CN109843907A

CN109843907A - 重组微囊藻毒素生产

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Publication number: CN109843907A
Application number: CN201780063757.7A
Authority: CN
Inventors: 布雷特·尼兰; T·刘; R·玛兹莫兹; S·安格里
Original assignee: NewSouth Innovations Pty Ltd
Current assignee: NewSouth Innovations Pty Ltd
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2017-10-17
Publication date: 2019-06-04
Also published as: WO2018071954A1; AU2017346933A1; US20190263868A1; EP3526234A4; US11130784B2; EP3526234A1; CA3049993A1; AU2017346933B2

Abstract

本发明一般涉及用于生产微囊藻毒素的方法和能够产生微囊藻毒素的重组细胞。该重组细胞在外源启动子的控制下表达外源性微囊藻毒素合酶多肽，并进一步表达外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)。本发明进一步涉及通过本文所述方法在重组细胞中产生的微囊藻毒素。

Description

重组微囊藻毒素生产

通过交叉引用并入

本申请要求2016年10月17日提交的澳大利亚临时专利申请号2016904211的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。

技术领域

本发明总体涉及生产微囊藻毒素的方法和能够产生微囊藻毒素的重组细胞。本发明进一步涉及通过本文所述方法在重组细胞中产生的微囊藻毒素。

背景技术

淡水体中蓝藻(“蓝绿藻”)毒素的产生对脊椎动物物种具有重要的健康意义。

微囊藻毒素是蓝藻毒素中最大和结构最多样的。微囊藻毒素是由某些蓝藻物种的特定成员产生的肝毒素，这些蓝藻物种包括微囊藻、节球藻、长孢藻(以前的鱼腥藻)、颤藻、浮丝藻、软管藻、席藻和念珠藻。它们是具有七个氨基酸的单环七肽，在第1位含有D-丙氨酸(Ala)，在第2和第4位的每一个都含有可变L-氨基酸，在第3位含有D-β-甲基天冬氨酸(MeAsp)，在第5位含有(2S,3S,8S,9S)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸(Adda)，在第6位含有异D-谷氨酸(Glu)，以及在第7位含有N-甲基脱氢丙氨酸(MDha)。结构变异发生在所有七种氨基酸肽中，并且最常见于可变位置2和4(例如第2位的亮氨酸(L)、精氨酸(R)和酪氨酸(Y)，第4位的精氨酸(R)和丙氨酸(A))。不同形式的微囊藻毒素通常根据存在于这两个主要可变位置(即第2位和第4位)的L-氨基酸命名。例如，最大量和毒性形式的微囊藻毒素-LR在第2位具有亮氨酸(L)，在第4位具有精氨酸(R)。

已经从不同种类的蓝藻中分离出100多种微囊藻毒素，因甲基化、羟基化、差向异构化、肽序列和/或毒性的程度不同而有所差异。负责在铜绿微囊藻PCC 7806中产生微囊藻毒素的基因是成簇的，跨度为55kb。该途径由10个基因组成，转录为两个不同的操纵子，mcyC-mcyA和mcyD-mcyJ，编码一个聚酮合酶(PKS)、三个非核糖体肽合成酶(NRPS)和两个杂合PKS-NRPS。

微囊藻毒素是全球最常见的淡水蓝藻毒素，引起急性中毒并长期诱发严重的肝损伤和肝癌。它们主要通过用于胆汁酸的多特异性主动转运系统进入肝脏。一旦进入细胞，它们共价结合到胞质蛋白上，导致它们驻留在肝脏中。除了对肝脏的不利影响外，微囊藻毒素还会影响心脏、胃肠道、神经系统和免疫系统，并且已显示出具有遗传毒性。它们也被认为是动物的潜在致癌物质，特别是通过抑制人体中的蛋白质磷酸酶导致细胞蛋白质的过度磷酸化。

含有微囊藻毒素的大量出现在澳大利亚、巴西、中国、欧洲、美国和南非等国家都是一个问题。除了在人类消费的水生动物(即海产品)中的生物累积外，由于富营养化，微囊藻毒素已在饮用水源中广泛传播，这严重损害了饮用水质量。

因此，微囊藻毒素的检测和毒理学研究的进展是必不可少的，但是由于微囊藻毒素的有限可用性和毒素标准的高成本而受到阻碍。

需要可靠且经济上可行的系统来生产微囊藻毒素，作为从缓慢生长的蓝藻培养物中分离毒素的替代方案。还需要能够以直接的方式针对生产多种不同形式的微囊藻毒素而定制的系统。

发明内容

本发明人发明了一种用于在大肠杆菌中异源表达重组微囊藻毒素合成酶的系统。本文所述的表达平台可以定制为以靶向和经济有效的方式异源产生多种微囊藻毒素同种型及其变体。因此，本发明解决了现有技术中存在的一个或多个需求。

下面列出了本发明的非限制性实施方案：

实施方案1：用于产生微囊藻毒素的重组细胞，其包含：(i)一种或多种外源多核苷酸，其编码选自微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的任意一种或多种微囊藻毒素多肽；(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作地连接的外源启动子；(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。

实施方案2：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；以及任选地微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的任意一种或多种。

实施方案3：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；或者

微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种。

实施方案4：根据实施方案1至3中任一个的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyF基因序列和/或与GenBank登录号JQ290099.1、AJQ290089.1、F183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyI基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案5：根据实施方案1的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码：(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)和微囊藻毒素T多肽(mcyT)中的每一种；或(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)和微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的每一种。

实施方案6：根据实施方案1、2或5中任一个的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列和/或与GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案7：根据实施方案1至6中任一个的重组细胞，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyA基因序列，和/或GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyB基因序列，和/或GenBank登录号JQ290083.1、JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyC基因序列，和/或GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyD基因序列，和/或GenBank登录号JQ290095.1、JQ290085.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyE基因序列，和/或GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyG基因序列，和/或GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyH基因序列，和/或GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyJ基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案8：根据实施方案1至7中任一项所述的重组细胞，其包含多个外源多核苷酸，其中：所述多核苷酸通过插入核苷酸彼此分开；并且所述每种外源多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

实施方案9：根据实施方案8的重组细胞，其包含：第一外源多核苷酸，其编码：(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一种；第二外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；或(ii)第一外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一种；第二外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；第三外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)中的每一种；第四外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或(iii)第一外源多核苷酸，编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一种；第二种外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)中的每一种。

实施方案10：根据实施方案8或实施方案9的重组细胞，其中插入的核苷酸是外源启动子。

实施方案11：根据实施方案1至7中任一个的重组细胞，其包含编码每种微囊藻毒素多肽的单个外源多核苷酸。

实施方案12：根据实施方案1至11中任一个的重组细胞，其中外源多核苷酸是DNA。

实施方案13：根据实施方案1至12中任一个的重组细胞，其中外源启动子是诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、四环素诱导型启动子中的一种或多种。

实施方案14：根据实施方案1至13中任一个的重组细胞，其中所述外源启动子是能够促进至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、或至少35kb的长度的mRNA转录物的产生的进行性启动子。

实施方案15：根据实施方案1至14中任一个的重组细胞，其中外源启动子是双向启动子。

实施方案16：根据实施方案15的重组细胞，其中外源启动子是与第一和第二外源多核苷酸可操作地连接的双向启动子。

实施方案17：根据实施方案1至16中任一个的重组细胞，其中外源启动子是Ptet_O。

实施方案18：根据实施方案1至17中任一个的重组细胞，其中外源PPT能够激活I型和II型酰基载体蛋白(ACP)和肽基载体蛋白(PCP)。

实施方案19：根据实施方案1至17中任一个的重组细胞，其中PPT是细菌PPT。

实施方案20：根据实施方案19的重组细胞，其中细菌PPT是蓝细菌、芽孢杆菌属(例如枯草芽胞杆菌)，粘细菌，放线菌(例如，链霉菌属)或假单胞菌属的PPT。

实施方案21：根据实施方案20的重组细胞，其中蓝细菌PPT是节球藻属(例如泡沫节球藻、泡沫节球藻NSOR10)PPT。

实施方案22：根据实施方案20的重组细胞，其中所述粘细菌PPT是柱头菌属(例如橙色标桩菌，橙色标桩菌DW4/3-1)PPT。

实施方案23：根据实施方案22的重组细胞，其中PPT是橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)DW4/3-1MtaA PPT。

实施方案24：根据实施方案1至23中任一个的重组细胞，包含编码PPT的外源多核苷酸序列。

实施方案25：根据实施方案1至24中任一个的重组细胞，包含编码PPT的外源多核苷酸序列，该外源多核苷酸序列整合到重组细胞基因组中。

实施方案26：根据实施方案1至25中任一个的重组细胞，其进一步包含编码用于并入微囊藻毒素中的氨基酸和/或羟基酸的外源多核苷酸序列。

实施方案27：根据实施方案1至25中任一个的重组细胞，其中所述细胞是重组原核细胞。

实施方案28：根据实施方案1至27中任一个的重组细胞，其中所述细胞是重组细菌细胞。

实施方案29：根据实施方案1至28中任一个的重组细胞，其中细胞是重组肠杆菌科细胞。

实施方案30：根据实施方案1至29中任一个的重组细胞，其中细胞是重组埃希氏菌属细胞。

实施方案31：根据实施方案1至30中任一个的重组细胞，其中细胞是重组大肠杆菌细胞。

实施方案32：根据实施方案1至31中任一个的重组细胞，其中重组细胞不是：真核细胞、蓝细菌、鞭毛藻、酵母、人细胞、哺乳动物细胞、植物细胞。

实施方案33：根据实施方案1至32中任一个的重组细胞，其中所述重组细胞不包含编码另外的蓝藻毒素，选自柱孢藻毒素、鱼腥藻毒素、鱼腥藻毒素同系物、蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、鞘丝藻毒素、海兔毒素和/或节球藻毒素中的任何一种或多种的遗传物质。

实施方案34：一种用于生产微囊藻毒素的方法，所述方法包括：在适合的培养基中培养根据实施方案1至33中任一个的重组细胞并持续合适的时间段以促进微囊藻毒素的产生。

实施方案35：根据实施方案34的方法，其进一步包括在培养期间或之后分离由细胞产生的微囊藻毒素。

实施方案36：根据实施方案34或实施方案35的方法，其进一步包括将氨基酸和/或羟基酸添加到培养基中，其中所述氨基酸和/或羟基酸并入由重组细胞产生的微囊藻毒素中。

实施方案37：根据实施方案36的方法，其中所述氨基酸和/或羟基酸不是由重组细胞内源产生的。

实施方案38：根据实施方案34至37中任一项所述的方法，其中重组细胞包含诱导型启动子，并且该方法还包括向培养基中加入化合物以激活诱导型启动子。

实施方案39：根据实施方案34至38中任一项所述的方法，其中微囊藻毒素是微囊藻毒素LA、微囊藻毒素LL、微囊藻毒素AR、微囊藻毒素YA、微囊藻毒素LM、微囊藻毒素VF、微囊藻毒素YM、微囊藻毒素LF、微囊藻毒素LR、[D-Asp³]微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素LW、微囊藻毒素FR、微囊藻毒素WR、微囊藻毒素LY、微囊藻毒素RR或微囊藻毒素YR。

实施方案40：一种用于产生能够生产微囊藻毒素的重组细胞的方法，该方法包括用以下物质转化亲本细胞：(i)一种或多种编码选自以下的微囊藻毒素多肽的任何一种或多种的外源性微囊藻毒素(mcy)多核苷酸：微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)；(ii)与所述mcy多核苷酸的至少一种可操作地连接的外源启动子；以及(iii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)的外源多核苷酸序列。

实施方案41：根据实施方案40的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)中的每一种，以及任选地微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素T多肽(mcyT)中的一种或多种。

实施方案42：根据实施方案41的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素F多肽(mcyF)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；或者

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，微囊藻毒素B多肽(mcyB)，微囊藻毒素C多肽(mcyC)，微囊藻毒素D多肽(mcyD)，微囊藻毒素E多肽(mcyE)，微囊藻毒素G多肽(mcyG)，微囊藻毒素H多肽(mcyH)，微囊藻毒素I多肽(mcyI)和微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种。

实施方案43：根据实施方案40至42中任一个的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸包含与GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyF基因序列和/或与GenBank登录号JQ290099.1、AJQ290089.1、F183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyI基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案44：根据实施方案40的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸编码以下各项：(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)和微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)和微囊藻毒素L多肽(mcyL)。

实施方案45：根据实施方案40、41或44中任一个的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸包含与GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列和/或与GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案46：实施方案40至45中任一个的方法，其中所述一种或多种外源性mcy多核苷酸包含与GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyA基因序列，和/或GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyB基因序列，和/或GenBank登录号JQ290083.1、JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyC基因序列，和/或GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyD基因序列，和/或GenBank登录号JQ290095.1、JQ290085.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyE基因序列，和/或GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyG基因序列，和/或GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyH基因序列，和/或GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyJ基因序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性的核苷酸序列。

实施方案47：根据实施方案40至46中任一个的方法，包括用多个外源性mcy多核苷酸转化亲本细胞，其中：通过插入核苷酸将mcy多核苷酸彼此分开；并且每种外源性mcy多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

实施方案48：根据实施方案47的方法，包括用以下各项转化亲本细胞：第一外源多核苷酸，其编码(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一种；第二外源多核苷酸，其编码微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)、微囊藻毒素I多肽(mcyI)、微囊藻毒素J多肽(mcyJ)中的每一种；或(ii)第一外源多核苷酸，其编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一种；第二种外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；第三外源多核苷酸，其编码微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)；第四种外源多核苷酸，其编码：微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或(iii)第一外源多核苷酸，其编码微囊藻毒素A多肽(mcyA)、微囊藻毒素B多肽(mcyB)、微囊藻毒素C多肽(mcyC)中的每一个；第二外源多核苷酸，其编码微囊藻毒素G多肽(mcyG)、微囊藻毒素D多肽(mcyD)、微囊藻毒素E多肽(mcyE)、微囊藻毒素F多肽(mcyF)、微囊藻毒素L多肽(mcyL)、微囊藻毒素H多肽(mcyH)中的每一个，其中：每个所述外源mcy多核苷酸通过插入核苷酸与其他外源多核苷酸分离；并且每个所述外源性mcy多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

实施方案49：根据实施方案47或实施方案48的方法，其中插入的核苷酸是外源启动子。

实施方案50：根据实施方案40至49中任一个的方法，包括用编码每种微囊藻毒素多肽的单个外源mcy多核苷酸转化亲本细胞。

实施方案51：根据实施方案40至50中任一个的方法，其中外源性mcy多核苷酸是DNA。

实施方案52：根据实施方案40至51中任一个的方法，其中外源启动子是以下一种或多种：诱导型启动子，抗生素诱导型启动子，四环素诱导型启动子。

实施方案53：根据实施方案40至52中任一个的方法，其中所述外源启动子是能够促进至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb、或至少35kb的长度的mRNA转录物产生的进行性启动子。

实施方案54：根据实施方案40至53中任一个的方法，其中外源启动子是双向启动子。

实施方案55：根据实施方案54的方法，其中外源启动子是与第一和第二外源多核苷酸可操作地连接的双向启动子。

实施方案56：根据实施方案40至55中任一个的方法，其中外源启动子是Ptet_O。

实施方案57：根据实施方案40至56中任一个的方法，其中外源PPT能够活化I型和II型酰基载体蛋白(ACP)和肽基载体蛋白(PCP)。

实施方案58：根据实施方案40至57中任一个的方法，其中PPT是细菌PPT。

实施方案59：根据实施方案58的方法，其中细菌PPT是蓝细菌、芽孢杆菌属(例如枯草芽胞杆菌)，粘细菌，放线菌(例如，链霉菌属)或假单胞菌属的PPT。

实施方案60：根据实施方案59的方法，其中蓝细菌PPT是节球藻属(例如泡沫节球藻、泡沫节球藻NSOR10)PPT。

实施方案61：根据实施方案59的方法，其中所述粘细菌PPT是柱头菌属(例如橙色标桩菌，橙色标桩菌DW4/3-1)PPT。

实施方案62：根据实施方案61的方法，其中PPT是橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)DW4/3-1MtaAPPT。

实施方案63：根据实施方案40至62中任一个的方法，其中PPT对于亲本细胞是外源的。

实施方案64：根据实施方案40至63中任一个的方法，其中编码PPT的外源多核苷酸序列整合到亲本细胞基因组中。

实施方案65：根据实施方案40至64中任一个的方法，其进一步包括用编码用于并入微囊藻毒素中的氨基酸和/或羟基酸的外源多核苷酸序列转化亲本细胞。

实施方案66：根据实施方案40至65中任一个的方法，其中亲本细胞是原核细胞。

实施方案67：根据实施方案40至66中任一个的方法，其中亲本细胞是细菌细胞。

实施方案68：根据实施方案40至67中任一个的方法，其中亲本细胞是肠杆菌科细胞。

实施方案69：根据实施方案40至68中任一个的方法，其中亲本细胞是埃希氏菌属细胞。

实施方案70：根据实施方案40至69中任一个的方法，其中亲本细胞是大肠杆菌细胞。

实施方案71：根据实施方案40至70中任一个的方法，其中亲本细胞不是：真核细胞、蓝细菌、鞭毛藻、酵母、人细胞、哺乳动物细胞、植物细胞。

实施方案72：根据实施方案40至71中任一个所述的方法，其中所述亲本细胞不包含编码另外的蓝藻毒素，选自柱孢藻毒素、鱼腥藻毒素、鱼腥藻毒素同系物、蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、鞘丝藻毒素、海兔毒素和/或节球藻毒素中的任何一种或多种的遗传物质。

实施方案73：根据实施方案40至72中任一个的方法，其进一步包括繁殖亲本细胞以产生重组子代细胞。

实施方案74：由实施方案34至39中任一项所述的方法产生、通过其获得或可通过其获得的微囊藻毒素。

本发明还涉及以下非限制性实施方案1-26：

实施方案1：用于产生微囊藻毒素的重组细胞，其包含：

(i)编码选自以下的任何一种或多种微囊藻毒素多肽的一种或多种外源多核苷酸：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素I多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)；

(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作连接的外源启动子；和

(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。

实施方案2：产生能够生产微囊藻毒素的重组细胞的方法，该方法包括用以下物质转化亲本细胞：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)；

(ii)与至少一种所述mcy多核苷酸可操作连接的外源启动子；和

(iii)编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)的外源多核苷酸序列。

实施方案3：根据实施方案1的重组细胞或实施方案2的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；

以及可选地编码以下的任何一个或多个：

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)。

实施方案4：实施方案1的重组细胞或实施方案2的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素I多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)。

实施方案5：实施方案1、3或4中任一个的重组细胞，实施方案2至4中任一个的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyF基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290099.1、AJQ290089.1、F183408.1、AY212249.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyI基因序列。

实施方案6：实施方案1的重组细胞或实施方案2的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，和

微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或者

(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和

微囊藻毒素L多肽(mcyL)。

实施方案7：根据实施方案1、3或6中任一个的重组细胞，或根据实施方案2、3或6中任一个的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列；和/或

GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列。

实施方案8：实施方案1或3至7中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyA基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyB基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290083.1、JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1或KC699835.1中所示的mcyC基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyD基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290095.1、JQ290085.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyE基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyG基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyH基因序列；和/或

GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2或KC699835.1中所示的mcyJ基因序列。

实施方案9：根据实施方案1或3至8中任一个的重组细胞，其包含多种外源多核苷酸，其中：

通过插入核苷酸将多核苷酸彼此分开；并且

每种外源多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

实施方案10：根据实施方案2至8中任一项所述的方法，包括用多种外源性mcy多核苷酸转化亲本细胞，其中：

通过插入核苷酸将所述mcy多核苷酸彼此分开；和

每种外源性mcy多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

实施方案11：根据实施方案9的重组细胞或实施方案10的方法，其中所述多种外源多核苷酸包含：(i)第一外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；或者

(ii)第一种外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码：

微囊藻毒素j多肽(mcyJ)；

第三外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)；

第四外源多核苷酸，其编码：

微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或者

(iii)第一种外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)。

实施方案12：实施方案9或实施方案11的重组细胞，或实施方案10或11的方法，其中插入的核苷酸是外源启动子。

实施方案13：根据实施方案1或3至8中任一个的重组细胞，或实施方案2至8中任一个的方法，其包含编码每一种微囊藻毒素多肽的单个外源多核苷酸。

实施方案14：实施方案1、3至9或11至13中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸是DNA。

实施方案15：实施方案1、3至9，或11至14中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至14中任一项所述的方法，其中外源启动子：

(i)不是T7聚合酶启动子；和/或

(ii)是以下一种或多种：诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、四环素诱导型启动子；和/或

(iii)是能够促进产生至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20k、至少25kb、至少30kb或至少35kb长度的mRNA转录物的进行性启动子；和/或

(iv)是双向促进剂；和/或

(v)是与第一和第二外源多核苷酸可操作连接的双向启动子；和/或

(vi)是Ptet_O。

实施方案16：实施方案1、3至9或11至15中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至15中任一项所述的方法，其中外源PPT：

(i)能够激活I型和II型酰基载体蛋白(ACP)和肽基载体蛋白(PCP)；和/或

(ii)是细菌PPT、蓝细菌PPT，芽孢杆菌属(例如枯草芽胞杆菌)PPT，粘细菌PPT，放线菌(例如链霉菌属)PPT，假单胞菌属PPT，是节球藻属(例如泡沫节球藻、泡沫节球藻NSOR10)PPT，柱头菌属(例如橙色标桩菌，橙色标桩菌DW4/3-1)PPT，或橙色标桩菌(Stigmatella aurantiaca)DW4/3-1MtaA PPT。

实施方案17：实施方案1、3至9，或11至16中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至16中任一项所述的方法，包括：

(i)编码PPT的外源多核苷酸序列；和/或

(ii)整合到重组细胞基因组中的编码PPT的外源多核苷酸序列；和/或

(iii)编码用于并入微囊藻毒素中氨基酸和/或羟基酸的外源多核苷酸序列。

实施方案18：实施方案1、3至9或11至17中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至17中任一项所述的方法，其中所述细胞是重组原核细胞、重组细菌细胞、重组肠杆菌科细胞、重组埃希氏菌属细胞、重组大肠杆菌细胞；

实施方案19：实施方案1、3至9，或11至18中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至18中任一项所述的方法，其中所述细胞：

(i)不是：

真核细胞

蓝细菌，

鞭毛藻，

酵母，

人细胞

哺乳动物细胞

植物细胞；和/或

(ii)不包括编码以下的遗传物质：

另外的蓝藻毒素，

选自柱孢藻毒素、鱼腥藻毒素、鱼腥藻毒素同系物、蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、鞘丝藻毒素、红霉素、海兔毒素和/或节球藻毒素中的任何一种或多种。

实施方案20：实施方案1、3至9或11至19中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至19中任一项所述的方法，其中所述重组细胞不包含编码以下的多核苷酸：

任何不是微囊藻毒素的聚酮化合物；和/或

6-脱氧红霉内酯B合酶或其催化结构域(例如，DEBS1、DEBS2和/或DEBS3)。

实施方案21：实施方案1、3至9或11至20中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至20中任一项所述的方法，其中：

(i)所述一种或多种外源基因位于单个质粒内；或者

(ii)所述一种或多种外源基因位于能够针对仅一种抗生素类型赋予抗性的单个质粒内。

实施方案22：一种用于制备微囊藻毒素的方法，所述方法包括：

在合适的培养基中培养根据实施方案1、3-9或11至21中任一个的重组细胞并持续合适的时间段，以促进所述微囊藻毒素的产生，

并且任选地在培养期间或之后分离由细胞产生的微囊藻毒素。

实施方案23：根据实施方案22的方法，其进一步包括将氨基酸和/或羟基酸添加到培养基中，其中所述氨基酸和/或羟基酸并入由重组细胞产生的微囊藻毒素中。

实施方案24：根据实施方案23的方法，其中所述氨基酸和/或羟基酸不是由重组细胞内源产生的。

实施方案25：根据实施方案1、3至9或11至21中任一项所述的重组细胞，或实施方案2至8或10至24中任一项所述的方法，其中所述微囊藻毒素是微囊藻毒素LA、微囊藻毒素LL、微囊藻毒素AR、微囊藻毒素YA、微囊藻毒素LM、微囊藻毒素VF、微囊藻毒素YM、微囊藻毒素LF、微囊藻毒素LR、[D-Asp³]微囊藻毒素LR、微囊藻毒素LW、微囊藻毒素FR、微囊藻毒素WR、微囊藻毒素LY、微囊藻毒素RR或微囊藻毒素YR。

实施方案26：根据实施方案22至24中任一项所述的方法，其中：

所述重组细胞是重组大肠杆菌细胞；

所述培养包括限制或防止所述重组细胞暴露于D-赤型-β-甲基-异-天冬氨酸；由重组细胞产生的微囊藻毒素至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％或100％为[D-Asp³]微囊藻毒素LR。

定义

如在本申请中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，短语“微囊藻毒素”还包括多种。

如本文所用，术语“包含”意指“包括”。“包含”的词语的变体，例如“含有”和“包括”，具有相应变化的含义。因此，例如，“包含”微囊藻毒素的组合物可以仅由微囊藻毒素组成，或者可以包括一种或多种另外的组分(例如，其他不同的蓝细菌毒素)。

如本文所用，术语“受试者”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包括牛、马、绵羊、灵长类动物、禽类和啮齿动物物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。

如本文所用，术语“多核苷酸”，“核苷酸序列”和“核酸序列”是指脱氧核糖核苷酸碱基、核糖核苷酸碱基、天然脱氧核糖核苷酸碱基和核糖核苷酸碱基的已知类似物或其混合物的单链或双链聚合物。除非另有说明，否则这些术语包括指定的序列以及与其互补的序列。

如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”各自是指由通过肽键连接在一起的氨基酸组成的聚合物，并且在本文中可互换使用。出于本发明的目的，“多肽”可以构成全长蛋白质或全长蛋白质的一部分。

如本文所用，“微囊藻毒素多核苷酸”应理解为包括全长微囊藻毒素多核苷酸以及编码微囊藻毒素多肽片段的全长微囊藻毒素多核苷酸的片段，其保持对全长微囊藻毒素多肽相同的生物活性特征的能力。

如本文所用，“微囊藻毒素多肽”应理解为包括全长微囊藻毒素多肽以及全长微囊藻毒素多肽的片段，其保持与全长微囊藻毒素多肽相同的生物活性特征的能力。

如本文所用，“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指其中已引入外源(即非天然/外源)遗传物质的细胞。外源遗传物质与宿主细胞内天然存在的遗传物质不同。该术语应理解为包括遗传外源遗传物质的子代细胞。重组宿主细胞或宿主细胞可以是原核的(例如包括埃希氏菌属(如大肠杆菌)的细菌细胞或真核生物(例如原生生物、真菌、植物和动物细胞)。

如本文所用，术语“外源的”在提及生物实体及其与给定细胞(例如宿主细胞)的关系时将被理解为意指生物实体不是天然产生的并且不是宿主的天然组分。细胞(即它对宿主细胞不是内源的，对宿主细胞是外源的)。例如，对给定细胞(例如宿主细胞)“外源”的多核苷酸、mcy多核苷酸、核苷酸序列、基因、核苷酸、多肽、mcy多肽、肽、蛋白质、氨基酸、底物或酶将不是由该宿主细胞天然产生并且不会天然存在于该宿主细胞内。

本文中对现有技术文献的任何描述，或本文中衍生于或基于那些文献的陈述，并不是承认该文献或衍生的陈述是相关领域的公知常识的一部分。

出于描述的目的，除非另有说明，否则本文提及的所有文献和GenBank登录号引用的序列均通过引用整体并入本文。

附图说明

现将参考相应附图，仅通过实施例描述本发明的实施方案，其中：

图1是显示具有工程化启动子的微囊藻毒素生物合成基因簇的重建的图。(A)微囊藻毒素生物合成基因簇的结构。(B)两个重叠的福斯质粒(fosmid)pFos-P10F4和pFos-P12F11。(C)通过使用Red/ET重组工程插入缺失mcyC区段和卡那霉素抗性盒，在pFos-P12F11上补充mcyC基因。为了在下一步骤中线性化pFos-P10F4，通过两轮Red/ET重组工程，用氨苄青霉素和四环素抗性盒将NruI限制性位点插入pFos-P10F4侧翼的mcyJ-mcyE中。(D)用NruI处理工程化的pFos-P10F4，并通过凝胶提取纯化得到的19kb NruI-AmpR-mcyJ-mcyE-NruI限制片段。(E)线性-环状同源重组工程导致在一个质粒pFos-mcy中重建整个微囊藻毒素簇。(F)用与阿泊拉霉素抗性盒融合的双向四环素诱导型启动子替换天然mcy启动子。

图2是经典PGR对mcy基因的转录分析中使用的电泳图的照片。扩增使用的cDNA(40ng)作为模板，从在大肠杆菌GB05-MtaA-pFos-mcy(天然启动子，NP)或GB05-MtaA-pFos-biTet-mcy(双向tet启动子，biTet)中提取的mRNA逆转录，铜绿微囊藻PCC 7806基因组DNA用作阳性对照，空福斯质粒pFOS用作阴性对照。

图3是显示mcy基因表达(RT-qPCR)的相对定量的图。使用cDNA作为模板进行RT-qPCR，从在大肠杆菌GB05-MtaA-pFos-mcy(天然启动子，NP)和GB05-MtaA-pFos-biTet-mcy(双向tet启动子，biTet)中提取的mRNA逆转录。将NP中基因的基因表达水平标准化至1倍，并且biTet中的基因表达水平显示为相对于天然启动子的倍数变化。一式三份实验的平均值±SD显示为误差棒值。(***代表通过Student’s检验分析的P<0.001，GraphPad Prism6)。

图4是显示biTet启动子构建的流程图。通过NcoI消化将质粒pET28b::Ptet线性化，用于通过Gibson克隆插入mcyD'-EcoRV片段。随后，通过BglII消化将该质粒线性化，并进行Gibson克隆以组装该线性化质粒，HA-EcoRV-mcyA'-HA片段，Ptet片段和HA-AprR-HA片段。得到的质粒含有侧翼为部分mcyA和mcyD基因的双向tet启动子(biTet)作为进一步LCHR的同源臂，其中阿泊拉霉素抗性盒作为选择标记。

图5显示了与[D-Asp³]微囊藻毒素-LR标准品相比，来自大肠杆菌GB05-MtaA的异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的LC-MS色谱图和质谱图。异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR(A)和标准品(B)的色谱图。异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR在9.16分钟(C)和标准品在9.12分钟(D)的质谱。来自异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR(E)和标准品(F)的离子981.54的串联质谱(MS-MS)。

图6显示了用L-亮氨酸-5,5,5-D₃培养的大肠杆菌GB05-MtaA异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的LC-MS色谱图和质谱。(A)针对m/z＝984.56(同位素标记的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的预测质量)的提取离子色谱图。(B)在9.14分钟的质谱。(C)离子984.56的串联质谱(MS-MS)。

图7显示了用L-亮氨酸-5,5,5-D₃和L-精氨酸-胍基-¹⁵N₂培养的大肠杆菌GB05-MtaA的异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的LC-MS色谱图和质谱图。(A)针对m/z＝984.56且m/z＝986.55(同位素标记的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的预测质量)的提取离子色谱图。(B)在9.16分钟的同位素标记的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的质谱。(C)来自同位素标记的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的离子984.56的串联质谱(MS-MS)。(D)来自同位素标记的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的离子986.55的串联质谱(MS-MS)。

图8显示了由大肠杆菌产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-L对蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制曲线。(A)[D-Asp³]微囊藻毒素-LR和[D-Asp³]微囊藻毒素-LR标准物对PP2A的抑制。(B)通过微囊藻毒素-LR(通过使用具有>94％同源物纯度的微囊藻毒素-LR)和微囊藻毒素-LR标准物对PP2A的抑制。

图9显示了异源产生的微囊藻毒素-LR和标准品的LC-MS分析。异源产生的微囊藻毒素-LR(A)和标准品(B)的色谱图。在9.40分钟的异源产生的微囊藻毒素-LR(C)和在9.27分钟标准品(D)的质谱。来自异源产生的微囊藻毒素-LR(E)和标准品(F)的离子995.56的串联质谱(MS-MS)。

具体实施方式

鉴于微囊藻毒素在饮用水供应中的普遍存在以及海产品中微囊藻毒素污染的发生，迫切需要开发更先进的检测方法并更好地了解微囊藻毒素的毒理学。微囊藻毒素的产生依赖于生长缓慢的蓝藻培养物，这在经济上是困难的并且产量不足。此外，普遍存在的微囊藻毒素生产者(如铜绿微囊藻)产生微囊藻毒素同种型的混合物，并且难以分离不同的微囊藻毒素同种型。现有的微囊藻毒素纯化技术采用连续几轮色谱法，并且为了分离特定的微囊藻毒素同种型，在每轮中通常需要使用几种溶剂变化的不同类型的色谱法。此外，可能难以获得微囊藻毒素的某些同种型，因为需要获得正确的蓝藻物种并以对于产生微囊藻毒素有效的方式生长。单独或结合考虑，这些因素使得通过现有方法生产和分离微囊藻毒素相当不充分。

据本发明人所知，本申请是促进在宿主细胞环境中重组产生微囊藻毒素的平台技术的首次公开内容。本发明提供了对现有技术中提到的一种或几种缺陷的处理，包括增加的微囊藻毒素产量、简化的分离；直接产生某些微囊藻毒素同种型和这些同种型的变体的能力、严格控制微囊藻毒素的量、和/或以与现有方法相比以较低的成本和/或以更高的效率获得微囊藻毒素的方法中的任何一种或多种。

本发明提供了一种系统，其中任何微囊藻毒素同种型、微囊藻毒素的任何新同种型或这些同种型的变体可以在重组细胞中产生。重组细胞可以是细菌细胞，其可以是埃希氏菌属，例如大肠杆菌。用编码用于产生微囊藻毒素的某些关键元件的异源遗传物质转化细菌细胞，该异源遗传物质包括例如编码微囊藻毒素合成途径的蛋白质或蛋白质组分的一种或多种异源基因和/或编码能够启动异源微囊藻毒素途径基因转录的异源启动子的一种或多种基因和/或编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)的一种或多种异源基因。

现有技术强调，聚酮化合物合成酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)产物的有限底物可用性是某些细菌(例如大肠杆菌)中异源表达的显著缺点(参见，例如，Weissman,(2016),Natural product reports 33,203-230)，该教导与本发明的实施例相背离。另外，在完成本发明时，发明人意外地成功地克服了一系列障碍和困难。已经认识到，当天然PPT对修饰次级代谢物合成酶(即由含PKS和NRPS的生物合成途径制备的蓝细菌的那些)具有有限的特异性时，用于异源蛋白质生产的细菌宿主如大肠杆菌是有问题的。另外，在试图构建重组系统时观察到天然宿主细胞启动子仅能够进行低水平转录而不能观察到可检测的微囊藻毒素产生。在用于异源微囊藻毒素生产的细菌宿主中缺乏触发微囊藻毒素基因表达的转录因子(例如氮诱导转录因子，响应于光强度和/或波长变化的转录因子)意味着控制水平的关键因素没有产生微囊藻毒素产生安全问题。尽管存在这些障碍的组合，但本发明人能够在细菌宿主细胞中实现微囊藻毒素的成功异源生产。此外，本发明人设计的系统相对于现有的微囊藻毒素生产方法得到显著改进，并且可以定制为以有效和受控的方式生产多种微囊藻毒素同种型和变体中的任何一种。

重组宿主细胞

本发明提供了重组宿主细胞。重组宿主细胞被修饰/制备并且与任何天然存在的实体不同。用异源生产微囊藻毒素所必需的一种或多种遗传元件转化宿主细胞。外源遗传物质可以整合到细胞的基因组中和/或保留在宿主细胞的细胞质中。可以将外源遗传物质作为载体的组分引入宿主细胞，例如质粒、粘粒(cosmid)、福斯质粒(fosmid)或类似物。

在一些实施方案中，外源遗传物质以单拷贝(例如质粒、粘粒、福斯质粒或类似物)的多个拷贝提供。载体可包含一种或多种赋予对一种或多种抗生素类型的抗性的基因。

在一些实施方案中，重组宿主细胞是原核的。例如，重组宿主细胞可以是细菌细胞。细菌细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞。革兰氏阴性细菌细胞可以选自产水菌门、拟杆菌门/纤维杆菌门-绿菌门(FCB群)、异常球菌-栖热菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌-疣微菌门/衣原体(PVC群)、变形菌门、螺旋体门和互养菌门。革兰氏阳性细菌细胞可选自放线菌门、硬壁菌门和柔膜菌门。

在一些实施方案中，重组宿主细胞是变形菌门的细菌。因此，细菌可以是变形菌纲。因此，细菌可以是肠杆菌科。因此，细菌可以是埃希氏菌属。

在某些实施方案中，重组宿主细胞是大肠杆菌物种的细菌。当对本发明进行操作时，可以使用能够异源生产微囊藻毒素的任何大肠杆菌菌株。非限制性地，可以使用的大肠杆菌菌株的实例包括：BAP1，G1，B1157，2155，L21，L21(AI)，L21(DE3)，L21(DE3)pLysS，LR，NN93，BNN97，BW25113，BW26434，CGSC菌株#7658，BW313，C600，C600hflA150(Y1073，BNN102)，CSH50，D1210，DB3.1，DC10B，DH1，DH5α，DH5αpir，DH5αpir116变体，NEB Turbo(NEB)，DH10B(Invitrogen)，DH12S(Invitrogen)，DM1(Invitrogen)，E.cloni(r)5alpha(Lucigen)，E.cloni(r)10G(Lucigen)，E.cloni(r)10GF'(Lucigen)，EPI300(Epicentre)，E.coli K12ER2738(NEB)，ER2566(NEB)，ER2267(NEB)，H12R8a，HB101，HMS174(DE3)，High-Control(tm)BL21(DE3)(Lucigen)，High-Control(tm)10G(Lucigen)，IJ1126，IJ1127，IM01B，IM08B，IM30B，IM93B，JM83，JM101，JM103，JM105，JM106，JM107，JM108，JM109，JM109(DE3)，JM110，JM2.300，JTK165，K12 3000，K12ΔH1Δtrp，LE392，M15(Qiagen)，M5219，Mach1，MC1061，MC1061(λ)，MC1061Rif，MC4100，MFDpir，MG1655，MG1655seqA-eYFP，MG1655seqA-mEOS3.2，MG1655seqA-PAmCherry，OmniMAX2，OverExpress(tm)C41(DE3)(Lucigen)，OverExpress(tm)C41(DE3)pLysS(Lucigen)，OverExpress(tm)C43(DE3)(Lucigen)，OverExpress(tm)C43(DE3)pLysS(Lucigen)，Rosetta^TM(DE3)pLysS，Rosetta-gami(DE3)pLysS，RR1，RV308，S26，S26R1d，S26R1e，SG4121，SM10(λpir)，SOLR(Stratagene)，SS320(Lucigen)，STBL2(Invitrogen)，STBL4，SURE(Stratagene)，SURE2(Stratagene)，TG1(Lucigen)，TOP10(Invitrogen)，Top10F'(Invitrogen)，W3110，W3110(λ857S7)，WK6mut(λ)，WM3064，XL1-Blue(Stratagene)，XL1-Blue MRF'(Stratagene)，XL2-Blue(Stratagene)，XL2-Blue MRF'(Stratagene)，XL1-Red(Stratagene)，XL10-Gold(Stratagene)，XL10-Gold KanR(Stratagene)，大肠杆菌GB05-MtaA以及下表2中提到的各菌株。

在某些实施方案中，重组宿主细胞不是真核细胞。在其他实施方案中，重组宿主细胞不是蓝细菌或重组蓝细菌。在其他实施方案中，重组宿主细胞不是鞭毛藻或重组鞭毛藻。在其他实施方案中，重组宿主细胞(例如重组细菌)不包含编码其他蓝藻毒素(例如，肝毒素、类毒素、同型毒素、蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、鞘丝藻毒素、海兔毒素和/或节球藻毒素中的任何一种或多种)的遗传物质。在一些实施方案中，重组宿主细胞(例如重组细菌)包含编码另外的蓝藻毒素的遗传物质(例如，肝毒素、类毒素、同型毒素、蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、鞘丝藻毒素、海兔毒素和/或节球藻毒素中的任何一种或多种)。

可以使用任何合适的方法用异源生产微囊藻毒素所必需的一种或多种遗传元件转化宿主细胞。这些方法通常是本领域已知的，并且描述于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Joseph Sambrook,David W Russell,第3版,Cold Spring HarbourPress 2001),Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel F.M.等(Eds),JohnWiley and Sons,Inc 2007),Molecular Cloning(Maniatis等,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982)以及Current Protocols in Microbiology(Coico等(Eds),John Wiley and Sons,Inc,2007)，其全部内容通过交叉引用并入本文。

在一些实施方案中，可以将遗传物质克隆到载体构建体中。用于将载体构建体和其他外源核酸材料引入宿主细胞的合适方法通常是本领域已知的，并且描述于例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等(Eds),New York:John Wiley&Sons,2007)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Sambrook等，第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)。举例来说，可以通过“热休克”方法转化宿主细胞。在该方法下，细胞在二价阳离子如Ca²⁺的存在下冷却，这导致细胞壁渗透性。将细胞在冰上与构建体一起孵育并短暂地热冲击(例如，在42℃下保持0.5-2分钟)使载体构建体进入细胞。或者，可以通过电穿孔用载体构建体转化宿主细胞，该方法包括用电场短暂地震荡细胞，使细胞短暂地形成孔，构建体可以通过该孔进入细胞。在冲击后，天然膜修复机制迅速关闭这些孔。

在构建体进入细胞后，可以在适于促进繁殖的条件下培养宿主细胞。用于培养的方法是本领域熟知的，并且描述于例如Current Protocols in Microbiology,(Coico等,(Eds),John Wiley&Sons,Inc.,2007)。培养物可以在含有底物的培养基中进行，所述底物有助于鉴定转化菌株，该底物例如抗生素(如氯霉素、卡那霉素或四环素)。

可以选择并繁殖转化的重组宿主细胞。例如，如果靶载体含有一个或多个选择标记，则可以通过一种或多种标记的表达来鉴定转化的宿主细胞。

另外或可替代地，遗传物质可以通过一个或多个转座子或其他移动元件插入宿主细胞基因组中。已经证明这些可以调动大小达59kb的大DNA片段。转座子的动员由转座酶介导，通常导致DNA插入基因组中的靶序列。已发现推定的转座酶与几种生物合成基因簇(如微囊藻毒素和节球藻毒素生物合成基因簇)有关。转座子动员大基因簇的能力提供了适合于转移工程化生物合成基因簇的DNA转移系统，其进入无效宿主以表达次级代谢物。

本领域技术人员将认识到，将外源遗传物质引入宿主细胞的其他方法是本领域熟知的，并且也可用于实施本发明。

微囊藻毒素基因

根据本发明，用编码微囊藻毒素合成途径的全部或一些蛋白质组分的外源基因转化宿主细胞。

因此，可以用微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和/或mcyJ中的任何一种或多种转化宿主细胞。

另外地或可替代地，宿主细胞可以用外源RNA(例如mRNA)转化，所述外源RNA通过任何一种或多种微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和/或mcyJ转录产生。

外源序列可以针对宿主细胞进行密码子优化。

在一些实施方案中，用微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ中的每一种和/或每一种基因的RNA转录物转化宿主细胞。

在一些实施方案中，用微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH和mcyJ中的每一种和/或每一种基因的RNA转录物转化宿主细胞。

在一些实施方案中，用微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ中的每一种和/或RNA转录物中的每一种转化宿主细胞。

在一些实施方案中，用微囊藻毒素生物合成基因mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyG、mcyH和mcyJ中的每一种和/或RNA转录物中的每一种转化宿主细胞。

mcyA

重组宿主细胞可包含编码非核糖体肽合成酶(NRPS)的外源mcyA基因和/或其RNA转录物。由mcyA基因编码的NRPS可以包含以下任何一个或多个：分别用于激活丝氨酸和丙氨酸的两个腺苷酸化结构域；缩合结构域，用于脱氢丝氨酸N-甲基化的N-甲基转移酶结构域；异构化域(例如在C-末端)。可用于转化宿主细胞的mcyA基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyA基因序列。用于转化宿主细胞的mcyA基因序列与GenBank登录号JQ290083.1、JQ290093.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyA基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyB

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码非核糖体肽合成酶(NRPS)的外源mcyB基因和/或其RNA转录物。由mcyB基因编码的NRPS可包含两个模块，每个模块包含以下中的任何一个或多个：腺苷酸化结构域、缩合域、硫化域。可用于转化宿主细胞的mcyB基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyB基因序列。用于转化宿主细胞的mcyB基因序列可具有与GenBank登录号JQ290092.1、AY034602.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyB基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyC

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码非核糖体肽合成酶(NRPS)的外源mcyC基因和/或其RNA转录物。由mcyC基因编码的NRPS可以包含模块，该模块包含以下任何一个或多个：腺苷酸化结构域、缩合域、硫化域。可用于转化宿主细胞的mcyC基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyC基因序列。用于转化宿主细胞的mcyC基因序列可具有与GenBank登录号JQ290091.1、AB019578.2、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1和KC699835.1中所示的mcyC基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyD

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码聚酮化合物合酶(PKS)的外源mcyD基因和/或其RNA转录物。由mcyD基因编码的PKS可包含用于I型PKS的两个模块。第一模块可包括以下任何一种或多种：β-酮酰基合酶(KS)结构域、酰基转移酶(AT)结构域、脱水酶(DH)结构域、C-甲基转移酶(CM)结构域、酮缩氨酶(KR)结构域、和/或酰基载体蛋白(ACP)结构域。第二模块可包括以下任何一种或多种：β-酮酰基合酶(KS)结构域、酰基转移酶(AT)结构域、脱水酶(DH)结构域、酮缩氨酶(KR)结构域、酰基载体蛋白(ACP)结构域。可用于转化宿主细胞的mcyD基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、API83408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyD基因序列。用于转化宿主细胞的mcyD基因序列可具有与GenBank登录号JQ290094.1、JQ290084.1、API83408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyD基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyE

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码混合PKS-NRPS的外源mcyE基因和/或其RNA转录物。由mcyE基因编码的混合PKS-NRPS可包含以下任何一种或多种：β-酮酰基合酶(KS)结构域、酰基转移酶(AT)结构域、C-甲基转移酶(CM)结构域、氨基转移酶(AMT)结构域、NRPS模块包含两个缩合结构域，腺苷酸化结构域和硫醇化结构域。可用于转化宿主细胞的mcyE基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290095.1，JQ290085.1，AF183408.1，AY212249.1，AJ441056.1，AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyE基因序列。用于转化宿主细胞的mcyE基因序列可具有与GenBank登录号JQ290095.1，JQ290085.1，AF183408.1，AY212249.1，AJ441056.1，AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyE基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyF

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码甲基转移酶的外源mcyF基因和/或其RNA转录物。可用于转化宿主细胞的mcyF基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyE基因序列。用于转化宿主细胞的mcyE基因序列可具有与GenBank登录号JQ290096.1、JQ290086.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyF基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyG

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码混合PKS-NRPS的外源mcyG基因和/或其RNA转录物。由mcyG基因编码的混合PKS-NRPS可包含以下任何一种或多种：β-酮酰基合酶(KS)结构域、酰基转移酶(AT)结构域、C-甲基转移酶(CM)结构域、氧化还原酶(KR)结构域、酰基载体蛋白(ACP)结构域、包含腺苷酸化结构域和硫醇化(磷酸泛酰巯基甲酸盐载体)结构域的NRPS模块。可用于转化宿主细胞的mcyG基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyG基因序列。用于转化宿主细胞的mcyG基因序列可具有与GenBank登录号JQ290097.1、JQ290087.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyG基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyH

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码ABC转运蛋白组分的外源mcyH基因和/或其RNA转录物。由mcyH基因编码的产物可包含以下任何一种或多种：ABC转运蛋白的膜跨越和ATP结合结构域。可用于转化宿主细胞的mcyH基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyH基因序列。用于转化宿主细胞的mcyH基因序列可具有与GenBank登录号JQ290098.1、JQ290088.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyH基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyI

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码甲基转移酶的外源mcyI基因和/或其RNA转录物。可用于转化宿主细胞的mcyI基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290099.1、JQ290089.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyI基因序列。用于转化宿主细胞的mcyI基因序列可具有与GenBank登录号JQ290099.1、JQ290089.1、AF183408.1、AY212249.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyI基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyJ

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码甲基转移酶的外源mcyJ基因和/或其RNA转录物。可用于转化宿主细胞的mcyJ基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyJ基因序列。用于转化宿主细胞的mcyJ基因序列可具有与GenBank登录号JQ290100.1、JQ290090.1、AB254436.1、AF183408.1、AY212249.1、AJ441056.1、AB032549.2和KC699835.1中所示的mcyJ基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyT

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码硫酯酶的外源mcyT基因和/或其RNA转录物。可用于转化宿主细胞的mcyT基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列。用于转化宿主细胞的mcyT基因序列可具有与GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

mcyL

另外地或可替代地，重组宿主细胞可包含编码乙酰-辅酶A-依赖性O-乙酰转移酶的外源mcyL基因和/或其RNA转录物。可用于转化宿主细胞的mcyL基因序列的非限制性实例包括GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列。用于转化宿主细胞的mcyL基因序列可具有与GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

可用于转化宿主细胞的完整微囊藻毒素生物合成途径基因序列的非限制性和示例性实例包括GenBank登录号AF183408.1(铜绿微囊藻PCC 7806)，GenBank登录号AJ441056(阿氏浮丝藻)和GenBank登录号AJ536156(鱼腥藻)。可用于转化宿主细胞的完整微囊藻毒素生物合成途径基因序列可具有与GenBank登录号AF183408.1(铜绿微囊藻PCC 7806)，GenBank登录号AJ441056(阿氏浮丝藻)和GenBank登录号AJ536156(鱼腥藻)中所示的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。

序列同一性

可以用具有特定程度的序列同一性的多核苷酸序列(DNA和/或RNA)转化重组宿主细胞，所述序列与给定的微囊藻毒素生物合成基因(例如mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI、mcyJ或mcyF)。

可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定两个序列之间的序列同一性的百分比。比较窗口中的序列的一部分可以例如包括与不包含缺失或添加的参考序列(例如，衍生自另一物种的序列)相比的删除或添加(即缺口)，以便最佳地比对两个序列，或反之亦然。然后可以通过确定两个序列中相同核苷酸出现的位置数来计算序列同一性的百分比，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并乘以100的结果产生序列同一性的百分比。

在两个或更多个核酸序列的情况下，序列同一性的百分比是指在比较和比对以获得最大对应性时在指定区域(或，当未指定时在整个序列上)相同的核苷酸的指定百分比。在比较窗口或指定区域上，使用以下序列比较算法之一或通过手动对齐和目视检查来测量。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

用于比较的序列比对方法是本领域已知的。用于确定序列同一性的序列的最佳比对可以使用已知的计算机程序常规地实现，包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可从Intelligenetics,Mountain View,California获得)；GCG Wisconsin遗传学软件包，版本10中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,California,USA获得)。可以使用默认参数执行使用这些程序的对齐。用于确定查询序列和主题序列之间的最佳总体匹配的另一种方法，也称为全局序列比对，可以使用基于Brutlag及其同行的算法的FASTDB计算机程序来确定(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))。

微囊藻毒素基因组织和转录

用于转化宿主细胞的微囊藻毒素生物合成基因和/或RNA转录物可以以适于促进其表达的任何方式组织。例如，可以将单个基因组织成一个或多个操纵子(例如1、2、3、4或5个操纵子)。

作为非限制性实例，可以将基因组织成单个操纵子。单个操纵子可包含mcyA、mcyB、mcyC、mcyD、mcyE，任选的mcyF、mcyG、mcyH，任选的mcyI、mcyJ和任选的mcyT(依此顺序或依不同的顺序)。

作为非限制性实例，基因可以组织成第一和第二操纵子。第一操纵子可包含mcyA、mcyB、mcyC(按此顺序或以不同顺序)，第二操纵子可包含mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI和mcyJ(依此顺序或依不同的顺序)。

作为非限制性实例，基因可以组织成第一，第二和第三操纵子。第一操纵子可包含mcyA、mcyB、mcyC(依此顺序或依不同的顺序)，第二操纵子可包含mcyG、mcyD、mcyJ、mcyE、incyF、mcyI(依此顺序或依不同的顺序)，和第三操纵子可包含mcyH。

作为非限制性实例，可以将基因组织成单个操纵子。单个操纵子可包含mcyA，mcyB，mcyC，mcyD，mcyE，mcyG，mcyH，mcyJ和mcyT(依此顺序或依不同的顺序)。

外源遗传物质(DNA)可以整合到宿主细胞的基因组中。另外或可替代地，外源遗传物质(DNA和/或RNA)可以保留在宿主细胞的细胞质中。出于任一目的，可以将外源遗传物质作为载体的组分引入宿主细胞，例如质粒、粘粒、福斯质粒或类似物。

例如，可以将外源遗传物质克隆到载体中。载体可包括例如DNA、RNA或互补DNA(cDNA)序列。载体可以是质粒载体、病毒载体或适于插入外源序列的任何其它合适载体，它们引入宿主细胞和引入序列的表达。载体可以是表达载体，并且可以包括表达控制和加工序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号和转录终止序列。可以优化表达控制和处理序列以用于宿主细胞。例如，如果宿主细胞是大肠杆菌，则可以包括大肠杆菌调节元件(例如启动子、终止子、核糖体结合序列)。本发明还涉及由这些载体转化的宿主细胞。例如，可以将本发明的多核苷酸克隆到载体中，该载体转化到细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中。用于构建载体及其转化入宿主细胞的方法通常是本领域已知的，并且在标准教科书中描述，例如Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York；和Ausubel等，(Eds)Current Protocols in Molecular Biology(2007),John Wiley and Sons,Inc.。

在一些实施方案中，重组宿主细胞可以包含外源启动子序列和/或适合于表达外源微囊藻毒素多核苷酸并且与它们可操作地结合的转录因子。

在一些实施方案中，宿主细胞可以转化为与mcy基因序列可操作地连接的外源启动子序列，并且不提供外源转录因子。在此类实施方案中，宿主细胞的内源转录因子可以使用外源启动子转录mcy基因。在一些实施方案中，宿主细胞被转化为与mcy基因序列可操作地连接的外源启动子序列，并且提供有能够通过外源启动子启动mcy基因转录的外源转录因子。

没有任何限制，启动子可以是诱导型启动子，其允许控制重组宿主细胞内的基因表达。

另外地或可替代地，启动子可以是普遍存在的或细胞特异性启动子。

另外地或可替代地，启动子可以是真核启动子、原核启动子、细菌启动子、组成型启动子、单向启动子、双向启动子和/或能够促进长度至少5kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少25kb、至少30kb或至少35kb的mRNA转录物产生的进行性启动子。

在一些实施方案中，启动子能够支持/启动能够转录长模板(例如超过5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb或超过35kb)的转录因子的活性。

在一些实施方案中，启动子能够支持/启动能够以低拷贝数转录长模板(例如超过5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb或超过35kb)的转录因子的活性。

合适启动子的非限制性实例包括抗生素诱导型(例如四环素诱导型)启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子、金属诱导型启动子、光诱导型启动子和温度诱导型启动子。

在某些实施方案中，重组宿主细胞可包含与四环素诱导型(‘tet-’)启动子可操作地连接的微囊藻毒素基因序列(例如，Ptet,Ptet_O)。启动子可以是双向的。启动子可位于分叉操纵子(divergent operon)之间，每个操纵子包含一个或多个mcy基因。作为非限制性实例，启动子可位于包含mcyC、mcyB、mcyA的第一操纵子和包含mcyD、mcyE、mcyF、mcyG、mcyH、mcyI、mcyJ的第二操纵子之间并且可操作地连接。第一和第二操纵子彼此分叉(即以相反的方向转录)。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)

在重组宿主细胞中产生的mcy基因产物可能需要和/或受益于翻译后修饰，这是表达含PKS和NRPS的生物合成途径的重要考虑因素。

存在于重组宿主细胞内的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)可以激活这些多模式酶，例如，通过向其载体蛋白添加磷酸泛酰巯基乙烯基接头以促进底物附着。

在一些实施方案中，包含微囊藻毒素基因和/或其RNA转录物的重组宿主细胞不提供外源PPT和/或不用编码外源PPT的核酸序列转化。在此类实施方案中，宿主细胞的天然/内源PPT能够进行翻译后修饰以提供微囊藻毒素同种型或其变体。

在其他实施方案中，向包含微囊藻毒素基因和/或其RNA转录物的重组宿主细胞提供外源PPT和/或用编码外源PPT的核酸序列转化。编码外源PPT的核酸序列可以稳定整合到宿主细胞的基因组中，或保留在宿主细胞的细胞质中(例如在载体中)。

PPT(重组宿主细胞的外源或内源)优选能够激活PKS和/或NRPS。在具有广泛的底物特异性的意义上，PPT可以是“混杂的”。PPT可以是细菌的细菌PPT，其能够内在地产生PKS和/或NRPS酶(例如蓝细菌、芽孢杆菌属(如枯草芽孢杆菌)、粘细菌、放线菌(例如链霉菌)、假单胞菌属)。

在一些实施方案中，外源PPT是蓝细菌PPT，例如来自泡沫节球藻的PPT。该PPT可以是例如泡沫节球藻NSOR10PPT。

底物

已经从不同种类的蓝细菌中分离出超过100种微囊藻毒素的同种型，其因甲基化、羟基化、差向异构化、肽序列和/或毒性程度而异。本发明提供了一种系统，其中任何微囊藻毒素同种型，微囊藻毒素的任何新同种型或这些同种型的变体可以在重组宿主细胞中产生。没有任何特别限制，重组宿主细胞可以是细菌细胞，且该细菌细胞可以是埃希氏菌属(例如大肠杆菌)。

参考本说明书的实施例1并且仅作为非限制性实例，铜绿微囊藻主要产生两种微囊藻毒素同种型，微囊藻毒素-LR和[D-Asp³]微囊藻毒素-LR，后者在第3位的天冬氨酸上缺乏甲基。在这种情况下用于表达微囊藻毒素的重组宿主细胞是大肠杆菌，其中不存在必需前体(β-甲基-天冬氨酸)，这意味着不产生微囊藻毒素-LR。出乎意料地，观察到大肠杆菌宿主掺入天然/内源天冬氨酸代替β-甲基-天冬氨酸，导致产生[D-Asp³]微囊藻毒素-LR，这是用于毒理学研究的关键产物。在这样做时，重组大肠杆菌宿主出乎意料地解决了现有技术的另一个问题，即提供该微囊藻毒素同种型的纯来源而无需从同种型的混合物中纯化。

本发明人设计的系统通过控制微囊藻毒素同种型生物合成中使用的特定底物的可用性，证明了促进或抑制重组宿主细胞中某些靶微囊藻毒素同种型产生的方法。这可以通过例如选择不能内源性产生微囊藻毒素生产所需的一种或多种底物的重组宿主细胞来实现。另外地或可替代地，这可以通过将微囊藻毒素产生所需的外源底物引入重组宿主细胞中来实现，例如，通过表达编码底物的多核苷酸或通过向宿主细胞提供底物供应。

在一些实施方案中，重组宿主细胞可以缺少或可以具有氨基酸和/或羟基酸(例如α羟基酸或β羟基酸)。

合适的氨基酸的非限制性实例包括任何已知氨基酸的L-或D-构型，这些氨基酸例如是精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、D-赤型-β-甲基-异-天冬氨酸、四氢酪氨酸、高异亮氨酸、高苯丙氨酸、高酪氨酸、高精氨酸、2-氨基异丁酸。3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸-4,6-二烯酸(Adda)变体，包括9-O-乙酰基-Adda、胍丁胺、β-丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、l-组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯基β-丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、瓜氨酸、肌酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸及其任何组合。

合适的α-羟基酸和β-羟基酸的非限制性实例包括α-羟基-丁酸、α-羟基异丁酸、α-羟基-α-乙基丁酸、α-羟基异己酸、α-羟基异丙酸、阿卓乳酸、α-羟基-β-甲基戊酸、β-羟基丁酸、β-苯基乳酸、β-苯基乳酸、β-苯基丙酮酸、α-羟基硬脂酸、α-羟基己酸、α-羟基丁酸、柠檬酸乙基丙酮酸、α-羟基戊酸、半乳糖醛酸、β-丁内酯、葡庚糖酸、葡萄糖庚酮1,4内酯、葡萄糖酸、葡糖酸内酯葡糖醛酸、葡糖醛酸内酯、乙醇酸、丙酮酸异丙酯、乳酸、α-羟基肉豆蔻酸、马来酸、α-羟基辛酸、β-丙基丙交酯、苦杏仁酸(amndelic acid)、新戊内酯、丙酮酸乙酯、粘酸、α-羟基异戊酸、新戊内酯、丙酮酸、糖二酸、α-羟基乙酸、糖二酸1,4-内酯、α-羟基庚酸、α-羟基癸酸、酒石酸、γ-丁内酯、四甲基乙交酯、丙醇二酸及其任何组合。

在一些实施方案中，宿主细胞可能缺乏或可能具有2-氨基异丁酸和/或3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-癸二烯酸(Adda)化合物的合成变体。

不受理论限制，可以掺入提供给重组宿主细胞的底物以使用下列方式提供不同的微囊藻毒素同种型和变体。NRPS的腺苷酸化结构域(A结构域)在ATP和Mg²⁺-依赖性反应中识别并活化氨基酸底物为氨基酰基腺苷酸，然后将其与肽基载体蛋白(PCP)的4'-磷酸泛酰巯基乙胺部分连接起来形成硫酯。A结构域的底物特异性很大程度上取决于10个残基的“特异性赋予编码”。一些A结构域，例如微囊藻毒素合成酶中的那些，显示出宽松的底物特异性并且能够活化多于一个氨基酸底物。在通过A结构域激活后，氨基酰基腺苷酸中间体通过PCP转移到下一个模块，其中缩合结构域形成上游PCP结构域上生长的肽链与拴系下游PCP结构域的活化氨基酸之间的肽键。通过受体氨酰基腺苷酸的氨基对供体酰基的亲核攻击发生肽键形成。

在一些实施方案中，外源底物可以在两个主要可变位置中的任一个或两个(即在位置2和4)掺入微囊藻毒素中。另外地或可替代地，外源底物可以在环肽结构的其他五个可用氨基酸位置中的任何一个或多个处掺入微囊藻毒素中。

可能由本发明的重组宿主细胞产生任何不同的同种型或其变体，包括例如同种型LA、LL、AR、YA、LM、VF、YM、LF、LR、[D-Asp³]微囊藻毒素-LR、LW、FR、WR、LY、RR和YR。

适合的重组宿主细胞的培养试剂和条件是本领域熟知的。所用的具体试剂和条件取决于用于产生微囊藻毒素或其组分的重组宿主细胞。培养后，可分离或浓缩宿主细胞(例如通过过滤和/或离心)并裂解以允许收集微囊藻毒素或其组成部分。可以使用已知方法将微囊藻毒素或其组分与裂解物中的其他化合物一起纯化和/或分离。

本领域普通技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中公开的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

实施例

现在将参考具体实施例描述本发明，这些实施例不应被解释为以任何方式进行限制。

实施例1

1.1介绍

由于毒素标准物的有限可用性和高成本，微囊藻毒素的检测和毒理学研究受到阻碍。在这些实验中，开发了在大肠杆菌中异源表达重组微囊藻毒素合成酶的系统，以产生微囊藻毒素同种型微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素[D-Asp³]微囊藻毒素-LR。来自铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa sp.)PCC 7806的55kb微囊藻毒素基因簇使用Red/ET重组工程组装，并用诱导型Ptet_O启动子替换天然启动子以产生优于铜绿微囊藻的生产水平。本文描述的表达平台可以定制为异源产生多种微囊藻毒素变体，以及可能具有商业相关性的其他蓝细菌天然产物。

1.2材料和方法

-细菌菌株和培养条件

将铜绿微囊藻PCC 7806在BG11培养基中培养，在25μmol光子m^-2.s^-1下恒定照射。将大肠杆菌菌株(表1)在37℃下培养，在补充有适当抗生素的溶菌肉汤(LB)中摇动(200rpm)用于质粒选择。用染色体整合的混杂PPT酶(MtaA)改造的异源表达菌株大肠杆菌GB05-MtaA13用于fosmid表达，并在补充有15μg.mL^-1氯霉素的LB、Terrific Broth(TB)或M9基本培养基中培养。

表1

本研究中使用的菌株和质粒列表

-RNA分离、PCR和实时qPCR

使用Direct-zol RNA小量制备试剂盒(Zymo Research)分离总RNA，按照制造商的说明书用Trizol(Invitrogen，USA)进行大肠杆菌裂解。在使用靶向16S rRNA基因的引物PCR确认RNA样品中不存在DNA后，通过Superscript II cDNA合成试剂盒(New EnglandBiolabs)将200ng总RNA用于cDNA合成。使用表2中列出的引物，使用BIOTaq DNA聚合酶(Bioline，Australia)进行PCR。qPCR在7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)中一式三份地进行，其中引物列于表3中，并且mcy基因的表达水平被标准化为各个样品的16s rRNA水平。

表2

本研究中用于cDNA扩增的引物列表。示出用于转录分析的引物、靶标与启动子(mcyA和mcyD之间)之间的距离。

表3

本研究中用于qPCR的引物列表。显示了用于定量转录分析(RT-qPCR)的引物，靶与启动子(mcyA和mcyD之间)之间的距离。

-铜绿微囊藻PCC 7806基因组福斯质粒文库的制备

如前所述(Morin等，(2010)，Journal of Microbiological Methods 80，148-154)从1L固定相培养的铜绿微囊藻PCC 7806中提取高分子量基因组DNA。使用CopyControl Fosmid Library Production试剂盒(Epicenter，USA)并稍作修改制备基因组文库。简而言之，省略了通过琼脂糖凝胶电泳步骤的大小选择，并且使用Genomic DNA Cleanand Concentrator-10试剂盒(Zymo Research，USA)通过纯化和剪切基因组DNA来代替。最后修复大约5-10μg的DNA，然后第二次纯化DNA并与pCC1FOS连接。将来自文库的大约1,500个菌落接种到含有15μg.mL^-1氯霉素的LB琼脂上，然后转移到96孔板中，然后用靶向微囊藻毒素基因簇侧翼区的引物进行PCR筛选。

-表达质体构建

pFos-biTet-mcy质粒构建的描述如下：

步骤1：构建同源性arm(HA)-mcyC’-KanR-HA

使用Velocity聚合酶(Bioline，Australia)和引物mcyC’-NcoI-F和mcyC’-Xbal-R，在福斯质粒pFos-P12F11上不存在的mcyC区域(mcyC’)从铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa sp.)PCC 7806基因组DNA中扩增。用DNA Clean和Concentrator-5试剂盒(ZymoResearch，USA)纯化后，用XbaI和Ncol(New England Biolabs，Australia)消化插入物，纯化并连接(T4DNA连接酶，New England Biolabs)到各自的纯化(Zymoclean Gel DNARecovery试剂盒，ZymoResearch)pET15b(Novagen，Australia)凝胶位点，并命名为pET15b::mcyC’。然后用BamHI和NdeI(New England Biolabs)消化该质粒，并用相同酶消化的卡那霉素抗性盒[使用KanR-BamHI-F和KanR-NdeI-R]扩增pET28b(Novagen)]连接。得到的质粒命名为pET15b::mcyC’-KanR。使用该质粒作为模板，使用引物HR-mcyC'-F和HR-KanR-R扩增HA-mcyC’-KanR-HA。得到的PGR产物HA-mcyC’-KanR-HA，进行凝胶纯化，并电穿孔至重组工程-熟练GB05-red，如前所述制备，含有pFos-P12F11，如前所述制备¹，用于线性环状同源重组(LCHR)。

步骤2：HA-NruI-AmpR-H A的构建

使用引物HR-AmpR-NruI-F和HR-AmpR-R以pET15b作为模板，通过Velocity DNA聚合酶扩增氨苄青霉素抗性盒，然后如上所述纯化该扩增子并用于具有pFos-P10F4的LCHR。

步骤3：HA1-TetR-NruI-HA2-AmpR-HA3的构建

用引物TetR-EcoR1-F和TetR-NotI-R以质粒pBR322作为模板扩增四环素抗性盒。在凝胶纯化和随后的连接之前，使用EcoRI和NotI(New England Biolabs)消化插入物和质粒(pET28b)；得到的质粒命名为pET28b::TetR。

然后通过NotI和XhoI(New England Biolabs)消化该质粒和NruI-HA2-AmpR片段[使用引物AmpR-NotI-NruI-F和AmpR-XhoI-R从pET15b(Novagen)扩增]，随后进行连接。将所得质粒命名为pET28b::TetR-NruI-HA-AmpR。

该质粒用作模板，并用HR-TetR-F HR-AmpR-R作为引物，以扩增HA1-TetR-NruI-HA2-AmpR-HA3。将该片段上的同源臂1和3用于该片段与pFos-P10F4之间的同源重组。

步骤4：Linearization of NruI-AmpR-mcyJ-mcyE-NruI的线性化

20kb的DNA片段NruI-AmpR-mcyJ-mcyE-NruI通过针对LCHR(步骤5)的NruI限制酶切消化从pFos-P10F4-NruI切除(步骤5)。

步骤5：构建pFos-mcy

如步骤3中所述，对于福斯质粒和同源臂2共有的600bp mcy区域用于在线性化的NruI-AmpR-mcyJ-mcyE-NruI(来自pFos-P10F4)和pFos-P12F11-mcyC之间引导LCHR，导致整个微囊藻毒素生物合成基因簇整合到一个福斯质粒pFos-mcy中

步骤6：在pFos-mcy中工程化启动子区域

步骤6.1：构建EcoRV-mcyA’-Ptet-AprR-Ptet-mcyD’-EcoRV

使用引物TetProm-BglII-F和TetProm-NcoI-R从pCC-Ptet-ltx¹扩增Ptet_O启动子，凝胶纯化，用BglII和NcoI消化，凝胶纯化，并连接到pET28b的各个位点。用NcoI消化pET28b::Ptet质粒，并进行凝胶纯化。使用引物Gib-mcyD'-F和Gib-mcyD'-EcoRV-R扩增mcyD基因的第一个252bp(mcyD')，并通过Gibson组装克隆到pET28b::Ptet中；得到的质粒命名为pET28b::Ptet-mcyD’。在Gibson与mcyA’(mcyA基因的第一个138bp，使用引物Gib-mcyA’-F和Gib-mcyA’-EcoRV-R通过PCR扩增)、AprR(阿普拉霉素抗性盒，使用引物Gib-ApraR-F和Gib-ApraR-R扩增)和Ptet(通过使用Gib-Ptet-F和Gib-Ptet-R的PCR扩增)组装之前用BglII消化该质粒。

步骤6.2：将biTet(mcyA’-Ptet-AprR-Ptet-mcyD’)插入pFos-mcy

通过EcoRV限制性消化从pET28b质粒释放DNA片段mcyA’-Ptet-AprR-Ptet-mcyD’，通过LCHR将该片段插入pFos-mcy，替换天然mcy启动子，以产生pFos-biTet-mcy。

-发酵条件

通过电穿孔用福斯质粒pFos-biTet-mcy转化大肠杆菌GB05-MtaA以产生GB05-MtaA-pFos-biTet-mcy。在含有20μg/mL阿泊拉霉素、25μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上选择克隆。在用15μg/mL氯霉素选择时，通过用空pCC1FOS质粒(Epicenter，USA)转化GB05-MtaA产生阴性对照菌株(GB05-MtaA-pCC1FOS)。将两种菌株在30℃下在补充有15μg/mL氯霉素的LB培养基中振荡(950rpm，Eppendorf Thermomixer，Germany)培养过夜。使用过夜培养物接种含有15μg/mL氯霉素的50mL LB培养基，在250mL Erlenmeyer烧瓶中以1:100稀释。将培养物在30℃下振荡(200rpm)温育直至OD600达到0.3。然后将培养物在18℃下振荡(200rpm)温育直至OD600达到0.5。通过添加0.5μg/mL四环素诱导表达并继续孵育4天。将Amberlite XAD-7聚合物树脂(2％v/v)加入培养物中以吸附分泌的代谢物，并继续培养24小时。通过以4,000g离心30分钟收获细胞和树脂，并且在毒素提取之前将细胞沉淀储存在-20℃。

-喂养实验

重组大肠杆菌在M9培养基中培养，单独补充0.05mg/mL L-亮氨酸-5,5,5-D₃(剑桥同位素实验室，USA)或补充0.05mg/mL L-亮氨酸-5,5,5-D₃和0.05mg/mL L-精氨酸-胍基-¹⁵N₂(剑桥同位素实验室)以确认亮氨酸和精氨酸在[D-Asp]微囊藻毒素-LR中的各自位置的并入。此外，将0.5mg/mL或5mg/mLβ-甲基-天冬氨酸(Sigma，Australia)加入到M9培养基中，以提供生产微囊藻毒素-LR所必需的甲基化天冬氨酸前体。

-微囊藻毒素的提取

将细胞沉淀在冰上解冻并重悬于6mL MilliQ水中。加入甲醇以获得80％甲醇水溶液。通过涡旋2小时破碎细胞，然后通过在室温下振荡(200rpm)1小时来提取。通过离心(4,000g)除去细胞碎片，并将上清液通过Whatman No.1过滤器(185mm)过滤到Syncore干燥器样品玻璃管(Buchi，Switzerland)中。用Syncore干燥器(200rpm，35℃，压力从93下降至40mbar)将提取物蒸发至3mL，转移至闪烁瓶中并通过Rotavapor(Welch 2027，USA)蒸发至干燥。将干燥的提取物重悬于3mL HPLC级甲醇中，以16,100g离心10分钟，然后转移至HPLC小瓶用于分析。

-微囊藻毒素生成分析

在与U3000UHPLC系统(ThermoFisher Scientific，USA)偶联的Q-Exactive Plus质谱仪上进行LC-MS/MS分析。将20μL样品溶液注入Waters CSH C18×150×2.1mm 1.9微米柱。色谱法在40℃下使用0.1％甲酸水溶液(A)对乙腈(B)在300μL/ml下使用以下梯度进行：时间0＝5％B，5＝38％B，15.5＝52％B，20＝95％B，23＝95％，25＝5％，然后在下一次注射之前在5％下平衡5分钟。将柱洗脱液导入保持在250℃的HESI-2探针中。保护气体和辅助气体分别为25和5(ThermoFisher任意单位)。毛细管温度为300℃。S-Lens是60。质谱以正离子模式在350-1500的范围内以70k的分辨率设置获得。数据依赖性采集用于获得前一全质谱中8个最强离子的MS/MS数据。利用包含列表确保在目标分析物(981.6000,983.5000,984.5000,986.5000,995.5560,1024.5000,1031.5000)上获得MS/MS数据。将诱导的微囊藻毒素表达培养物的提取物与阴性对照进行比较，所述阴性对照包括未诱导的微囊藻毒素表达培养物和用空福斯质粒转化的诱导培养物。

-蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制试验

从Heresztyn和Nicholson的PP2A方法(Heresztyn和Nicholson，(2001),WaterResearch 35,3049-3056)修改该测定方法。微囊藻毒素相对于PP2A(Promega，澳大利亚)的抑制能力是基于当与一定浓度的微囊藻毒素一起孵育时PP2A(与对照相比)对底物对硝基苯磷酸盐(pNPP)的相对活性来测量的。通过用40mM DTT、10mM MnCl₂、10mg/mL BSA和去离子水以10:1:4:2:3的比例在0.1M Tris缓冲液(pH7.0)稀释PP2A酶来制备酶溶液。反应缓冲液包含0.4M Tris缓冲液(pH 8.1)、10mM MnCl₂、0.3M MgCl₂、10mg/mL BSA，其比例为25:2:13:10。通过以4:1:5的比例将50mM pNPP和40mM DTT加入反应缓冲液中来制备底物溶液。在反应之前，将10μL样品和10μL酶溶液在96孔微量培养板孔中混合，并在37℃下孵育5分钟。通过向孔中加入100μl底物溶液开始反应，并在37℃下孵育80分钟。用去离子水代替样品作为对照组，并且用去离子水代替对照组中的酶溶液作为空白组。在反应混合物中，PP2A的浓度为0.33U/mL(空白组除外)，并且最终反应混合物中的微囊藻毒素浓度用于绘制抑制曲线并计算引起50％抑制的微囊藻毒素浓度(IC₅₀)。

1.3结果和讨论

铜绿微囊藻PCC 7806中负责微囊藻毒素产生的基因是成簇的，跨度为55kb。该途径包含10个基因，转录为两个不同的操纵子，mcyC-mcyA和mcyD-mcyJ，编码一个聚酮化合物合成酶(PKS)，三个非核糖体肽合成酶(NRPS)和两个杂合PKS-NRPS。为了分离mcy基因簇，构建铜绿微囊藻PCC 7806基因组DNA福斯质粒文库，然后进行聚合酶链式反应(PCR)筛选，靶向位于mcy簇侧翼的两个基因。揭示了两个阳性克隆(pFos-mcyJ-mcyE，18.8kb和pFos-mcyE-mcyC，35.6kb)，覆盖54kb的55kb基因簇，包括600bp重叠，后者克隆中缺失一小部分mcyC。为了重新装配生物合成途径，设计了克隆策略(图1)。简而言之，mcyC通过缺失区域的线性-环状同源重组(LCHR)完成。为了进行该途径的最终重组，通过LCHR将两个限制性位点插入到pFos-mcyJ-mcyE，侧面相接这些基因。使用限制性消化切除的mcyJ-mcyE和pFos-mcyE-mcyC进行LCHR。将整个mcy基因簇重构到一个质粒pFos-mcy上。

翻译后修饰是表达含PKS和NRPS的生物合成途径的重要考虑因素。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)通过向其载体蛋白添加磷酸泛酰巯基乙酰基接头来激活这些多模式酶，以促进底物附着。PPTase不与mcy途径成簇，并且天然大肠杆菌PPTase对修饰次级代谢物合成酶具有有限的特异性。来自粘细菌的橙色标桩菌DW4/3-1的杂合磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(MtaA)整合到大肠杆菌GB2005的基因组中产生大肠杆菌GB05-MtaA。用pFos-mcy转化大肠杆菌GB05-MtaA(产生GB05-MtaA-pFos-mcy)后，确认的克隆在不同温度(30℃、25℃、18℃)下培养3天、5天和7天，但是从这些培养物的细胞裂解物中没有检测到微囊藻毒素。

位于mcyA和mcy1之间负责微囊藻毒素生物合成中涉及的基因转录的启动子区域含有由全局氮响应转录因子NtcA识别的序列基序，其通过氮可用性的改变调节mcy基因的表达。光强度和波长也影响mcy基因转录，其代表铜绿微囊藻中微囊藻毒素生物合成的另一个调节因子。由于在大肠杆菌中没有描述NtcA的同源物，因此认为mcy基因簇的有效异源表达不可能从其天然启动子实现。为了测试这一点，对从发酵中提取的mRNA进行转录分析，随后PCR扩增靶向簇内所有基因的cDNA(表2和3)。出乎意料的是，即使LC-MS未检测到微囊藻毒素，也检测到来自天然启动子的转录物(图2和3)。因此，为了增强微囊藻毒素生物合成酶的表达，必须用在大肠杆菌中有效发挥作用的启动子替换天然mcy启动子。

由于转录本mcyD-mcyJ跨越35kb，因此T7启动子不是该研究的理想候选者。多功能四环素诱导型启动子(Ptet_O)被认为是一种很好的选择。为了工程化在大肠杆菌中表达的mcy途径，构建了双向Ptet_O启动子(PbiTet)，侧翼为部分mcyA和mcyD基因并且限制性酶切位点以使用pFos-mcy指导的PbiTet的LCHR(表4，图4)。将该启动子插入pFos-mcy中，取代天然mcy启动子，使mcyA-mcyC和mcyD-mcyJ操纵子同时表达。这种新质粒命名为pFos-PbiTet-mcy。

表4

本研究中用于构建pFos-biTet-mcy的引物列表。粗体序列是限制性位点，下划线序列是LCHR或Gibson克隆所需的同源臂。

用pFos-PbiTet-mcy转化大肠杆菌GB05-MtaA(以产生GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy)后，将表达菌株在30℃培养至早期对数期并在用四环素诱导之前冷却至18℃。然后在18℃温育5天，在收获前一天加入Amberlite XAD-7聚合物树脂，通过离心吸附细胞外代谢物。使用80％甲醇水溶液提取微囊藻毒素，并通过液相色谱质谱(LC-MS)分析提取物。与[D-Asp³]微囊藻毒素-LR标准品(Enzo Life Sciences，USA)的比较显示存在对应于[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的峰，在9.16分钟检测，其中m/z为981(图5)。在未诱导的对照(GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy)的甲醇提取物中不存在该峰，并诱导阴性对照[GB05-pCC1FOS(空福斯质粒)]。针对[D-Asp³]微囊藻毒素-LR标准，通过LC-MS/MS进一步验证了981m/z离子的特性(图5)。

所有微囊藻毒素中都有五种微囊藻毒素断裂离子，便于对这些化合物进行分析验证。这些离子包括[C₉H₁₁O]⁺，其是具有甲氧基取代基的Adda基团的裂解产物，m/z 135；[C₁₁H₁₅O]⁺m/z 163；[Mdha+Ala+H]⁺m/z 155；[Glu+Mdha+H]⁺m/z 213；以及[C₁₁H₁₅O+Glu+Mdha]⁺m/z 375。诱导GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy甲醇提取物的LC-MS/MS分析显示了所有五种微囊藻毒素碎裂离子，证实前体离子(m/z 981)确实是微囊藻毒素变体。在前体离子的碎裂之后，还观察到其他特征离子，包括[Mdha+Ala+H-CO]⁺m/z 127和[Arg+NH₃+H]⁺m/z174。此外，观察离子[D-Asp+Arg+H-NH₃]⁺m/z 255和[D-Asp+Arg+H]⁺m/z 272的观察结果表明981m/z前体离子为[D-Asp³]微囊藻毒素-LR。[D-Asp³]微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-LR之间的m/z 14的差异对应于这些微囊藻毒素变体的位置3处的D-Asp和Me-Asp之间的质量差异。

通过同位素标记的氨基酸进料实验进一步建立GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy提取物中[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的存在，在此期间整个质量移位3(l-Leu-5,5,5-D₃)和2(l-Arg-胍基-¹⁵N₂)，并且当使用L-Arg-guanidino-¹⁵N₂喂养时，m/z从174变为176对应于检测到离子[Arg+NH₃+H]⁺(图6和7)。

ADDA特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种免疫测定，用于检测和定量水样中的微囊藻毒素和结节蛋白。进行该测定，结果显示来自重组大肠杆菌的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR中出现ADDA基团。ELISA另外定量[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的产率在65±7μg/L。为了证实异源产生的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的生物活性，进行蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制测定，其模拟微囊藻毒素在脊椎动物中引发毒性的机制。当异源生成[D-Asp³]微囊藻毒素-LR加入到反应中时观察到对PP2A的强抑制，并且当用0.33mU/mL磷酸酶进行测定时IC₅₀为0.17nM(μg/L)[D-Asp³]微囊藻毒素-LR，如图8所示。

为了优化毒素产量，测试了不同的培养条件。在Terrific Broth(TB)和M9基本培养基中进行大肠杆菌GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy的发酵。[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的产量分别为使用溶菌肉汤(LB)获得的总产量的约250％(TB)和10％(M9)(表)

表5

通过ELISA定量来自不同培养基的[D-Asp³]微囊藻毒素-LR(由Sydney WaterCorporation进行)。

在实验室条件下，铜绿微囊藻PCC 7806主要产生两种毒素同种型，微囊藻毒素-LR和[D-Asp³]微囊藻毒素-LR，后者在3位天冬氨酸上缺乏甲基。已知在大肠杆菌中不存在D-赤型-β-甲基-异-天冬氨酸，这解释了为什么在我们的异源系统中不产生微囊藻毒素-LR。先前已经提出PKS和NRPS产物的有限底物可用性是大肠杆菌中异源表达的主要缺点。缺乏必需前体通常导致异源表达的失败，然而，在本例中，合成酶掺入天冬氨酸代替D-赤型-β-甲基-异-天冬氨酸。[D-Asp³]微囊藻毒素-LR是毒理学研究所需的关键产物。由于它们的化学相似性，从天然生产者中分离该变体和微囊藻毒素-LR可能是麻烦的。在大肠杆菌中成功生产微囊藻毒素为获得纯[D-Asp³]微囊藻毒素-LR提供了极好的选择。这激发了一种通过异源宿主中的底物限制将天然产物的生物合成指向特定类似物的新方法。

除了防止不需要的底物掺入之外，所开发的异源表达系统还提供了简单地通过添加特定前体来指导所需微囊藻毒素变体的生物合成的替代方案。由于大肠杆菌中不存在β-甲基-天冬氨酸，并且天冬氨酸β位上甲基的出现是微囊藻毒素-LR与[D-Asp³]微囊藻毒素-LR的变化，这种氨基酸的添加是大肠杆菌中微囊藻毒素-LR生物合成的有希望的方法(图9)。为了最小化培养基中氨基酸的干扰，在补充有如上所述的500mg/L的β-甲基-天冬氨酸的M9基本培养基中进行发酵。在该培养基中发酵导致产生40.98±4.64μg/L的天冬氨酸(50mg/L)产量减半。补充产生约96％的微囊藻毒素-LR和约4％[D-Asp³]微囊藻毒素-LR。这些变化表明滴定底物补充量如何能够改变总微囊藻毒素中产生的微囊藻毒素-LR的比例。随后的PP2A测定显示，这种大肠杆菌产生的微囊藻毒素-LR具有活性，并且显示出比[D-Asp³]微囊藻毒素-LR具有更强的抑制能力，针对0.33mU/mL的磷酸酶的IC₅₀为0.12nM(μg/L)微囊藻毒素-LR(图8)。

现有的微囊藻毒素纯化技术采用连续几轮色谱法；此外，为了分离特定的微囊藻毒素类似物，利用几种溶剂变化的不同类型的色谱法(具有正常柱和反相柱的HPLC，TLC)对于每个步骤强调类似物的特定极性所必需的(Lawton等(2001)，Journal ofchromatography A 912,191-209)。通过底物补充异源生产高纯度微囊藻毒素-LR比从蓝细菌中分离微囊藻毒素-LR所需的复杂纯化更有效。

由于密码子偏倚问题和一般缺乏关于其生物合成的信息，蓝藻天然产物的异源表达具有挑战性。该研究表明，尽管天然mcy启动子在大肠杆菌中起作用，但它不适用于微囊藻毒素合成酶的异源表达[表达水平为7-(mcyC)、15-(mcyB)、3-(mcyA)、36-(mcyD)、14-(mcyE)、29-(mcyF)、6-(mcyG)、2-(mcyH)、3-(mcyI)和3-(mcyJ)与天然启动子驱动相比，与来自biTet启动子的相比，折叠率更低(表3，图3)]。尽管如此，由于不可控制的诱导条件，来自天然mcy启动子的功能性表达是非常不希望的。由于该途径的产物具有高毒性，清晰的调节机制和严格的生产控制是必不可少的。这些结果表明，[D-Asp³]微囊藻毒素-LR仅由大肠杆菌GB05-MtaA-pFos-PbiTet-mcy在四环素诱导后产生，表明TetR抑制物严格调节生物合成途径的表达和作为安全控制的充分措施。

在实验室条件下，铜绿假单胞菌PCC 7806产生的微囊藻毒素为0.65-2.2fg/细胞/天，而重组大肠杆菌仅产生0.0007-0.0059fg/细胞/天(LB>TB>M9)。当考虑到大肠杆菌的快速生长速率和高细胞密度时，该异源宿主的产量可以达到1.3-32.5μg/L/天(TB>LB>M9)，这远远优于来自铜绿微囊藻的5.7-16.7μg/L/天的产量。本文所述的微囊藻毒素表达平台比用于从缓慢生长的蓝细菌培养物和复杂的大量繁殖样品中纯化毒素的传统色谱方法更快速，更有效和更经济。

迅速形成的淡水蓝藻因其产生毒素的能力而为人厌弃，毒素会污染水资源并危害人类和动物的健康。这些实验已证明使用诱导型异源表达系统产生大的、复杂的、几乎无处不在的淡水毒素微囊藻毒素。异源表达平台是产生[D-Asp³]微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-LR的稳定且有效的方法，并且最终将有益于微囊藻毒素生物合成，检测和毒理学的全球研究。该平台还通过严格调节，高度可控的表达系统提供对其他微囊藻毒素变体的访问，并且还为从蓝细菌生产其他毒素和天然产物奠定了基础。

例二

微囊藻毒素-LR生产需要D-赤型-β-甲基-天冬氨酸的生产。先前在文献中已经注意到ΔmcyI/ΔmcyJ不会影响D-Asp³]微囊藻毒素-LR的产生。

本发明人进行的基因敲除研究(数据未显示)表明，mcyI和mcyH都需要产生微囊藻毒素的任何变体，表明它们参与微囊藻毒素的生产(不仅仅是定制(tailoring))，可能是通过稳定巨型合成酶(megasynthetase)(NRPS-PKS)。

序列表

<110> 新南创新有限公司

<120> 重组微囊藻毒素生产

<130> P247350C

<160> 68

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

cacctgtctt gatgcttatg 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 合成寡核苷酸

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ctattgcctc ggaattatct c 21

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<212> DNA

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<223> 合成寡核苷酸

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accatataag cgggcagttg 20

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ataatgagcc gtacaacagc caat 24

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cggcagccat atggaacagg gattatttag cag 33

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ggcttctccc ccgacaatta 20

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ctgaggggat tacggattga 20

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<212> DNA

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<223> 合成寡核苷酸

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accatataag cgggcagttg 20

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<212> DNA

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<223> 合成寡核苷酸

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gcgacggcca atgatgtc 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 26

gagggcgcgg gtttg 15

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 27

agttagcaac gggagacatg atc 23

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 28

taaaaccggt agctggaaat acaat 25

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 29

ataccgttga cggcggttt 19

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 30

agggctaaag gatgacgaca aa 22

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 31

ccaagtcaat ctggaacatc tcaa 24

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 32

ataatgagcc gtacaacagc caat 24

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 33

cagccgctat tttaggccat a 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 34

cctcgatggc tgaccagttt 20

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 35

caaacaccgg attatgaaaa ggta 24

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 36

aaccttcgcc tggttcgat 19

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 37

tggctgaatc ggactttgtt t 21

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 38

aacatttccc gcgtttcact 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 39

gcggaagctt ttcgagtttt 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 40

tctaggcaaa caatccgcta ca 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 41

cacctgtctt gatgcttatg 20

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 42

ctattgcctc ggaattatct c 21

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 43

gagcatcaat cgcagtca 18

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 44

gaagccataa tagcatccat c 21

<210> 45

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 45

catgccatgg ttacgactgt tttgggttga gaat 34

<210> 46

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 46

cagctctaga acattccgct ggcggatttt t 31

<210> 47

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 47

cgcggatccg cggaacccct atttgtt 27

<210> 48

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 48

ggaattccat atggacgctc agtggaacga a 31

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 49

cattccgctg gcggattttt 20

<210> 50

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 50

atagaatact caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag aggatcccac gcggaacccc 60

tatttgttta 70

<210> 51

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 51

gagctttggg taggaatgat ttgagtctga ttcgttaata tttcgcgacc tatttgttta 60

tttttcta 68

<210> 52

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 52

aatacgactc actatagggc gaattcgagc tcggtacccg gggatcccac catgagatta 60

tcaaaaagga 70

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 53

aataggcgta tcacgagg 18

<210> 54

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 54

ataagaatgc ggccgcacgc gatggatatg ttct 34

<210> 55

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 55

ataagaatgc ggccgctcgc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 60

agggggatgc atgagattat caaaaagga 89

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 56

ccgctcgagc ctatttgttt atttttcta 29

<210> 57

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 57

cagttaatcc gttgtttgga attagtggcg gttttatcgg acctcatgtt tgacagctta 60

tc 62

<210> 58

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 58

ttctccctga atttccgccg ccatggactc tttggcgcta cctcctattt gtttattttt 60

ct 62

<210> 59

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 59

aggcagatct caattcgttc aagccgaata 30

<210> 60

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 60

tctgccatgg gtcgatcctc ttctctatca ct 32

<210> 61

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 61

gatagagaag aggatcgaca tggactttca agataaaaag aac 43

<210> 62

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 62

atgatgatga tggctgctgc gatatcctgc tggttccagc g 41

<210> 63

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 63

tgatagagaa gaggcacgat atggaagcac atctggtttc 40

<210> 64

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 64

gcgtccggcg tagaggatcg gatatctgta gagatgacct caag 44

<210> 65

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 65

ttaagaccca ctttcac 17

<210> 66

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 66

atcgtgcctc ttctc 15

<210> 67

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 67

gaaagtgggt cttaagcgaa aaaggatgga tatac 35

<210> 68

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 68

ggcttgaacg aattggatat agttcctcct ttcag 35

Claims

1.一种用于产生微囊藻毒素的重组细胞，包含：

(i)编码选自以下的一种或多种微囊藻毒素多肽的一种或多种外源多核苷酸：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素I多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)；

(ii)与至少一种所述多核苷酸可操作连接的外源启动子；以及

(iii)外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。

2.一种产生能够生产微囊藻毒素的重组细胞的方法，所述方法包括用以下物质转化亲本细胞：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)；

(ii)与至少一种所述mcy多核苷酸可操作连接的外源启动子；以及

3.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；

以及可选地编码以下的任何一个或多个：

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素T多肽(mcyT)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)。

4.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素I多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)。

5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的重组细胞，根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

6.根据权利要求1所述的重组细胞或根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸编码以下中的每一种：

(i)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)，和

微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或者

(ii)微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，和

微囊藻毒素L多肽(mcyL)。

7.根据权利要求1、3或6中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2、3或6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

GenBank登录号EU266362.1或AJ441056.1中所示的mcyT基因序列；和/或

GenBank登录号KC699835.1中所示的mcyL基因序列。

8.根据权利要求1或3至7中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸包含与以下序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的序列同一性的核苷酸序列：

9.根据权利要求1或3-8中任一项所述的重组细胞，其包含多个外源多核苷酸，其中：

通过插入核苷酸将所述多核苷酸彼此分开；和

每种所述外源性多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

10.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，包括用多种外源性mcy多核苷酸转化所述亲本细胞，其中：

通过插入核苷酸将所述mcy多核苷酸彼此分开；和

每种所述外源性mcy多核苷酸编码不同的微囊藻毒素多肽。

11.根据权利要求9所述的重组细胞或根据权利要求10所述的方法，其中所述多种外源多核苷酸包含：

(i)第一外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)，

微囊藻毒素1多肽(mcyI)，

微囊藻毒素J多肽(mcyJ)；或者

(ii)第一种外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码：

微囊藻毒素j多肽(mcyJ)；

第三外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)；

第四外源多核苷酸，其编码：

微囊藻毒素T多肽(mcyT)；或者

(iii)第一种外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素A多肽(mcyA)，

微囊藻毒素B多肽(mcyB)，

微囊藻毒素C多肽(mcyC)；

第二外源多核苷酸，其编码以下中的每一种：

微囊藻毒素G多肽(mcyG)，

微囊藻毒素D多肽(mcyD)，

微囊藻毒素E多肽(mcyE)，

微囊藻毒素F多肽(mcyF)，

微囊藻毒素L多肽(mcyL)，

微囊藻毒素H多肽(mcyH)。

12.根据权利要求9或权利要求11所述的重组细胞，或根据权利要求10或11所述的方法，其中所述插入的核苷酸是外源启动子。

13.根据权利要求1或3-8中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其包含编码所述微囊藻毒素多肽中的每一种的单个外源多核苷酸。

14.根据权利要求1、3-9或11-13中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-13中任一项所述的方法，其中所述一种或多种外源多核苷酸是DNA。

15.根据权利要求1、3-9或11-14中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2至8或10-14中任一项所述的方法，其中所述外源启动子：

(i)不是T7聚合酶启动子；和/或

(iv)是双向促进剂；和/或

(vi)是Ptet_O。

16.根据权利要求1、3-9或11-15中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-15中任一项所述的方法，其中所述外源PPT：

(ii)是细菌PPT、蓝细菌PPT，芽孢杆菌属(例如枯草芽胞杆菌)PPT，粘细菌PPT，放线菌(例如链霉菌属)PPT，假单胞菌属PPT，是节球藻属(例如泡沫节球藻、泡沫节球藻NSOR10)PPT，柱头菌属(例如橙色标桩菌，橙色标桩菌DW4/3-1)PPT，或橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)DW4/3-1 MtaA PPT。

17.根据权利要求1、3-9或11-16中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2至8或10-16中任一项所述的方法，包括：

(i)编码所述PPT的外源多核苷酸序列；和/或

(ii)整合到所述重组细胞基因组中的编码所述PPT的外源多核苷酸序列；和/或

(iii)编码用于并入所述微囊藻毒素中氨基酸和/或羟基酸的外源多核苷酸序列。

18.根据权利要求1、3-9或11-17中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-17中任一项所述的方法，其中所述细胞是重组原核细胞、重组细菌细胞、重组肠杆菌科细胞、重组埃希氏菌属细胞、重组大肠杆菌细胞。

19.根据权利要求1、3至9或11-18中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-18中任一项所述的方法，其中所述细胞：

(i)不是：

真核细胞

蓝细菌，

鞭毛藻，

酵母，

人细胞

哺乳动物细胞

植物细胞；和/或

(ii)不包括编码以下的遗传物质：

另外的蓝藻毒素，

20.权利要求1、3-9或11-19中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-19中任一项所述的方法，其中所述重组细胞不包含编码以下的多核苷酸：

任何不是微囊藻毒素的聚酮化合物；和/或

21.根据权利要求1、3-9或11-20中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-20中任一项所述的方法，其中：

(i)所述一种或多种外源基因位于单个质粒内；或者

22.一种用于生产微囊藻毒素的方法，所述方法包括：

在合适的培养基中培养根据权利要求1、3-9或11-21中任一项所述的重组细胞并持续合适的时间段，以促进所述微囊藻毒素的产生，

并且任选地在所述培养期间或之后分离由所述细胞产生的所述微囊藻毒素。

23.根据权利要求22所述的方法，还包括将氨基酸和/或羟基酸添加到所述培养基中，其中所述氨基酸和/或羟基酸并入由所述重组细胞产生的所述微囊藻毒素中。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述氨基酸和/或羟基酸不是由所述重组细胞内源产生的。

25.根据权利要求1、3-9或11-21中任一项所述的重组细胞，或根据权利要求2-8或10-24中任一项所述的方法，其中所述微囊藻毒素是微囊藻毒素LA、微囊藻毒素LL、微囊藻毒素AR、微囊藻毒素YA、微囊藻毒素LM、微囊藻毒素VF、微囊藻毒素YM、微囊藻毒素LF、微囊藻毒素LR、[D-Asp³]微囊藻毒素LR、微囊藻毒素LW、微囊藻毒素FR、微囊藻毒素WR、微囊藻毒素LY、微囊藻毒素RR或微囊藻毒素YR。

26.根据权利要求22-24中所述任一项所述的方法，其中：

所述重组细胞是重组大肠杆菌细胞；

所述培养包括限制或防止所述重组细胞暴露于D-赤型-β-甲基-异-天冬氨酸；由所述重组细胞产生的所述微囊藻毒素至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97.5％或100％为[D-Asp³]微囊藻毒素LR。