CN108456688A

CN108456688A - 一种基于t7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用

Info

Publication number: CN108456688A
Application number: CN201710094163.4A
Authority: CN
Inventors: 陆文强; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd; Cathay Industrial Biotech Ltd
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2018-08-28

Abstract

本发明涉及一种重组表达质粒，特别涉及一种基于T7启动子的重组表达质粒，本发明还涉及包含该重组表达质粒的转化子，本发明还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产肽如赖氨酸脱羧酶方面的应用，及进一步生产1,5‑戊二胺方面的应用。一种重组表达质粒，包括：质粒骨架；复制子；目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的糖诱导的严谨型启动子如阿拉伯糖启动子。一种转化子，所述转化子的重组表达质粒如上文所述。一种发酵生产多肽的方法，包括培养如上文任一项技术方案所述的转化子的步骤。本发明降低了目前的诱导型的重组表达诱导剂的成本。

Description

一种基于T7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组表达质粒，特别涉及一种基于T7启动子的重组表达质粒，本发明还涉及包含该重组表达质粒的转化子，本发明还涉及该转化子的应用，特别是在发酵生产多肽如赖氨酸脱羧酶方面的应用，及进一步生产1,5-戊二胺方面的应用。

背景技术

本发明涉及的是一种核酸序列的组成以及用该序列进行酶、蛋白质或多肽(统称多肽)的大量的表达。在酶、蛋白质或多肽的研究中，多数涉及到蛋白/酶/多肽的结构以及功能研究，如蛋白质或酶的三维结构研究，酶的催化性能研究以及酶在医疗、工业、农业领域的应用，如蛋白药物、疫苗、淀粉酶、蛋白酶之类的。在这类研究中就需要对酶、蛋白质或多肽进行大量的有功能的表达。

目前酶、蛋白质或多肽的表达系统有多种，主要分为真核表达系统(如植物细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统)和原核表达系统(大肠杆菌表达系统、蜂房哈夫尼菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统)。在这些系统中真核表达系统因为其具有完善的转录后修饰、翻译后修饰、糖基化等功能，特别适合于表达来源于真核细胞的酶、蛋白质或多肽。但是真核表达系统也存在其自身的缺点，比如细胞培养操作较为苛刻、培养使用的培养基较为昂贵、培养周期较长等。因此真核细胞表达系统多用于在原核系统中无法正常功能化表达且附加值较高的酶、蛋白质或多肽。而原核系统则因为其易于培养操作、发酵培养基便宜易得、较短的发酵周期以及简单的后处理等成为了酶、蛋白质或多肽的研究或应用过程中首选的表达系统。

在原核表达系统中，表达酶、蛋白质或多肽的元件至少包含以下几部分：启动子序列(包含RNA聚合酶识别序列、核糖体结合位点序列)、目标基因序列、终止子序列。表达方式可以根据启动子的类型分为两种，即组成型表达和诱导型表达。组成型表达是在细菌的整个生命周期中都表达的方式，这种表达的方式可以用于表达少量的蛋白质、酶或多肽，常见于代谢途径改造过程中的一些节点的酶的表达，但是如果要大量表达目的蛋白则并不适用，因为是整个生命周期都会表达，因为过早的表达可能会遇到三个问题，一是蛋白的大量表达与细胞分裂、生长过程中碳源氮源的利用形成竞争，二是大量蛋白在胞内存在对细胞及细胞膜都可能形成负担，三是如果表达的蛋白具有毒性，则其对细胞的毒害作用可能会使得表达过程提前终止。诱导表达则是需要通过人为的诱导控制细胞内蛋白的表达。诱导控制表达可以是控制表达的时间及表达的强度。目前常见的诱导表达体系使用的启动子有lac、lacUV⁵、tac、trc、tet、ara等，对应的诱导剂有IPTG、四环素、阿拉伯糖等。如利用lac或trc启动子在大肠杆菌中表达来源于荚膜红细菌的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶(刘欣毅，张惠展，袁勤生(2007)."荚膜红细菌十聚异戊二烯焦磷酸合成酶异源表达及纯化的研究."中国药学杂志42(1):13-16.)。如利用阿拉伯糖启动子在大肠杆菌中分泌表达精氨酸脱亚胺酶(李娜，倪晔，孙志浩(2012)."精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的分泌型表达."工业微生物42(1):1-6.)。但是在上述诱导表达体系中，存在的问题是表达强度均不够强，其中tet和ara属于弱启动子，仅能表达少量的蛋白、酶或多肽，而lac、lacUV⁵、tac、trc启动子属于中等强度启动子，其如果需要表达大量的酶、蛋白或多肽，则需要加入较多的诱导剂，使得诱导表达过程中的成本增加。为了减少诱导剂的使用成本，novagen开发了一套新的原核的二级诱导表达系统(pET系统)，他们在该系统中引入了强启动子T7，并用诱导型启动子lacUV⁵控制表达T7启动子的调控蛋白T7RNA聚合酶，并将lacUV⁵-T7RNA聚合酶片段整合到大肠杆菌BL21基因组上，构成第一级调控，而将要表达的外源蛋白的基因放在独立于基因组的质粒上的T7启动子之后，构成第二级调控，在该质粒上还存在有抑制lacUV⁵泄漏表达的lacI^Q蛋白基因。该系统已经在很多的蛋白表达案例中成功应用，但是其仍存在一定的问题。如使用的诱导剂IPTG价格昂贵，虽然pET系统将表达量放大减少IPTG的使用，但是对于生产更大量的酶、蛋白或多肽的表达，IPTG的使用还是非常可观的。

为了避免使用IPTG作为诱导剂，阿拉伯糖及阿拉伯糖启动子可以是一种理想的替代组合。McKinney等设计了一套基于阿拉伯糖启动子的二级调控方式，他们将T7RNA聚合酶基因放置在阿拉伯糖启动子控制之下形成一级调控操纵子，并将该一级调控操纵子整合到基因组上，然后将目标基因克隆到T7启动子之下，形成二级调控操纵子，该二级调控操纵子以质粒的形式游离在基因组外，他们将该设计成功地在伤寒沙门氏菌中得以实现(Mckinney,J.,C.Guerrier-Takada,J.Galán and S.Altman(2002)."Tightly regulatedgene expression system in Salmonella enterica serovar Typhimurium."JournalofBacteriology 184(21):6056-6059.)。他们开发这套系统的目的是为了更严谨地控制对细胞具有毒性的外源蛋白的表达，而对于表达量未做过多的要求。这种方案中使用的阿拉伯糖启动子的强度低于novagen公司使用的lacUV⁵启动子，所以虽然诱导剂单价相对便宜，但是如果要表达大量蛋白，因为T7RNA聚合酶基因的拷贝数只有1个，使用的诱导剂的成本并不会比novagen的系统的低。

T7启动子强度太大，在目前商业化的质粒中，为了保证绝大多数外源蛋白能够表达且不影响宿主的正常繁殖，往往以损失一些表达量为代价，将T7RNA聚合酶基因整合在宿主的基因组上，使得表达成本仍旧维持在较高水平。此外，目前的这种做法，使得需要表达外源蛋白时，宿主细胞的种类会受到限制。因为在实际生产中，可能会遇到一些尚未整合T7RNA聚合酶基因的宿主细胞，并且由于基因整合技术的限制，并不能够使得T7RNA聚合酶基因成功地整合到基因组中。

申请公布号CN 103276005 A，申请公布日2013.09.04的中国发明专利申请公开了一种基于T7表达系统的重组质粒，该发明公开了属于基因工程技术领域的一种基于T7表达系统的重组质粒，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。本发明采用反义RNA技术，将T7RNA聚合酶基因和T7启动子基因拼接到一个基因片段中，使得T7表达系统能在同一个质粒上实现其高效表达的功能，使T7表达系统能够不依赖于DE3溶源化菌株。该T7表达系统片段，可以跟不同的质粒载体组合，构建适用于不同宿主的基于T7表达系统的质粒，其T7表达系统不依赖于特殊菌株，只需要该菌株能正常启动表达T7RNA的启动子，因此能方便地将T7表达系统应用于不同的菌种、菌株，甚至在植物或者动物细胞中表达目的基因，极大的扩大了T7表达系统的应用范围。但是，该发明极大地限制了目的基因表达量。

上述系统对于表达对细胞有毒害作用、不易折叠的蛋白特别适宜，但是对于表达那些毒害作用小又容易折叠的蛋白、酶或多肽，则可以使用更加廉价的表达系统。本发明要解决的技术问题在于开发一套使用更少成本的诱导剂产出更加多量的蛋白、酶或多肽。

发明内容

本发明的第一方面目的在于提供一种重组表达质粒，以降低目前的诱导型重组表达的诱导剂成本。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的目的。

一种重组表达质粒，包括：

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；

还包括：

T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的糖诱导的严谨型启动子。

优选地，所述糖诱导的严谨型启动子为阿拉伯糖启动子、鼠李糖启动子或木糖启动子，所述重组表达质粒还包括转录调控蛋白基因及控制所述转录调控蛋白基因表达的启动子。

更优选地，所述糖诱导的严谨型启动子为阿拉伯糖启动子，所述重组表达质粒还包括araC基因或其突变体，及控制所述araC基因或其突变体表达的启动子。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述质粒拷贝数在细胞内为5-50，优选5-20,，因此所述重组表达质粒的复制子选自pSC101、ColE1、p15A、pMB1及这些复制子中等拷贝数(所述中等拷贝数为5-20个)的衍生复制子中的一种。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述重组表达质粒还包括标记基因及控制所述标记基因表达的启动子；又进一步，所述标记基因是抗性筛选标记基因，如原核抗性筛选标记基因；更进一步，所述抗性筛选标记基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因或四环素抗性基因中的一种或多种。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述控制所述araC基因或其突变体表达的启动子是来源于pKD46(GenBank:AY048746.1)或大肠杆菌(Escherichia coli)基因组的阿拉伯糖操纵子的Pc启动子。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述T7RNA聚合酶基因是来源于大肠杆菌BL21(DE3)的基因组的T7RNA聚合酶基因、大肠杆菌JM109(DE3)的基因组的T7RNA聚合酶基因、噬菌体基因组的T7RNA聚合酶基因或者全基因合成的方法获得的T7RNA聚合酶基因；所述的控制所述T7RNA聚合酶基因表达的阿拉伯糖启动子是来源于pKD46或大肠杆菌基因组的阿拉伯糖操纵子的PBAD启动子。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；又进一步，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步，所述裂合酶是脱羧酶，又更进一步，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括/是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

本发明的第二方面目的在于提出一种转化子，以降低诱导型重组表达的诱导剂成本。

一种转化子，所述转化子的重组表达质粒是如上文任一项技术方案所述的重组表达质粒。

或者，所述转化子包括：

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；

T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的糖诱导的严谨型启动子；

优选地，所述糖诱导的严谨型启动子为阿拉伯糖启动子、鼠李糖启动子或木糖启动子，所述重组表达质粒还包括转录调控蛋白基因及控制所述转录调控蛋白基因表达的启动子；

更优选地，所述糖诱导的严谨型启动子为阿拉伯糖启动子，所述转化子还包括araC基因或其突变体，及控制所述araC基因或其突变体表达的启动子；

所述目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子、所述T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的糖诱导的严谨型启动子、所述转录调控蛋白基因及控制所述转录调控蛋白基因表达的启动子分别位于两个或三个可共存的重组表达质粒上。

进一步，所述目的基因是是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸，优选地，是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

在上述任一技术方案基础上进一步，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或大肠杆菌；进一步，所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

本发明的第三方面目的是提出一种发酵生产多肽的方法，以降低诱导型发酵生产多肽的方法的诱导剂成本。

一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到多肽。

进一步，所述发酵生产多肽的方法是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如上文任一项技术方案所述的转化子(所述目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸)；

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明的第四方面目的是提出一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，以降低诱导型发酵生产1,5-戊二胺的方法的诱导剂成本。

一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

I)按上述发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法的步骤1)生产赖氨酸脱羧酶；

II)用步骤I中得到的菌液或菌体，或用来自所述菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。

本发明提供一种基于质粒的二级诱导表达系统，本发明是一种基于质粒的二级诱导表达系统，该系统是将一个构建好的质粒转化到宿主细胞中后，在培养基中培养一定时间后加入诱导剂，从而表达出目的蛋白的系统。因为本发明将T7启动子和T7RNA聚合酶基因都整合在表达质粒上，提高了T7RNA聚合酶基因的拷贝数，并且使用糖诱导的严谨型启动子如阿拉伯糖启动子控制T7RNA聚合酶基因的表达，所以可以在较少及比IPTG廉价的糖如阿拉伯糖使用的前提下表达出更多的目的蛋白，降低了成本(目前市价，阿拉伯糖人民币125元/公斤，木糖人民币18元/公斤，鼠李糖人民币250元/公斤，IPTG人民币200元/5g)，又进一步通过复制子控制拷贝数，防止因过量表达导致蛋白折叠受限或宿主生长受抑制。本发明涉及的表达系统还具有不受宿主限制的特点，可以在多种宿主细胞如大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌等常见的原核细胞中表达，使用方便。而在现有的基于T7启动子的表达系统中，首先需要将T7RNA聚合酶整合到染色体上，这对染色体整合难度大的宿主来说，将会受到很大的限制。

附图说明

图1是对比例1中质粒p7A的质粒谱图；

图2是对比例4中质粒paA的质粒谱图；

图3是实施例1中质粒paraT7CA的质粒谱图。

具体实施方式

下面结合附图，详细说明本发明。

本发明的第一方面提出了一种重组表达质粒，包括：

复制子，本发明中所述质粒拷贝数在细胞内为5-20，因此所述复制子选自pSC101、ColE1、p15A、pMB1及这些复制子中等拷贝数(所述中等拷贝数为5-20个)的衍生复制子中的一种；对于质粒的骨架的类型不受限制，例如骨架可以来源于pBR322及其衍生质粒、pUC与pGEM系列质粒、pACY及其衍生质粒、pSC101及其衍生质粒、Co1E1；复制子pMB1在一些骨架(如来源于pUC与pGEM系列质粒的骨架)中拷贝数高于20，可以通过在骨架上增加该复制子的抑制蛋白基因将拷贝数控制在5-20。

现有技术披露的常用质粒载体的复制子与拷贝数如下：

标记基因及控制所述标记基因表达的启动子；所述标记基因是抗性筛选标记基因，如原核抗性筛选标记基因；所述抗性筛选标记基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因和四环素抗性基因中的一种或多种；

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述多肽包括酶或多肽类药物；又进一步，所述的酶包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物包括激素、抗体和生长因子中的至少一种；更进一步，所述裂合酶包括脱羧酶，又更进一步，所述脱羧酶包括氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。优选地，编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段；

araC基因或其突变体及控制所述araC基因或其突变体表达的启动子(araC基因突变体在现有技术中已经有披露，如曾伟强，Ron,G,W(1998)."大肠杆菌araC突变基因的分子克隆及DNA序列分析."微生物学报28(1):34-39.)；所述控制araC基因或其突变体表达的启动子是来源于pKD46或大肠杆菌基因组的阿拉伯糖操纵子的Pc启动子；

T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的阿拉伯糖启动子。所述T7RNA聚合酶基因是来源于大肠杆菌BL21(DE3)的基因组的T7RNA聚合酶基因；控制所述T7RNA聚合酶基因表达的阿拉伯糖启动子是来源于pKD46或大肠杆菌基因组的阿拉伯糖操纵子的PBAD启动子。

当然，所述阿拉伯糖启动子可以用鼠李糖启动子代理，相应地，所述araC基因或其突变体及控制所述araC基因或其突变体表达的启动子可以用鼠李糖启动子的转录调控蛋白RhaS、RhaR的基因或其突变体及控制所述鼠李糖启动子的转录调控蛋白RhaS、RhaR的基因或其突变体的启动子代替。

所述阿拉伯糖启动子还可以用木糖启动子代替，相应地，所述araC基因或其突变体及控制所述araC基因或其突变体表达的启动子可以用木糖启动子的转录调控蛋白Xy1R的基因或其突变体及控制所述木糖启动子的转录调控蛋白Xy1R的基因或其突变体的启动子代替。

本发明的第二方面提出了一种转化子，所述转化子的重组表达质粒是如上文任一项技术方案所述的重组表达质粒。所述目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸，包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌或大肠杆菌；所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

或者，所述转化子包括：

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；

所述目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子、所述T7RNA聚合酶基因及控制所述T7RNA聚合酶基因表达的糖诱导的严谨型启动子、所述转录调控蛋白基因及控制所述转录调控蛋白基因表达的启动子分别位于两个或三个可共存的重组表达质粒上。所述目的基因是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸，包括cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌或大肠杆菌；所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

本发明的第三方面提出了一种发酵生产多肽的方法，包括以下步骤：

A)培养如上文任一项技术方案所述的转化子；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到多肽。

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

本发明的第四方面提出了一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括以下步骤：

II)用步骤I)中得到的菌液或菌体，或用来自所述菌液、菌体中的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺。

以下实施例中提到的PCR扩增、纯化、质粒提取、酶切、酶切产物连接的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行，其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN。

以下实施例中提到的质粒转化方法如下：将10ul的连接产物或2μl的质粒加入至100ul的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB培养基。涂布至相对应的抗性平板上。

对比例1基于T7启动子的表达质粒(p7A)在大肠杆菌BL21(DE3)(购自北京天恩泽基因科技有限公司，以下各菌种、菌株同，另有说明的除外)中的使用

以大肠杆菌MG K1665的基因组为模板，引物对3-1F(序列如SEQ ID NO：1所示)和3-1R(序列如SEQ ID NO：2所示)扩增出CadA基因，将PCR产物纯化后用NdeI和HindIII酶切回收，用同样的酶酶切质粒pET30a(购自北京天恩泽基因科技有限公司)并回收，将PCR和质粒酶切回收片段连接，产生的质粒名为pCA。以质粒pBR322(购自北京天恩泽基因科技有限公司)为模板，引物对3-2F(序列如SEQ ID NO：3所示)和3-2R(序列如SEQ ID NO：4所示)扩增质粒上对应的序列，PCR产物使用KpnI和HindIII酶切；以质粒pCA为模板，引物对3-6F(序列如SEQ ID NO：5所示)和3-6R(序列如SEQ ID NO：6所示)扩增出质粒上包含的T7启动子(pET30上有T7启动子)和CadA片段的序列，并用KpnI和HindIII酶切，酶切产物与上述pBR322的3-2F&R扩增产物酶切后回收产物连接。得到质粒p7A(序列如SEQ ID NO：7所示)，参见图1。

将质粒p7A转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL7A(DE3)。

BL7A(DE3)单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床(购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B，下同)中培养过夜(约16h，下同)，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入IPTG到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

IPTG浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	15.5±7.8	28.1±6.2	65.8±3.1

本对比例中重要参数的具体的检测方法如下(下文的对比例、实施例同)：

赖氨酸转化率的测定：取600ul的诱导后菌液与400ul的质量浓度为40％的赖氨酸盐酸盐及5ul的0.1M的磷酸吡哆醛混匀。在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中反应2h。反应结束后12000rpm离心3min(常温离心机，品牌及型号Beckman coulter microfuge16centrifuge)收集反应液上清。上清通过核磁共振分析(Bruker 400MHZ)分别测定反应液中残留的赖氨酸以及产生的戊二胺，通过计算戊二胺的摩尔量除以赖氨酸和戊二胺的总摩尔量即得发酵液对赖氨酸的转化率。

OD₆₀₀测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm下吸收光(ABS)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在UV-8000紫外可见分光光度计中测试600nm下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的OD₆₀₀。

对比例2基于T7启动子的表达质粒(p7A)在大肠杆菌DH5a中的使用

将质粒p7A转化到大肠杆菌DH5a中，得到重组菌株DH7A。DH7A单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入IPTG到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

IPTG浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	2.5±1.8	1.1±0.8	0.8±0.4

对比例3基于T7启动子的表达质粒(p7A)在蜂房哈夫尼菌(蜂房哈夫尼菌CGMCC1.1009，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，下同)中的使用

将质粒p7A转化到蜂房哈夫尼菌中，得到重组菌株Ha7A。Ha7A单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入IPTG到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

IPTG浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	1.5±0.8	0±0	0.7±0.6

对比例4基于阿拉伯糖启动子的一级调控表达质粒(paA)在大肠杆菌DH5a中的使用

以大肠杆菌MG K1665的基因组为模板，引物对3-7F(序列如SEQ ID NO：8所示)和3-7R(序列如SEQ ID NO：9所示)扩增出CadA基因，将PCR产物纯化后用NcoI和SacI酶切回收，用同样的酶酶切质粒pKD46(购自北京天恩泽基因科技有限公司，下同)并回收，将PCR和质粒酶切回收片段连接，产生的质粒名为pKDCA。以质粒pBR322为模板，引物对3-2F(序列如SEQ ID NO：10所示)和3-2R(序列如SEQ ID NO：11所示)扩增质粒上对应的序列，PCR产物使用KpnI和HindIII酶切；以质粒pKDCA为模板，引物对3-3F(序列如SEQ ID NO：12所示)和3-3R(序列如SEQ ID NO：13所示)扩增出质粒模板上的araC基因到ParaB启动子区域片段，并用KpnI和HindIII酶切，酶切产物与pBR322PCR的酶切产物连接，得到质粒paA(序列如SEQID NO：14所示)，参见图2。

将质粒paA转化到大肠杆菌DH5a中，得到重组菌株DHaA。DHaA单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入阿拉伯糖到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

阿拉伯糖浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	10.5±1.1	18.7±0.9	25.9±5.6

对比例5基于阿拉伯糖启动子的一级调控表达质粒(paA)在蜂房哈夫尼菌中的使用

将质粒paA转化到蜂房哈夫尼菌中，得到重组菌株HaaA。HaaA单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入阿拉伯糖到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

阿拉伯糖浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	15.3±2.5	24.6±1.3	43.7±5.6

实施例1

1.1载体构建

以质粒pBR322(复制子pMB1)为模板，引物对3-2F(序列如SEQ ID NO：15所示)和3-2R(序列如SEQ ID NO：16所示)扩增质粒上对应的序列，PCR产物使用KpnI和HindIII酶切；以质粒pKD46为模板，引物对3-3F(序列如SEQ ID NO：17所示)和3-3R(序列如SEQ ID NO：18所示)扩增出质粒模板上的araC基因到ParaB启动子区域片段，并用KpnI和HindIII酶切，酶切产物与pBR322PCR的酶切产物连接，得到质粒pBR3-1。

以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，引物对3-4F(序列如SEQ ID NO：19所示)和3-4R(序列如SEQ ID NO：20所示)扩增T7RNA聚合酶，PCR产物用HindIII和SalI酶切回收，用同样的酶对质粒pBR3-1,酶切并回收，将酶切产物连接，得到质粒pBR3-2。

以质粒pCA为模板，引物对3-5F(序列如SEQ ID NO：21所示)和3-5R(序列如SEQ IDNO：22所示)扩增出质粒上包含T7启动子和CadA片段的序列，并用SalI和SpeI酶切，将质粒pBR3-2用同样的酶酶切后回收，连接两个回收片段。得到质粒paraT7CA序列如SEQ ID NO：23所示)，参见图3。

1.2质粒paraT7CA在大肠杆菌DH5a中的使用情况

将质粒paraT7CA转化到大肠杆菌DH5a中，得到重组菌株DHa7A。DHa7A单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入阿拉伯糖到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

阿拉伯糖浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	85.5±2.8	97.1±2.2	99.8±0.1

1.3质粒paraT7CA在大肠杆菌BL21中的使用情况

将质粒paraT7CA转化到大肠杆菌BL21中，得到重组菌株BLa7A。BLa7A单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入阿拉伯糖到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

阿拉伯糖浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	92.2±3.5	96.5±1.5	99.1±0.8

1.4质粒paraT7CA在蜂房哈夫尼菌中的使用情况

将质粒paraT7CA转化到蜂房哈夫尼菌中，得到重组菌株Haa7A。Haa7A单克隆接种到5ml的LB试管中，加入氨苄霉素至终浓度为100mg/L。在37℃，220rpm的摇床中培养过夜，次日早晨以2v/v％的接种量转接到3根新的含有100mg/L的氨苄霉素的LB试管中。转接后的试管在37℃，220rpm的摇床中培养，到菌液OD₆₀₀＝0.6的时候，加入阿拉伯糖到终浓度分别为0.005,0.01和0.1mM，开始诱导。诱导表达5h后收集菌液并使用该菌液转化赖氨酸。

阿拉伯糖浓度	0.005	0.01	0.05
				转化率(％)	78.6±6.9	98.3±1.6	99.4±0.5

从上面的对比例和实施例可以看出，分别基于T7启动子和阿拉伯糖启动子的一级调控表达质粒建立的表达系统，在低浓度的诱导剂使用的情况下，细胞表达的目的蛋白(对比例中的CadA)较低，对应的菌液对赖氨酸的转化率也较低。虽然使用较高浓度的诱导剂(对比例1、对比例4和对比例5中诱导剂浓度为0.05mM时)后，蛋白表达增加，菌液对赖氨酸的转化率也增加了，但是其转化率仍然没有二级调控表达系统中低浓度诱导剂诱导的菌液对赖氨酸的转化率高。而且在基于T7启动子控制的一级调控表达质粒中，表达系统的适应性较低，只能适用于含有DE3溶原片段或T7RNA聚合酶基因的宿主中，将p7A转化到大肠杆菌DH5a(对比例2)或蜂房哈夫尼菌(对比例3)中就无法实现目的基因的表达。虽然基于阿拉伯启动子的一级表达质粒paA可以在不同宿主(对比例4大肠杆菌DH5a和对比例5蜂房哈夫尼菌)中表达目的蛋白，但是表达强度相对于基于T7启动子的表达系统的表达强度较弱，对应的诱导后的菌液对赖氨酸的转化率也相对较少。要克服这个问题，方法之一是通过增加诱导剂的浓度，但是增加诱导剂的浓度就势必会增加蛋白表达的生产成本。

而本发明中设计的二级诱导调控表达质粒，则可以很好地在不同的宿主中进行表达目的蛋白，这使得需要在一株新型的或缺乏基因组操作工具的菌株中大量表达目的蛋白成为可能，或者是极大地方便了目的蛋白在这类宿主中地表达。另外，通过二级放大，本发明使用的质粒可以有效的降低诱导剂的使用，使得在极低或较低浓度的诱导剂使用的情况下，表达大量的目的蛋白。极大地节约了目的蛋白大量生产的成本。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> 一种基于T7启动子的重组表达质粒、转化子及其应用

<130> PA16010

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-1F

<400> 1

ggaattccat atgatgaacg ttattgcaat at 32

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3-1R

<400> 2

cccaagcttc cttgtacgag ctaattat 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-2F

<400> 3

cggggtaccg gggttgcctt actggtta 28

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-2R

<400> 4

cccaagcttg tcgacactag tcattcaaat atgtatccgc tca 43

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-6F

<400> 5

ggggtaccca ttaggaagca gcccagtag 29

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-6R

<400> 6

gcaagcttct caagacccgt ttagaggc 28

<210> 7

<211> 5419

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid p7A

<220>

<221> RBS

<222> (408)..(412)

<223> Shine-Dalgarno sequence

<220>

<221> CDS

<222> (418)..(609)

<223> ROP

<220>

<221> misc_feature

<222> (514)..(670)

<223> H-strand Y effector site

<220>

<221> misc_feature

<222> (854)..(917)

<223> L-strand Y effector site

<220>

<221> rep_origin

<222> (1038)..(1038)

<223> ORI

<220>

<221> CDS

<222> (1796)..(2659)

<223> AP(R)

<220>

<221> RBS

<222> (2664)..(2668)

<223> Shine-Dalgarno sequence

<220>

<221> promoter

<222> (2691)..(2697)

<223> promoter P3

<220>

<221> terminator

<222> (2748)..(2776)

<223> T7\terminator

<220>

<221> protein_bind

<222> (2844)..(2861)

<223> His\tag

<220>

<221> CDS

<222> (2898)..(5045)

<223> CadA

<220>

<221> protein_bind

<222> (5093)..(5117)

<220>

<221> promoter

<222> (5120)..(5136)

<223> T7\promoter

<400> 7

cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 60

tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 120

tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 180

gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 240

tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 300

caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 360

cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg 420

accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 480

cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 540

cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 600

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 660

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 720

acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 780

ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 840

accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 900

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 960

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 1020

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 1080

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 1140

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 1200

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 1260

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 1320

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 1380

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 1440

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 1500

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 1560

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 1620

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 1680

gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 1740

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 1800

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 1860

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 1920

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 1980

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 2040

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2100

ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2160

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2220

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 2280

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 2340

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 2400

gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 2460

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 2520

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 2580

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 2640

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2700

gtctcatgag cggatacata ttctagtgtc gacaagcttc tcaagacccg tttagaggcc 2760

ccaaggggtt atgctagtta ttgctcagcg gtggcagcag ccaactcagc ttcctttcgg 2820

gctttgttag cagccggatc tcagtggtgg tggtggtggt gctcgagtgc ggccgcaagc 2880

ttccttgtac gagctaatta ttttttgctt tcttctttca ataccttaac ggtatagcgg 2940

ccatcagcct gacggtatgc accgtgaata tcggtttcaa agcccggata gtgagcgccg 3000

atttcacaca gcatctgcag gaactccaga accggacggc tttcttcggt gatcatttca 3060

cccggcatta ccagaggaac tcccggcggg tacggaagga tcatattggc gttaatacga 3120

cctaccattt cgtcgaggta aacttcttcg gtcataccgt gcagctcttt ctggaatgca 3180

gcatacggag tcattaccat cgtcggcagc acttcaaatg cgcgatacat cagatccggc 3240

agattgtggt gaacaatcag tttgtggata ttctgagcca gttcctgaat acgcatgttt 3300

tcatagaatt caggatcttc acgatacaga gacggcagca tgtttttcac acgcaggttc 3360

aggtcgaacg cacgtttaaa gtcagtcaga gcacgcagca ggctcagtgc tttggtctta 3420

tcgataccga tgctgaacag gaacagcagg ttatacggac cggttttctc aacaacgatg 3480

ccatgttcgt cgaggtattt cgccacgatg ctggccggaa taccaaagtc gctcatggtg 3540

ccgtcttttt ccatccccgg agtcagcagg gtgactttga tcgggtcaag atacatgtgc 3600

tcgttatcga tgtttttgaa gccgtgccag gtgctgtcag aacgcagcgg ccagcattca 3660

gtcgtatcga tatgatccgg ctgccataca tcaaagaacc agccatcaga ttccgttctc 3720

agacgtttga tctctttacg gaatttgatc gcacgttcaa tagaaccgtt gatcagacgc 3780

ttacctgcat tgcctttcat catcgccgca gcggtttcag tggacgccac gataccgtag 3840

tgcggagaag tggtggtgtg catcatgtag gcttcgttaa aggtttcttc gtttacgtca 3900

cctttaacgt ggatcatgga agcctgagag aacgccgcca gcagtttgtg agtggactgg 3960

gtttcgtaaa tcactttccc ttctacacgg ccaccgctca taccgcattt accttcgtaa 4020

atcggtgaga agttggtgta aggcacccac gcggagtcaa agtggatgga tttcacatcc 4080

agtgttttct tgatgaagtc ggtgttgtac agcagaccat cataggtaga gttggtaatt 4140

acagcatgta ccggccaggt tgcgtttggt gtttctttca cgcgcttagc aatggtagcg 4200

tgctggaatt cactctgtgg gataccacca agaataccgt aagcgttacg ggtcgggcgg 4260

aaatagattg gcgtaacatc gctcatcatc atcaggtggg tcagcgattt gtggcagtta 4320

cggtcaatca gaatggtgct gcctgctgga gcagagtaca taccaacaat tttgttcgca 4380

gtggaagtac cgttggtcac catgtagctg cggtctgcgt taaagacgcg agcgatatac 4440

tgttctgctt ctttgtgtgg accactgtga tccagcagag aacccagttc agatactgaa 4500

atggaaatat cagatttcat ggtattcgga ccaaagaaat catagaacag gctacctacc 4560

gggcttttct ggaatgcagt accgcccatg tgaccaggag tacagaaagt atatttacct 4620

tcacgaacat atttaaacag tgctttagtc agcggaggca gaatagtgtt gatatattcg 4680

tcagtggtct gcttgatctt attagcaata tcttcagcag cacccagcgc atattcaaag 4740

aagctaatct gtaaacgcag gtcattcagg cttacatcga gagtggaata cgtattagcg 4800

aacgcgtaca acggcaggtt ctcgttcatt ttgctaattt cttcgcacag ctcgagatta 4860

tatttatccc agtcaaaaat aacgccgcac agacgcgcat tgttttcgat cagttttaat 4920

aagtcgtcac ggtcgttcgg gtaaacaatc tggaagttca gacgttcaag cgcgcgatga 4980

agttcacgga tgggttcttc tttaaaataa acccccatgt gattcaatat tgcaataacg 5040

ttcatcatat gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt 5100

tatccgctca caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatcgatct 5160

cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg 5220

gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 5280

gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 5340

tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg 5400

gctgcttcct aatgggtac 5419

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-7F

<400> 8

ggggagctca tgatgaacgt tattgcaata t 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-7R

<400> 9

cccccatggc cttgtacgag ctaattat 28

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-3F

<400> 10

cggggtaccc cgaaaagtgc cacctgc 27

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-3R

<400> 11

tatccataag ctttagaaca actgttcacc gtta 34

<210> 12

<211> 6206

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid paA

<220>

<221> CDS

<222> (29)..(907)

<223> araC\protein

<220>

<221> misc_feature

<222> (1058)..(1086)

<223> Pc

<220>

<221> misc_feature

<222> (1183)..(1210)

<223> ParaB

<220>

<221> CDS

<222> (1248)..(3395)

<223> CadA

<220>

<221> promoter

<222> (3506)..(3512)

<223> promoter P3

<220>

<221> RBS

<222> (3535)..(3539)

<223> Shine-Dalgarno sequence

<220>

<221> CDS

<222> (3544)..(4407)

<223> E-286

<220>

<221> rep_origin

<222> (5165)..(5165)

<223> ORI

<220>

<221> misc_feature

<222> (5286)..(5349)

<223> L-strand Y effector site

<220>

<221> misc_feature

<222> (5533)..(5689)

<223> H-strand Y effector site

<220>

<221> CDS

<222> (5594)..(5785)

<220>

<221> RBS

<222> (5791)..(5795)

<223> Shine-Dalgarno sequence

<400> 12

cccgaaaagt gccacctgca tcgatttatt atgacaactt gacggctaca tcattcactt 60

tttcttcaca accggcacgg aactcgctcg ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc 120

gcgagaaata gagttgatcg tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc 180

gggtggtgct caaaagcagc ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga 240

cgctaatccc taactgctgg cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat 300

gctgtgcgac gctggcgata tcaaaattgc tgtctgccag gtgatcgctg atgtactgac 360

aagcctcgcg tacccgatta tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc 420

gccgcagtaa caattgctca agcagattta tcgccagcag ctccgaatag cgcccttccc 480

cttgcccggc gttaatgatt tgcccaaaca ggtcgctgaa atgcggctgg tgcgcttcat 540

ccgggcgaaa gaaccccgta ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt 600

aggcgcgcgg acgaaagtaa acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac 660

cgtagtgatg aatctctcct ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt 720

ctcgtccctg atttttcacc accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt 780

tcattcccag cggtcggtcg ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta 840

aacccgccac cagatgggca ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt 900

cagccatact tttcatactc ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca 960

gacattgccg tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc 1020

ttattaaaag cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa 1080

gtgtctataa tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct 1140

atgccatagc atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac 1200

tctctactgt ttctccatac ccgttttttt gggaattcga gctcatgatg aacgttattg 1260

caatattgaa tcacatgggg gtttatttta aagaagaacc catccgtgaa cttcatcgcg 1320

cgcttgaacg tctgaacttc cagattgttt acccgaacga ccgtgacgac ttattaaaac 1380

tgatcgaaaa caatgcgcgt ctgtgcggcg ttatttttga ctgggataaa tataatctcg 1440

agctgtgcga agaaattagc aaaatgaacg agaacctgcc gttgtacgcg ttcgctaata 1500

cgtattccac tctcgatgta agcctgaatg acctgcgttt acagattagc ttctttgaat 1560

atgcgctggg tgctgctgaa gatattgcta ataagatcaa gcagaccact gacgaatata 1620

tcaacactat tctgcctccg ctgactaaag cactgtttaa atatgttcgt gaaggtaaat 1680

atactttctg tactcctggt cacatgggcg gtactgcatt ccagaaaagc ccggtaggta 1740

gcctgttcta tgatttcttt ggtccgaata ccatgaaatc tgatatttcc atttcagtat 1800

ctgaactggg ttctctgctg gatcacagtg gtccacacaa agaagcagaa cagtatatcg 1860

ctcgcgtctt taacgcagac cgcagctaca tggtgaccaa cggtacttcc actgcgaaca 1920

aaattgttgg tatgtactct gctccagcag gcagcaccat tctgattgac cgtaactgcc 1980

acaaatcgct gacccacctg atgatgatga gcgatgttac gccaatctat ttccgcccga 2040

cccgtaacgc ttacggtatt cttggtggta tcccacagag tgaattccag cacgctacca 2100

ttgctaagcg cgtgaaagaa acaccaaacg caacctggcc ggtacatgct gtaattacca 2160

actctaccta tgatggtctg ctgtacaaca ccgacttcat caagaaaaca ctggatgtga 2220

aatccatcca ctttgactcc gcgtgggtgc cttacaccaa cttctcaccg atttacgaag 2280

gtaaatgcgg tatgagcggt ggccgtgtag aagggaaagt gatttacgaa acccagtcca 2340

ctcacaaact gctggcggcg ttctctcagg cttccatgat ccacgttaaa ggtgacgtaa 2400

acgaagaaac ctttaacgaa gcctacatga tgcacaccac cacttctccg cactacggta 2460

tcgtggcgtc cactgaaacc gctgcggcga tgatgaaagg caatgcaggt aagcgtctga 2520

tcaacggttc tattgaacgt gcgatcaaat tccgtaaaga gatcaaacgt ctgagaacgg 2580

aatctgatgg ctggttcttt gatgtatggc agccggatca tatcgatacg actgaatgct 2640

ggccgctgcg ttctgacagc acctggcacg gcttcaaaaa catcgataac gagcacatgt 2700

atcttgaccc gatcaaagtc accctgctga ctccggggat ggaaaaagac ggcaccatga 2760

gcgactttgg tattccggcc agcatcgtgg cgaaatacct cgacgaacat ggcatcgttg 2820

ttgagaaaac cggtccgtat aacctgctgt tcctgttcag catcggtatc gataagacca 2880

aagcactgag cctgctgcgt gctctgactg actttaaacg tgcgttcgac ctgaacctgc 2940

gtgtgaaaaa catgctgccg tctctgtatc gtgaagatcc tgaattctat gaaaacatgc 3000

gtattcagga actggctcag aatatccaca aactgattgt tcaccacaat ctgccggatc 3060

tgatgtatcg cgcatttgaa gtgctgccga cgatggtaat gactccgtat gctgcattcc 3120

agaaagagct gcacggtatg accgaagaag tttacctcga cgaaatggta ggtcgtatta 3180

acgccaatat gatccttccg tacccgccgg gagttcctct ggtaatgccg ggtgaaatga 3240

tcaccgaaga aagccgtccg gttctggagt tcctgcagat gctgtgtgaa atcggcgctc 3300

actatccggg ctttgaaacc gatattcacg gtgcataccg tcaggctgat ggccgctata 3360

ccgttaaggt attgaaagaa gaaagcaaaa aataattagc tcgtacaagg ccatgggtat 3420

ggacagtttt ccctttgata tgtaacggtg aacagttgtt ctaaagcttg tcgacactag 3480

aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 3540

aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 3600

cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 3660

ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 3720

cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 3780

ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 3840

gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 3900

gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 3960

acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 4020

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 4080

acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 4140

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 4200

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 4260

gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 4320

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 4380

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 4440

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 4500

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 4560

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 4620

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 4680

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 4740

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 4800

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 4860

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 4920

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 4980

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 5040

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 5100

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 5160

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 5220

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 5280

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 5340

gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5400

atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc 5460

cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 5520

cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 5580

ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagctgcggt 5640

aaagctcatc agcgtggtcg tgaagcgatt cacagatgtc tgcctgttca tccgcgtcca 5700

gctcgttgag tttctccaga agcgttaatg tctggcttct gataaagcgg gccatgttaa 5760

gggcggtttt ttcctgtttg gtcactgatg cctccgtgta agggggattt ctgttcatgg 5820

gggtaatgat accgatgaaa cgagagagga tgctcacgat acgggttact gatgatgaac 5880

atgcccggtt actggaacgt tgtgagggta aacaactggc ggtatggatg cggcgggacc 5940

agagaaaaat cactcagggt caatgccagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac 6000

agggtagcca gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgctgact 6060

tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt gttgctcagg 6120

tcgcagacgt tttgcagcag cagtcgcttc acgttcgctc gcgtatcggt gattcattct 6180

gctaaccagt aaggcaaccc cggtac 6206

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-4F

<400> 13

cccaagctta tgaacacgat taacatcgct aag 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-4R

<400> 14

acgcgtcgac tgcgcgcacg aaaagcatca ggt 33

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-5F

<400> 15

ggactagtca ttaggaagca gcccagtag 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Primer 3-5R

<400> 16

gcgtcgacct caagacccgt ttagaggc 28

<210> 17

<211> 9395

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Plasmid paraT7CA

<220>

<221> promoter

<222> (284)..(300)

<223> T7\promoter

<220>

<221> protein_bind

<222> (303)..(327)

<220>

<221> CDS

<222> (357)..(2522)

<223> CadA

<220>

<221> protein_bind

<222> (2559)..(2576)

<223> His\tag

<220>

<221> terminator

<222> (2644)..(2676)

<223> T7\terminator

<220>

<221> CDS

<222> (2750)..(5401)

<223> T7\RNA\polymerase

<220>

<221> misc_feature

<222> (5453)..(5480)

<223> ParaB

<220>

<221> misc_feature

<222> (5577)..(5605)

<223> Pc

<220>

<221> CDS

<222> (5756)..(6634)

<223> araC protein

<220>

<221> CDS

<222> (7084)..(7275)

<223> Rop

<220>

<221> rep_origin

<222> (7704)..(7704)

<223> ORI

<220>

<221> CDS

<222> (8462)..(9325)

<223> AP(R), E-286

<220>

<221> promoter

<222> (9357)..(9363)

<223> promoter P3

<400> 17

ctagtcatta ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg 60

aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata 120

cccacgccga aacaagcgct catgagcccg aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg 180

atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg 240

cgtccggcgt agaggatcga gatcgatctc gatcccgcga aattaatacg actcactata 300

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa ttttgtttaa ctttaagaag 360

gagatataca tatgatgaac gttattgcaa tattgaatca catgggggtt tattttaaag 420

aagaacccat ccgtgaactt catcgcgcgc ttgaacgtct gaacttccag attgtttacc 480

cgaacgaccg tgacgactta ttaaaactga tcgaaaacaa tgcgcgtctg tgcggcgtta 540

tttttgactg ggataaatat aatctcgagc tgtgcgaaga aattagcaaa atgaacgaga 600

acctgccgtt gtacgcgttc gctaatacgt attccactct cgatgtaagc ctgaatgacc 660

tgcgtttaca gattagcttc tttgaatatg cgctgggtgc tgctgaagat attgctaata 720

agatcaagca gaccactgac gaatatatca acactattct gcctccgctg actaaagcac 780

tgtttaaata tgttcgtgaa ggtaaatata ctttctgtac tcctggtcac atgggcggta 840

ctgcattcca gaaaagcccg gtaggtagcc tgttctatga tttctttggt ccgaatacca 900

tgaaatctga tatttccatt tcagtatctg aactgggttc tctgctggat cacagtggtc 960

cacacaaaga agcagaacag tatatcgctc gcgtctttaa cgcagaccgc agctacatgg 1020

tgaccaacgg tacttccact gcgaacaaaa ttgttggtat gtactctgct ccagcaggca 1080

gcaccattct gattgaccgt aactgccaca aatcgctgac ccacctgatg atgatgagcg 1140

atgttacgcc aatctatttc cgcccgaccc gtaacgctta cggtattctt ggtggtatcc 1200

cacagagtga attccagcac gctaccattg ctaagcgcgt gaaagaaaca ccaaacgcaa 1260

cctggccggt acatgctgta attaccaact ctacctatga tggtctgctg tacaacaccg 1320

acttcatcaa gaaaacactg gatgtgaaat ccatccactt tgactccgcg tgggtgcctt 1380

acaccaactt ctcaccgatt tacgaaggta aatgcggtat gagcggtggc cgtgtagaag 1440

ggaaagtgat ttacgaaacc cagtccactc acaaactgct ggcggcgttc tctcaggctt 1500

ccatgatcca cgttaaaggt gacgtaaacg aagaaacctt taacgaagcc tacatgatgc 1560

acaccaccac ttctccgcac tacggtatcg tggcgtccac tgaaaccgct gcggcgatga 1620

tgaaaggcaa tgcaggtaag cgtctgatca acggttctat tgaacgtgcg atcaaattcc 1680

gtaaagagat caaacgtctg agaacggaat ctgatggctg gttctttgat gtatggcagc 1740

cggatcatat cgatacgact gaatgctggc cgctgcgttc tgacagcacc tggcacggct 1800

tcaaaaacat cgataacgag cacatgtatc ttgacccgat caaagtcacc ctgctgactc 1860

cggggatgga aaaagacggc accatgagcg actttggtat tccggccagc atcgtggcga 1920

aatacctcga cgaacatggc atcgttgttg agaaaaccgg tccgtataac ctgctgttcc 1980

tgttcagcat cggtatcgat aagaccaaag cactgagcct gctgcgtgct ctgactgact 2040

ttaaacgtgc gttcgacctg aacctgcgtg tgaaaaacat gctgccgtct ctgtatcgtg 2100

aagatcctga attctatgaa aacatgcgta ttcaggaact ggctcagaat atccacaaac 2160

tgattgttca ccacaatctg ccggatctga tgtatcgcgc atttgaagtg ctgccgacga 2220

tggtaatgac tccgtatgct gcattccaga aagagctgca cggtatgacc gaagaagttt 2280

acctcgacga aatggtaggt cgtattaacg ccaatatgat ccttccgtac ccgccgggag 2340

ttcctctggt aatgccgggt gaaatgatca ccgaagaaag ccgtccggtt ctggagttcc 2400

tgcagatgct gtgtgaaatc ggcgctcact atccgggctt tgaaaccgat attcacggtg 2460

cataccgtca ggctgatggc cgctataccg ttaaggtatt gaaagaagaa agcaaaaaat 2520

aattagctcg tacaaggaag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag 2580

atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat 2640

aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gtcgactgcg cgcacgaaaa 2700

gcatcaggtc tttccttcga aggggatccg gagtcgtatt gatttggcgt tacgcgaacg 2760

cgaagtccga ctctaagatg tcacggaggt tcaagttacc tttagccgga agtgctggca 2820

ttttgtccaa ttgagactcg tgcaactggt cagcgaactg gtcgtagaaa tcagccagta 2880

catcacaaga ctcatatgtg tcaaccatag tttcgcgcac tgctttgaac aggttcgcag 2940

cgtcagccgg aatggtaccg aaggagtcgt gaatcagtgc aaaagattcg attccgtact 3000

tctcgtgtgc ccacactaca gtcttacgaa ggtggctacc gtcttggctg tgtacaaagt 3060

taggagcgat accagactcc tgtttgtgtg catcaatctc gctatctttg ttggtgttaa 3120

tggtaggctg taagcggaac tgaccgagga acatcaggtt caagcgcgtc tgaataggct 3180

tcttgtattc ctgccacaca gggaaaccat caggagttac ccaatgcaca gcgcaacgct 3240

tgcgaagaat ctctccagtc ttcttatctt tgacctcagc agccagcagc ttagcagcag 3300

acttaagcca gttcattgct tcaaccgcag ctaccaccgt cacgctcaca gattcccaaa 3360

tcagcttagc catgtatcca gcagcctgat tcggctgagt gaacatcaga cccttgccgg 3420

aatcaatagc tggctgaatg gtatcttcca gcacttgttg acggaagccg aactctttgg 3480

acccgtaagc cagcgtcatg actgaacgct tagtcacact gcgagtaaca ccgtaagcca 3540

gccattgacc agccagtgcc ttagtgccca gcttgacttt ctcagagatt tcaccagtgt 3600

tctcatcggt cacggtaact acttcgttat cggtcccatt gattgcgtct gcttgtagaa 3660

tctcgttgac tttcttagca acaatcccgt agatgtcctg aacggtttca ctaggaagca 3720

agttaaccgc gcgaccacct acctcatctc ggagcatcgc ggagaagtgc tggatgccag 3780

agcaagaccc gtcaaacgcc agcggaaggg agcagttata gctcaggccg tggtgctgta 3840

ccccagcgta ctcaaagcag aacgcaagga agcagaacgg agaatcttgc tcagcccacc 3900

aagtgttctc cagtggagac ttagcgcaag ccatgatgtt ctcgtggttt tcctcaatga 3960

acttgatgcg ctcagggaac ggaaccttat cgacacccgc acagtttgca ccgtggattt 4020

tcagccagta gtaaccttcc ttaccgattg gtttaccttt cgccagcgta agcagtcctt 4080

tggtcatatc gttaccttgc gggttgaaca ttgacacagc gtaaacacga ccgcgccagt 4140

ccatgttgta agggaaccag atggccttat ggttagcaaa cttattggct tgctcaagca 4200

tgaactcaag gctgatacgg cgagacttgc gagccttgtc cttgcggtac acagcagcgg 4260

cagcacgttt ccacgcggtg agagcctcag gattcatgtc gatgtcttcc ggtttcatcg 4320

ggagttcttc acgctcaatc gcagggatgt cctcgaccgg acaatgcttc cacttggtga 4380

ttacgttggc gaccgctagg actttcttgt tgattttcca tgcggtgttt tgcgcaatgt 4440

taatcgcttt gtacacctca ggcatgtaaa cgtcttcgta gcgcatcagt gctttcttac 4500

tgtgagtacg caccagcgcc agaggacgac gaccgttagc ccaatagcca ccaccagtaa 4560

tgccagtcca cggcttagga ggaactacgc aaggttggaa catcggagag atgccagcca 4620

gcgcacctgc acgggttgcg atagcctcag cgtattcagg tgcgagttcg atagtctcag 4680

agtcttgacc tactacgcca gcattttggc ggtgtaagct aaccattccg gttgactcaa 4740

tgagcatctc gatgcagcgt actcctacat gaatagagtc ttccttatgc cacgaagacc 4800

acgcctcgcc accgagtaga cccttagaga gcatgtcagc ctcgacaact tgcataaatg 4860

ctttcttgta gacgtgccct acgcgcttgt tgagttgttc ctcaacgttt ttcttgaagt 4920

gcttagcttc aaggtcacgg atacgaccga agcgagcctc gtcctcaatg gcccgaccga 4980

ttgcgcttgc tacagcctga acggttgtat tgtcagcact ggttaggcaa gccagagtgg 5040

tcttaatggt gatgtacgct acggcttccg gcttgatttc ttgcaggaac tggaaggctg 5100

tcgggcgctt gccgcgctta gctttcactt cctcaaacca gtcgttgatg cgtgcaatca 5160

tcttagggag tagggtagtg atgagaggct tggcggcagc gttatccgca acctcaccag 5220

ctttaagttg acgctcaaac atcttgcgga agcgtgcttc acccatctcg taagactcat 5280

gctcaagggc caactgttcg cgagctaaac gctcaccgta atggtcagcc agagtgttga 5340

acgggatagc agccagttcg atgtcagaga agtcgttctt agcgatgtta atcgtgttca 5400

taagctttaa cctccttaga gctcgaattc ccaaaaaaac gggtatggag aaacagtaga 5460

gagttgcgat aaaaagcgtc aggtaggatc cgctaatctt atggataaaa atgctatggc 5520

atagcaaagt gtgacgccgt gcaaataatc aatgtggact tttctgccgt gattatagac 5580

acttttgtta cgcgtttttg tcatggcttt ggtcccgctt tgttacagaa tgcttttaat 5640

aagcggggtt accggtttgg ttagcgagaa gagccagtaa aagacgcagt gacggcaatg 5700

tctgatgcaa tatggacaat tggtttcttc tctgaatggc gggagtatga aaagtatggc 5760

tgaagcgcaa aatgatcccc tgctgccggg atactcgttt aatgcccatc tggtggcggg 5820

tttaacgccg attgaggcca acggttatct cgattttttt atcgaccgac cgctgggaat 5880

gaaaggttat attctcaatc tcaccattcg cggtcagggg gtggtgaaaa atcagggacg 5940

agaatttgtt tgccgaccgg gtgatatttt gctgttcccg ccaggagaga ttcatcacta 6000

cggtcgtcat ccggaggctc gcgaatggta tcaccagtgg gtttactttc gtccgcgcgc 6060

ctactggcat gaatggctta actggccgtc aatatttgcc aatacggggt tctttcgccc 6120

ggatgaagcg caccagccgc atttcagcga cctgtttggg caaatcatta acgccgggca 6180

aggggaaggg cgctattcgg agctgctggc gataaatctg cttgagcaat tgttactgcg 6240

gcgcatggaa gcgattaacg agtcgctcca tccaccgatg gataatcggg tacgcgaggc 6300

ttgtcagtac atcagcgatc acctggcaga cagcaatttt gatatcgcca gcgtcgcaca 6360

gcatgtttgc ttgtcgccgt cgcgtctgtc acatcttttc cgccagcagt tagggattag 6420

cgtcttaagc tggcgcgagg accaacgtat cagccaggcg aagctgcttt tgagcaccac 6480

ccggatgcct atcgccaccg tcggtcgcaa tgttggtttt gacgatcaac tctatttctc 6540

gcgggtattt aaaaaatgca ccggggccag cccgagcgag ttccgtgccg gttgtgaaga 6600

aaaagtgaat gatgtagccg tcaagttgtc ataataaatc gatgcaggtg gcacttttcg 6660

gggtaccggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 6720

agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 6780

cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 6840

tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 6900

tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 6960

ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 7020

ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa atccccctta cacggaggca 7080

tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc gctttatcag aagccagaca 7140

ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa 7200

tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac 7260

ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat 7320

gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca 7380

gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag 7440

agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga 7500

gaaaataccg catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 7560

ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 7620

caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 7680

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 7740

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 7800

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 7860

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 7920

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 7980

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 8040

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 8100

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 8160

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 8220

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 8280

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 8340

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 8400

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 8460

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 8520

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 8580

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 8640

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 8700

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 8760

acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 8820

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 8880

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 8940

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 9000

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 9060

gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 9120

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 9180

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 9240

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 9300

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 9360

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatga 9395

Claims

1.一种重组表达质粒，包括：

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；

其特征在于，还包括：

2.如权利要求1所述的一种重组表达质粒，其中：所述重组表达质粒的复制子选自pSC101、ColE1、p15A、pMB1及这些复制子中等拷贝数的衍生复制子中的一种；进一步优选地，所述中等拷贝数为5-20个。

3.如权利要求1或2任一项所述的一种重组表达质粒，其中：所述重组表达质粒还包括标记基因及控制所述标记基因表达的启动子；进一步优选地，所述标记基因是抗性筛选标记基因；又进一步优选地，所述抗性筛选标记基因是氨苄霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、链霉素抗性基因和四环素抗性基因中的一种或多种。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种重组表达质粒，其中：所述控制所述araC基因或其突变体表达的启动子是来源于pKD46或大肠杆菌(Escherichia coli)基因组的阿拉伯糖操纵子的Pc启动子。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种重组表达质粒，其中：所述T7RNA聚合酶基因是来源于大肠杆菌BL21(DE3)的基因组的T7RNA聚合酶基因、大肠杆菌JM109(DE3)的基因组的T7RNA聚合酶基因、噬菌体基因组的T7RNA聚合酶基因或者全基因合成的方法获得的T7RNA聚合酶基因；所述的控制所述T7RNA聚合酶基因表达的阿拉伯糖启动子是来源于pKD46或大肠杆菌基因组的阿拉伯糖操纵子的PBAD启动子。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种重组表达质粒，其中：所述目的基因是编码多肽的聚核苷酸；所述的多肽是酶或多肽类药物；进一步优选地，所述的酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶中的至少一种，所述多肽类药物是激素、抗体和生长因子中的至少一种；又进一步优选地，所述裂合酶是脱羧酶，更进一步优选地，所述脱羧酶是氨基酸脱羧酶，又更进一步优选地，所述氨基酸脱羧酶是赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。

7.根据权利要求6所述的一种重组表达质粒，其中，所述目的基因是是编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸；优选地，所述编码赖氨酸脱羧酶的聚核苷酸是cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段。

8.一种转化子，其特征在于，所述转化子的重组表达质粒是如权利要求1-7任一项所述的重组表达质粒；

或者，所述转化子包括：

目的基因及控制所述目的基因表达的T7启动子；

9.如权利要求8所述的转化子，其中，所述转化子的重组表达质粒是如权利要求7任一项技术方案所述的重组表达质粒。

10.如权利要求8或9所述的转化子，所述转化子的宿主菌为蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)或大肠杆菌；进一步，所述蜂房哈夫尼菌是无内源性质粒的蜂房哈夫尼菌或者有内源性质粒的蜂房哈夫尼菌，所述大肠杆菌是无内源性质粒的大肠杆菌或者有内源性质粒的大肠杆菌。

11.一种发酵生产多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)培养权利要求8-10任一项所述的转化子；

B)从步骤A)中得到的菌液或菌体中得到多肽。

12.如权利要求11所述的一种发酵生产多肽的方法，其中，是发酵生产赖氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤：

1)培养如权利要求9-10任一项所述的转化子；

2)从步骤1)中得到的菌液或菌体中得到赖氨酸脱羧酶。

13.一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

I)按照权利要求12步骤1)生产赖氨酸脱羧酶；