CN104988172B

CN104988172B - 一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用

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Publication number: CN104988172B
Application number: CN201510459220.5A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 赵广; 刘敏
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2035-07-30
Also published as: CN104988172A

Abstract

本发明公开了一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明所提供的方法是敲除出发菌株的转录控制因子iclR基因获得突变菌株，再将突变菌株转为感受态后导入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒，获得重组细胞。本发明首次实现通过提高乙醛酸循环活性，促进乙酸同化的代谢改造方式提高间苯三酚产量，具有较高的工业应用价值。

Description

一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

间苯三酚是一种重要的精细化工产品，是合成黄酮、异黄酮类药物的中间体，间苯三酚本身可作为一种优良的平滑肌解痉药物，广泛应用于临床。间苯三酚还能抑制过氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化H₂O₂分解为分子氧和水，是一种重要的抗氧化酶。此外，间苯三酚还是一种性能优越的抗养护剂、稳定剂、燃料偶合剂、轮胎增粘剂等，具有广阔的市场需求。目前，间苯三酚的工业化生产方法主要为化学合成法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。化学合成法存在多种弊端，如原料来源困难、副产物较多、分离提纯困难、环境污染严重等。以微生物发酵生产间苯三酚，可以克服化学法的多种弊端，并且生物法合成间苯三酚周期短，安全环保。

异源表达荧光假单胞菌聚酮合成酶基因phlD可以合成间苯三酚(Jihane Achkar,Mo Xian,Huimin Zhao,J.W.Frost.Biosynthesis of phloroglucinol[J].Journal ofthe American Chemical Society,2005,127(15):5332-5333.；Wenjuan Zha,SherylB.Rubin-Pitel,Huimin Zhao.Characterization of the substrate specificity ofPhlD,a type III polyketide synthase from Pseudomonas fluorescens[J].Journalof Biological Chemistry,2006,281(42):32036-32047.)。在此基础上表达多重抗性激活因子marA，增强大肠杆菌对间苯三酚的耐受性，表达大肠杆菌自身的乙酰CoA羧化酶基因(Accase)，细胞内丙二酸单酰CoA的水平为原始菌株的3.6倍(Yujin Cao,Xinglin Jiang,Rubing Zhang,Mo Xian.Improved phloroglucinol production by metabolicallyengineered Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:1545–1552.)。然而，间苯三酚目前的产量、产率仍然偏低，难以满足工业生产的需求。需要进一步对工程菌株进行基因改造，以期提高间苯三酚的合成能力。

大肠杆菌的代谢网络包含数百种代谢物，这些代谢物通过大量的生化和调节反应相互关联。代谢流的调控可在转录水平，转录后水平，酶活动力学等不同水平通过多种复杂机制实现。转录水平的调控是大肠杆菌最重要的调节模式。iclR是大肠杆菌的一种局部调控因子，能够抑制aceBAK操作子的表达。aceBAK操作子主要负责编码乙醛酸循环的相关酶，异柠檬酸裂解酶、苹果酸合酶和异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸化酶(Hendrik Waegeman,StijnDe Lausnay,Joeri Beauprez,Jo Maer tens,Marjan De Mey and WimSoetaert.Increasing recombinant protein production in Escherichia coliK12through metabolic engineering.New Biotechnology.2013,2(30):255-261.)。敲除iclR能够提高乙醛酸循环的活性，促进乙酸的利用。乙酰辅酶A合成酶(ACS)是细胞内同化乙酸的主要途径，ACS通过两步酶促反应催化乙酸合成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A经过乙醛酸循环和TCA循环，提供细胞合成的前体物质和能量。研究表明，过表达acs能够促进乙酸同化，降低乙酸的积累(Lin H,Castro NM,Bennett GN,San KY:Acetyl-CoA synthetaseoverexpression in Escherichia coli demonstrates more efficient acetateassimilation and lower acetate accumulation:a potential tool in metabolicengineering.Appl Microbiol Biotechnol 2006,71(6):870-874.)。

过表达phlD、Accase等基因可提高间苯三酚产量，但目前间苯三酚的产量和产率仍无法满足工业生产的需求。iclR是大肠杆菌内重要的转录调控因子，敲除iclR能够显著提高乙醛酸循环的活性。过表达acs能够促进乙酸转化为乙酰辅酶A，提高乙酸的同化能力。敲除调控因子iclR同时过表达acs的基因改造方法对间苯三酚发酵生产的影响暂无报道，通过活化乙醛酸循环，促进乙酸同化提高间苯三酚产量的基因改造方法也无报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法，所采取的技术方案如下：

本发明的一个目的在于提供一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法，该方法是敲除出发菌株的转录控制因子iclR基因获得突变菌株，再将突变菌株转为感受态后导入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒，获得重组细胞。

所述方法的步骤如下：

1)利用P1噬菌体侵染供体菌，制备噬菌体的溶菌产物，再利用所得溶菌产物侵染出发菌，获得侵染菌株；

2)制备步骤1)所得侵染菌株的感受态细胞，并导入质粒pcp20，敲除卡那霉素抗性基因，获得突变菌株；

3)制备含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒；

4)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞，并导入步骤3)所得的重组质粒，获得重组菌。

优选地，步骤1)所述供体菌，是大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan。

优选地，步骤1)所述出发菌，是大肠杆菌。更优选地，所述大肠杆菌，是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

优选地，步骤3)所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因Accase四个亚基，来源于大肠杆菌Escherichia coli，accA的Genebank ID：6062185，accB的Genebank ID：6058890，accC的Genebank ID：6058863，accD的Genebank ID：6059083；乙酰辅酶A合成酶acs，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：948572。

所述方法的具体步骤如下：

1)利用P1噬菌体侵染大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan，制备噬菌体的溶菌产物，再利用所得溶菌产物侵染大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，获得侵染菌株E.coli(DE3)iclR:Kan；

2)制备步骤1)所得侵染菌株的感受态细胞，并导入质粒pcp20，消除卡那霉素抗性基因，获得突变菌株E.coli(DE3)△iclR；

3)将聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰辅酶A合成酶基因acs连接到载体pET30a上，获得重组质粒pET-phlD-marA-acs；乙酰CoA羧化酶基因Accase连接到载体pACYC上，获得重组质粒pACYC-accADBC；所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因Accase四个亚基，来源于大肠杆菌Escherichia coli，accA的Genebank ID：6062185，accB的Genebank ID：6058890，accC的Genebank ID：6058863，accD的Genebank ID：6059083；乙酰辅酶A合成酶acs，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：948572；

4)制备步骤2)所得突变菌株E.coli(DE3)△iclR的感受态细胞，并将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA-acs和pACYC-accADBC导入到突变菌株E.coli(DE3)△iclR的感受态细胞中，获得重组菌。

所述任一方法用于获得高产间苯三酚的基因工程菌和生产间苯三酚。

本发明的另一目的在于提供了一种利用所述方法生产间苯三酚的方法，该方法的步骤如下：

4)制备步骤2)所得突变菌株E.coli(DE3)△iclR的感受态细胞，并将步骤3)所得的重组质粒pET-phlD-marA-acs和pACYC-accADBC导入到突变菌株E.coli(DE3)△iclR的感受态细胞中，获得重组菌；

5)通过摇瓶培养或发酵罐培养步骤4)所得重组细胞生产间苯三酚。

优选地，步骤5)所述培养，重组菌种子液的接种量为培养基体积的1％-5％，培养温度为37℃，搅拌速度为400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀为8-12，然后加入诱导剂IPTG至终浓度100μM，利用质量体积比浓度50-80％的葡萄糖储液继续补料发酵12-24h后结束。

本发明获得的有益效果如下：

1.本发明提供一种提高间苯三酚产量的基因改造方法及应用，该方法首次实现通过提高乙醛酸循环活性，促进乙酸同化的代谢改造方式提高间苯三酚产量，具有较高的工业应用价值。

2.本发明提供一种提高间苯三酚产量的工程菌株，是以大肠埃希氏杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为出发菌株，通过P₁噬菌体转导技术敲除iclR基因，得到工程菌株E.coliBL21(DE3)△iclR。将重组质粒pET-phlD-mar-acs和pACYC-accADBC导入该工程菌株，用于间苯三酚的发酵生产。

3.本发明提供的基因改造方法，在摇瓶及发酵罐水平，在含有两种重组质粒pET-phlD-marA-acs和pACYC-accADBC的基础上，敲除iclR基因，同时过表达acs基因，间苯三酚的产量比对照菌株Escherichia coli BL21(DE3)提高约3.5倍。

定义和缩写

在本文中使用下列的缩写或简称：

间苯三酚(Phloroglucinol)：PG

异丙基硫代半乳糖苷：IPTG

聚酮合成酶基因：phlD

多重抗性激活因子：marA

乙酰CoA羧化酶基因：Accase

乙酰辅酶A合成酶基因：acs

大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)：E.coli

“基因敲除”指通过一定途径，将特定基因从基因组中全部或部分删除，从而使特定基因功能丧失。

“基因型”指某一生物个体全部基因组合的总称，是该生物的细胞内所包含的、特有的那组基因。

“过量表达”或“过表达”指细胞内特定基因受到各种信号调控后，在生物体中超过原有水平表达，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

“转导”指细胞内的基因通过病毒载体，将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。

附图说明

图1为突变菌株ZG-2280构建流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

下述实施例中所涉及的实验方法若无特殊说明，均为常规技术。

下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。

所用限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自MBI Fermentas公司，质粒提取及胶回收所用试剂盒购自美国OMEGA公司，操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

1)种子液培养基

LB培养基：酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，接种时补加卡那霉素50μg/mL，氯霉素50μg/mL。

M9培养基：NH₄Cl 1.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15.2g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，1000×微量元素((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 3.7g/L；ZnSO₄·7H₂O2.9g/L；H₃BO₃24.7g/L；CuSO₄·5H₂O 2.5g/L；MnCl₂·4H₂O 15.8g/L)，接种时补加卡那霉素50μg/mL，氯霉素50μg/mL。

2)发酵培养基

K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L，葡萄糖20g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，1000×微量元素((NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O3.7g/L；ZnSO₄·7H₂O 2.9g/L；H₃BO₃24.7g/L；CuSO₄·5H₂O 2.5g/L；MnCl₂·4H₂O 15.8g/L)，卡那霉素50μg/mL，氯霉素50μg/mL。

其中：K₂HPO₄·3H₂O 9.8g/L，Citric acid·H₂O 2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，(NH4)₂SO₄3.0g/L混合后调至pH 7.0，121℃，20min高压蒸气灭菌。葡萄糖储液为500g/L，115℃，20min单独灭菌，MgSO₄·7H₂O储液为200g/L，121℃，20min单独灭菌，1000×微量元素采用0.22μm滤菌膜过滤除菌，转接种子液时分别补加上述单独除菌的葡萄糖、MgSO₄·7H₂O、1000×微量元素储液及抗生素。

实施例1 突变菌株E.coli(DE3)△iclR的构建

本实施例以大肠埃希氏杆菌E.coliBL21(DE3)为出发菌株，利用P1噬菌体转导技术，敲除iclR基因，构建突变菌株ZG-2280(图1)。

本领域技术人员应该理解，大肠埃希氏杆菌E.coliBL21(DE3)的基因敲除实验的各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

1 供体菌溶菌产物的制备

1)过夜培养受体菌株E.coliBW25113iclR:Kan；

2)向无菌的10ml EP管中加入4ml加热融化的0.4％琼脂培养基，加入400μL过夜培养受体菌，加入10μL P1噬菌体原液，混合均匀后倒入无抗平板，湿润环境下培养。

3)待不规则的噬菌斑出现后，收集增殖的噬菌体裂解液，加入约400μL氯仿保存，此溶液即为受体菌株E.coliBW25113iclR:Kan的P1噬菌体裂解液，4℃保存待用。

2 受体菌的基因敲除

1)过夜培养受体菌E.Coli BL21(DE3)

2)收集过夜培养的受体菌，加入不同稀释梯度的供体菌P1裂解液，37℃孵育30min。

3)加入200μL 1M柠檬酸钠(pH5.5)，加入1mL LB培养液，37℃生长1h，使抗性标签充分表达。

4)收集菌体，重悬细胞后涂布卡那霉素抗性平板。

5)筛选阳性克隆E.coli(DE3)iclR:Kan。

3 抗性基因的消除

制备E.coli(DE3)iclR:Kan的感受态，利用热激法转化质粒pcp20，30℃过夜培养消除卡那霉素抗性，选取单克隆重新划线无抗平板，42℃培养以消除pcp20质粒，最后选取能在无抗平板生长，在卡那霉素、氨苄霉素不生长的克隆即为抗性消除的菌株E.coli(DE3)△iclR。

实施例2 重组质粒的制备

原始质粒pET-phlD-marA，pACYC-accADBC的构建过程参见文献：Yujin Cao,Xinglin Jiang,Rubing Zhang,Mo Xian.Improved phloroglucinol production bymetabolically engineered Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:1545–1552.本实施例在原始质粒pET-phlD-marA的基础上，插入acs基因，通过T7启动子诱导acs过量表达表达，获得重组质粒pET-phlD-marA-acs。

2.1 重组质粒pET-phlD-marA-acs的制备

以大肠杆菌E.coli(DE3)基因组为模板，设计引物扩增acs基因，引物序列如下：

acs-5':5'-CTAGCCATGGCTAGCCAAATTCACAAACACACC-3'

acs-3':5'-CGGGATCCTTACGATGGCATCGCGATAGC-3'

利用NcoI、BamHI分别双酶切基因acs和载体pET-phlD-marA，酶切片段回收后，T₄DNA连接酶连接，转化DH5α感受态后过夜培养，筛选阳性克隆即为重组质粒pET-phlD-marA-acs。

2.2 表达载体转化宿主细胞

按照TAKARA感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株E.coliBL21(DE3)及本发明提供的工程菌株ZG-2280感受态，将原始质粒pET-phlD-mar和pACYC-accADBC通过热激法转化至出发菌株E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到对照菌株ZG-1944。将重组质粒pET-phlD-mar-acs和pACYC-accADBC通过热激法转化至ZG-2280感受态细胞，得到工程菌株ZG-2294。

实施例3 发酵生产间苯三酚

3.1 摇瓶发酵实验

1)一级种子液的培养，将对照菌株ZG-1944、工程菌株ZG-2294分别接种至3mL LB液体培养基中，并加入50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素，37℃生长8-12h。

2)将一级种子液按1％接种量转接至250mL发酵摇瓶中，含50mL发酵培养基，转接种子液时补加200g/L MgSO4.7H2O 100μL，500g/L葡萄糖2mL，1000×微量元素50μL，50μg/mL卡那霉素，50μg/mL氯霉素双抗性，每种菌株设定3个平行对照，37℃、180rpm培养。

3)细胞OD₆₀₀达到0.6-0.8间即可加入100μM/L IPTG诱导。

4)IPTG诱导后，37℃、180rpm继续培养24h后收集菌液，离心取上清，测定间苯三酚含量。

3.2间苯三酚的分批补料发酵生产

1)一级种子液的培养，依据上述3.1接种方法

2)二级种子液的培养，将一级种子液按1％接种量转接至250mL三角瓶中，含50mLM9培养基，转接种子液时补加200g/L MgSO₄.7H₂O 100μL，500g/L葡萄糖2mL，1000×微量元素50μL，50μg/mL卡那霉素，50μg/mL氯霉素双抗性，37℃、180rpm培养8-12h。

3)将二级种子液按1％接种量转接至5L发酵罐中，含2-3L发酵培养基中进行发酵，培养温度37℃、搅拌速度400-800rpm、pH 6.0-8.0和溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀约为8，加入诱导剂IPTG至终浓度100μM/L，50％-80％葡萄糖储液继续补料发酵24小时，离心取上清，测定间苯三酚含量。

3.3 间苯三酚的含量检测

本实施例采用肉桂醛显色法对间苯三酚(PG)的浓度进行测定，具体步骤如下：

1)配制10mg/L的肉桂醛显色液(肉桂醛直接溶解于体积比1:3的浓盐酸/乙醇溶液中)。

2)向1.5mL离心管中加入1mL肉桂醛显色液，再加入5μL发酵液上清，颠倒混匀，室温放置15min。

3)用10mm光径比色杯读取OD₄₄₆值，OD₄₄₆值在2h内稳定；

4)绘制间苯三酚标准曲线，根据标准曲线计算间苯三酚含量。

根据本实施例操作步骤，摇瓶水平，野生对照菌株ZG-1944的PG产量为0.36g/L，敲除iclR基因同时过表达acs基因的工程菌株ZG-2294的PG产量为1.27g/L；在分批补料发酵罐水平，ZG-1944的PG产量为3.2g/L，ZG-2294的PG产量为10.9g/L。相同发酵条件下，摇瓶及发酵罐水平，本发明提供的工程菌株，间苯三酚的产量比对照菌株提高约3.5倍。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种高产间苯三酚基因工程菌的构建方法，其特征在于，是敲除出发菌株的转录控制因子iclR基因获得突变菌株，再将突变菌株转为感受态后导入含有聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA、乙酰CoA羧化酶基因Accase、乙酰辅酶A合成酶基因acs的重组质粒，获得重组细胞，具体步骤如下：

4)制备步骤2)所得突变菌株的感受态细胞，并导入步骤3)所得的重组质粒，获得重组菌；

其中：步骤1)所述供体菌，是大肠杆菌E.coli BW25113iclR:Kan；所述出发菌，是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因Accase四个亚基，来源于大肠杆菌Escherichia coli，accA的Genebank ID：6062185，accB的Genebank ID：6058890，accC的Genebank ID：6058863，accD的Genebank ID：6059083；乙酰辅酶A合成酶acs，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：948572。

3.权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

3)将聚酮合成酶基因phlD、多重抗性激活因子marA和乙酰辅酶A合成酶基因acs连接到载体pET30a上，获得重组质粒pET-phlD-marA-acs；乙酰CoA羧化酶基因Accase连接到载体pACYC上，获得重组质粒pACYC-accADBC；所述聚酮合成酶基因phlD，来源于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，Genebank ID：11830552；所述多重抗性激活因子marA，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：6060688；所述乙酰CoA羧化酶基因Accase四个亚基，来源于大肠杆菌Escherichia coli，accA的Genebank ID：6062185，accB的GenebankID：6058890，accC的Genebank ID：6058863，accD的Genebank ID：6059083；乙酰辅酶A合成酶acs，来源于大肠杆菌Escherichia coli，Genebank ID：948572；

4.权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，用于获得高产间苯三酚的基因工程菌和生产间苯三酚。

5.权利要求4所述方法，其特征在于，步骤如下：

6.权利要求5所述方法，其特征在于，步骤5)所述培养，重组菌种子液的接种量为培养基体积的1％-5％，培养温度为37℃，搅拌速度为400-800rpm，pH6.0-8.0，溶氧18％以上的条件下培养至OD₆₀₀为8-12，然后加入诱导剂IPTG至终浓度100μM，利用质量体积比浓度50-80％的葡萄糖储液继续补料发酵12-24h后结束。