的转录输出。因此转录读出是细胞内3HP浓度的度量。

图18显示了基于prpR的3-HP生物传感器对升高浓度的3-HP的响应。绿色条显示响应3-HP的完整系统，而灰色条显示单独的prpR传感器不能检测到3-HP。

图19显示了基于acuR的3-HP生物传感器对升高浓度的3-HP的响应。蓝色条显示对3-HP量的增加有响应的完整系统，而灰色条显示acuR传感器本身针对3-HP的存在发生反应。

实施例12

使用基于prpR的3-HP生物传感器以诱导荧光报告物的产生的实时代谢物观察

通过使用基于prpR的3-HP生物传感器实时监测3-HP生产。如图20A所示，3-HP生产途径由来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的碳固定途径的丙二酰-CoA和双功能酶丙二酰-CoA还原酶(mcr)的内源性生物合成组成。Mcr通过催化丙二酰-CoA，首先转化为丙二酸半醛，然后以两个NADPH+的代价转化为3HP，从脂肪酸生物合成中分离丙二酰-CoA。从葡萄糖到3HP的途径已在之前公布，达到60mg/L的滴度，其中仅mcr表达(参见Rathnasingh,C.,Raj,S.M.,Lee,Y.,Catherine,C.,Ashok,S.和Park,S.(2012)通过使用重组大肠杆菌菌株的丙二酰-CoA途径生产3-羟基丙酸(Production of 3-hydroxypropionicacid via malonyl-CoA pathway using recombinant Escherichia coli strains).Journal of biotechnology,157,633-640)。滴度随着ACC复合物和pntAB的过度表达增加到180mg/L，其分别增加丙二酰-CoA和NADPH+的可及性。通过使用脂肪酸抑制剂浅蓝菌素而不是通过遗传操作来增加可用于3HP生产的丙二酰-CoA的量。脂肪酸生物合成是丙二酰-CoA的主要集(sink)，并且以比异源表达的mcr高得多的速度运行。由于浅蓝菌素抑制fabB和fabF的活性，提高其浓度导致较低的脂肪酸生物合成速率和较高浓度的可用丙二酰-CoA。在每种3-HP实施中，生物传感器辅助酶pcs和pcs^Δ3/ach被组成型表达，而mcr在添加IPTG的条件下被表达。

mcr和基于prpR的3HP生物传感器的共表达便于观察3HP产生，而不需要HPLC或质谱(参见图20B)。包含生物传感器和mcr的细胞随时间显示出比仅包含生物传感器的细胞更高的荧光。当通过IPTG诱导mcr活性增加时，含有mcr的细胞显示出更高的GFP积累速率，最终达到更高水平的荧光。没有mcr的细胞不受IPTG诱导的影响。当使用基于prpR的生物传感器进行3-HP观察时，使用富LB培养基作为碳源生产3-HP。prpR对分解代谢物抑制的敏感性排除了使用葡萄糖作为3-HP生产的起始材料。甚至低水平的葡萄糖导致prpR转录调节物变得对诱导不响应。来自prpR生物传感器的未诱导的GFP表达是显着的，可能是由于细胞中基础水平的2-甲基柠檬酸盐。尽管如此，终点荧光测量显示具有产生3HP(mcr+)的能力的细胞比没有mcr的细胞具有多20％的荧光(参见图20C)。当诱导时，mcr+细胞的荧光增加50％，接近用1.5mM的外源3-HP观察到的诱导水平。

实施例13

使用基于acuR的3-HP生物传感器以诱导荧光报告物的产生的实时代谢物观察

如图20D所示，通过使用基于acuR的3-HP生物传感器实时监测3-HP生产。acuR生物传感器不受分解代谢物抑制的影响，并且可用于观察从葡萄糖的3-HP生产。Mcr与基于acuR的生物传感器共表达，并持续12小时观察到荧光。用50mM葡萄糖但不含IPTG或浅蓝菌素孵育的细胞产生与背景水平不可区分的荧光。用葡萄糖和IPTG孵育的细胞显示荧光显着增加。当同时使用IPTG和浅蓝菌素时观察到最显着的荧光增加。用葡萄糖，IPTG和浅蓝菌素产生3-HP比其它两种培养条件中的任一个有更高的GFP表达速率和终点荧光值。终点测量揭示当与葡萄糖，IPTG和浅蓝菌素一起孵育时，mcr+细胞对mcr-细胞的荧光增加8倍(见图20E)。用葡萄糖和IPTG孵育导致两倍增加。与缺乏mcr的细胞相比，仅用葡萄糖孵育仅导致荧光增加20％。

实施例14

使用基于cdaR的葡糖二酸盐生物传感器以诱导荧光报告物的产生的实时葡糖二酸盐观察

实时观察细胞中葡糖二酸盐的产生。细胞经遗传修饰以包括葡糖二酸盐生物传感器cdaR，其调节具有IPTG诱导型肌醇-1-磷酸合酶(Ino1，酿酒酵母)，肌醇加氧酶(MIOX，小家鼠)和糖醛酸脱氢酶(Udh，根癌土壤杆菌)的葡糖二酸盐生物合成途径的荧光分子的产生，如图21A所示。葡糖二酸盐生物传感器产生与细胞内产生的葡糖二酸盐的量成比例的荧光响应。在代表性实施例中，保持相同的生产条件(遗传学，培养基组成)，但改变外源补充的前体分子。沿生物合成途径的其他化合物(即，通过较少的反应从葡糖二酸盐分离)导致更快的葡糖二酸盐形成速率。如图21B所示，葡糖二酸盐本身的加入导致最快的GFP产生速率并最终达到最高的荧光量。在具有和不具有生物合成途径的生物传感器菌株中观察到对葡糖二酸盐的荧光响应。如图21C所示，其他外源提供的分子都没有在缺乏葡糖二酸盐生物合成途径的生物传感器菌株中产生荧光响应。在含有生物传感器和生物合成途径的菌株中，向培养基中加入葡萄糖醛酸盐，导致滞后葡糖二酸盐约90分钟的荧光响应，最终达到葡糖二酸盐的80％的终点荧光。这与添加肌醇相反，其导致荧光响应滞后于葡萄糖醛酸盐60分钟。添加肌醇得到的终点荧光仅为添加葡萄糖醛酸盐的20％。如图21B所示，补充有50mM葡萄糖的培养基在实验期间内不产生荧光响应。

葡糖二酸盐生物传感器的荧光输出反映了葡糖二酸盐生物合成途径的性质。已知葡萄糖醛酸盐向葡糖二酸盐的转化是葡糖二酸盐生物合成中最快的异源反应。相应地，当葡糖糖醛酸盐是起始材料时，可以看到稳健的生物传感器活化。对肌醇添加的荧光响应是缓慢的，并且可能是由于在大肠杆菌中肌醇向葡萄糖醛酸盐的催化中使用小家鼠MIOX。对额外的葡萄糖缺乏生物传感器响应可能是因为葡糖二酸盐生物合成与糖酵解竞争葡萄糖-6-磷酸。可能需要大量的Ino1活性来产生有意义的量的肌醇。可能由于MIOX活性弱导致低肌醇产生，最终产生低葡糖滴度和生物传感器介导的荧光。因此，提供调节内源代谢以平衡糖酵解与葡糖二酸盐产生同时筛选由葡萄糖补充产生的荧光以鉴定产生高葡糖二酸盐滴度的菌株的方法。提供了类似的方法用于从靶向或非靶向突变的文库中鉴定MIOX的有用和有效的变体。

虽然荧光响应的动力学揭示了产物形成的相对速率，但终点荧光是产物滴度的良好代表。测量添加前体分子后8小时观察到的荧光，并与在类似条件下获得的葡糖二酸盐滴度进行比较。当细胞含有生物合成途径时，在每种测试条件下都观察到了葡糖二酸盐生产，但没有该途径则没有观察到生产。即使没有添加额外的底物，在丰富LB培养基中也观察到了葡糖二酸盐形成。添加5mM葡萄糖在8小时内没有导致葡糖二酸盐滴度的显着增加，这与所观察到的荧光响应缺乏一致。然而，如荧光响应中所反映的，添加肌醇导致葡糖二酸盐滴度升高。添加葡萄糖醛酸盐以97％的产率导致葡糖二酸盐的产生(减去了来自LB的葡糖二酸盐的背景产生)。这个产量反映了添加葡糖二酸盐所实现的高荧光。作为荧光的函数绘制滴定度再次证实，如图22所示，在所评估的四种培养条件(R²＝0.96)下，荧光是滴度的良好预测物。

实施例15

使用基于benM的黏康酸盐生物传感器以诱导荧光报告物的产生的实时黏康酸盐观察

实时观察细胞中黏康酸盐的产生。细胞经遗传修饰以包括调节荧光分子产生的黏康酸盐生物传感器benM和源自贝氏不动杆菌的LysR型转录调节物(参见Craven,S.H.,Ezezika,O.C.,Haddad,S.,Hall,R.A.,Momany,C.和Neidle,E.L.(2009)BenM的诱导剂响应，一种源自贝氏不动杆菌ADP1的LysR型转录调节物(Inducer responses of BenM,aLysR-type transcriptional regulator from Acinetobacter baylyi ADP1).MolMicrobiol,72,881-894，其全部内容通过引用并入本文)。这种设置类似于之前描述的黏康酸盐人工选择，其中benM控制抗生素抗性基因的表达(参见Raman,S.,Rogers,J.K.,Taylor,N.D.和Church,G.M.(2014)生物合成途径的进化引导优化(Evolution-guidedoptimization of biosynthetic pathways).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,111,17803-17808，其全部内容通过引用并入本文。为了实现用于实时观察的各种黏康酸盐生产速率，黏康酸盐从一系列前体分子通过实施由Draths和Frost开发的生物合成途径来产生(参见Niu,W.,Draths,K.M.和Frost,J.W.(2002)己二酸的无苯合成(Benzene-free synthesis of adipic acid).Biotechnology progress,18,201-211以及Draths,K.M.和Frost,J.W.(1994)己二酸从D-葡萄糖的环境相容性合成(Environmentally Compatible Synthesis of Adipic Acidfrom D-Glucose).Journal of the American Chemical Society,116,399-400，其各自通过引用全文并入本文)。如图23A所示，该途径使用三种异源酶将3-脱氢莽草酸(DHS)(一种芳族氨基酸生物合成的中间体)转化为顺式，顺式-黏康酸盐。内源性代谢的分支点是由DHS脱水酶(贝氏不动杆菌，quiC)催化产生原儿茶酸，其进而由原儿茶酸脱羧酶(肺炎克雷伯氏菌，aroY)脱羧成儿茶酚，之后由1,2-双加氧酶(贝氏不动杆菌，catA)加氧成黏康酸盐。观察到途径中间体DHS，原儿茶酸和儿茶酚的快速荧光响应，而如图23B所示，当从葡萄糖开始黏康酸盐生产时观察到缓慢响应。当黏康酸盐生物合成途径不存在时，没有观察到对任何中间体的荧光响应。DHS与其他途径中间体一样快地产生响应的观察表明，与芳族氨基酸生物合成的竞争不限制在这些条件下黏康酸盐生产的速率。相反，由于添加葡萄糖导致的GFP表达的缓慢速率表明获得足够的内源性DHS供应可限制所用的遗传背景。这与在芳香族氨基酸生物合成中以转录和变构水平纯在的负反馈一致。负反馈设计用于芳香族氨基酸存在下压制DHAP(DHS和由此黏康酸盐的前体)的产生。针对黏康酸盐生物合成优化的菌株过表达aroF的反馈抗性突变体，其是产物抑制缺陷型的。其他旨在增加DHS集的遗传修饰包括敲除aroE以及过表达aroB和tktA(参见Niu,W.,Draths,K.M.和Frost,J.W.(2002)己二酸的无苯合成(Benzene-free synthesis of adipic acid).Biotechnology progress,18,201-211，其全部内容通过引用并入本文。

如图23C所示，检查终点荧光指示所获得的最终荧光与在该时间点的上清液中测量的黏康酸盐滴度一致。尽管后期中间体的终点荧光相似，但对于葡萄糖显着较低。这在滴定中反映出来，因为在这个早期的时间点从葡萄糖产生的黏液康酸盐低于检测限。生物传感器比传统的定量方法更敏感。这可能是由于细胞内与细胞外感测；除非黏康酸盐被主动转运出细胞，否则细胞内浓度预计会在上清液浓度之前升高。使用具有黏康酸盐生物传感器的这种中间生物传感器来控制GFP和RFP提供了使潜在有毒途径中间体的浓度最小化并使最终产物形成最大化的筛选方法。

实施例16

用于实施例11-16的方法

以下方法和材料用于实施例11-16。

化学物质和试剂

除非另有说明，所有试剂均从西格玛公司获得。从金生物技术公司获得抗生素和IPTG。PCR混合物购自卡帕生物系统公司。3-羟基丙酸盐购自多伦多研究化学公司(TorontoResearch Chemicals)。浅蓝菌素购自卡曼化学公司(Cayman Chemical)并溶于乙醇。丙烯酸在室温下用200ppm MEHQ作为抑制剂储存，并在即将使用前稀释。将所有细胞培养添加剂溶于去离子水中以达到适当的工作浓度。

菌株和质粒

使用Gibson等温装配方法构建质粒(参见Gibson,D.G.,Young,L.,Chuang,R.Y.,Venter,J.C.,Hutchison,C.A.,3rd和Smith,H.O.(2009)多达数百个千碱基的DNA分子的酶促组装(Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases)Nat Methods,6,343-345，通过引用将其全部内容并入本文)并转化到DH5α电感受态细胞(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室公司)中。产物分子的生物合成在BL21(DE3)或DH5α中进行。基于prpR的3HP生物传感器被以双质粒系统实施。第一个质粒是pPro24-GFP(Addgene质粒#18880)，其在提供β-内酰胺抗性的pBR322复制起点上，甲基-柠檬酸盐响应性转录因子prpR的控制下表达GFPuv。构建第二质粒(pJKR-PCS)，使丙酰基-CoA合成酶处于提供卡那霉素抗性的ColA复制起点上的组成型启动子proD的控制下。基于acuR的3-HP生物传感器包含两种质粒。第一种是先前表征的高拷贝丙烯酸盐生物传感器pJKR-H-acuR(Addgene质粒#62567)，其在提供β-内酰胺抗性的pUC复制起点上丙烯酸盐反应性转录因子acuR的控制下表达sfGFP。第二种来自pJKR-PCS，使得PCS在氨基酸1400和1401之间被截短。随后将来自贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的酶丙烯酰-CoA水解酶克隆到P2组成型启动子控制下的质粒中(Mutalik,V.K.,Guimaraes,J.C.,Cambray,G.,Lam,C.,Christoffersen,M.J.,Mai,Q.A.,Tran,A.B.,Paull,M.,Keasling,J.D.,Arkin,A.P.等，(2013)通过标准转录和翻译启动元件的精确和可靠基因表达(Precise and reliablegene expression via standard transcription and translation initiationelements).Nat Methods,10,354-360，其全文通过引用并入本文)。得到的质粒被命名为pJKR-PCSfrag-ACH。构建命名为pJKR-MCR的3-HP生物合成质粒，使得来自橙色绿屈挠菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酰-CoA还原酶由pLlacO启动子(参见Lutz,R.andBujard,H.(1997)通过LacR/O，TetR/O和AraC/I1-I2调节元件对大肠杆菌中转录单元的独立和紧密调控(Independent and tight regulation of transcriptional units inEscherichia coli via the LacR/O,the TetR/O and AraC/I1-I2regulatoryelements).Nucleic acids research,25,1203-1210)在具有壮观霉素抗性的p15a复制起点上的LacI的控制下表达。葡糖二酸盐生物传感器是先前表征的质粒pJKR-H-cdaR(Addgene质粒#62557)，其在提供β-内酰胺抗性的pUC复制起点上的葡糖二酸盐响应性转录因子cdaR的控制下表达sfGFP。葡糖二酸盐生物合成途径在单一质粒pJKR-GA-EXP上实施，pJKR-GA-EXP从在提供卡那霉素抗性的p15a复制起点上的IPTG调节的T7启动子共同顺反子表达基因MIOX，Ino1和Udh。用对大肠杆菌表达优化的密码子合成来自小家鼠(Musmusculus)的MIOX和来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Ino1。Udh获自根癌土壤杆菌基因组DNA(ATCC#33970D-5)。黏康酸盐生物传感器是用在提供壮观霉素抗性的pUC复制起点上的黏康酸盐响应性转录因子benM(贝氏不动杆菌)控制下用sfGFP构建的。用proB启动子组成型表达benM(参见Davis,J.H.,Rubin,A.J.和Sauer,R.T.(2011)一组绝缘细菌启动子的设计、构建和表征(Design,construction and characterization of a set ofinsulated bacterial promoters).Nucleic acids research,39,1131-1141)。为了提供表达标准化的选项，从P11(32)启动子组成型表达RFP mKate2(Mutalik,V.K.,Guimaraes,J.C.,Cambray,G.,Lam,C.,Christoffersen,M.J.,Mai,Q.A.,Tran,A.B.,Paull,M.,Keasling,J.D.,Arkin,A.P.等，(2013)通过标准转录和翻译启动元件的精确和可靠基因表达(Precise and reliable gene expression via standard transcription andtranslation initiation elements).Nat Methods,10,354-360，其全文通过引用并入本文)。得到的质粒被命名为pJKR-H-benM。黏康酸盐生物合成途径被构建为具有生物合成基因的密码子优化的变异体的单个质粒，所述生物合成基因在提供β-内酰胺抗性的p15a复制起点上从IPTG诱导型T7启动子共顺反子表达。

3-羟基丙酸盐生物传感器表征

使用质粒pPro24-GFP和pJKR-PCS，或质粒pJKR-H-acuR和pJKR-PCSfrag-ACH双重转化的DH5α细胞暴露于浓度逐渐增加的3-HP，并监测GFP表达。将细胞生长过夜至饱和，然后以1:100稀释到新鲜的LB培养基中并在200RPM和37℃下孵育。4小时后，将150μl对数生长期细胞转移到96孔板中，加入3HP以达到终浓度。每次接种和诱导一式三份进行。包括缺乏生物传感器辅助质粒的菌株以揭示生物传感器激活的确依赖于辅助质粒的存在。在终点测量的情况下，在用Biotek HT酶标仪(激发485/20，发射528/20)测量添加3-HP后16小时的荧光。在同一酶标仪上在37℃下快速摇动和10分钟测量间隔收集16小时内的时程数据。荧光通过光密度标准化。通过将在电流诱导水平获得的荧光除以没有诱导下获得的荧光来确定倍数诱导。误差线表示从平均值的标准误差导出的95％置信区间。

3-羟基丙酸盐产生和监测

含有用于基于prpR和acuR的3-HP生物传感器的质粒的DH5α细胞用质粒pJKR-MCR转化。将这些生产菌株过夜生长并以1:100稀释回新鲜的LB培养基中，并在200RPM和37℃下孵育。4小时后，将150μl对数生长期细胞转移到96孔板中，并暴露于3HP生产条件。在含有和不含1mM IPTG和20μg/ml浅蓝菌素的LB中，孵育基于prpR的生物传感器生产菌株。将基于acuR的生物传感器生产菌株与50mM葡萄糖以及1mM IPTG和20μg/ml浅蓝菌素的不同组合孵育。如上所述在Biotek HT酶标仪中观察到生长标准化的荧光。在12小时后进行终点测量。通过液相色谱和质谱(LC/MS)测定3-HP生产滴度。用于滴度测量的菌株仅包含生产质粒pJKR-MCR。将过夜培养物以1：100接种到96孔板中的1mL补充有1mM IPTG，20μg/ml浅蓝菌素和50mM葡萄糖的LB中。在900RPM和37℃下进行16小时的生产，然后分离上清液并以0.2μm过滤用于LC/MS。所有生产一式三份运行。误差线表示从平均值的标准误差导出的95％置信区间。

葡糖二酸盐生产和监测

在用pJKR-H-cdaR和pJKR-GA-EXP双重转化的BL21细胞中进行了葡糖二酸盐生产监测。用pJKR-H-cdaR单独转化的BL21用作对照。过夜培养物以1:100稀释回到补充有5g/L葡萄糖的Davis培养基中。在200RPM和37℃下孵育4小时后，将150μl对数生长期细胞转移至96孔板，并暴露于1mM IPTG和所述途径中间体。在加入途径中间体后观察到标准化的荧光八小时。在8小时后进行终点测量。在用pJKR-GA-EXP转化的BL21中进行滴度测定的葡聚糖生产。将过夜培养物以1：100接种到1mL补充有1mM IPTG和特定浓度的途径中间物的LB中。在96孔板中，在900RPM和37℃下进行8小时的生产，然后分离上清液并以0.2μm过滤用于LC/MS。所有生产一式三份运行。误差线表示从平均值的标准误差导出的95％置信区间。

黏康酸盐生产和监测

在用pJKR-H-benM和黏康酸盐生产质粒双重转化的BL21细胞中进行了黏康酸盐生产监测。过夜培养物生长过夜，然后以1:100稀释到LB中，并在200RPM和37℃下孵育。4小时后，将150μl对数生长期细胞转移到96孔板中，并在酶标仪中监测。1小时后，一式三份加入特定浓度的途径中间体，并重新开始荧光监测。终点测量是在添加中间体后5小时进行的。用黏康酸盐生产质粒单独转化的菌株用于测定产物滴度。将过夜培养物以1：100接种到1mL补充有特定浓度的途径中间物的LB中。生产发生在96孔板中，900RPM和37℃下持续5小时。通过HPLC测定上清液中黏康酸盐的量。所有生产一式三份运行。误差线表示从平均值的标准误差导出的95％置信区间。

表2：调节蛋白和同源启动子/操纵子的序列

表3：MIOX直向同系物的序列

序列表

<110> 哈佛学院董事及会员团体（President and Fellows of Harvard College）

<120> 细胞中代谢物的生产和检测

<130> 010498.00554

<140> 62/146,478

<141> 2015-04-13

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 结合位点

<400> 1

tttaacttta agaaggagat atacat 26

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 2

gaaataagga ggtaatacaa 20

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 3

gcttcacaac cgcacttgat ttaatagacc ataccgtcta ttatttctgg 50

<210> 4

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 4

agaaaccaat tgtccatatt gcatcagaca ttgccgtcac tgcgtctttt actggctctt 60

ctcgctaacc caaccggtaa ccccgcttat taaaagcatt ctgtaacaaa gcgggaccaa 120

agccatgaca aaaacgcgta acaaaagtgt ctataatcac ggcagaaaag tccacattga 180

ttatttgcac ggcgtcacac tttgctatgc catagcattt ttatccataa gattagcgga 240

tcctacctga cgctttttat cgcaactctc tactgtttct ccatacccgc tttcatatct 300

ttcacttttt ttgggctaac 320

<210> 5

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 5

atgctgttga ttgacgccag tgagaacccg gaaccggaaa cggaatcaaa tccgtgggtc 60

gaacagtggg gcacgctgtt gtcctgatat gttcagcgag cggtaaatgt cgttttagcg 120

gtgctgaatc gaatcttttc aggcaaatgc cagtaaaaac tgcttcatag cgcggatttt 180

tactggcgtt tgcctggagt caagcgatcc atttcatact cttctttatt tcttcgtttt 240

aacccttcct ttcttgttct tgttttcatt tccgtgaagt ggattccacc gtccagggct 300

aatgccaaaa tcgggcctca ttgaacgcat taatgttgtg ttgttgcacg gtgagccgct 360

atggcgcgct ttttatactg ctattgccag atataaacac gcgccgtatt cggcgaacga 420

cctataaaaa cggcaaaaaa caccctacgt cacctctgat ttcctggcga tgtcgcagtc 480

cagagtgagc gtggctaacg cgaattttca ggagtgcaac a 521

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 6

ggattgaata taaccgacgt gactgttaca tttaggtggc taaacccgtc aa 52

<210> 7

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 7

tcgagtccct atcagtgata gagattgaca tccctatcag tgatagagat actgagcaca 60

tcagcaggac gcactgaccg aattcattaa a 91

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 启动子

<400> 8

cacccagcag tatttacaaa caaccatgaa tgtaagtata ttccttagca a 51

<210> 9

<211> 660

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 9

atgccgctga ccgacacccc gccgtctgtt ccgcagaaac cgcgtcgtgg tcgtccgcgt 60

ggtgctccgg acgcttctct ggctcaccag tctctgatcc gtgctggtct ggaacacctg 120

accgaaaaag gttactcttc tgttggtgtt gacgaaatcc tgaaagctgc tcgtgttccg 180

aaaggttctt tctaccacta cttccgtaac aaagctgact tcggtctggc tctgatcgaa 240

gcttacgaca cctacttcgc tcgtctcctc gaccaggcgt tcctggacgg ttcgctggct 300

ccgctggctc gtctgcgtct gttcacccgt atggctgaag aaggtatggc tcgtcacggt 360

ttccgtcgtg gttgcctggt tggtaacctg ggtcaggaaa tgggtgctct gccggacgac 420

ttccgtgctg ctctgatcgg tgttctggaa acctggcagc gtcgtaccgc tcagctgttc 480

cgtgaagctc aggcttgcgg tgaactgtct gctgaccacg acccggacgc tctggctgaa 540

gctttctgga tcggttggga aggtgctatc ctgcgtgcta aactggaact gcgtccggac 600

ccgctgcact ctttcacccg taccttcggt cgtcacttcg ttacccgtac ccaggaataa 660

<210> 10

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 10

atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaacgc ccatctggtg 60

gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120

ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180

ggacgagaat ttgtctgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240

cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300

cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac gggtttcttt 360

cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420

gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480

ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540

gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600

gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660

attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgcattagtc aggcgaagct gcttttgagc 720

actacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780

ttctcgcgag tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagtttcg tgccggttgt 840

gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

<210> 11

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 11

atggctggct ggcatcttga taccaaaatg gcgcaggata tcgtggcacg taccatgcgc 60

atcatcgata ccaatatcaa cgtaatggat gcccgtgggc gaattatcgg cagcggcgat 120

cgtgagcgta ttggtgaatt gcacgaaggt gcattgctgg tactttcaca gggacgagtc 180

gtcgatatcg atgacgcggt agcacgtcat ctgcacggtg tgcggcaggg gattaatcta 240

ccgttacggc tggaaggtga aattgtcggc gtaattggcc tgacaggtga accagagaat 300

ctgcgtaaat atggcgaact ggtctgcatg acggctgaaa tgatgctgga acagtcgcgg 360

ttgatgcact tgttggcgca ggatagccgt ttgcgggaag aactggtgat gaacctgatt 420

caggcagagg agaatactcc cgcacttact gaatgggcgc aacggctggg gatcgatctc 480

aatcaaccgc gagtggtggc tattgttgag gtcgacagcg gtcagcttgg cgtggacagc 540

gcaatggcgg agttacaaca actgcaaaac gcgctgacta cgcccgagcg taataatctg 600

gtggcgattg tctcgctaac cgaaatggtg gtgttgaaac cggcgttgaa ctcttttggg 660

cgctgggatg cagaagatca tcgtaagcga gttgaacaac tgattacccg catgaaagag 720

tacggccagc tgcgttttcg cgtttcactg ggcaactatt ttaccggtcc tggcagtatt 780

gcccgatcct atcgtacggc gaaaacgacg atggtggtgg gtaaacagcg gatgccagaa 840

agtcgctgct atttttatca ggatctgatg ttacctgtgt tactcgacag tttgcgtggc 900

gactggcagg ccaacgaact ggcgcgaccg ctggcgcggc tgaaaacgat ggacaataac 960

ggcttgctgc gacgaacgct ggcggcgtgg tttcgccaca atgtgcaacc gctggcaacg 1020

tcaaaggcgt tgtttattca tcgtaatacc ctggagtatc ggcttaatcg tatatcggaa 1080

ctgaccgggc ttgatttggg caattttgat gacaggttgc tgctgtatgt ggcgttacaa 1140

ctggatgaag agcggtag 1158

<210> 12

<211> 585

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 12

atgccgcgtc cgaaactgaa atctgacgac gaagttctgg aagcggcgac cgttgttctg 60

aaacgttgcg gtccgatcga attcaccctg tctggtgttg cgaaagaagt tggtctgtct 120

cgtgcggcgc tgatccagcg tttcaccaac cgtgacaccc tgctggttcg tatgatggaa 180

cgtggtgttg aacaggttcg tcactacctg aacgcgatcc cgatcggtgc gggtccgcag 240

ggtctgtggg aattcctgca ggttctggtt cgttctatga acacccgtaa cgacttctct 300

gttaactacc tgatctcttg gtacgaactg caggttccgg aactgcgtac cctggcgatc 360

cagcgtaacc gtgcggttgt tgaaggtatc cgtaaacgtc tgccgccggg tgcgccggcg 420

gcggcggaac tgctgctgca ctctgttatc gcgggtgcga ccatgcagtg ggcggttgac 480

ccggacggtg aactggcgga ccacgttctg gcgcagatcg cggcgatcct gtgcctgatg 540

ttcccggaac acgacgactt ccagctgctg caggcgcacg cgtaa 585

<210> 13

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 13

atgtctcgtt tagataaaag taaagtgatt aacagcgcat tagagctgct taatgaggtc 60

ggaatcgaag gtttaacaac ccgtaaactc gcccagaagc taggtgtaga gcagcctaca 120

ttgtattggc atgtaaaaaa taagcgggct ttgctcgacg ccttagccat tgagatgtta 180

gataggcacc atactcactt ttgcccttta gaaggggaaa gctggcaaga ttttttacgt 240

aataacgcta aaagttttag atgtgcttta ctaagtcatc gcgatggagc aaaagtacat 300

ttaggtacac ggcctacaga aaaacagtat gaaactctcg aaaatcaatt agccttttta 360

tgccaacaag gtttttcact agagaatgca ttatatgcac tcagcgcagt ggggcatttt 420

actttaggtt gcgtattgga agatcaagag catcaagtcg ctaaagaaga aagggaaaca 480

cctactactg atagtatgcc gccattatta cgacaagcta tcgaattatt tgatcaccaa 540

ggtgcagagc cagccttctt attcggcctt gaattgatca tatgcggatt agaaaaacaa 600

cttaaatgtg aaagtgggtc ttaa 624

<210> 14

<211> 633

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 调节物

<400> 14

atggtgcgtc gcaccaaaga agaagcacag gaaacgcgtg cgcagattat cgaagcggcc 60

gaacgcgcgt tttataaacg tggtgtggca cgtaccacgc tggcagatat tgcagaactg 120

gcaggtgtta cccgcggtgc aatctactgg catttcaaca ataaagccga actggttcag 180

gcactgctgg attctctgca cgaaacgcat gatcacctgg cccgtgcaag cgaatctgaa 240

gatgaactgg acccgctggg ctgcatgcgc aaactgctgc tgcaggtgtt taacgaactg 300

gttctggatg cacgtacccg tcgcattaat gaaatcctgc atcacaaatg cgaatttacg 360

gatgatatgt gtgaaattcg tcagcagcgc cagagcgccg tgctggattg tcataaaggt 420

atcaccctgg cactggcaaa cgcagttcgt cgcggtcagc tgccgggtga actggatgtg 480

gaacgcgcag cggttgcgat gtttgcctat gtggatggcc tgattggtcg ttggctgctg 540

ctgccggata gtgttgatct gctgggcgat gtggaaaaat gggttgatac cggtctggat 600

atgctgcgtc tgagcccggc gctgcgcaaa taa 633

<210> 15

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIOX变体

<400> 15

atggtaaaca aggtcggtaa atctactctc gataagagca caaacctaga taaatccaaa 60

gggaatatat tagagaaact agatgatgat atacttcatg tcaatagaat tcgaggctct 120

ttaactaaca aaactccaat caccaaaacc cattcgatag atgatgagct taaactagaa 180

gaacaatcag aaactgccgc cgatgaaaat tggcaaatag catcggaata ttataaaaac 240

atagacacga aggctttccg ccaatatgaa ttagcttgtg atagagtcaa acagttttat 300

gaagaacaac atgaaaaaca aaccgtggcg tataatattc aagcaagaat taatttcaaa 360

actaaaacaa gagcaagaat gacagtttgg gaaggactag agaaattaaa caaattgtta 420

gatgattctg atcccgacac cgaattgtca caaatagatc atgcattaca gacggcagaa 480

gctatacggc gagatgggaa accacgatgg tttcaattag ttgggttgat tcatgattta 540

gggaaattac tatatttttt tgattctcgt ggtcaatggg atgtagtggg tgatactttc 600

cctgttggtt gtaaattcct gaaacggatt attttccctg atagttttaa aaataatcca 660

gatttcctaa atccattgta taataccaaa tatggcatat attcaaaaca ttgtggatta 720

gataaagtca tgttgagttg gggtcatgat gagtatatgt atcatgttgc gaaaaagaat 780

tcgacattac caccggaagc attggcaatg ataaggtatc attcatttta tccttggcat 840

caagaattgg catatagtta tttaatggat gagcatgata aagagatgtt gaaagcagtc 900

aaagctttca attcctatga tttatattcc aagatagatc aacagtatga tgttgaagag 960

ttgaaaccat attacctaga gttgattgat gagtttttcc caaataaagt aattgatttt 1020

taa 1023

<210> 16

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIOX变体

<400> 16

atgagtcaga ccgtggaaaa cacgtttggc gaatttcgta actacaccga tagcaaattc 60

caggatcgtg tggaacgcac gtacaaagat atgcacatta accagaatct ggaatacgtt 120

acccagatga aagataaata cttcaaactg gatctgggta aaatggatgt gtacgaagtt 180

ttcaaactgc tggaaaacgt tcatgatgaa agcgatccgg ataatgatct gccgcagatc 240

gaacacgcat atcagaccgc ggaagcctgc cagaacaaat tcctgaaatc tgatacggaa 300

ctgcgcgaaa atgcgctgat tcgtagtatc tttcgcgatc atgaatggca gagcattccg 360

aaaatctggc aggatttcta taccaaaaaa cagagtctgg gcaatctgta cagccatatt 420

aaagattggt cttggtttcc gctggttggc ttcgttcacg atctgggtaa aatcatgacc 480

ctgccggaat atggtcagct gccgcagtgg agcaccgtgg gtgatacgta cccgattgcc 540

tgcccgtttg caagcgcgaa cgtgttttct caccgtgaat ttgttaaaga ttctaaagat 600

tacaacaatt acaataccga aagtgaaacg cattatggca aatacgagaa aaaatgtggt 660

ttcgataacg tggatatgag cttcggtcac gatgaataca tctacaaagt tttcgaacag 720

ggcagcgata tcccgtatga aggtctgtac ctgctgcgct atcattcttt ctacccgtgg 780

cacaccccgc agacgggcgg tcatgcgtat caggaactgg ccaacgaaaa agattggctg 840

ctgctgccgc tgctgaaagc ctttcagaaa gcggatctgt attctaaact gccggaactg 900

ccgccgaaag aagtgctgga gaaaaaatac aaaagtctgc tggataaatg ggttccgaac 960

aagaaaatta actggtaa 978

<210> 17

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIOX变体

<400> 17

atgaaaaagc atatagacac agacaatccg ttgaaaaatt tagatgagtg ggaagatgat 60

ttgttaatgc gatatcctga cccttctgaa gtaaatgaaa gtttaaaaga aaagcagaaa 120

gaagaattta gaaattatgt cgattctgaa agagtagaaa cggtaaaaga attttacagg 180

ataaaccata cctaccaaac ttatgacttt gtatgcagta aagaacaaga atttctgcaa 240

tttaatagaa aagaaatgtc aatctgggaa gctgtcgagt ttttaaacac gcttgtagac 300

gacagtgacc cagatattga cttagaccag acacagcacc ttttacagac ttcagaagcc 360

attcgtgctg atggtcatcc ggattggttt gtactgacag gtttcattca cgatttgggt 420

aaagttttat gcttatttgg agaaccgcaa tgggcagtcg ttggcgatac ttttccggtt 480

ggctgtgcgt attcggataa aattgtgtat tcagaatttt ttaaagaaaa tccggattat 540

acagatgaga gattcaatac taaactagga atctacactg aaaactgcgg attagataac 600

gtaaaaatga gctggggtca tgacgaatat ttgtatcaga ttatgaaaga ttatttaccg 660

gatcctgctt tatacatgat tcgttatcac tctttttatt cgcagcataa agaaaatgcg 720

tatgcacatt taatgaatga aaaagacatc gaaatgtttg actgggttcg aaaattcaat 780

ccgtacgatt tgtatacaaa ggctcctgta aaaccagatg ttcaggcatt acttccttat 840

tataaagaat tagttgctaa atatttgcct gaaaaattga agttttaa 888

<210> 18

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MIOX变体

<400> 18

atgaaagtgg atgttggccc ggacccgagc ctggtttacc gcccggatgt ggacccggaa 60

atggcaaaaa gcaaagattc gtttcgtaac tacaccagtg gcccgctgct ggatcgtgtt 120

tttaccacgt ataaactgat gcatacccac cagacggttg actttgtcag ccgtaaacgc 180

attcaatatg gcggtttctc ttacaagaaa atgaccatca tggaagcggt gggcatgctg 240

gatgacctgg ttgatgaatc agatccggac gtcgattttc cgaattcgtt tcatgcgttc 300

cagacggccg aaggtattcg caaagcccac ccggacaaag attggttcca tctggtcggc 360

ctgctgcacg atctgggtaa aatcatggca ctgtggggtg aaccgcagtg ggctgtggtt 420

ggtgatacct ttccggtggg ttgccgtccg caagcaagtg tcgtgttttg tgactccacc 480

ttccaggaca acccggatct gcaagacccg cgctattcaa cggaactggg catgtaccag 540

ccgcattgcg gtctggaaaa cgtgctgatg tcgtggggtc acgatgaata cctgtaccag 600

atgatgaaat tcaacaaatt cagcctgccg tctgaagcct tctacatgat ccgtttccat 660

agtttctacc cgtggcacac cggcggtgat tatcgccagc tgtgctccca gcaagacctg 720

gatatgctgc cgtgggtgca agaattcaac aaattcgatc tgtacacgaa atgtccggat 780

ctgccggacg ttgaatctct gcgtccgtac taccaaggtc tgattgataa atactgtccg 840

ggcaccctgt cgtggtaa 858

Claims (42)

1.一种选择用于生产代谢物的微生物亚组的方法，包括

提供微生物群；

其中该微生物群已经遗传修饰以包括编码报告物的外源DNA，

其中所述微生物群已经遗传修饰以包括编码传感器分子的外源DNA，其表达时调节所述微生物表达所述报告物，

其中所述微生物群已经遗传修饰以包括外源DNA编码基因以产生所述传感器的代谢物结合伴侣，

并且其中所述微生物产生所述代谢物结合伴侣，所述代谢物结合伴侣结合所述传感器，从而以依赖于产生的代谢物的浓度的方式诱导所述报告物的表达，并且

通过检测所述报告物来筛选所述微生物群以鉴定微生物亚组。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物是荧光蛋白。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述筛选通过以下进行：荧光活化的细胞分选，显微分析，微量滴定板测定法，乳液测定，微流体测定，下拉测定或荧光素酶高通量筛选。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述传感器生物分子和所述代谢物结合伴侣选自由下述成员对组成的组：cdaR/葡糖二酸，ttgR/柚皮素，btuB核糖开关/钴胺素，mphR/大环内酯类，tetR/四环素衍生物，benM/黏康酸，alkS/中链正烷烃，xylR/木糖，araC/阿拉伯糖，gntR/葡萄糖酸盐，galS/半乳糖，trpR/色氨酸，qacR/黄连素，rmrR/植物抗毒素，cymR/苯甲酸异丙酯，melR/蜜二糖，rafR/棉子糖，nahR/水杨酸盐，nocR/胭脂碱，clcR/氯苯甲酸盐，varR/维及霉素，rhaR/鼠李糖，PhoR/磷酸盐，MalK/苹果酸盐，GlnK/谷氨酰胺，视黄酸受体/视黄酸，雌激素受体/雌激素和雄激素受体/雄激素。

6.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括

遗传修饰所述微生物亚组以改变直接或间接影响所述代谢物生产的基因，和

通过检测所述报告物来筛选所述微生物亚组以鉴定后续微生物亚组。

7.一种修饰微生物以包括对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括

遗传修饰所述微生物以包括编码所述传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，

遗传修饰所述微生物以包括外源DNA编码基因以产生对应于所述传感器的代谢物，

并且其中所述微生物产生所述代谢物，所述代谢物结合所述传感器，从而以依赖于产生的代谢物的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达，并且

其中所述传感器是AcuR并且所述代谢物是丙烯酸盐或

其中所述传感器是ttgR并且所述代谢物是苯酚。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。

13.一种微生物

其中所述微生物经遗传修饰以包括编码传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，并且

其中所述微生物经遗传修饰以包括外源DNA编码基因以生产代谢物，

并且其中所述微生物产生所述代谢物，所述代谢物结合所述传感器生物分子，从而以依赖于产生的丙烯酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达，并且

其中所述传感器是AcuR并且所述代谢物是丙烯酸盐或

其中所述传感器是ttgR并且所述代谢物是苯酚。

14.如权利要求13所述的微生物，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。

19.一种修饰微生物以包括对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括

遗传修饰所述微生物以包括编码prpR传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，

遗传修饰所述微生物以包括外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成2-甲基柠檬酸盐，

并且其中所述微生物产生2-甲基柠檬酸盐，该2-甲基柠檬酸盐结合所述prpR传感器，从而以依赖于2-甲基柠檬酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

24.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。

25.一种微生物

其中所述微生物经遗传修饰以包括编码prpR传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，并且

其中所述微生物经遗传修饰以包括外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成2-甲基柠檬酸盐，

并且其中所述微生物产生2-甲基柠檬酸盐，该2-甲基柠檬酸盐结合所述prpR传感器生物分子，从而以依赖于产生的2-甲基柠檬酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达。

26.如权利要求25所述的微生物，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

28.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

29.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

30.如权利要求25所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。

31.一种修饰微生物以包括对应于代谢物的传感器生物分子的方法，包括

遗传修饰所述微生物以包括编码acuR传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，

遗传修饰所述微生物以包括外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成丙烯酸盐，

并且其中所述微生物产生丙烯酸盐，该丙烯酸盐结合所述acuR传感器，从而以依赖于丙烯酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

34.如权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

35.如权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

36.如权利要求31所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。

37.一种微生物

其中所述微生物经遗传修饰以包括编码acuR传感器生物分子的外源DNA，其调节所述微生物表达编码蛋白质的基因，并且

其中所述微生物经遗传修饰以包括外源DNA编码基因以产生3-羟基丙酸盐并将3-羟基丙酸盐转化成丙烯酸盐，

并且其中所述微生物产生丙烯酸盐，该丙烯酸盐结合所述acuR传感器生物分子，从而以依赖于产生的丙烯酸盐的浓度的方式诱导所述蛋白质的表达。

38.如权利要求37所述的微生物，其中所述微生物经遗传修饰以包括编码所述蛋白质的外源DNA。

39.如权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质是荧光蛋白。

40.如权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质选自：mPlum，mCherry，tdTomato，mStrawberry，J-Red，DsRed-单体，mOrange，mKO，mCitrine，Venus，YPet，EYFP，Emerald，EGFP，CyPet，mCFPm，Cerulean，T-Sapphire，萤火虫(FLuc)，改良萤火虫(Ultra-Clo)，叩头虫(CBLuc)，海肾(RLuc)，桡足类甲壳动物(GLuc)，和介形类甲壳动物(CLuc)。

41.如权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂。

42.如权利要求37所述的方法，其中所述蛋白质是毒素的解毒剂，其选自由下述解毒剂毒素对组成的组：SDS：tolC，大肠菌素：tolC，卡那霉素：卡那霉素核苷酸转移酶，氯霉素：氯霉素酰基转移酶，氨苄青霉素：β-内酰胺酶，四环素：四环素外排泵tetA，氯化镍：四环素外排泵tetA，和5-氟乳清酸：URA3。