CN111690647B - 丙酮酸响应生物传感器及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丙酮酸响应生物传感器及其构建方法与应用，本发明通过对插入在P43启动子上的PdhR结合序列优化以及插入位点进行优化，在本发明中成功构建了不同动态范围丙酮酸响应生物传感器，其中最小的动态范围增加了0.6倍，最高的增加了30.7倍。可以用于细胞中各个基因表达量的精细控制。由于丙酮酸是细胞中的关键中心碳代谢物，因此，这些生物传感器可以根据细胞内丙酮酸含量的变化，动态调控胞内基因的表达水平，从而实现对胞内代谢流的动态控制。本发明获得的丙酮酸生物传感器具有良好的特异性，此外其对丙酮酸响应范围为10‑35nmol/g DCW。

Description

丙酮酸响应生物传感器及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种丙酮酸响应生物传感器及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。
背景技术
代谢工程的主旨在于以微生物为宿主，生物质为原料，高效的合成所需的化学品，例如药物、材料、生物燃料、精细化学品和功能营养品等。然而，传统的代谢工程技术(产物合成途径相关基因的过量表达、竞争途径的敲除以及辅因子的优化等)往往会导致细胞胞内代谢流失衡、原料利用率低下和有毒代谢物积累等问题，从而难以实现化合物产量与生产强度的最大化。此外，传统的诱变育种方法虽然能够迅速的获得大量的突变株，但现有的筛选方法难以从这些突变株中迅速的获得高产量的目的菌株，比如高效液相色谱-质谱联用技术，价格昂贵且筛选通量低下。因此，急需找到一种高效的技术或方法应用于微生物的代谢工程改造。
随着合成生物学技术的发展，生物传感器被广泛应用于代谢工程、环境检测和药物定期靶向治疗等领域。生物传感器是一类生物来源、能够识别特定物质并将识别信号最终转换成为输出信号的感应元器件。根据生物传感器识别的物质类型，可将生物传感器分为响应环境信号、胞外化合物和胞内化合物的生物传感器。生物传感器一般具有一个响应信号的功能区和一个实现信号输出的功能区。目前，大多数的生物传感器都是通过改造转录调控因子或者核糖开关获得的。转录调控因子和核糖开关是生物体内一类能够响应特定信号，调控胞内相关基因表达的蛋白质或RNA。核糖开关具有结构简单和调控效果明显的优点，但是往往特异性较低且稳定性较差。转录调控因子虽然结构更为复杂，但具有更高的特异性以及更好的稳定性。因此，转录调控因子更加适合应用于高特异性生物传感器的构建与设计。生物传感器可被用于设计人工基因回路，动态控制细胞胞内的代谢流，平衡细胞生长与产物合成，从而实现产物的高效合成。此外，生物传感器相对传统的代谢物检测方法，具有更高的灵敏度以及更方便的检测手段，从而能够被应用于高产突变株的高通量筛选。因此，生物传感器目前被广泛应用于微生物代谢网络的动态控制、目标产物高产菌株的高通量筛选以及定向进化。
丙酮酸是生物体内连接糖酵解途径以及三羧酸循环的关键中心代谢物，一方面为细胞提供合成其它化合物所需的碳骨架，另一方面流入三羧酸循环为细胞提供必需的还原力以及能量。因此，胞内丙酮酸浓度不仅仅是生物疾病发生的重要检测对象，同时也是微生物代谢工程改造的重要调控节点。所以，构建的丙酮酸响应生物传感器能够应用于胞内丙酮酸浓度的监测以及微生物中心碳代谢的动态控制，实现目标产物的高效合成。
目前国内外基于天然界存在的丙酮酸响应转录调控因子PdhR已经设计一些丙酮酸生物传感器。2014年，Barros等人基于荧光共振能量转移技术以及PdhR成功构建了一种丙酮酸酸响应生物传感器，这个生物传感器可以应用于胞内丙酮酸浓度的检测。2019年，中国科学院天津工业生物技术研究所的张大伟等人公开了一篇专利，内容为基于PdhR，启动子Pap，报告基因gfp，成功获得了另一种丙酮酸生物传感器，并通过构建PdhR突变文库，获得了能够响应不同浓度丙酮酸的PdhR突变体，此类突变体可应用于丙酮酸和其前体化合物高产突变株的高通量筛选。
Barros等人所构建的丙酮酸响应传感器并没有调控基因表达的功能，因此只能作为报告系统，监测胞内丙酮酸的浓度，并不能够应用于菌株代谢工程改造。张大伟等人所构建的丙酮酸响应传感器主要应用于丙酮酸及其前体化合物的高通量筛选，仅通过筛选PdhR突变体，获得了能够响应不同丙酮酸浓度的丙酮酸生物传感器。这个传感器适用于丙酮酸及其前体化合物的突变菌株的高通量筛选。然而这个传感器并没有对其它必要组件进行改造，难以实现对复杂代谢网络多条代谢途径表达量的精细控制，从而难以用于菌株代谢网络的动态控制。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明本发明拟基于PdhR，启动子P43，报告基因egfp，在枯草芽孢杆菌中，构建一系列具有不同动态范围的丙酮酸响应生物传感器，这些传感器能够用于菌株中基因表达强度的精细调控，从而可以用于菌株中心代谢网络的动态控制。
本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸响应生物传感器，所述的生物传感器包括PdhR基因、P43启动子以及插入在P43启动子上的PdhR结合序列。
进一步地，所述的PdhR结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述的PdhR结合序列在P43启动子上的插入位点为+1位点、+1位点上游第5个位点或+1位点下游第1～11个位点中的一个。
在本发明中，P43序列为：
Figure BDA0002547953420000031
Figure BDA0002547953420000032
其中加框的序列分别表示-35区、-10区和+1位点。
进一步地，所述的PdhR基因整合至枯草芽孢杆菌基因组ycgB基因上游。
进一步地，所述的PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述的生物传感器还包括位于P43启动子下游的报告基因egfp。
进一步地，所述的P43启动子、PdhR结合序列以及报告基因egfp位于载体PHT01上。
本发明的第二个目的是提供一种时期依赖型丙酮酸响应生物传感器，所述的时期依赖型丙酮酸响应生物传感器包括PdhR基因、时期依赖型启动子以及插入在时期依赖型启动子-35区、-10区或+1位点的PdhR结合序列，所述的时期依赖型启动子为PyteJ、PywjC或Pyqfd。
本发明的第三个目的是提供所述的丙酮酸响应生物传感器或时期依赖型丙酮酸响应生物传感器在枯草芽孢杆菌代谢调控中的应用。
进一步地，所述的应用是将目的基因构建在启动子下游，通过丙酮酸调控目的基因表达。
本发明的有益效果：
1.在本发明中成功构建了不同动态范围丙酮酸响应生物传感器，其中最小增加了0.6倍，最高的增加了30.7倍。可以用于细胞中各个基因表达量的精细控制。由于丙酮酸是细胞中的关键中心碳代谢物，因此，这些生物传感器可以根据细胞内丙酮酸含量的变化，动态调控胞内基因的表达水平，从而实现对胞内代谢流的动态控制。
2.本发明获得的丙酮酸生物传感器具有良好的特异性，此外其对丙酮酸响应范围为10-35nmol/g DCW。
3.本发明成功获得了时期依赖型的丙酮酸生物传感器，包括对数后期依赖型的和稳定期依赖型的丙酮酸响应启动子。这些时期依赖型的丙酮酸生物传感器可以应用于胞内基因的时序性表达。例如，毒性代谢物合成途径相关基因的表达，使用稳定期依赖型的丙酮酸响应启动子可以使调控的基因在稳定期后才开始表达，避免毒性化合物过早积累对细胞产生的有害影响。
附图说明
图1为菌株168-PR核酸电泳验证图；
图2为在不同位点添加PdhR结合位点的丙酮酸响应启动子活性检测；
图3为转录因子PdhR的纯化SDS-PAGE图；
图4为丙酮酸响应启动子P43D与转录因子PdhR的ITC检测图；
图5为丙酮酸响应启动子随丙酮酸浓度变化的荧光强度变化图；
图6为丙酮酸响应启动子的丙酮酸响应范围检测图；
图7为丙酮酸响应生物传感器的正交性检测图；
图8为丙酮酸与转录因子PdhR的ITC检测图；
图9为改变PdhR结合位点非保守区对丙酮酸生物传感器动态范围的影响；
图10为改变PdhR结合位点与+1位的距离对丙酮酸生物传感器动态范围的影响；
图11为时期依赖型丙酮酸生物传感器荧光强度检测图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
涉及的检测方法：
1.胞内丙酮酸含量检测方法：使用Solarbio公司的丙酮酸(PA)含量检测试剂盒(货号：BC2205)检测胞内丙酮酸含量。
2.相对荧光强度检测方法：将待检测荧光强度的菌株在含有氯霉素(5μg/mL)的LB固体培养基平板上划线，挑取单菌落，接种于LB液体培养基37℃，220rpm培养12h。再将菌液以2％(V/V)的接种量转接到含有200μL LB液体培养基的96孔荧光酶标板上，37℃，900rpm培养。在不同时间段取出酶标板，在Cytation microplate reader(BioTek)上检测荧光强度(激发光：488nm吸收光：520nm)和细胞密度(600nm)。
3.等温微量热滴定检测：使用Malvern公司的MicroCal PEAQ-ITC进行PdhR分别与丙酮酸和杂合启动子的等温微量热滴定检测。仪器参数为默认参数，分析软件为仪器配套软件MicroCal PEAQ-ITC Analysis Software。
表1引物序列
Figure BDA0002547953420000061
Figure BDA0002547953420000071
实施例1：菌株168-PR的构建
(1)以大肠杆菌K12基因组为模板，P43-pdhR-F和P43-pdhR-R为引物，扩增获得pdhR片段；以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，pdhR-FF和pdhR-FR为引物，扩增获得pdhR上游同源臂；以pdhR-RF和pdhR-RR为引物，扩增获得pdhR下游同源臂；人工合成含有壮观霉素基因和P43启动子的lox71-spc-lox66-P43盒(序列如SEQ ID NO.12所示)；使用融合PCR技术将pdhR片段、pdhR上游同源臂、pdhR下游同源臂和lox71-spc-lox66-P43盒融合，获得融合基因片段pdhRF-lox71-spc-lox66-P43-pdhR-pdhRR(实验方法参照Takara PrimerSTARMax DNA Polymeraser说明书)。
(2)将步骤(1)中得到的融合片段通过电击转化进入Bacillus subtilis 168中，电击条件为电压2.5kV，电击时间5ms，37℃复苏5h涂布终浓度为50μg/mL的壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养48h。挑取平板上的单菌落，利用YZ_pdhR-F和YZ_pdhR-R为引物，进行菌落PCR，扩增获得大小为1700bp的验证片段(图1)，证明成功将融合片段整合进入Bacillussubtilis 168基因组，并将片段送往测序，测序正确的片段对应的菌株则为成功构建的菌株168-PR。
实施例2：丙酮酸生物传感器的构建
以实验室保藏的质粒PHT01-P43-GFP为模板(含P43启动子，并且报告基因egfp被置于P43下游)，P43U-F/P43U-R、P43M-F/P43M-R和P43D-F/P43D-R为引物，利用反向PCR技术在质粒中P43启动子-35区、-10区和+1位点的不同位置插入PdhR结合序列，构建受到PdhR调控的杂合启动子，从而获得含有丙酮酸响应生物传感器的重组质粒PHT01-P43U-GFP、PHT01-P43M-GFP和PHT01-P43D-GFP。随后将重组质粒利用电击转化技术分别转化进入Bacillus subtilis 168以及实施例1中的重组菌株168-PR，再按照检测方法2的方法检测各个重组质粒在对应菌株中的荧光强度。结果如图2所示，在P43启动子中引入pdhR结合序列ATTGGTATGACCAAT(SEQ ID NO.2)会影响启动子本身的强度，其中P43D相对P43启动子活性提高3.4倍，P43U相对P43启动子活性降低9.7倍。此外，当菌株中存在pdhR时，P43D的活性下降4.2倍，证明pdhR能够抑制启动子P43D的活性。
实施例3：体外验证P43D与pdhR的结合常数
(1)以实验室保藏的质粒pET-28a为模板，Z_PET28F和Z_PET28R为引物，PCR扩增获得线性化的载体pET-28a；以大肠杆菌K12基因组为模板，28apdhRF和28apdhRR为引物，PCR扩增获得含有同源臂的pdhR片段。随后使用NEB公司的Gibson
Figure BDA0002547953420000081
Master Mix将pdhR片段与线性化的载体pET-28a融合(具体步骤参照产品说明书)，获得重组质粒pET-28a-pdhR。将重组质粒送往测序，测序正确的质粒保藏于-20℃。
(2)将步骤(1)获得的重组质粒转化进入E.coli BL21感受态中(操作方法参照基本分子生物学操作手册)，获得含有质粒pET-28a-pdhR的重组菌株E.coli BL21-pdhR。随后将该重组菌株划线至含有卡那霉素(50μg/mL)的固体LB培养基中，37℃培养12h。随后挑取单菌落于200ml含有卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6。接着在培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导蛋白PdhR表达，16℃，180rpm培养12h。
(3)将步骤(2)中培养获得的菌液4℃，4000rpm离心10min，收集菌体，使用20mMPBS缓冲液洗涤菌体2次，最终使用20mL的20mM PBS重悬菌体。随后，使用超声破碎仪破碎菌体，4℃，10000rpm离心30min，收集上清。接着将上清液加载到His GraviTrap柱(GEHealthcare)上，并用
Figure BDA0002547953420000092
(GE Healthcare)纯化然后，将柱用15mL缓冲液A(20mMTris，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH＝8.0)和15mL缓冲液B(20mM Tris，0.5M NaCl，100mM咪唑，PH＝8.0)洗涤。最后，通过使用5mL缓冲液C(20mM Tris，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH＝8.0)洗脱蛋白PdhR。最后，使用SDS-PAGE检测pdhR的纯度(图3)。随后使用透析液(20mM Tris，0.5MNaCl，5％甘油)透析纯化的pdhR蛋白。
(4)以质粒PHT01-P43D-GFP为模板，P43DF和P43DR为引物，PCR扩增获得DNA片段P43D，使用Thermo Scientific的GeneJET Gel Extraction Kit回收DNA片段，最后使用步骤(3)的透析液洗脱P43D片段。
(5)按照检测方法3，使用等温热滴定技术检测转录因子pdhR与DNA P43D的结合常数，结果如图(4)所示，P43D与pdhR的结合常数为1.4μM，进一步证明了pdhR能够结合构建的杂合启动子P43D。
实施例4：丙酮酸生物传感器的特异性及响应范围检测
(1)按照检测方法2，检测实验例2中含有质粒PHT01-P43D-GFP的菌株168和168-PR的相对荧光强度，同时在培养基中添加不同的浓度的葡萄糖和丙酮酸检测所构建丙酮酸生物传感器的丙酮酸响应范围，体外添加的葡萄糖和丙酮酸浓度分别为0+0、50+0、50+5、50+7.5、50+10、50+12.5、50+15和50+20g/L。实验结果如图5所示，随着丙酮酸浓度的提高，丙酮酸生物传感器的相对荧光强度逐渐提高，而在菌株168(不含FapR)中则不受丙酮酸浓度影响，证明了所构建的丙酮酸响应生物传感器能够响应丙酮酸。为进一步检测其的丙酮酸响应范围，使用检测方法1检测在这些培养条件下胞内的丙酮酸浓度，并将数据拟合至Hill方程
Figure BDA0002547953420000091
结果显示所构建的丙酮酸响应生物传感器的丙酮酸响应范围为10-35nmol/g DCW(图6)。
(2)为检测所构建丙酮酸生物传感器的特异性，按照检测方法2，检测检测实验例2中含有质粒PHT01-P43D-GFP的菌株168-PR的相对荧光强度，同时在培养基中添加5g/L的诱导物，包括枯草芽孢杆菌常用的诱导剂(阿拉伯糖、木糖和IPTG)、丙酮酸类似物(乳酸、乙酸、乙偶姻、丙氨酸和乳糖)、其他中心代谢物(葡萄糖、α-酮戊二酸和葡萄糖二酸)和丙酮酸。结果显示只有丙酮酸能够显著的诱导丙酮酸生物传感器的活性，证明所构建的丙酮酸生物传感器具有良好的特异性(图7)。
实施例5：体外验证丙酮酸与pdhR的结合常数
(1)按实施例3中的步骤(1)、(2)和(3)获得PdhR蛋白。
(2)使用透析液(20mM Tris，0.5M NaCl，5％甘油)溶解丙酮酸钠，使丙酮酸的终浓度为500μM。
(3)按照检测方法3，使用等温热滴定技术检测转录因子pdhR与丙酮酸的结合常数，结果如图8所示，丙酮酸与pdhR的结合常数为3.97μM，进一步证明pdhR能够响应丙酮酸。
实施例6：优化丙酮酸生物传感器的pdhR结合位点
以实施例2中的PHT01-P43D-GFP质粒为模板，分别以pdhRBox-F1/R1、pdhRBox-F2/R2、pdhRBox-F3/R3、pdhRBox-F4/R4、pdhRBox-F5/R5、pdhRBox-F6/R6、pdhRBox-F7/R7、pdhRBox-F8/R8、pdhRBox-F9/R9和pdhRBox-F10/R10为引物，PCR扩增获得重组质粒PHT01-P43BOX1-GFP、PHT01-P43BOX2-GFP、PHT01-P43BOX3-GFP、PHT01-P43BOX4-GFP、PHT01-P43BOX5-GFP、PHT01-P43BOX6-GFP、PHT01-P43BOX7-GFP、PHT01-P43BOX8-GFP、PHT01-P43BOX9-GFP和PHT01-P43BOX10-GFP，将重组质粒送往测序，测序正确的质粒保藏于-20℃。随后将重组质粒利用电击转化技术分别转化进入Bacillus subtilis 168以及实施例1中的重组菌株168-PR，再按照检测方法2的方法检测各个重组质粒在对应菌株中的荧光强度。实验结果如图9所示，重组质粒PHT01-P43BOX1-GFP、PHT01-P43BOX2-GFP、PHT01-P43BOX3-GFP、PHT01-P43BOX4-GFP、PHT01-P43BOX5-GFP、PHT01-P43BOX6-GFP、PHT01-P43BOX7-GFP、PHT01-P43BOX8-GFP、PHT01-P43BOX9-GFP和PHT01-P43BOX10-GFP的动态范围依次为7.2、2.6、2.3、1.2、1.9、1.4、1.1、1.0、1.0和1.1倍。PHT01-P43BOX1-GFP具有最大的动态范围。本实施例中，pdhR结合序列分别为：BOX1～BOX10的序列如图9中所示，分别为SEQ ID NO.1～10。
实施例7：优化丙酮酸生物传感器pdhR结合位点与启动子+1位的距离
以实施例6中的PHT01-P43BOX1-GFP质粒为模板，分别以D(-5)F/R、D1F/R、D2F/R、D3F/R、D4F/R、D5F/R、D6F/R、D7F/R、D8F/R、D9F/R、D10F/R和D11F/R引物，PCR扩增获得重组质粒PHT01-P43D(-5)-GFP、PHT01-P43D1-GFP、PHT01-P43D2-GFP、PHT01-P43D3-GFP、PHT01-P43D4-GFP、PHT01-P43D5-GFP、PHT01-P43D6-GFP、PHT01-P43D7-GFP、PHT01-P43D8-GFP、PHT01-P43D9-GFP、PHT01-P43D10-GFP和PHT01-P43D11-GFP，其中，D(-5)表示在+1位上游距离+1位点间隔5个位点，D1表示在+1位下游距离+1位点间隔1个位点，其他类推，将重组质粒送往测序，测序正确的质粒保藏于-20℃。随后将重组质粒利用电击转化技术分别转化进入Bacillus subtilis 168以及实施例1中的重组菌株168-PR，再按照检测方法2的方法检测各个重组质粒在对应菌株中的荧光强度。实验结果如图10所示，重组质粒PHT01-P43D(-5)-GFP、PHT01-P43D1-GFP、PHT01-P43D2-GFP、PHT01-P43D3-GFP、PHT01-P43D4-GFP、PHT01-P43D5-GFP、PHT01-P43D6-GFP、PHT01-P43D7-GFP、PHT01-P43D8-GFP、PHT01-P43D9-GFP、PHT01-P43D10-GFP和PHT01-P43D11-GFP的动态范围依次为15.1、12.9、5.3、6.1、24.9、8.3、18.8、1.6、8.8、28.1和31.7倍。
实施例8：时期依赖型丙酮酸生物传感器的构建
(1)以实验室保藏的质粒PHT01-P43-GFP为模板，Z_PHT01-F和Z_PHT01-R为引物，PCR扩增获得线性化的载体PHT01-GFP(去除了P43启动子)；以B.subtilis 168基因组为模板，分别以PyteJ-F/R、Pywjc-F/R和PyqfD-F/R为引物，PCR扩增获得含有同源臂的PyteJ、Pywjc和PyqfD片段。随后使用NEB公司的Gibson
Figure BDA0002547953420000121
Master Mix分别将PyteJ、Pywjc和PyqfD片段与线性化的载体PHT01-GFP融合(具体步骤参照产品说明书)，获得重组质粒PHT01-PyteJ-GFP、PHT01-Pywjc-GFP和PHT01-PyqfD-GFP。将重组质粒送往测序，测序正确的质粒保藏于-20℃。
(2)以步骤一获得的重组质粒PHT01-PyteJ-GFP为模板，PyteJU-F/PyteJU-R、PyteJD-F/PyteJD-R和PyteJ1-F/PyteJ1-R为引物，利用反向PCR技术在质粒中P43启动子-35区、-10区和+1位点的不同位置插入PdhR结合序列，构建受到PdhR调控的杂合启动子，从而获得含有丙酮酸响应生物传感器的重组质粒PHT01-PyteJU-GFP、PHT01-PyteJD-GFP和PHT01-PyteJ1-GFP。
(3)以步骤一获得的重组质粒PHT01-Pywjc-GFP为模板，PywjcU-F/PywjcU-R、PywjcD-F/PywjcD-R和Pywjc1-F/Pywjc1-R为引物，利用反向PCR技术在质粒中P43启动子-35区、-10区和+1位点的不同位置插入PdhR结合序列，构建受到PdhR调控的杂合启动子，从而获得含有丙酮酸响应生物传感器的重组质粒PHT01-PywjcU-GFP、PHT01-PywjcD-GFP和PHT01-Pywjc1-GFP。
(4)以步骤一获得的重组质粒PHT01-PyqfD-GFP为模板，PyqfDU-F/PywjcU-R、PyqfDD-F/PyqfDD-R和PyqfD1-F/PyqfD1-R为引物，利用反向PCR技术在质粒中P43启动子-35区、-10区和+1位点的不同位置插入PdhR结合序列，构建受到PdhR调控的杂合启动子，从而获得含有丙酮酸响应生物传感器的重组质粒PHT01-PyqfDU-GFP、PHT01-PyqfDD-GFP和PHT01-PyqfD1-GFP。
(5)将重组质粒PHT01-PyteJ-GFP、PHT01-Pywjc-GFP、PHT01-PyqfD-GFP、PHT01-PyteJU-GFP、PHT01-PyteJD-GFP、PHT01-PyteJ1-GFP、PHT01-PywjcU-GFP、PHT01-PywjcD-GFP、PHT01-Pywjc1-GFP、PHT01-PyqfDU-GFP、PHT01-PyqfDD-GFP和PHT01-PyqfD1-GFP利用电击转化技术分别转化进入Bacillus subtilis 168以及实施例1中的重组菌株168-PR，再按照检测方法2的方法检测各个重组质粒在对应菌株中的荧光强度。结果如图11所示，生物传感器PHT01-PyteJU-GFP、PHT01-PyteJD-GFP、PHT01-PyteJ1-GFP、PHT01-PywjcU-GFP、PHT01-PywjcD-GFP、PHT01-Pywjc1-GFP、PHT01-PyqfDU-GFP、PHT01-PyqfDD-GFP和PHT01-PyqfD1-GFP的动态范围分别为1.3、1.2、1.9、3.6、2.7、2.0、1.0、2.9和1.8倍。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 丙酮酸响应生物传感器及其构建方法与应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
attggtaaga ccaat 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
attggtatga ccaat 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
attggtaata ccaat 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
attggttaaa ccaat 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
attggtatta ccaat 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
attggtttaa ccaat 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
attggtacta ccaat 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
attggtagta ccaat 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
attggttgaa ccaat 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
attggtgaca ccaat 15
<210> 11
<211> 765
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
atggcctaca gcaaaatccg ccaaccaaaa ctctccgatg tgattgagca gcaactggag 60
tttttgatcc tcgaaggcac tctccgcccg ggcgaaaaac tcccaccgga acgcgaactg 120
gcaaaacagt ttgacgtctc ccgtccctcc ttgcgtgagg cgattcaacg tctcgaagcg 180
aagggcttgt tgcttcgtcg ccagggtggc ggcacttttg tccagagcag cctatggcaa 240
agcttcagcg atccgctggt ggagctgctc tccgaccatc ctgagtcaca gtatgacttg 300
ctcgaaacac gacacgccct ggaaggtatc gccgcttatt acgccgcgct gcgtagtacc 360
gatgaagaca aggaacgcat ccgtgaactc caccacgcca tagagctggc gcagcagtct 420
ggcgatctgg acgcggaatc aaacgccgta ctccagtatc agattgccgt caccgaagcg 480
gcccacaatg tggttctgct tcatctgcta aggtgtatgg agccgatgtt ggcccagaat 540
gtccgccaga acttcgaatt gctctattcg cgtcgcgaga tgctgccgct ggtgagtagt 600
caccgcaccc gcatatttga agcgattatg gccggtaagc cggaagaagc gcgcgaagca 660
tcgcatcgcc atctggcctt tatcgaagaa attttgctcg acagaagtcg tgaagagagc 720
cgccgtgagc gttctctgcg tcgtctggag caacgaaaga attag 765
<210> 12
<211> 1106
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
gtaccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcgatt ttcgttcgtg aatacatgtt 60
ataataacta taactaataa cgtaacgtga ctggcaagag atatttttaa aacaatgaat 120
aggtttacac ttactttagt tttatggaaa tgaaagatca tatcatatat aatctagaat 180
aaaattaact aaaataatta ttatctagat aaaaaattta gaagccaatg aaatctataa 240
ataaactaaa ttaagtttat ttaattaaca actatggata taaaataggt actaatcaaa 300
atagtgagga ggatatattt gaatacatac gaacaagtta ataaagtgaa aaaaatactt 360
cggaaacatt taaaaaataa ccttattggt acttacatgt ttggatcagg agttgagagt 420
ggactaaaac caaatagtga tcttgacttt ttagtcgtcg tatctgaacc attgacagat 480
caaagtaaag aaatacttat acaaaaaatt agacctattt caaaaaaaat aggagataaa 540
agcaacttac gatatattga attaacaatt attattcagc aagaaatggt accgtggaat 600
catcctccca aacaagaatt tatttatgga gaatggttac aagagcttta tgaacaagga 660
tacattcctc agaaggaatt aaattcagat ttaaccataa tgctttacca agcaaaacga 720
aaaaataaaa gaatatacgg aaattatgac ttagaggaat tactacctga tattccattt 780
tctgatgtga gaagagccat tatggattcg tcagaggaat taatagataa ttatcaggat 840
gatgaaacca actctatatt aactttatgc cgtatgattt taactatgga cacgggtaaa 900
atcataccaa aagatattgc gggaaatgca gtggctgaat cttctccatt agaacatagg 960
gagagaattt tgttagcagt tcgtagttat cttggagaga atattgaatg gactaatgaa 1020
aatgtaaatt taactataaa ctatttaaat aacagattaa aaaaattata aataacttcg 1080
tatagcatac attatacgaa cggtag 1106

Claims (5)

1.一种丙酮酸响应生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括PdhR基因、P43启动子以及插入在P43启动子上的PdhR结合序列；
所述的PdhR结合序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQID NO.5所示；
所述的PdhR结合序列在P43启动子上的插入位点为+1位点、+1位点上游第5个位点或+1位点下游第1~11个位点中的一个；
所述的PdhR基因整合至枯草芽孢杆菌基因组ycgB基因上游；
所述的PdhR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的丙酮酸响应生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器还包括位于P43启动子下游的报告基因egfp。
3.根据权利要求2所述的丙酮酸响应生物传感器，其特征在于，P43启动子、PdhR结合序列以及报告基因egfp位于载体PHT01上。
4.一种权利要求1~3任一项所述的丙酮酸响应生物传感器在枯草芽孢杆菌代谢调控中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用是将目的基因构建在启动子下游，通过丙酮酸调控目的基因表达。
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