CN109370965B - 葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及葡萄糖合成1,3‑丙二醇的基因工程菌及其应用。该工程菌合成1,3‑丙二醇的途径为：葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；丙烯酰辅酶A在3‑羟基丙酰基‑辅酶A脱水酶的作用下生成3‑羟基丙酰辅酶A；3‑羟基丙酰辅酶A在‑羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3‑丙二醇。该工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，该表达盒包含基因scpA、scpB、acuI‑E或acuI‑K和Msed。

Description

葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于基因重组技术领域，涉及葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用。
背景技术
1,3-丙二醇(1,3-PDO)是于上个世纪90年代初开发出来的一种重要二醇产品，主要被应用于印染和纺织品、工程塑料、涂料和油墨等领域，是PTT(polytrimethyleneterephthalate)聚酯纤维合成不可替代的重要原料。随着1,3PDO合成工艺不断创新和产能扩大，从1991年30美金/千克的工业售价降到现在1.7美金/千克。目前全球1,3-PDO产能为30万吨，还远远不能满足百万吨以上的市场需求，发展空间巨大。当前，1,3-PDO的生产方法主要分为化学法和生物法：化学法主要是丙烯醛法和环氧乙烷法，生物法主要是利用微生物发酵生产。目前微生物合成1,3-PDO主要有两条原料路线：一条是自然界中存在的，以Klebsiella pneumoniae(K.pneumoniae)菌、梭菌等微生物为代表直接将甘油转化为1,3-PDO的合成路线；另一条是葡萄糖为代表的非甘油原料转化路线。因为自然界中不存在将葡萄糖转化为1,3-PDO的天然微生物菌株，因此葡萄糖转化1,3-PDO的路线需要利用基因工程菌来完成。葡萄糖途径的基因工程菌构建方法主要分为途径整合策略和非天然途径的设计。
因此，目前存在的问题是需要构建价廉高效的葡萄糖合成1,3-丙二醇的菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌。该工程菌通过将1,3-丙二醇合成酶基因导入E.coli菌株BL21(DE3)菌株中，构建1,3-丙二醇合成途径制成。该工程菌能够以含葡萄糖为底物通过发酵培养高效制备1,3-丙二醇。
为此，本发明第一方面提供了一种葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌，其合成1,3-丙二醇的途径如下：
(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；
(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；
(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；
(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；
(5)丙烯酰辅酶A在3-羟基丙酰基-辅酶A脱水酶的作用下生成3-羟基丙酰辅酶A；
(6)3-羟基丙酰辅酶A在-羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3-丙二醇。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，其中，所述表达盒含有至少一种以下基因：
(a)甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA；
(b)甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB；
(c)丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或acuI-K；
(d)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed。
根据本发明的一些实时方式，当所述表达盒包含(a)-(d)中的三种以下的基因时，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的相应的基因中的每种至少一个。
在本发明的一些优选的实施例中，所述表达盒包含(a)-(d)所有基因。
本发明中，所述合适宿主生物体包括大肠杆菌和/或克雷伯菌。
本发明中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列包含如SEQ-No.1所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列为与SEQ-No.1的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
本发明中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列包含如SEQ-No.2所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列为与SEQ-No.2的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
本发明中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列包含如SEQ-No.3所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列为与SEQ-No.3的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
本发明中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列包含如SEQ-No.4所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列为与SEQ-No.3的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
本发明中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列包含如SEQ-No.5所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列为与SEQ-No.5的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的基因工程菌在发酵糖类生产1,3-丙二醇中的应用。
本发明将非天然代谢途径的设计和重构对于拓展菌株的代谢能力用于化学品的生产，通过分析1,3-丙二醇的合成机理，利用代谢途径反向合成的方法，建立“基因-蛋白-反应”对应关系，设计和挖掘葡萄糖生产1,3-丙二醇的新途径，葡萄糖经由succinyl-CoA(琥珀酰辅酶A)、propionyl-CoA(丙酰辅酶A)和3-hydroxypropyl-CoA(3-羟基丙酰辅酶A)，最终合成1,3-丙二醇。本发明实现了葡萄糖直接合成1,3-丙二醇，拓宽了1,3-丙二醇的合成路线。
进一步地，本发明利用能够过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB、丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或基因acuI-K，并表达3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的重组微生物在摇瓶中以葡萄糖为底物进行发酵培养获得1,3-丙二醇。本发明的重组微生物在发酵过程中可以利用廉价的葡萄糖为原料，可以显著降低生产成本，拓宽了1,3-丙二醇的合成路线，具有良好的市场应用前景。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1为本发明中的葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌所具有的葡萄糖合成1,3-PDO途径示意图；
图2示出1,3-PDO的LC-MS/MS检测结果；其中，图2A示出1,3-丙二醇标准品的出峰时间；图2B示出BL21-EAB-M重组菌株发酵培养产物的出峰时间；图2C示出对照菌株发酵培养产物的出峰时间。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。若未特别指明，下列实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如大肠杆菌、克雷伯菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。
本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。
本发明所述用语“模式微生物”是指可以作为实验模型的各种动物、植物和微生物；其一般繁殖快、无污染、成本低，并且具有同一类生物特征的特点。
Ⅱ.实施方案
如前所述，现有的Klebsiella pneumoniae(K.pneumoniae)作为天然的1,3-PDO生产菌株，可利用甘油为原料，具有耐受性好、生长快等优点，但因胞内同工酶及副产物众多，NADH供应不足等问题，导致菌株生产效率不高，而且途径改造具有不确定性；而自然界中不存在将葡萄糖转化为1,3-PDO的天然微生物菌株。鉴于此，本发明人对于葡萄糖转化为1,3-PDO的菌株的构建进行了大量的研究，通过在大肠杆菌、克雷伯菌等细菌体中过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB、丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed，成功构建了具有葡萄糖合成1,3-丙二醇途径的基因工程菌。
因此，本发明所涉及的葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌，其合成1,3-丙二醇的途径如图1所示。从图1可以看出，本发明的葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌合成1,3-丙二醇的途径包括：
(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；
(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；
(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；
(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；
(5)丙烯酰辅酶A在3-羟基丙酰基-辅酶A脱水酶的作用下生成3-羟基丙酰辅酶A；
(6)3-羟基丙酰辅酶A在-羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3-丙二醇。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，其中，所述表达盒含有至少一种以下基因：
(a)甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA；
(b)甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB；
(c)丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或acuI-K，优选为acuI-E；
(d)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed。
根据本发明的一些实时方式，当所述表达盒包含(a)-(d)中的三种以下的基因时，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的相应的基因中的每种至少一个。
在本发明的一些优选的实施例中，所述表达盒包含(a)-(d)所有基因。
本发明中对于所述合适宿主生物体没有特别的限制，可以选用本领域常用的模式微生物，例如所述合适宿主生物体包括但不限于大肠杆菌和/或克雷伯菌，优选为大肠杆菌。
在本发明的一些优选的具体实施例中，例如，采用大肠杆菌作为宿主生物体，基因scpA、基因scpB以及acuI-E为该宿主生物体的内源性基因，当所述表达盒包含这三种基因中的一种或几种时，相当于这三种基因中的一种或几种在过表达，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的相应的基因中的每种至少一个；而基因Msed属于宿主生物体的外源性基因，当所述表达盒包含该基因时，不存在过表达，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的该种基因至少一个。
根据本发明的一些实施方式，所述基因工程菌能够表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA和甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB。
本发明中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列包含如SEQ-No.1所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列为与SEQ-No.1的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA来源于大肠杆菌K12，其氨基酸序列如SEQ-No.1所示。
在一些进一步具体的实施例中，所述大肠杆菌K12的保藏编号为CGMCC4.6049。
本发明中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列包含如SEQ-No.2所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列为与SEQ-No.2的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
在本发明的一些具体优选的实施例中，甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB来源于大肠杆菌K12，其氨基酸序列如SEQ-No.2所示。
进一步地，本发明的基因工程菌能够表达丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E、3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed。
本发明中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列包含如SEQ-No.3所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列为与SEQ-No.3的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E来源于大肠杆菌，其氨基酸序列如SEQ-No.3所示。
本发明中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列包含如SEQ-No.4所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列为与SEQ-No.4的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K来源于克雷伯菌，其氨基酸序列如SEQ-No.4所示。
本发明中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列包含如SEQ-No.5所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。
在本发明的一些实施例中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列为与SEQ-No.5的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed来源于人工合成，其氨基酸序列如SEQ-No.5所示。
本领域技术人员应当了解，本申请不限于实施例中菌株来源的酶，其他来源具有相同功能的酶也可以实现相同的技术效果；也就是说，只要行驶同样功能的酶，即便和本专利实例中的宿主来源不同，也可以实现相同的技术效果。
本发明还提供了一种构建上述葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌的方法，其包括：
步骤J，将scpA基因、scpB基因、acuI-E基因和Msed基因分别连接到质粒pET-Ptac上，获得重组质粒pET-Ptac-scpA、pET-Ptac-scpB、pETPtac-acuI-E、和pET-Ptac-Msed；
步骤K，以重组质粒pET-Ptac-Msed和pET-Ptac-acuI-E为模板，扩增得到表达盒Ptac-Msed和Ptac-acuI-E，分别插入质粒pACYC-Duet1和pRSF-Duet1中，得到单表达盒质粒pACYC-Ptac-Msed和pRSF-Ptac-acuI-E
步骤L，以pET-Ptac-scpA重组质粒为模板，扩增得到表达盒Ptac-scpA，酶切Ptac-scpA和pRSF-Ptac-acuI-E后进行连接，然后转化于大肠杆菌Trans10中，筛选和测序后保存，获得重组质粒pRSF-Ptac-acuI-E--scpA
步骤M，以pET-Ptac-scpB重组质粒为模板，扩增得到表达盒Ptac-scpB，酶切后插入pRSF-Ptac-acuI-E--scpA中，筛选得到重组质粒pRSF-Ptac-acuI-E-scpA-B。本发明研究共得到两个重组质粒，分别为pRSFPtac-acuI-E--scpA-B和pACYC-Msed。
步骤N，将pRSF-Ptac-acuI-E--scpA-B和pACYC-Ptac-Msed同时转入大肠杆菌菌株，筛选获得重组菌E.coli/EAB-M，作为本发明所述的葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌。
本领域技术人员应该了解的是，上述各步骤仅属于本发明的较为优选的实施方式，实际上本发明的构建上述葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌的方法还包括其他等同的实施方式，例如，在步骤J中也可以采用acuI-K基因替代acuI-E基因连接到质粒pET-Ptac上获得pETPtac-acuI-K；相应地，在后续的步骤中进行同样的操作，可以构建获得本发明所述的葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌。
在本发明的一些具体实施例中，构建上述葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌，包括以下步骤：
(1)将SEQ ID NO.1所示的scpA基因、SEQ ID NO.2所示的scpB基因、SEQ ID NO.3所示的acuI-E基因和SEQ ID NO.5所示的Msed基因，分别连接到质粒pET-Ptac上，获得重组质粒，pET-Ptac-scpA、pET-Ptac-scpB、pETPtac-acuI-E、和pET-Ptac-Msed；
(2)以重组质粒pET-Ptac-Msed和pET-Ptac-acuI-E为模板，扩增得到表达盒Ptac-Msed和Ptac-acuI-E，分别插入质粒pACYC-Duet1和pRSF-Duet1中，得到单表达盒质粒pACYC-Ptac-Msed、pRSF-Ptac-acuI-E；
(3)以pET-Ptac-scpA重组质粒为模板，扩增得到表达盒Ptac-scpA，酶切Ptac-scpA和pRSF-Ptac-acuI-E后进行连接，然后转化于大肠杆菌Trans10中，筛选和测序后保存，获得重组质粒pRSF-Ptac-acuI-E-scpA。
(4)以pET-Ptac-scpB重组质粒为模板，扩增得到表达盒Ptac-scpB，酶切后插入pRSF-PtacacuI-E-scpA中，筛选得到重组质粒pRSF-Ptac-acuI-EscpA-B。本发明研究共得到两个重组质粒，分别为pRSFPtac-acuI-E-scpA-B和pACYC-Msed。
(5)将pRSF-Ptac-acuI-E-scpA-B/和pACYC-Ptac-Msed同时转入大肠杆菌菌株，筛选获得重组菌E.coli/EAB-M，作为本发明所述的葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌。
本发明所涉及的上述基因工程菌在发酵糖类生产1,3-丙二醇中的应用，可以理解为利用上述基因工程菌对糖类进行发酵生产1,3-丙二醇的方法。
根据本发明的一些实施方式，以含可发酵糖的原料为底物将所述基因工程菌进行发酵培养，制备1,3-丙二醇。
在本发明的一些实施例中，所述发酵糖类为葡萄糖，所述发酵条件包括：发酵温度为30℃，转速180rpm/min，诱导剂浓度0.04mmol/mL。
在本发明的一些进一步具体的实施例中，构建葡萄糖生产1,3-丙二醇的基因工程菌，并将该工程菌用于发酵培养生产1,3-丙二醇，其包括以下步骤：
(1)过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA重组质粒的构建。
以大肠杆菌K12的基因组为模板，以NdeI-scpA-F(TCCATATGTCTAACGTGCAGGAGTGG)和XhoI-scpA-R(CCGCTCGAGTTAATCATGATGCTGGCTTATCAG)为引物进行PCR，获得scpA基因(scpA基因序列如SEQ ID NO.1所示)约2.1kb并进行PCR产物纯化。将pET-Ptac质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化获得的scpA片段连接到pET-Ptac上，获得的重组质粒命名为pET-Ptac-scpA。
(2)过表达甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的重组质粒的构建。
以大肠杆菌K12的基因组为模板，以引物NdeI-scpB-F(TCCATATGTCTTATCAGTATGTTAACGTTGTCAC)和引物XhoI-scpB-R(CCGCTCGAGTTAATGACCAACGAAATTAGGTTTACG)进行PCR，获得scpB基因(scpB基因序列如SEQ ID NO.2所示)约0.8kb并进行PCR产物纯化。将pET-Ptac质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化获得的scpB片段连接到pET-Ptac上，获得的重组质粒命名为pET-Ptac-scpB。
(3)过表达丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的重组质粒的构建。
以大肠杆菌来源的基因组为模板，以引物NdeI-acuI-E-F(TCCATATGCAGGCGTTACTTTTAGAA)和引物XhoI-acuI-E-R(CCGCTCGAGTTAGTTAACCTTCACCAGCGT)进行PCR，获得acuI-E基因(acuI-E基因序列如SEQ IDNO.3所示)约1kb并进行PCR产物纯化。将pET-Ptac质粒用NdeI和XhoI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化获得的acuI-E片段连接到pET-Ptac上，获得的重组质粒命名为pET-Ptac-acuI-E。
(4)过表达3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的重组质粒的构建。
以密码子优化后直接人工合成得到的质粒为模板，以引物Ptac-Msed-BamHI-F(CGGATCCTTGACAATTAATCATCGGCTCG)和引物Msed-SalI-R(CGTCGACTCATTTGCCTTTGAAGGTCGGTTC)进行PCR，获得Msed基因Msed基因(序列如SEQ IDNO.5所示)约0.8kb并进行PCR产物纯化。将pET-Ptac质粒用BamHI和SalI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化获得的Msed片段连接到pET-Ptac上，获得的重组质粒命名为pET-Ptac-Msed。
以pET-Ptac-Msed为模板，以引物Ptac-Msed-BamHI-F(CGGATCCTTGACAATTAATCATCGGCTCG)和引物Msed-SalI-R(CGTCGACTCATTTGCCTTTGAAGGTCGGTTC)进行PCR，获得Ptac-Msed表达盒。将Ptac-Msed表达盒和pACYC-Duet1质粒用BamHI和SalI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化随后连接，获得的重组质粒命名为pACYC-Ptac-Msed。
(5)过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB、丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的重组质粒的构建。
以pET-Ptac-acuI-E为模板，以引物BamHI-Ptac-acuI(CGGGATCCCGATCCCGCGAAATTGAC)和引物SalI-SacI-acuI-E-R(GCGTCGACGAGCTCTTAGTTAACCTTCACCAGCGT)进行PCR，获得Ptac-acuI-E表达盒。将Ptac-acuI-E表达盒和pRSF-Duet1质粒用BamHI和SacI进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化随后连接，获得的重组质粒命名为pRSF-Ptac-acuI-E。以pET-Ptac-scpA为模板，以引物SacI-Ptac-scpA(CGGAGCTCCGATCCCGCGAAATTGAC)和引物AflII-scpA-ter(CCCTTAAGCAAAAAACCCCTCAAGACCC)为引物进行PCR，获得Ptac-scpA表达盒。将Ptac-scpA表达盒和pRSF-Ptac-acuI-E质粒用SacI和AflII进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化随后连接，获得的重组质粒命名为pRSF-Ptac-acuI-E-scpA。以pET-Ptac-scpB为模板，以引物BglII-Ptac-scpB(GAAGATCTCGATCCCGCGAAATTGAC)和引物AvrII-scpB-R(CCTAGGTTAATGACCAACGAAATTAGGTTTACG)为引物进行PCR，获得Ptac-scpB表达盒。将Ptac-scpB表达盒和pRSF-Ptac-acuI-E-scpA质粒用BglII和AvrII进行双酶切，利用试剂盒(OMEGA)纯化随后连接，获得的重组质粒命名为pRSF-Ptac-acuI-E-scpA-B。通过化学转化法将pRSF-Ptac-acuI-E-scpA-B和pACYC-Ptac-Msed共转入到E.coli菌株BL21(DE3)菌株中，在含30mg/L的氯霉素和50mg/L卡那霉素的LB平板上筛选获得重组菌，命名为BL21-EAB-M。
(6)重组大肠杆菌发酵培养生产1,3-丙二醇。
将步骤(5)获得的重组菌株BL21-EAB-M在含30mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素LB平板上过夜培养，长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆接种到含有4mL种子培养基的试管中(加入4微升30mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素)，过夜培养后转接到含有50mL发酵液的250mL不带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.9后，添加2mM IPTG，30℃，180rpm培养48小时。
种子培养基的配方包括：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5.0g/L，氯霉素1.0mL/L，卡那霉素1.0mL/L。
从甘油管里取出10微升接种到含有4mL种子培养基的试管里摇床培养，控制温度为30℃，转速为180rpm，过夜发酵。
发酵培养基配方包括(LB)：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5.0g/L，氯霉素1.0mL/L，卡那霉素1.0mL/L。
发酵培养基配方包括(M9)：葡萄糖5.0g/L，酵母粉3.0g/L，M9salt(10X)100mL/L，1MMgSO4 1mL/L，1MCaCl 0.3mL/L，1.0g/L生物素1.0mL/L，1.0g/L硫胺素1.0mL/L，微量元素(100X)10mL/L，氯霉素1.0mL/L，卡那霉素1.0mL/L。
M9salt(10X)(M9盐)配方包括：Na2HPO4 33.7mM/L，KH2PO4 22mM/L，NaCl 8.55mM/L，NH4Cl 9.35mM/L。
微量元素(100X)配方包括：EDTA 5g/L，FeCl2·6H2O 0.83g/L，ZnCl2 0.084g/L，CuCl2·2H2O 0.013g/L，CoCl2·2H2O 0.01g/L，H3BO3 0.01g/L，MnCl2·4H2O0.0016g/L。
从种子培养基里取出500微升转接到含有50mL发酵液的250mL不带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.9时，添加2mM IPTG，30℃，180rpm培养48小时。
发酵48小时后，重组菌株BL21-EAB-M生产142mg/L 1,3-丙二醇，说明构建的重组菌株能够直接利用葡萄糖生产1,3-丙二醇。在同样条件下，对照菌株不能生产1,3-丙二醇。
Ⅲ、实施例
实施例1：重组质粒的构建
本实施例中构建重组质粒所采用的引物如表1所示。
表1构建重组质粒所采用的引物(相应的序列如SEQ-No.6-25所示)
Figure BDA0001827704760000111
Figure BDA0001827704760000121
实施例2：重组菌株的构建
(1)大肠杆菌化学转化方法
从-80℃冰箱中取出购买的E.coli(BL21-DE3)感受态细胞置于冰浴中，加入要转化的连接体系充分混匀后在冰浴中放置30min后将体系放入42℃水浴中精确计时90s迅速放回冰浴中保持冰浴2min，加入500μL预冷SOC或LB培养基放入37℃摇床中复苏，45min复苏结束后取合菌液涂平板(含有质粒对应的抗生素)倒置于37℃培养箱中培养。
为了构建途径优化的重组菌株，将pRSF-Ptac-acuI-E-scpA-B和与质粒pACYC-Ptac-Msed构建所需的重组菌株化学转化进入E.coli(BL21-DE3)。
表2构建的重组菌株
Figure BDA0001827704760000122
Figure BDA0001827704760000131
①购自湖南优宝生物科技有限公司；②购自湖南优宝生物科技有限公司。
实施例3：重组菌株的摇瓶发酵验证
(1)重组菌株的摇瓶培养
从甘油管里取出10微升接种到含有4mL种子培养基的试管里，摇床培养，控制温度为30℃，转速为180rpm，过夜发酵。
从种子培养基里取出500微升转接到含有50mL发酵液的250mL不带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.9时，添加2mM IPTG，30℃，180rpm培养48小时。
(2)生物量的测定
菌株的生物量是利用紫外分光光度计测定菌液在600nm处的吸光值表示。
主要发酵底物(葡萄糖)的浓度测定是采用高效液相色谱法。色谱柱型号为BIO-RAD-HPX-87H，流动相为5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温65℃，进样体积20μL，检测器为紫外和示差检测器。将主要发酵底物和产物配成不同梯度的混合标准溶液，进行标准曲线的测定和绘制，之后的样品按照标准曲线进行检测和计算，从而得到其浓度。
实施例4：发酵培养条件
按照实例3重组菌株发酵验证的实验方法，通过改变培养基类型，进行菌株的培养和产量测定，以筛选最适的发酵培养基。本发明下E.coli菌株采用的发酵培养基LB培养基外，还采用了M9发酵培养基作为对比。
从甘油管里取出10微升接种到含有4mL种子培养基的试管里，摇床培养，控制温度为30℃，转速为180rpm，过夜发酵。
从种子培养基里取出500微升转接到含有50mL M9发酵液的250mL不带挡板的摇瓶里，培养至细菌生产量(即OD600值)为0.6-0.9时，添加2mM IPTG，30℃，180rpm培养48小时。
与标准品的质谱解谱结果对比，succinyl-CoA途径合成1,3-PDO的两株重组大肠杆菌BL21-EAB-M(包含acuI-E、scpA、scpB和Msed)、在LB培养基和M9培养基中48h时均有1,3-PDO的产出，由发酵的定性分析结果证明葡萄糖从头合成1,3PDO的非天然途径成功在E.coli表达。
从附录中可以看出，BL21-EAB-M重组菌株(包含acuI-E、scpA、scpB和Msed)，产量达到142mg/L。
实施例5：重组菌株产物的鉴定
LC-MS/MS检测方法：葡萄糖新途径生产的1,3-PDO采用LC-MS/MS进行定性和定量分析，结果由安捷伦公司合作测定完成。
样品的测定方法为：取发酵液上清，加入等体积的乙腈，之后快速衍生后采用C18柱检测。
分别检测1,3-丙二醇标准品、BL21-EAB-M重组菌株发酵培养产物和对照菌株[在大肠杆菌中转入了两个不含有四个基因的相应的空质粒(pRSF-Duet1，pACYC-Duet1)作为空白对照]发酵培养产物的出峰时间，结果见图2A-2C。
在相同检测方法及条件下，将1,3-丙二醇标准品、BL21-EAB-M重组菌株发酵培养产物的出峰时间进行对比可以看出，BL21-EAB-M重组菌株发酵培养产物的出峰时间4.7min，这与和1,3-丙二醇标准品的出峰时间完全一致，而空白对照并无任何峰出现，由此证明产物是1,3-丙二醇。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用
<130> RB1802931-FF
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 714
<212> PRT
<213> （基因scpA）
<400> 1
Met Ser Asn Val Gln Glu Trp Gln Gln Leu Ala Asn Lys Glu Leu Ser
1 5 10 15
Arg Arg Glu Lys Thr Val Asp Ser Leu Val His Gln Thr Ala Glu Gly
20 25 30
Ile Ala Ile Lys Pro Leu Tyr Thr Glu Ala Asp Leu Asp Asn Leu Glu
35 40 45
Val Thr Gly Thr Leu Pro Gly Leu Pro Pro Tyr Val Arg Gly Pro Arg
50 55 60
Ala Thr Met Tyr Thr Ala Gln Pro Trp Thr Ile Arg Gln Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Phe Ser Thr Ala Lys Glu Ser Asn Ala Phe Tyr Arg Arg Asn Leu Ala
85 90 95
Ala Gly Gln Lys Gly Leu Ser Val Ala Phe Asp Leu Ala Thr His Arg
100 105 110
Gly Tyr Asp Ser Asp Asn Pro Arg Val Ala Gly Asp Val Gly Lys Ala
115 120 125
Gly Val Ala Ile Asp Thr Val Glu Asp Met Lys Val Leu Phe Asp Gln
130 135 140
Ile Pro Leu Asp Lys Met Ser Val Ser Met Thr Met Asn Gly Ala Val
145 150 155 160
Leu Pro Val Leu Ala Phe Tyr Ile Val Ala Ala Glu Glu Gln Gly Val
165 170 175
Thr Pro Asp Lys Leu Thr Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile Leu Lys Glu
180 185 190
Tyr Leu Cys Arg Asn Thr Tyr Ile Tyr Pro Pro Lys Pro Ser Met Arg
195 200 205
Ile Ile Ala Asp Ile Ile Ala Trp Cys Ser Gly Asn Met Pro Arg Phe
210 215 220
Asn Thr Ile Ser Ile Ser Gly Tyr His Met Gly Glu Ala Gly Ala Asn
225 230 235 240
Cys Val Gln Gln Val Ala Phe Thr Leu Ala Asp Gly Ile Glu Tyr Ile
245 250 255
Lys Ala Ala Ile Ser Ala Gly Leu Lys Ile Asp Asp Phe Ala Pro Arg
260 265 270
Leu Ser Phe Phe Phe Gly Ile Gly Met Asp Leu Phe Met Asn Val Ala
275 280 285
Met Leu Arg Ala Ala Arg Tyr Leu Trp Ser Glu Ala Val Ser Gly Phe
290 295 300
Gly Ala Gln Asp Pro Lys Ser Leu Ala Leu Arg Thr His Cys Gln Thr
305 310 315 320
Ser Gly Trp Ser Leu Thr Glu Gln Asp Pro Tyr Asn Asn Val Ile Arg
325 330 335
Thr Thr Ile Glu Ala Leu Ala Ala Thr Leu Gly Gly Thr Gln Ser Leu
340 345 350
His Thr Asn Ala Phe Asp Glu Ala Leu Gly Leu Pro Thr Asp Phe Ser
355 360 365
Ala Arg Ile Ala Arg Asn Thr Gln Ile Ile Ile Gln Glu Glu Ser Glu
370 375 380
Leu Cys Arg Thr Val Asp Pro Leu Ala Gly Ser Tyr Tyr Ile Glu Ser
385 390 395 400
Leu Thr Asp Gln Ile Val Lys Gln Ala Arg Ala Ile Ile Gln Gln Ile
405 410 415
Asp Glu Ala Gly Gly Met Ala Lys Ala Ile Glu Ala Gly Leu Pro Lys
420 425 430
Arg Met Ile Glu Glu Ala Ser Ala Arg Glu Gln Ser Leu Ile Asp Gln
435 440 445
Gly Lys Arg Val Ile Val Gly Val Asn Lys Tyr Lys Leu Asp His Glu
450 455 460
Asp Glu Thr Asp Val Leu Glu Ile Asp Asn Val Met Val Arg Asn Glu
465 470 475 480
Gln Ile Ala Ser Leu Glu Arg Ile Arg Ala Thr Arg Asp Asp Ala Ala
485 490 495
Val Thr Ala Ala Leu Asn Ala Leu Thr His Ala Ala Gln His Asn Glu
500 505 510
Asn Leu Leu Ala Ala Ala Val Asn Ala Ala Arg Val Arg Ala Thr Leu
515 520 525
Gly Glu Ile Ser Asp Ala Leu Glu Val Ala Phe Asp Arg Tyr Leu Val
530 535 540
Pro Ser Gln Cys Val Thr Gly Val Ile Ala Gln Ser Tyr His Gln Ser
545 550 555 560
Glu Lys Ser Ala Ser Glu Phe Asp Ala Ile Val Ala Gln Thr Glu Gln
565 570 575
Phe Leu Ala Asp Asn Gly Arg Arg Pro Arg Ile Leu Ile Ala Lys Met
580 585 590
Gly Gln Asp Gly His Asp Arg Gly Ala Lys Val Ile Ala Ser Ala Tyr
595 600 605
Ser Asp Leu Gly Phe Asp Val Asp Leu Ser Pro Met Phe Ser Thr Pro
610 615 620
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Ala Val Glu Asn Asp Val His Val Val Gly
625 630 635 640
Ala Ser Ser Leu Ala Ala Gly His Lys Thr Leu Ile Pro Glu Leu Val
645 650 655
Glu Ala Leu Lys Lys Trp Gly Arg Glu Asp Ile Cys Val Val Ala Gly
660 665 670
Gly Val Ile Pro Pro Gln Asp Tyr Ala Phe Leu Gln Glu Arg Gly Val
675 680 685
Ala Ala Ile Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Met Leu Asp Ser Val Arg Asp
690 695 700
Val Leu Asn Leu Ile Ser Gln His His Asp
705 710
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> （基因scpB）
<400> 2
Met Ser Tyr Gln Tyr Val Asn Val Val Thr Ile Asn Lys Val Ala Val
1 5 10 15
Ile Glu Phe Asn Tyr Gly Arg Lys Leu Asn Ala Leu Ser Lys Val Phe
20 25 30
Ile Asp Asp Leu Met Gln Ala Leu Ser Asp Leu Asn Arg Pro Glu Ile
35 40 45
Arg Cys Ile Ile Leu Arg Ala Pro Ser Gly Ser Lys Val Phe Ser Ala
50 55 60
Gly His Asp Ile His Glu Leu Pro Ser Gly Gly Arg Asp Pro Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Asp Pro Leu Arg Gln Ile Thr Arg Met Ile Gln Lys Phe Pro
85 90 95
Lys Pro Ile Ile Ser Met Val Glu Gly Ser Val Trp Gly Gly Ala Phe
100 105 110
Glu Met Ile Met Ser Ser Asp Leu Ile Ile Ala Ala Ser Thr Ser Thr
115 120 125
Phe Ser Met Thr Pro Val Asn Leu Gly Val Pro Tyr Asn Leu Val Gly
130 135 140
Ile His Asn Leu Thr Arg Asp Ala Gly Phe His Ile Val Lys Glu Leu
145 150 155 160
Ile Phe Thr Ala Ser Pro Ile Thr Ala Gln Arg Ala Leu Ala Val Gly
165 170 175
Ile Leu Asn His Val Val Glu Val Glu Glu Leu Glu Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Gln Met Ala His His Ile Ser Glu Lys Ala Pro Leu Ala Ile Ala Val
195 200 205
Ile Lys Glu Glu Leu Arg Val Leu Gly Glu Ala His Thr Met Asn Ser
210 215 220
Asp Glu Phe Glu Arg Ile Gln Gly Met Arg Arg Ala Val Tyr Asp Ser
225 230 235 240
Glu Asp Tyr Gln Glu Gly Met Asn Ala Phe Leu Glu Lys Arg Lys Pro
245 250 255
Asn Phe Val Gly His
260
<210> 3
<211> 324
<212> PRT
<213> （基因acuI-E）
<400> 3
Met Gln Ala Leu Leu Leu Glu Gln Gln Asp Gly Lys Thr Leu Ala Ser
1 5 10 15
Val Gln Thr Leu Asp Glu Ser Arg Leu Pro Glu Gly Asp Val Thr Val
20 25 30
Asp Val His Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Lys Asp Ala Leu Ala Ile Thr
35 40 45
Gly Lys Gly Lys Ile Ile Arg Asn Phe Pro Met Ile Pro Gly Ile Asp
50 55 60
Phe Ala Gly Thr Val Arg Thr Ser Glu Asp Pro Arg Phe His Ala Gly
65 70 75 80
Gln Glu Val Leu Leu Thr Gly Trp Gly Val Gly Glu Asn His Trp Gly
85 90 95
Gly Leu Ala Glu Gln Ala Arg Val Lys Gly Asp Trp Leu Val Ala Met
100 105 110
Pro Gln Gly Leu Asp Ala Arg Lys Ala Met Ile Ile Gly Thr Ala Gly
115 120 125
Phe Thr Ala Met Leu Cys Val Met Ala Leu Glu Asp Ala Gly Val Arg
130 135 140
Pro Gln Asp Gly Glu Ile Val Val Thr Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly
145 150 155 160
Ser Thr Ala Val Ala Leu Leu His Lys Leu Gly Tyr Gln Val Val Ala
165 170 175
Val Ser Gly Arg Glu Ser Thr His Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gly Ala
180 185 190
Ser Arg Val Leu Pro Arg Asp Glu Phe Ala Glu Ser Arg Pro Leu Glu
195 200 205
Lys Gln Val Trp Ala Gly Ala Ile Asp Thr Val Gly Asp Lys Val Leu
210 215 220
Ala Lys Val Leu Ala Gln Met Asn Tyr Gly Gly Cys Val Ala Ala Cys
225 230 235 240
Gly Leu Ala Gly Gly Phe Thr Leu Pro Thr Thr Val Met Pro Phe Ile
245 250 255
Leu Arg Asn Val Arg Leu Gln Gly Val Asp Ser Val Met Thr Pro Pro
260 265 270
Glu Arg Arg Ala Gln Ala Trp Gln Arg Leu Val Ala Asp Leu Pro Glu
275 280 285
Ser Phe Tyr Thr Gln Ala Ala Lys Glu Ile Ser Leu Ser Glu Ala Pro
290 295 300
Asn Phe Ala Glu Ala Ile Ile Asn Asn Gln Ile Gln Gly Arg Thr Leu
305 310 315 320
Val Lys Val Asn
<210> 4
<211> 325
<212> PRT
<213> （基因acuI-K）
<400> 4
Met Lys Ala Leu Val Leu Asp Gln Ile Asp Asn Arg Thr Val Ala Thr
1 5 10 15
Val Lys Asp Ile Asp Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gly Asp Val Arg Val
20 25 30
Ala Ile Asp Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Lys Asp Ala Leu Ala Ile Thr
35 40 45
Gly Lys Gly Lys Ile Ile Arg Gln Phe Pro Met Val Pro Gly Ile Asp
50 55 60
Phe Ala Gly Gln Val Lys Glu Ser Arg Asp Pro Arg Phe Val Pro Gly
65 70 75 80
Gln Ala Val Ile Leu Thr Gly Trp Gly Val Gly Glu Asn His Trp Gly
85 90 95
Gly Leu Ala Thr Glu Ala Cys Val Lys Gly Asp Trp Leu Val Ala Leu
100 105 110
Pro Glu Thr Leu Ser Ala Arg Gln Ala Met Ile Ile Gly Thr Ala Gly
115 120 125
Phe Thr Ala Met Leu Cys Val Asp Ala Leu Val Ser Ala Gly Val Thr
130 135 140
Pro Asp Ser Gly Asp Ile Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly
145 150 155 160
Ser Thr Ala Val Val Leu Leu Lys Ala Leu Gly Tyr Arg Val Thr Ala
165 170 175
Val Ser Gly Arg Glu Ser Thr His Asp Tyr Leu Arg Gln Leu Gly Ala
180 185 190
Asp Thr Ile Leu Pro Arg Ser Asp Phe Ala Glu Thr Arg Pro Leu Glu
195 200 205
Lys Gln Leu Trp Ala Gly Ala Val Asp Thr Val Gly Gly Pro Val Leu
210 215 220
Ala Lys Val Leu Ala Gln Thr Gln Tyr Arg Gly Cys Val Ala Ala Cys
225 230 235 240
Gly Leu Ala Gly Gly Phe Asp Leu Pro Thr Thr Val Met Pro Phe Ile
245 250 255
Leu Arg Asn Val Arg Leu Gln Gly Val Asp Ser Val Met Val Pro Thr
260 265 270
Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gln Arg Leu Ala Gln Leu Leu Pro Glu
275 280 285
Ser Tyr Tyr Gln Gln Ala Ala Thr Glu Ile Thr Leu Glu Gln Ala Pro
290 295 300
Ala Tyr Ala Ala Asp Phe Leu Ser Asn Asn Ile His Gly Arg Thr Leu
305 310 315 320
Val Asn Ile Gly Gln
325
<210> 5
<211> 259
<212> PRT
<213> （基因Msed）
<400> 5
Met Glu Phe Glu Thr Ile Glu Thr Lys Lys Glu Gly Asn Leu Phe Trp
1 5 10 15
Ile Thr Leu Asn Arg Pro Asp Lys Leu Asn Ala Leu Asn Ala Lys Leu
20 25 30
Leu Glu Glu Leu Asp Arg Ala Val Ser Gln Ala Glu Ser Asp Pro Glu
35 40 45
Ile Arg Val Ile Ile Ile Thr Gly Lys Gly Lys Ala Phe Cys Ala Gly
50 55 60
Ala Asp Ile Thr Gln Phe Asn Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Trp Lys
65 70 75 80
Phe Ser Lys Lys Gly Arg Glu Ile Met Asp Lys Ile Glu Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Pro Thr Ile Ala Met Ile Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Gly Gly Leu
100 105 110
Glu Leu Ala Leu Ala Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ala Glu Glu Ala Gln
115 120 125
Leu Gly Leu Pro Glu Ile Asn Leu Gly Ile Tyr Pro Gly Tyr Gly Gly
130 135 140
Thr Gln Arg Leu Thr Arg Val Ile Gly Lys Gly Arg Ala Leu Glu Met
145 150 155 160
Met Met Thr Gly Asp Arg Ile Pro Gly Lys Asp Ala Glu Lys Tyr Gly
165 170 175
Leu Val Asn Arg Val Val Pro Leu Ala Asn Leu Glu Gln Glu Thr Arg
180 185 190
Lys Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Lys Ser Pro Ile Ser Leu Ala Leu
195 200 205
Ile Lys Glu Val Val Asn Arg Gly Leu Asp Ser Pro Leu Leu Ser Gly
210 215 220
Leu Ala Leu Glu Ser Val Gly Trp Gly Val Val Phe Ser Thr Glu Asp
225 230 235 240
Lys Lys Glu Gly Val Ser Ala Phe Leu Glu Lys Arg Glu Pro Thr Phe
245 250 255
Lys Gly Lys
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> （引物Ptac-Msed-BamHI-F）
<400> 6
cggatccttg acaattaatc atcggctcg 29
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> （引物Msed-SalI-R）
<400> 7
cgtcgactca tttgcctttg aaggtcggtt c 31
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> （引物MfeI-Ptac）
<400> 8
cgcaattgcg atcccgcgaa attgacaat 29
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> （引物NdeI-acuI-E-F）
<400> 9
tccatatgca ggcgttactt ttagaa 26
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> （引物NdeI-acuI-E-F）
<400> 10
ccgctcgagt tagttaacct tcaccagcgt 30
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> （引物BamHI-Ptac-acuI）
<400> 11
cgggatcccg atcccgcgaa attgac 26
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物SalI-SacI-acuI-E-R）
<400> 12
gcgtcgacga gctcttagtt aaccttcacc agcgt 35
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物NdeI-acuI-K-F）
<400> 13
tccatatgaa agcattagtt ctggacca 28
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> （引物XhoI-acuI-K-R）
<400> 14
ccgctcgagt tactggccga tattgacca 29
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> （引物SalI-SacI-acuI-K-R）
<400> 15
cggtcgacga gctcttactg gccgatattg acca 34
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> （引物NdeI-scpA-F）
<400> 16
tccatatgtc taacgtgcag gagtgg 26
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物XhoI-scpA-R）
<400> 17
ccgctcgagt taatcatgat gctggcttat cag 33
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> （引物SacI-Ptac-scpA）
<400> 18
cggagctccg atcccgcgaa attgac 26
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物AflII-scpA-ter）
<400> 19
cccttaagca aaaaacccct caagaccc 28
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> （引物NdeI-scpB-F）
<400> 20
tccatatgtc ttatcagtat gttaacgttg tcac 34
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> （引物XhoI-scpB-R）
<400> 21
ccgctcgagt taatgaccaa cgaaattagg tttacg 36
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> （引物BglII-Ptac-scpB）
<400> 22
gaagatctcg atcccgcgaa attgac 26
<210> 23
<211> 33
<212> DNA
<213> （引物AvrII-scpB-R）
<400> 23
cctaggttaa tgaccaacga aattaggttt acg 33
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> （引物scpA-cpcr-F）
<400> 24
tacttgagat cgacaacgtg atggtgcg 28
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> （引物scpA-cpcr-F）
<400> 25
gccgtgtaca atacgattac tttctgttcg actta 35

Claims (1)

1.一种葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌在发酵糖类生产1,3-丙二醇中的应用；所述应用为以含可发酵糖的原料为底物将所述基因工程菌进行发酵培养，制备1,3-丙二醇，所述发酵糖类为葡萄糖，所述发酵条件包括：发酵温度为30℃，转速180rpm/min，诱导剂IPTG浓度2mM；
所述葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌的合成1,3-丙二醇的途径如下：
(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；
(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；
(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；
(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；
(5)丙烯酰辅酶A在3-羟基丙酰基-辅酶A脱水酶的作用下生成3-羟基丙酰辅酶A；
(6)3-羟基丙酰辅酶A在-羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3-丙二醇；
所述基因工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，其中，所述表达盒含有以下基因：
(a)甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA；
(b)甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB；
(c)丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E；
(d)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed；
所述合适宿主生物体为大肠杆菌；
所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列如SEQ-No.1所示；
所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列如SEQ-No.2所示；
所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列如SEQ-No.3所示；
所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列如SEQ-No.5所示。
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