CN113025639B - 一种氧气响应型生物传感器的构建与应用 - Google Patents

一种氧气响应型生物传感器的构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧气响应型生物传感器的构建与应用，属于合成生物学领域。本发明以富马酸硝酸盐还原酶FNR和含有FNR靶向结合位点的启动子PfnrF8为基础，建立了一种可激活厌氧代谢途径相关基因的生物传感器，同时通过启动子工程调节启动子强度，获得了具有不同响应强度的生物传感器，以此应用于调控大肠杆菌生物合成己二酸的优化发酵中取得了显著的正向效果。本发明实现了随发酵环境变化而对基因表达水平的动态调控，不同与传统的人为干预的静态发酵，所述方法为其他高附加值化合物的生产提供了有益借鉴。

Description

一种氧气响应型生物传感器的构建与应用
技术领域
本发明涉及一种氧气响应型生物传感器的构建与应用，属于合成生物学领域。
背景技术
利用微生物细胞工厂进行化合物的合成通常涉及利用代谢工程的方法来提高目标代谢流的通量，传统的代谢工程多为静态的不可逆的改变，如基因的过表达与敲除等，此方法不能很好地适应细胞内和细胞外条件的变化进而平衡代谢流在生长与生产之间的分布，这会潜在地影响细胞的生长或目标化合物的生产。细胞内生物传感器的发展与应用缓解了传统方法所面临的的难题，其可以实时监测细胞内外环境变化并将环境信号转换为基因表达信号，从而动态平衡细胞生长和生产之间的代谢流分布。三类主要的细胞内生物传感器分别为：基于共振能量转移的生物传感器，基于转录调节因子的生物传感器和基于核糖体开关的生物传感器。其中，基于转录调节因子的生物传感器和基于核糖体开关的生物传感器被广泛地应用于代谢流的动态调控。以基于转录调节因子的生物传感器为例，根据转录调节因子的类型可分为两类：(1)激活剂调节模型，当转录激活因子被激活并与启动子区域结合时发生转录，从而激活靶基因表达；(2)抑制剂调节模型，当转录阻遏因子被激活并与启动子区域结合时，转录被抑制，从而抑制靶基因表达。
有研究分析表明，当微生物细胞从有氧生长状态向厌氧生长状态的转变时，有氧条件生长过程中表达的基因中，超过三分之一的基因的表达会发生变化，除此之外，厌氧条件的氧气限制会由于呼吸活性减弱或产生抑制性副产物而对细胞的生长和生产力产生影响。为更好地平衡菌株随发酵环境氧气变化而出现的代谢转换，氧气响应型生物传感器被开发用来调节与碳流和能量流相关的中心代谢途径。丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)响应的大肠杆菌天然启动子Ppfl，硝酸还原酶(NAR)响应的大肠杆菌天然启动子Pnar，透明颤菌血红蛋白响应的启动子Pvgb和利用计算机设计及文库构建获得的PfnrF8合成启动子等均被报道为具有优异性能的合成和天然氧气响应型启动子，以这些启动子元件构建的氧气响应型生物传感器均为厌氧诱导型生物传感器，即厌氧生长条件下，其调控的参与厌氧呼吸和发酵的基因表达增强，而参与有氧呼吸和三羧酸循环的基因表达被抑制。迄今为止，研究最多的氧气响应型生物传感器是富马酸酯和硝酸盐还原酶(FNR)转录激活因子依赖的厌氧诱导型生物传感器。
发明内容
技术问题：
本发明要解决的技术问题是提供一种氧气响应型生物传感器，能使细胞在生长和生产之间达到动态平衡。
技术方案：
所述氧气响应型生物传感器，是以氧气响应的转录调控蛋白富马酸硝酸盐还原蛋白FNR为基础构建的反馈响应系统，当环境中氧气水平降低或无氧气时，FNR二聚体诱导下游目的基因的表达。
本发明的第一个目的是提供一种氧气响应型生物传感器，含有启动子Pffs、PfnrF8、FNR基因、FNR基因结合位点；所述Pffs调控FNR的表达；所述PfnrF8上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子Pffs和启动子PfnrF8转录方向相反。
在一种实施方式中，所述生物传感器还含有启动子Pc和其调控表达的抗性基因。
在一种实施方式中，启动子Pffs、PfnrF8、Pc、FNR基因、FNR基因结合位点和抗性基因位于质粒上。
在一种实施方式中，所述载体为pACM4G。
在一种实施方式中，所述载体pACM4G是以pACM4为模板，全质粒PCR，将CmR基因替换为GmR基因。
在一种实施方式中，所述抗性基因为庆大霉素抗性基因GmR。
在一种实施方式中，所述生物传感器FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0～27bp。
在一种实施方式中，编码所述启动子Pffs的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述启动子PfnrF8的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；编码所述FNR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述FNR结合位点的核苷酸序列为TTGA(T/C)NNNN(A/G)TCAA；所述抗性基因GmR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述生物传感器的目的基因是编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD、编码富马酸还原酶的基因frdABCD和编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。
本发明的第二个目的是提供含有所述生物传感器的基因工程菌。
本发明的第三个目的是提供一种构建氧气响应型生物传感器的方法，其具体步骤如下：克隆大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655的FNR基因，质粒pGRT-ffs的启动子Pffs，合成启动子PfnrF8，连接到载体pACM4G上，获得生物传感器质粒；所述Pffs调控FNR的表达；所述PfnrF8上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子Pffs和启动子PfnrF8转录方向相反。
本发明的第四个目的是提供一种构建不同厌氧诱导强度的启动子的方法。
在一种实施方式中，在FNR结合位点与启动子PfnrF8的-35区之间增加10～20bp的距离获得具有不同厌氧诱导强度的启动子。
在一种实施方式中，在FNR结合位点与启动子PfnrF8的-35区之间缩短3～7bp的距离获得具有不同厌氧诱导强度的启动子。
本发明的第五个目的是提供一种不同厌氧诱导强度的启动子。
在一种实施方式中，所述启动子的FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0～27bp。
在一种实施方式中，所述启动子的FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0～7bp。
本发明的第六个目的是提供一种构建不同厌氧诱导强度的生物传感器的方法，所述方法包括以下步骤：
1)克隆大肠杆菌(Escherichia coli)K12 MG1655的FNR基因，质粒pGRT-ffs的启动子Pffs，合成启动子PfnrF8，连接到上述载体pACM4G上，获得生物传感器质粒；
2)以步骤1)所述生物传感器质粒为模板，全质粒PCR获得FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0～27bp的传感器质粒。
在一种实施方式中，步骤2)中全质粒PCR获得FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0～7bp的传感器质粒。
本发明第七个目的是提供一种调控氧气含量诱导基因表达的方法，其具体步骤如下：
将上述工程菌株于35-39℃，220-270rpm过夜活化得到种子液，以2％接种量接种于含有SOB培养基的橡胶塞瓶中，初始添加3～5g/L葡萄糖，前期以透气封口膜封口好氧发酵，35-39℃，220-270rpm发酵培养，待葡萄糖耗尽，以橡胶塞封口进行厌氧发酵，并补充3～5g/L葡萄糖，35-39℃，220-270rpm发酵培养。
本发明还提供所述生物传感器在生物合成方面的应用。
有益效果：
1)构建获得了一种氧气响应型生物传感器，此传感器依托于富马酸硝酸盐还原酶FNR及其启动子PfnrF8，FNR活性受氧气含量变化在4Fe-4S和2Fe-2S簇之间转换调节，其中FNR二聚体在厌氧条件下被激活，并作为后续厌氧代谢基因的激活剂。氧气响应型生物传感器厌氧条件下荧光强度相比有氧条件下提高了6.14倍；厌氧条件下，氧气响应型生物传感器相比空白对照传感器荧光强度提高了83.36倍。
2)缩短FNR靶向结合位点与启动子-35区距离获得了厌氧条件下具有梯度响应性能的诱导型生物传感器，也即获得了不同强度的厌氧诱导型启动子。启动子PfnrD3F8，PfnrD4F8，PfnrD7F8分别为启动子PfnrF8诱导强度的71.55％，55.24％，10.71％，此传感器的成功构建可以被针对性地应用于厌氧条件相关基因的动态表达调控与强化。
3)本发明中的氧气响应型生物传感器被运用到己二酸合成的发酵优化中，己二酸的产量相比优化前提高了76.67％。此外，此传感器也为其他高附加值化合物的代谢生产提供了一定的借鉴。
附图说明
图1氧气响应型生物传感器工作原理及性能评价。A：FNR调控的氧气响应型生物传感器的工作原理图；B：本发明所构建生物传感器所在质粒示意图；C：氧气响应型生物传感器及其空白对照生物传感器有氧及厌氧条件下荧光响应性能比较。
图2不同响应强度氧气响应型生物传感器的性能比较及应用。A：FNR靶向结合位点与启动子-35区位置关系示意图及不同响应强度厌氧诱导型生物传感器的筛选原则图。B：不同响应强度厌氧诱导型生物传感器的筛选结果比较。C：不同响应强度厌氧诱导型生物传感器应用于己二酸发酵生产优化。
具体实施方式
构建生物传感器所用质粒为本实验室保存，限制性内切酶和DNA聚合酶分别购自赛默飞和Takara公司。多功能酶标仪BioTek HT plate reader(Winooski,VT,USA)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌JM109用于分子克隆，大肠杆菌K12 MG1655重组菌株Mad1415用于蛋白质表达和己二酸合成。
质粒pGRT-ffs：公布于专利：公开号CN110684792A。
质粒pACM4：公布于已发表文章：doi:10.1021/sb300016b。
质粒pBBR1MCS-5：gb:U25061.1。
质粒pACM4G的构建：以质粒pACM4为模板，进行全质粒PCR，将氯霉素抗性基因CmR替换为庆大霉素抗性基因GmR。
大肠杆菌K12 MG1655重组菌株Mad1415：公开于已发表文章：doi:10.1016/j.jbiotec.2020.03.011。
Corynebacterium crenatum：公开于已发表文章：doi:10.3969/j.issn.1673-1689.2019.03.012。
生物传感器性能评价：含生物传感器的JM109菌株经过夜活化后，以2％(v/v)的接种量接种至含50mL LB培养基的250mL摇瓶中进行好氧条件培养；过夜活化的种子液以2％的接种量接种至新鲜LB培养基后分装至1.5mL离心管，使装液量为1.5mL，以此进行厌氧条件培养。培养12h后取样收集上清液，用PBS缓冲液适当稀释以确保OD600在0.2-0.8的范围内，使用BioTek HT平板阅读器(VT，Winooski，USA)在室温37℃下，在485±20nm的激发波长和528/20nm的发射波长下测量荧光。最后，通过将OD600和荧光(AU)相除来对荧光进行归一化。按要求加入庆大霉素(50μg/mL)。
己二酸双相发酵：LB培养基中35-39℃，220-270rpm过夜活化得到种子液，2％(v/v)接种量接种至含有200mL SOB培养基的250mL丁基橡胶塞血清瓶中，初始葡萄糖添加量为4g/L，前期使用透气封口膜进行好氧条件培养，此阶段用于富集细胞收集能量，待葡萄糖耗尽后(约12h)血清瓶加塞转为厌氧进行发酵，同时补加4g/L葡萄糖。37℃，250rpm培养。按要求分别加入氨苄青霉素(100μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)。
下述实施例中所涉及的所有菌体培养都利用LB培养基，培养条件为37℃、250rpm。己二酸发酵利用SOB培养基，发酵条件为37℃、250rpm。
实施例1氧气响应型生物传感器的构建
如图1B所示，传感器质粒主要由3个部分组成：1)FNR基因及其上游的启动子Pffs；2)含有FNR转录激活因子靶向结合位点的厌氧诱导型启动子PfnrF8及其下游诱导表达的目的基因；3)GmR抗性基因及其上游启动子Pc。
厌氧诱导型启动子PfnrF8位于质粒pACM4G酶切位点Avr II和Xba I之间，且整合有FNR转录激活因子靶向结合位点；启动子PfnrF8诱导目的基因的表达；启动子Pffs位于质粒pACM4G酶切位点Avr II上游，诱导下游FNR基因的表达；GmR抗性基因位于FNR基因的下游，由上游Pc启动子诱导表达。
以大肠杆菌K12 MG1655基因组为模板，使用引物FNR-F/FNR-R进行PCR扩增出FNR片段；以质粒pGRT-ffs为模板，使用引物Pffs-F/Pffs-R进行PCR扩增出启动子Pffs用于启动FNR蛋白的转录；以pGRT-ffs为模板，使用引物GFP-F/GFP-R进行PCR扩增出GFP；以pBBR1MCS-5为模板，使用引物GmR-F/GmR-R进行PCR扩增出GmR抗性基因及其启动子Pc；通过合成互补单链退火得到厌氧诱导型启动子PfnrF8和空白对照启动子PfnrF8*；以pACM4G质粒为骨架，通过多片段融合PCR，无缝克隆组装得到氧气响应型生物传感器质粒pACM4G-F8-GFP和空白对照质粒pACM4G-F8*-GFP。
在上述基础上，以pACM4G-F8-GFP为模板，分别使用引物U10F8-F/U10F8-R，U15F8-F/U15F8-R，U20F8-F/U20F8-R，D3F8-F/D3F8-R D4F8-F/D4F8-R，D7F8-F/D7F8-R进行全质粒PCR，获得含有FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离不同的启动子的传感器质粒pACM4G-U10F8-GFP，pACM4G-U15F8-GFP，pACM4G-U20F8-GFP和pACM4G-D3F8-GFP，pACM4G-D4F8-GFP，pACM4G-D7F8-GFP。
表1引物序列表
实施例2氧气响应型生物传感器的响应性能评价
富马酸和硝酸还原酶(FNR)转录激活因子依赖的生物传感器是目前研究最多的氧气响应型生物传感器，FNR作为转录激活因子通过调节基因的转录从而介导生物从有氧代谢到厌氧代谢，其活性随氧气含量变化在4Fe-4S和2Fe-2S簇之间转换(图1A)，在无氧条件下，FNR与4Fe-4S簇结合而使蛋白构象发生改变，随之进行二聚化并结合至启动子区域的特定位点，最终使蛋白激活而激活有关厌氧代谢途径中相关基因的表达，当存在氧气的情况下，4Fe-4S簇被氧化为2Fe-2S簇，同时二聚体分解，FNR蛋白失去活性。
经过酶标仪检测来评价生物传感器有氧及厌氧条件下响应性能。以不含FNR靶向结合位点的空白质粒pACM4G-F8*-GFP作为对照，将实施例1获得的传感器质粒pACM4G-F8-GFP，导入大肠杆菌JM109进行生物传感器性能评价。结果如图1C所示，启动子PfnrF8在厌氧条件下诱导GFP的表达量是有氧条件下的6.14倍。此外，在厌氧条件下，启动子PfnrF8调控的GFP表达量是对照启动子PfnrF8*的83.36倍。
实施例3不同强度厌氧诱导型启动子的筛选
已知FNR转录激活因子通过靶向启动子特定结构域从而实现下游基因正常转录，在启动子PfnrF8中，FNR靶向结合位点位于启动子-35区上游(图2A)，改变两者之间的距离可能会影响生物传感器的响应性能，从而造成启动子下游基因的表达水平差异。
分别在有氧及厌氧条件下进行性能检测，以不含FNR靶向结合位点的空白质粒pACM4G-F8*-GFP作为对照，将实施例1获得的传感器质粒pACM4G-F8-GFP，pACM4G-U10F8-GFP，pACM4G-U15F8-GFP，pACM4G-U20F8-GFP，pACM4G-D3F8-GFP，pACM4G-D4F8-GFP和pACM4G-D7F8-GFP导入大肠杆菌JM109进行生物传感器性能评价。
结果如图2B所示，增加FNR靶向结合位点与启动子-35区距离使得传感器变为厌氧抑制型，即厌氧条件下GFP表达水平低于有氧条件。这可能是由于距离的增大导致转录灵敏性降低。另外，缩短FNR靶向结合位点与启动子-35区距离获得了厌氧条件下具有梯度响应性能的诱导型生物传感器，也即获得了不同强度的厌氧诱导型启动子。可知，启动子PfnrD3F8，PfnrD4F8，PfnrD7F8分别为启动子PfnrF8诱导强度的71.55％，55.24％，10.71％。
实施例4氧气响应型生物传感器的应用
以实施例2，3为基础，已知使用实施例1中获得的氧气响应型生物传感器质粒为骨架，用还原TCA途径的关键基因代替GFP，以及偶联逆己二酸降解途径可以用来强化己二酸的生物合成。
从大肠杆菌K12 MG1655的基因组DNA中分别扩增出编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD、编码富马酸还原酶的基因frdABCD；从Corynebacterium crenatum的基因组DNA中扩增出编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，分别克隆至实施例1中构建获得的生物传感器质粒pACM4G-F8-GFP的Nde I/Xho I位点。根据质粒骨架的ePathBrick载体的原理迭代基因的表达，获得具有单顺反子结构的重组质粒pACM4G-F8NAspf，此时，sucD、pyc及frdABCD基因均处于高表达水平。将获得的重组质粒导入大肠杆菌Mad1415获得己二酸生产菌株Mad1415-F8NAspf，以其进行己二酸合成，如图2C所示，己二酸的产量为0.3g/L。
选取PfnrF8，PfnrD4F8，PfnrD7F8分别作为高，中，低强度的厌氧诱导启动子来进行己二酸生产菌株Mad1415-F8NAspf中sucD及pyc基因表达水平的优化。
具体操作方法为：在质粒pACM4G-F8NAspf的基础上，将sucD基因及pyc基因各自上游的启动子分别设置为高强度启动子PfnrF8，中强度启动子PfnrD4F8，低强度启动子PfnrD7F8，共有9种排列组合，除质粒pACM4G-F8NAspf外，其他8种质粒分别为pACM4G-F8NAs4pf，pACM4G-F8NAs7pf，pACM4G-F8NA4spf，pACM4G-F8NA4s4pf，pACM4G-F8NA4s7pf，pACM4G-F8NA7spf，pACM4G-F8NA7s4pf，pACM4G-F8NA7s7pf。
如图2C所示，将获得的重组质粒分别导入大肠杆菌Mad1415进行己二酸合成，在Mad1415-F8NA4s7pf菌株中，当基因sucD处于中表达水平，基因pyc处于低表达水平时最有利于己二酸的生物合成，相比未优化前，己二酸的产量提高至0.53g/L，相比提高了76.67％。
表2引物序列表
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧气响应型生物传感器的构建与应用
<130> BAA210163A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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cagcagatga tgcgtctgat gagcggtgaa atcaaaggcg atcaggacat gatcctgctg 480
ttgtcgaaga aaaatgccga ggaacgtctg gctgcattca tctacaacct gtcccgtcgt 540
tttgcccaac gcggcttctc ccctcgtgaa ttccgcctga cgatgactcg tggcgatatc 600
ggtaactatc tgggcctgac ggtagaaacc atcagccgtc tgctgggtcg cttccagaaa 660
agcggcatgc tggcagtcaa aggtaaatac atcaccatcg aaaataacga tgcgctggcc 720
cagcttgctg gtcatacgcg taacgttgcc tga 753
<210> 2
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atagccttcg ggaatagcgg cgacgatttg ccagacgcgt tggggaaatg aatcttcttt 60
ttccatcttt tcttcctgag gtaatttttc agcataatct ggaaaaacgc ccgagtgaag 120
tcgcattgcg caagaaacca gcatctggca cgcgatgggt tgcaattagc cggggcagca 180
gtgataatgc gcctgcgcgt tggttctcaa cgctctcaat 220
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgacataag cctgttcggt tcgtaaact 29
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
taataagagg tgggattacg gctaggtcag tcctcggtat tatgctagtt a 51
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttgatttac atcaattacg gctaggtcag tcctcggtat tatgctagtt a 51
<210> 6
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt 60
ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg 120
cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat 180
cagccggact ccgattacct cgggaacttg ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct 240
gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag 300
cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag 360
ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat 420
gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg 480
ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgccac ctaa 534

Claims (7)

1.一种生物传感器质粒，其特征在于，以pACM4G为载体，由启动子Pffs、启动子Pc、PfnrF8、FNR基因、FNR基因结合位点组成；所述Pffs调控FNR的表达；所述PfnrF8上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子Pffs和启动子PfnrF8转录方向相反；所述FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0~27 bp；所述pACM4G是以pACM4为模板，将氯霉素抗性基因CmR替换为庆大霉素抗性基因GmR；
启动子Pffs的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示、启动子PfnrF8的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、FNR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的生物传感器质粒，其特征在于，启动子Pc调控表达的抗性基因。
3.含有权利要求1或2所述生物传感器质粒的基因工程菌。
4.一种构建权利要求1或2所述生物传感器质粒的方法，其特征在于，将编码如SEQ IDNO.2所示启动子Pffs的核苷酸序列、编码如SEQ ID NO.3所示启动子Pc的核苷酸序列、编码如SEQ ID NO.5所示启动子PfnrF8的核苷酸序列、编码如SEQ ID NO.1所示FNR基因的核苷酸序列连接载体pACM4G上。
5.一种构建权利要求1或2所述生物传感器质粒的方法，其特征在于，以权利要求1或2所述生物传感器质粒为模板，全质粒PCR获得FNR基因结合位点的序列与启动子PfnrF8的-35区之间距离为0~27 bp的传感器质粒。
6.一种通过调控氧气含量诱导基因表达的方法，其特征在于，其具体步骤如下：将权利要求3所述的基因工程菌进行发酵，初始添加3~5 g/L葡萄糖，前期好氧发酵，待葡萄糖耗尽，进行厌氧发酵，并补充3~5 g/L葡萄糖。
7.权利要求1或2所述生物传感器质粒在己二酸合成方面中的应用。
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