CN1504575A - 以左旋阿拉伯糖诱导t7表达系统的控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明的控制方法在于构建一株能以左旋阿拉伯糖来诱导生产T7 RNA聚合酶的重组菌种BL21(BAD)，此菌种的染色体上篏含有以araBAD启动子控制的T7基因1。而这株重组菌种生成的T7 RNA聚合酶可以诱导活化T7启动子，以制造克隆在此启动子下游的目标基因的产物。本发明旨在利用左旋阿拉伯糖为诱导物，并使用二阶段碳源和区段式进料发酵方法，来达到使菌种大量生产重组蛋白质的目的。

Description

以左旋阿拉伯糖诱导T7表达系统的控制方法

技术领域

本发明是关于一种以诱导物控制大肠杆菌中基因表达载体(expressionvector)的方法，更明确的是，本发明是一种以左旋阿拉伯糖诱导T7表达系统的控制方法，此方法以二阶段碳源和区段式进料的批次发酵策略，以达到大量生产重组蛋白质的目的。

背景技术

以生物细胞来生产具有商业价值或医疗用途的重组蛋白质(recombinantproteins)是一项极为重要且具经济前瞻性的生物技术产业。大体而言，可用来作为蛋白质生产的生物细胞包括微生物、昆虫、动物和植物细胞等，其中又以利用微生物细胞来生产重组蛋白质的方法较具经济竞争力，其原因在于，微生物细胞较易大量培养、生长快速和培养所需营养基配方简单且价格低廉。过去数十年来，由于许多的科学研究均以大肠杆菌(Escherichia coli)作为核心主题，学术界因此累积了庞大且详尽的此菌种的生化相关知识，无疑的，发展大肠杆菌以制造重组蛋白质的生产系统相对的也较使用其它生物细胞发展的系统更为成功。

为了利用生物细胞达到有效生产蛋白质的目的，基因表达载体(expression vectors)是一项不可或缺的工具，在大肠杆菌中有许多针对不同需求而发展出来的基因表达载体(Markides，Microbiol.Rev.，60：512-538，1996)，其中最为实验室普遍使用的首推T7表达系统(T7expression system)。T7表达系统包含T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase)和一个能被T7 RNA聚合酶驱动的T7启动子(T7 promoter)。T7 RNA聚合酶是噬菌体(phage)T7基因1(T7 gene 1)的产物，相对于大肠杆菌的RNA聚合酶它对于克隆的基因(cloned gene)具有极为优越的转录(transcription)能力(Colomb and Chamberlin，J.Biol.Chem.，249：2858-2863，1974)，再则它对于T7启动子特具专一性(Tabor andRichardson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1074-1078，1985)，基于T7 RNA聚合酶的专一选择性和优越转录能力，Studier等人(Studier andMoffatt，J.Mol.Biol.189：113-130，1986；Studier et al.，U.S.patent4,952,496，1990)首先据此发展T7表达系统。此系统包含一株重组菌种BL21(DE3)和一个含有T7启动子的基因表达质体，而重组菌种BL21(DE3)的染色体上则含有一个以lacUV5启动子控制的T7基因1。

在T7表达系统中，虽然加入化学物质以诱导生产目标蛋白质的方法极为简单和容易操作，然而加入的化学物质价格昂贵，且会污染发酵母液，不利于生产具医疗功用的蛋白质，而且无法达到均匀诱导每一细胞。

一种已知技术是以化学物质β-D-硫代半乳糖吡呐糖基(IPTG)为诱导物，使菌种可以生产大量的重组蛋白质，然而，一个可作为工业规模生产蛋白质的基因表达质体需具有几项要件：即在发酵规模使用时具有简单且经济的诱导方式、高基因表达能力和稳定性。因此，以IPTG为诱导方式的T7表达系统显然无法达到工业化使用的目的，其原因为(1)IPTG的价格昂贵，(2)IPTG不被细菌细胞代谢，容易造成发酵液的污染而使得发酵产品纯化不易，(3)IPTG具有潜在的毒性，因此不适用在生产医疗用的产品(Figge et al.，Cell，52：713-722，1988)，(4)由于lacUV5启动子的调控性不够严谨而导致菌种BL21(DE3)在非诱导情况下会产生微量的T7 RNA聚合酶造成克隆在质体上以T7启动子控制表达的目标基因产物因而产生，尤其是目标基因产物对于宿主细胞具有潜在毒性时，细胞的生长将会受到抑制，进而使得含目标基因的质体产生不稳定的现象(Studier et al.，Methods in Enzymology，185：60-89，1991)，这些缺点显然限制了T7表达系统的工业实用性。

在另一已知技术Wycuff和Mattews(Anal.Biochem.，277：67-73，2000)，曾发展以araBAD启动子调控T7基因1，进而控制克隆在T7启动子下的目标基因的表达。然而，该已知技术是将受araBAD启动子调控的T7基因1克隆在具pACYC184复制源点(origin)的质体上，所以导致过高未诱导时蛋白质的生成，并不适合用来生产具有潜在毒性的重组蛋白质。

发明内容

本发明在于提供一种能被左旋阿拉伯糖诱导的控制大肠杆菌中的T7表达系统的方法，以便改善T7表达系统并使其具有工业实用性。

本发明的一种诱导T7表达系统的控制方法，包含以下步骤：

构建一株重组菌种，该重组菌种含有一个内含T7启动子和克隆基因的质体，且该重组菌种的染色体上篏含有以araBAD启动子控制的T7基因1和araC控制基因；

培养该重组菌种；在菌种细胞达到所需要的密度后，加入含有左旋阿拉伯糖的诱导物，该重组菌种产生的克隆基因的产物即为重组蛋白质。

所述左旋阿拉伯糖的诱导物可选自富含左旋阿拉伯糖的植物萃取物。

优选采用馈料批次发酵方法培养该重组菌种，在批次发酵阶段，提供的发酵液中含有葡萄糖为碳源，而在进料阶段，提供的进料液中含有甘油和葡萄糖为碳源，使达到高细胞密度发酵。进一步优选进料阶段所使用的进料方式为区段式进料法。利用左旋阿拉伯糖为诱导物，以控制T7表达系统的方法，并配合二阶段碳源和区段式进料发酵策略，可以达到使菌种大量生产重组蛋白质。

优选所述的细胞达到的密度是每升18g干重细胞。

所述的控制方法，优选还包含一种检测方法，该检测方法是以小规模提高该重组菌种数量，加入左旋阿拉伯糖诱导产生一异源蛋白质；该异源蛋白质易形成内涵体和具有潜在毒性。

过去的研究发现，能被左旋阿拉伯糖诱导的araBAD启动子具有严密调控性、迅速被诱导活化和高基因表达能力等特性(Guzman et al.，J.Bacteriol.，177：4121-4130，1995)，因此本发明特别以左旋阿拉伯糖为诱导物应用在控制T7表达系统。

本发明是构建一株能以左旋阿拉伯糖来诱导生产T7 RNA聚合酶的重组菌种BL21(BAD)，此菌种的染色体上篏含有以araBAD启动子控制的T7基因1和araC控制基因(regulatory gene)。基本上，AraC控制蛋白质(regulatoryprotein)与左旋阿拉伯糖结合所形成的复合蛋白质可以驱动活化araBAD启动子，而AraC控制蛋白质本身则具有抑制araBAD启动子的效能，因此重组菌种T7 RNA聚合酶的生产在于左旋阿拉伯糖的存在与否，而克隆在T7启动子下游的目标基因的表达自然为左旋阿拉伯糖所控制。

在本发明的一较佳实施例中，以生产Agrobacterium radiobacter NRRLB11291的氨甲酰酶(carbamoylase)蛋白质为例，未加入左旋阿拉伯糖诱导时，氨甲酰酶在菌种BL21(BAD)中几乎没有生成，然而以300μM左旋阿拉伯糖诱导时，菌种BL21(BAD)即生产高达30％总细胞蛋白质量的氨甲酰酶，这个结果显示本发明使用的系统具有工业发酵生产重组蛋白质的潜能。以高细胞密度馈料批次发酵并施以足量的左旋阿拉伯糖诱导，菌种BL21(BAD)可以生产多出以摇瓶发酵生产所得蛋白质1000倍以上的量。

在整个馈料批次发酵步骤中是应用「二阶段碳源方法」，在初期发酵阶段使用葡萄糖以稳定重组质体，而在进料阶段，则以葡萄糖和甘油混合物来诱导效能和降低成本。此外，为达大量生产重组蛋白质的目的，本发明在进料阶段更进一步发展「区段式进料法」以达高细胞密度发酵。在加入适量的左旋阿拉伯糖或是大豆萃取液诱导，菌种BL21(BAD)可以生产多出以摇瓶规模生产所得蛋白质1000倍以上的量。综合言之，本发明发展的系统具有以下多项优点：

(1)可以左旋阿拉伯糖诱导来生产重组蛋白质，左旋阿拉伯糖的来源可取自植物如大豆萃取液，不但价格较有经济竞争性而且可为细菌代谢分解而不造成发酵液污染。

(2)araBAD启动子极具敏感性，10μM的左旋阿拉伯糖即可诱导重组菌种生产大量的蛋白质。

(3)本发明菌种BL21(BAD)极具稳定性可以维持含氨甲酰酶基因质体100％稳定度达100细胞世代(generations)，相对的菌种BL21(DE3)只可维持相同的质体稳定度仅达20细胞世代。

(4)本发明发展的「区段进料式」发酵策略可将本发明菌种以发酵槽规模培养至高细胞密度，细胞密度达每升37.5g干重细胞。

(5)本发明发展的「二阶段碳源方法」策略可有效维持重组质体的稳定性，以1-2％的大豆萃取液诱导本发明发展的菌种，菌种可产生高出摇瓶规模1000倍的重组蛋白质，由此显示结合本发明发展的发酵方法和本发明所建构的菌种BL21(BAD)可以用来大量生产重组蛋白质，具有工业实用性。

附图说明

图1(a)为显示本发明实施例的曲线图，是说明不同浓度的左旋阿拉伯糖诱导菌种所产生的蛋白质量。

图1(b)为显示本发明实施例的蛋白质电泳分析图。

图2为显示本发明实施例的曲线图，是说明馈料批次发酵的进料阶段以区段式进料法(长条状区域)进行重组菌种BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km的高细胞密度发酵。

具体实施方式

本发明以左旋阿拉伯糖诱导T7表达系统的控制方法，包含以下步骤：

构建一株重组菌种，该重组菌种含有一个内含T7启动子的质体，且该重组菌种的染色体上篏含有以araBAD启动子控制的T7基因1和araC控制基因；

以馈料批次发酵方法培养该重组菌种，在批次发酵阶段，提供的发酵液中含有葡萄糖为碳源，而在进料阶段，提供的进料液中含有甘油和葡萄糖为碳源，使达到高细胞密度发酵；以及

在细胞达到一定高密度后，加入含有左旋阿拉伯糖的诱导物，使该重组菌种产生一重组蛋白质。

本发明的控制方法，进一步地包含：以左旋阿拉伯糖诱导构建出的重组菌种BL21(BAD)，进行异源蛋白质(heterologous protein)摇瓶规模的生产，而在此处选择生产异源蛋白质是作为检测模式。

以下伴随着相关图标并经由图例说明本发明的原理，而详细揭露本发明的其它方面和优点。

(一)、建构重组菌种BL21(BAD)

为了发展以左旋阿拉伯糖来控制T7表达系统，首先将建构一株重组菌种使其染色体上篏含有一个以araBAD启动子调控的T7基因1和araC控制基因。

A.T7基因1的克隆操作

(1)基因克隆使用的菌种和摇瓶培养方式

基因克隆过程中均采用大肠杆菌DH5α(deoR endA1 gyr96 hsdR17supE444 thi Δ(lacIZYA-argF 169)recA1 lacZM15)，液态培养菌种时，首先由固态培养皿中点取数颗菌落至含营养基的摇瓶中，在37℃、每分钟200转条件的水浴旋转培养槽中培养过夜，隔日以百倍稀释的体积取出菌液并接种至含新鲜营养基的摇瓶中，依相同培养条件继续培养。营养基质的成分视需求而定，在本例中采用Luria-Bertani(LB)营养基下培养。而抗生素也视需要而决定是否加入培养基中，在本例中则加入抗生素安培西林(ampicillin)，使用量为0.1mg/mL。

(2)T7基因1的克隆

根据T7基因1的发表序列(Grachev and Pletnev，Bioorg.Chem.，10：824-843，1984)，我们设计一组涵盖T7基因1编码区(coding region)但排除启动子区域的寡核苷酸，其序列如下-CGGAATTCCCAACCGCGTGGCACAAC和CCGGATCCTCGAGCTAACTCACATTAATTGC，并委由GENSET Singapore Biotech公司合成。相关克隆技术均参照Maniatis et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)一书。以含T7基因1的质体pMR-7wt(Mallet et al.，Gene，199：149-156，1997)为DNA样版(DNA template)，依照一反应条件使用PCR(polymerase chain reaction，聚合酶连锁反应)反应来扩增制造2.7kb的T7基因1DNA产物，其中此反应条件为：50μL反应溶液中包含样板DNA(10ng/mL)、2.5活性单元Pfu聚合酶一对寡核苷酸(oligonucleotide)(0.5μM)和四种核苷酸(200μM)，首先将反应溶液加热至94℃3分钟，随后以底下条件重复28个循环：以94℃加热1分钟、55℃4分钟、72℃1分钟，所有循环结束后再以72℃维持加热10分钟。

随后将PCR产物以核苷酸纯化组(NuceloSpin Nucleic AcidPurification Kit，Clontech Lab.，Inc.)纯化，并利用EcoRI、HindIII限制性酶切割和再纯化，最后使用T4 DNA粘接酶将DNA产物粘接至质体pKF2(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene，137：211-216，1993)中。接着使用EcoRI、HindIII限制性酶把含有T7基因1的DNA片段切下回收，再粘接至质体pBAD18(Guzman et al.，J.Bacteriol.，177：4121-4130，1995)。随后使用ClaI、HindIII限制性酶将含有araC基因和克隆于araBAD启动子下游的T7基因1的DNA片段切割，并粘接至质体pACYC177得到质体pACYC-G1或pACYC184得到质体pACYC-G2。克隆在质体pACYC-G1或pACYC-G2上的T7基因1位于araBAD启动子下游，而接邻在启动子的上游区则含有araC基因。

B.克隆基因片段镶篏入菌种染色体

(1)噬菌体P1因子转移法(P1 transduction)

以内含LB和5mM氯化钙营养基的摇瓶培养基因供给细胞(donor cell)，待细胞生长至OD₅₅₀(波长550nm吸光度)达0.3时，加入浓度约每毫升10⁸个Plvir噬菌体分解颗粒(phage lysate)，继续培养直至细胞完全分解为止，将分解液回收并加入0.1mL的氯仿，以4500g离心10分钟并回收上层液。另一方面，以内含LB营养基的摇瓶过夜培养基因接收细胞(recipientcell)，以15000g离心十分钟回收细胞，随即以2.5mL浓度为10mM的硫酸镁和5mM氯化钙重新溶解回收细胞。取出0.1mL的菌液放入试管中，并加入等量体积的分解液，在37℃下反应30分钟，最后加入0.1mL浓度为1M的柠檬酸钠，由试管中取出0.1mL的混合液洒养在筛选培养基上。

(2)重组菌种构建

为了将克隆基因片段镶篏入菌种染色体中，随即由质体pACYC-G1将含有位于araBAD启动子下游的T7基因1和上游区的araC基因的DNA片段以HindIII、XhoI限制性酶切除并回收，最后插接入质体pBRINT-Cm(Balbas etal.，Gene，172：65-69，1996)所含的lacZ基因当中得到质体pBRINT-G1。接着把质体pBRINT-G1转入以氯化钙处理的菌种JC7623(recBC sbcBC)中，其质体转化程序是采用氯化钙制备感受态细胞(competent cell)法，相关技术主要参照Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)一书。

利用lacZ同源基因重组(homologous recombination)方式将质体上的基因篏入菌种染色体中，转植后的菌种随即洒养在含0.005mg/mL氯霉素(chloramphenicol)和0.004％5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside(X-gal)的洋菜培养基上。其中一个呈现白色的菌落以摇瓶培养作为噬菌体P1因子转移法的基因供给细胞，依据B的第(1)项方法制备分解液并感染基因接收细胞大肠杆菌BL21，经基因转移后的细胞则洒养在含0.005mg/mL氯霉素和0.004％X-gal的洋菜培养基上，选择一株显现白色的细胞再利用PCR方法来检测其染色体上是否含有T7基因1，如此得到的菌种便命名为BL21(BAD)。

(二)、以菌种BL21(BAD)进行摇瓶规模的检测模式

检验重组菌种BL21(BAD)产生异源重组蛋白质的可行性，在此我们选择生产氨甲酰酶为检测模式。生产异源蛋白质(heterologous protein)最大的挑战莫过于该蛋白质易形成内涵体(inclusion body)和具有毒害细胞的特性，而氨甲酰酶来自A.radiobacter是属于异源蛋白质，况且极易形成内涵体和潜在毒性，因此以此蛋白质作为生产模式正足以对本发明构建的系统提供最严苛的检测方式。

A.培养方法与营养基质

与建构重组菌种BL21(BAD)中A项培养方法相同，使用摇瓶来培养菌种。S-M9基质配方包含每升6g磷酸化二钠、3g磷化钾、0.5g氯化钠、1g氯化氨、0.01mM氯化钙、1mM硫化镁、1mg维他命B1和5g酵母萃取物。

B.氨甲酰酶活性分析

氨甲酰酶活性分析主要依据过去已发表的方法(Chao et al.，Biotechnol.Prog.，15：603-607，1999)，而一个单位酶活性(U)定义为每分钟一毫摩尔产物生成，比酶活性单位为U/mg干重细胞，体积酶活性则以测得的比酶活性与获得的细胞浓度之乘积所得，单位为U/mL。

C.蛋白质电泳胶分析

主要依据过去发表的方法(Chao and Liao，J.Biol.Chem.，269：5122-5126，1994)操作，将离心收集到的细胞用法式细胞粉碎机(FrenchPress)打破，以15000g离心5分钟后回收上层液，使用Bradford分析法(Bio-Rad)量测蛋白质浓度，将20mg的蛋白质样本逐一置入电泳胶中。

D.左旋阿拉伯糖诱导生产重组蛋白质的特性

将含有以T7启动子调控氨甲酰酶基因表达的质体pTAHL10(Chao et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54：348-353(2000))和含有以araBAD启动子调控groELS基因表达的质体pAR3-GRO-Km同时转殖到菌种BL21(BAD)中，得到重组菌种BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km。质体pAR3-GRO-Km源自于质体pAR3-GRO(Perez and Gutierrez，Gene，158：141-142，1995)，一个抗卡那霉素的基因片段由质体pKRP11(Reece and Philip，Gene，165：141-142，1995)以EcoRI限制性酶切下回收，随即粘接入质体pAR3-GRO得到质体pAR3-GRO-Km。首先以不同营养基质并使用摇瓶方式培养重组菌，待细胞生长至OD₅₅₀达0.5时，加入300μM左旋阿拉伯糖，随后继续培养细胞至停滞生长时期，以15000g离心10分钟回收细胞并测定酶活性，结果整理在表一。

相对于非诱导菌种而言，以左旋阿拉伯糖诱导的菌种可产生50-100倍可溶性氨甲酰酶。而营养基中含有葡萄糖可有效降低非诱导时蛋白质生成量，但即加入左旋阿拉伯糖却也难以诱导产生大量重组蛋白质，这是由于araBAD启动子会受到底物抑制(substrate inhibition)效应所造成的结果。另一方面，非诱导时生产的蛋白质量在较丰富的营养基如LB中也较高，其中我们发现LB营养基中所含的胰化胨(tryptone)是造成高非诱导时蛋白质生成量的主因。这些结果显示，本发明使用的菌种却可利用左旋阿拉伯糖诱导方式来控制T7表达系统以生产重组蛋白质，且具有严密调控和高蛋白质生产的效能。

表一、不同营养基质对于重组蛋白质生产的效应。

营养基质                  酶比活性(U/mg干重细胞)

                      诱导                       非诱导

LB                    0.202                      0.004

LB+葡萄糖             0.033                      0.003

S-M9+甘油             0.191                      0.002

S-M9+葡萄糖           0.021                      0.001

批注：表中所列的碳源浓度均为0.4％。

由表一可知，本发明使用的菌种可通过左旋阿拉伯糖来诱导生产重组蛋白质，而不同浓度的左旋阿拉伯糖将影响菌种蛋白质生产量。因此，重组菌种BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km以LB为营养基以摇瓶在37℃条件下培养，待细胞生长至OD₅₅₀达0.5时，加入不同浓度的左旋阿拉伯糖，随后继续培养细胞至停滞生长时期，以15000g离心10分钟回收细胞并测定酶活性如图1(a)所示，菌种生成的蛋白质量随着左旋阿拉伯糖的诱导浓度增加而增加，当浓度达300μM时蛋白质产量达到饱和。参考图1(b)的蛋白质电泳分析，其中径1：蛋白质标准物；径2：未经诱导；径3：以10μM左旋阿拉伯糖诱导；径4：以30μM左旋阿拉伯糖诱导；径5：以50μM左旋阿拉伯糖诱导；径6：以100μM左旋阿拉伯糖诱导；径7：以300μM左旋阿拉伯糖诱导；径8：以2000μM左旋阿拉伯糖诱导。左旋阿拉伯糖的诱导以蛋白质电泳分析并辅以影像分析(GAS9000，UVItech，UK)可定量出最大可溶性蛋白质量达到总细胞蛋白质量的30％，而微量的左旋阿拉伯糖如10μM即可诱导菌种生产出相当于10％的总细胞蛋白质。这些结果显示本发明发展的表达系统具有优越的蛋白质生产效能和高敏感的特性。

E.重组菌种质体稳定度测试

重组菌种BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km以内含20mL未含抗生素营养基质的摇瓶在37℃、每分钟200转条件下培养过夜，取出0.2mL菌液接种至另一个含有20mL新鲜基质的摇瓶，依相同条件继续培养至隔日，即完成一个培养循环。在每一培养循环终止时，取出0.1mL样本并注入含1mL的无菌生理食盐水的试管中，如此经过一系列连续稀释后，取出0.1mL样本洒养在洋菜培养基，于30℃下培养16小时后，再挑选100颗菌落分别点划在一个洋菜培养基和另一个含抗生素的洋菜培洋基上，于30℃下培养16小时后，估计每一个培养基生成的菌落数，而质体稳定度即定义成在含有抗生素的洋菜培养基上的菌落数除以在洋菜培养基形成的菌落数。相同培养循环则依需要持续进行到终止，而每一培养循环估计约经过10个细胞世代。同样的，我们将质体pTAHL10和pAR3-GRO-Km同时转染到过去发明所发展的菌种BL21(DE3)中得到重组菌BL21(DE3)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km，并依照上述方式测试菌种BL21(DE3)对于质体的稳定性。

结果如表二显示，在所测试的营养基质中菌种BL21(BAD)可以维持100％的质体稳定度达100细胞世代，而菌种BL21(DE3)在LB营养基下经过50细胞世代只维持50％的质体稳定度，在S-M9营养基下经过50细胞世代只维持68％的质体稳定度，由此可知本发明发展的菌种BL21(BAD)具有极高的质体稳定性。

表二、质体在重组菌种BL21(BAD)和BL21(DE3)中的稳定性

细胞世代        BL21(BAD)                 BL21(DE3)

            LB            S-M9       LB            S-M9

10          100％         100％      100％         100％

30          100％         100％      70％          84％

50          100％         100％      50％          68％

100         96％          100％      20％          35％

批注：S-M9营养基包含0.4％葡萄糖。

(三)、以馈料批次发酵培养BL21(BAD)达到高细胞密度

一个基因表达系统的实用性决定在放大规模时仍具可行性，除此之外，在工业化生产重组蛋白质时，高蛋白质的产量乃是必然的考虑，而其成功的关键则在于重组菌种发酵诱导后能同时获得高细胞密度和高酶比活性。基于此，本发明在馈料批次发酵的进料阶段，首先发展所谓的「区段式进料法」以达高细胞密度培养的目的。

A.区段式进料法

馈料批次发酵法是培养高细胞密度最佳的方法，其基本理论在于利用进料量来控制细胞比生长速率，以使得菌种无法或是降低制造发酵产物如醋酸等。本发明发展的区段式进料法是将进料区分成i个区段(i＝1～n)，每个进料区段以定流速F进料Δt分钟。根据生长率定义可得公式(1)，细胞比生长速率定义得到公式(2)，而公式(1)、(2)可导出公式(3)。公式(3)说明在欲控制的细胞比生长速率和生长率条件下，可以计算出每个区段的进料流量。

Y＝(Vi Xi-Vi-1 Xi-1)/(F Δt S)             (1)

d(Vi Xi)/dt＝μ(Vi Xi)                     (2)

F＝{vi-1 Xi-1[exp(μΔt)-1]}/(YSΔt)       (3)

F：进料流量(mL/min)

S：进料浓度(mg/mL)

Δt：阶段进料时间(min)

m：比生长速率(l/min)

V：发酵槽体积(mL)

Y＝ΔX/ΔS：生长率(mg/mg)

X：细胞浓度(mg/mL)

Vi-1、Vi：第i区段起始体积和最终体积

Xi-1、Xi：第i区段起始细胞浓度和最终细胞浓度

B.高细胞密度培养

采用5L实验室规模的发酵槽(Biostat，B.Braun，Germany)作为放大规模菌种的培养。发酵槽操作的条件设定在37℃、pH6.5-7.0、溶氧度为15％的饱和溶氧度。先期以摇瓶培养300mL的BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km菌种作为接种菌(实例一A项)，而营养基质为S-M9加上0.2％葡萄糖，待细胞培养至OD₅₅₀达1时，将所有菌液接种至含1.5L营养基的发酵槽中，而发酵槽中培养基成分为每升溶液含3.3g磷酸钾、15.3g磷酸化二钾、3.46g氯化氨、0.19g硫酸镁、0.12g硫化铁、0.09g氯化钙、0.03mg维他命B1、5g酵母萃取物和11.5g葡萄糖。当细胞在批次发酵阶段生长进入停滞生长期，0.5L的进料液随即以A项公式(3)决定的流速使用帮浦打入发酵槽中直到进料结束。而进料液的营养基质成分为每升溶液含6g氯化氨、9g硫酸镁、0.146g硫化铁、20g酵母萃取物和300g葡萄糖。如图2所示，在批次发酵结束后随即以区段式方法进料，最后发酵结果可得到总细胞干重达75g。

(四)、以左旋阿拉伯糖诱导高细胞密度的菌种BL21(BAD)生产发酵槽规模的重组蛋白质

本发明的馈料批次发酵是应用「二阶段碳源方式」以达到高细胞密度发酵。在批次发酵阶段采用葡萄糖作为碳源，来稳定重组菌种中的质体，而在区段进料发酵阶段，则改用葡萄糖和甘油混合物为碳源，以期一方面有效以左旋阿拉伯糖诱导araBAD启动子以促进大量重组蛋白质生产，另一方面则考虑降低发酵成本。

A.二阶段碳源方式与区段式进料法进行高细胞密度发酵

采用5L实验室规模的发酵槽(Biostat，B.Braun，Germany)作为放大规模菌种的培养。发酵槽操作的条件设定在37℃、pH6.5-7.0、溶氧度为15％的饱和溶氧度。先期以摇瓶培养300mL的BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km菌种作为接种菌(实例一A项)，而营养基质为S-M9加上0.2％葡萄糖，待细胞培养至OD₅₅₀达1时，将所有菌液接种至含1.5L营养基的发酵槽中，而发酵槽中培养基成分为每升溶液含3.3g磷酸钾、15.3g磷酸化二钾、3.46g氯化氨、0.19g硫酸镁、0.12g硫化铁、0.09g氯化钙、0.03mg维他命B1、5g酵母萃取物和11.5g葡萄糖。当细胞在批次发酵阶段生长进入停滞生长期，1L的进料液随即以公式(3)决定的流速使用帮浦打入发酵槽中直到进料结束。而进料液的营养基质成分为每升溶液含12g氯化氨、14g硫酸镁、0.2g硫化铁、40g酵母萃取物、100g葡萄糖和400g甘油。在整个发酵过程中所使用的培养液均排除使用抗生素。

B.以微量左旋阿拉伯糖诱导大量的重组蛋白质

在上述重组菌种BL21(BAD)/pTAHL10/pAR3-GRO-Km进行馈料批次发酵的进料阶段末期以左旋阿拉伯糖进行诱导。在细胞密度为每升18g干重细胞时，以每升5g左旋阿拉伯糖诱导，另一方面考虑降低发酵成本，左旋阿拉伯糖含量丰富的植物萃取液如大豆萃取液亦被用来作为诱导物。另外由图二的发酵曲线选择适当诱导时机如区段进料后10小时或16小时。结果得到在诱导条件为区段进料后10小时或16小时，以推算的左旋阿拉伯糖为诱导饱和量或是0.1-0.2％的大豆萃取液来诱导，发酵培养的细胞密度可达每升约35g干重细胞，而酶体积活性达2.92U/mL。整个发酵产生的重组蛋白质总计有8760U，这个产量是以摇瓶方式所获得蛋白质量的1000倍。此外，在发酵结束后检测菌种所含质体的稳定度也达100％。这些结果显示，本发明发展的菌种具有高稳定性且可放大生产大量的重组蛋白质，极有工业实用潜力。

根据本发明所实施以左旋阿拉伯糖诱导T7表达系统的控制方法，只需微量的左旋阿拉伯糖或是采用价格低廉的植物萃取液如大豆萃取液即可达到诱导生产大量的重组蛋白质的效能，特具经济效益。此外，为有效利用本发明的菌种以达工业量产重组蛋白质之目的，本发明发展高细胞密度发酵策略，成功到将重组蛋白质以发酵规模大量生产，其产量超出摇瓶规模产量的1000倍。

Claims (7)

1.一种以热诱导T7表达系统的控制方法，包含以下步骤：

构建一株重组菌种，该重组菌种含有一个内含T7启动子和克隆基因的质体，且该重组菌种的染色体上篏含有以araBAD启动子控制的T7基因1和araC控制基因；

培养该重组菌种；在菌种细胞达到所需要的密度后，加入含有左旋阿拉伯糖的诱导物，该重组菌种产生的克隆基因的产物即为重组蛋白质。

2.如权利要求1所述的控制方法，其特征在于左旋阿拉伯糖的诱导物是富含左旋阿拉伯糖的植物萃取物。

3.如权利要求1所述的控制方法，其特征在于采用馈料批次发酵方法培养该重组菌种，在批次发酵阶段，提供的发酵液中含有葡萄糖为碳源，而在进料阶段，提供的进料液中含有甘油和葡萄糖为碳源。

4.如权利要求3所述的控制方法，其特征在于在进料阶段所使用的进料方式为区段式进料法。

5.如权利要求1或3所述的控制方法，其特征在于细胞所达到的密度是每升18g干重细胞。

6.如权利要求1所述的控制方法，其特征在于还包含一种检测方法，该检测方法是以小规模提高该重组菌种数量，加入左旋阿拉伯糖诱导产生一异源蛋白质。

7.如权利要求6所述的控制方法，其特征在于该异源蛋白质易形成内涵体和具有潜在毒性。

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