CN1914330A - 通过大肠杆菌发酵大规模生产质粒dna的方法 - Google Patents

通过大肠杆菌发酵大规模生产质粒dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及增加质粒DNA生产的产量的方法。该方法包括下述步骤：选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的高产克隆亚型，并在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵培养所述克隆亚型。当以工业规模培养所述高产克隆亚型时，本文所述的质粒DNA生产方法可以产生最高记录量的质粒DNA。公开的方法可以用于生产药物级DNA，以用于多核苷酸疫苗接种和基因治疗治疗方案中。

Description

通过大肠杆菌发酵大规模生产质粒DNA的方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求享有2004年2月4日提交的美国临时申请号60/541,894的利益，其在这里引作参考。
发明领域
本发明涉及生产质粒DNA的方法，其包含下述步骤：(a)选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的高产克隆亚型，其中与相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数；和，(b)在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵，培养所述高产克隆亚型。在本发明的一个实施方案中，作为以工业规模培养所述高产克隆亚型的结果，本文所述的质粒DNA生产方法能产生大量的质粒DNA。本发明还涉及选择大肠杆菌菌株的高产克隆亚型的方法，包括但不限于DH5细胞的高产克隆，以用于生产质粒DNA。本文公开的过程和方法可以用于产生药物级质粒DNA，以用于多核苷酸疫苗接种和基因治疗治疗方案中。
发明背景
DNA疫苗是用于诱导针对特定疾病的保护性免疫的创新方法，其包括将质粒DNA靶向送递给细胞(Montgomery，D.L.等，1993，Cell Biol.169：244-247；Ulmer，J.B.等，1993，Science 259：1745-1749)。DNA疫苗能生产中和抗体，以及诱导更优选的细胞-介导的免疫(“CMI”)反应。一般，如下所述产生DNA疫苗：首先向质粒中插入能编码目标抗原的基因，所述质粒含有在哺乳动物细胞中有活性的启动子。然后，将质粒转化进重组微生物宿主例如大肠杆菌(Escherichia coli)(“E.coli”)，它在其中扩增，然后纯化。通过直接注射进肌细胞或通过粒子轰击，将质粒DNA(通常悬浮在盐水中)施用给身体。肌细胞内在化的质粒DNA被转录和翻译，且表达的蛋白被转运到细胞表面，以进行T-细胞呈递。该作用模式会导致随后的针对表达的抗原的体液和CMI反应。重要的是，施用的质粒DNA是非感染性的，其不能复制，且仅仅编码目标蛋白。已经为许多感染性疾病，包括癌症、变态反应和自身免疫病，证实了DNA疫苗在疾病模型中的临床前免疫原性和效能(综述见，Gurunathan，S.等，Ann.Rev.Immunol.2000；18：927-974)。已经报道了评价DNA疫苗产生针对HTV、疟疾、流感、乙型肝炎和癌症的保护性免疫反应的能力的临床试验(综述见，Gurunathan，S.等，2000，Curr. Opin.Immunol.12：442-447；Shroff，K.等，1999，PSTT 2：205-212；和Restifo，N.& S.Rosenberg，1999，Curr.Open.Oncol.11：50-57)。最近，混合形式疫苗已经被证明为有前途的策略，其中将DNA疫苗与其它基因-送递系统相结合。临床前数据已经表明，施用作为引发剂(prime)的质粒DNA，然后施用作为加强剂(boost)的能编码相同抗原的另一个基于基因的载体系统，会产生比使用引发剂和加强剂的任一种载体更强的免疫反应。
另外，质粒DNA已经被批准用于基因治疗疗法。基因治疗包括，将功能基因施用进身体，将所述基因送递给靶细胞，和表达治疗产物，以选择性地校正或调控疾病状况。基因治疗代表对遗传缺陷的预防、治疗或治愈的替代方案。已经开始了许多基于质粒DNA的基因治疗临床试验(综述见，Mountain，A.，2000，TIBTECH 18：119-128；和Ferber，D.，2001，Science 294：1638-1642)。
为了用于多核苷酸疫苗接种和基因治疗方案两者，可以将DNA质粒形式的基因配制成类似于常规的药物产品，并直接施用给患者。无论是作为预防还是治疗方案的一部分，用于抗击疾病的DNA疫苗或基因治疗的人用户的潜在数目是非常高的，从而造成对质粒DNA的很大需求。用于兽医疾病的DNA疫苗可能进一步增加该需求。另外，有效的治疗可能需要毫克量的质粒DNA，因为已经表明，仅仅少量呈递给细胞的质粒分子能达到表达目标基因的核(Leitner，W.等，2000，Vaccine 18：765-777)。因而，大量药物级DNA的生产和纯化是至关重要的。
要完全开发和利用DNA疫苗和基因治疗治疗选项能提供的优点，高产质粒DNA生产方法是必需的。出于这些原因，仍然需要增加质粒DNA生产和纯化方法的生产力。许多描述的增加用于基因治疗或多核苷酸疫苗接种的质粒DNA生产的方法集中在质粒纯化步骤，即生产方法的下游部分；但是，很不清楚如何最优化用于生产质粒DNA的生产方法的最初的发酵步骤，尤其是对于工业规模的生产。尽管以前研究了小规模的质粒DNA纯化方法，但已经难以按比例放大临床级质粒DNA的生产和纯化(Prazeres，D.M.F.等，1999，TIBTECH 17：169-174)。施用未最优化的生产质粒DNA的实验室条件，总是导致非常低的(5-40mg/L)体积产量。增加质粒DNA生产方法的生产力，需要质粒拷贝数(即，个别产量(specific yield))和生物量浓度(即，体积产量)的伴随最优化。尽管有些为最优化在商业规模进行大肠杆菌重组蛋白生产的发酵方法而鉴定的技术可以转化成旨在超量生产质粒的方法，但有利于最佳蛋白表达的条件可能在一定程度上不同于达到高质粒拷贝数必需的条件。
PCT国际申请PCT/US96/09746(国际公开号WO 96/40905)公开了一种补料分批发酵方法，其用于在微生物中高效率地产生生产规模量的药物级质粒DNA，其中生长速度受到限制，以达到最佳产量。
除了在诱变处理后，在化学成分确定的培养基上选择高生长菌株外，PCT国际申请PCT/EP98/01122(国际公开号WO 98/37179)公开了化学成分确定的培养基在有价值的化合物的工业规模的发酵生产中的用途。
分别在1999年11月9日和2003年1月7日授权给Thatcher等的美国专利号5,981,735和6,503,738，公开了可升级的在大肠杆菌中生产高度纯化的质粒DNA的方法，其由使含有质粒的细胞以指数增长生长到高生物量，并通过将培养物的pH升高到能使染色体DNA变性、而质粒DNA能可逆地复性的值来裂解细胞组成。
O′Kennedy，R.等(2000，J.Biotechnol.76：175-183)表明，在半确定的培养基中培养携带质粒pSVβ的大肠杆菌DH5α细胞，会导致比标准的复合Luria Bertrani(“LB”)培养基制剂更高的质粒个别产量，从而证实最佳的碳/氮比的存在。
本发明公开了高产的、可升级的和可再现的生产质粒DNA的方法。该方法组合了大肠杆菌高产克隆的选择和在发酵过程中质粒扩增的诱导，这是作为在化学成分确定的培养基中使用限制的营养物补料方案的结果的。该方法可以用于生产质粒DNA，以用于许多人和动物疾病的基因治疗和遗传疫苗接种，所述疾病包括HIV、丙型肝炎和狂犬病。
发明概述
本发明公开了生产质粒DNA的方法，其包含下述步骤：(a)选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的高产克隆亚型；和，(b)在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵，培养所述高产克隆亚型。根据本发明，与类似地测试的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5细胞)的高产克隆亚型，能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的一个实施方案中，本文所述的质粒DNA生产方法能产生最高记录量的质粒DNA，这是作为以工业规模培养所述高产克隆亚型的结果的。因而，当与其它大规模的质粒DNA生产方法相比较时，本发明的DNA生产方法可以导致质粒DNA产量的增加。
本发明还涉及如上所述的质粒DNA生产方法，其中所述选择组分包含两步过程：第一个选择步骤，其中分离大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的潜在高产克隆亚型；随后是第二个选择步骤，其中在小规模发酵系统中测试以前分离的所述潜在高产克隆亚型，以确定哪个克隆亚型是高产的。在本发明的一个实施方案中，在化学成分确定的培养基上选择所述潜在高产克隆亚型。
在本发明的一个实施方案中，当铺平板在作为指示剂的血琼脂上时，通过本文公开的方法选择的大肠杆菌潜在高产克隆亚型菌落在表型上是灰色的。在本发明的另一个实施方案中，当铺平板在化学成分确定的琼脂培养基上、并培养直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体时，大肠杆菌潜在高产克隆亚型菌落在表型上是奶油色的。
在本发明的另一个实施方案中，在小规模发酵系统中培养所述克隆亚型后，测定在本发明的选择方法的步骤1中选择的所述大肠杆菌(包括但不限于DH5细胞)潜在高产克隆亚型的生产力(即，每个细胞的质粒拷贝数)。在本发明的一个实施方案中，该小规模发酵系统由具有营养物补料方案的摇瓶发酵组成。摇瓶发酵系统能模仿在最终的生产方案中使用的发酵方案，以产生需要的质粒DNA。在本发明的另一个实施方案中，在化学成分确定的培养基中，培养使用小规模发酵系统、包括但不限于摇瓶发酵系统评价的克隆亚型。在另一个实施方案中，当所述克隆亚型处于对数生长期中期时，将碳和/或氮溶液连续补料给所述小规模发酵系统。
本发明涉及生产质粒DNA的方法，其包含使用补料分批技术，培养携带DNA质粒的高产大肠杆菌克隆亚型，包括但不限于DH5细胞的高产克隆亚型。在本发明的一个实施方案中，在化学成分确定的培养基上，进行如本文所述的潜在高产大肠杆菌克隆亚型的选择。在化学成分确定的培养基中，随后评价所述潜在高产大肠杆菌克隆亚型，以确定哪个克隆能表现出比标准的比生产力更高，并进行最终的发酵方案。在本发明的一个实施方案中，在选自DME-P5、DME-B12、培养基C、培养基D、培养基E、培养基F和培养基G的化学成分确定的培养基中，选择和/或培养如本文所述鉴定的高产克隆亚型。
本发明还涉及发酵方法，其包括但不限于大规模发酵方法，以用于生产质粒DNA，如本文所述，其中该方法的培养方案包含至少一个生产阶段发酵期。在本发明的另一个实施方案中，当选择的携带DNA质粒的大肠杆菌高产克隆亚型是在对数生长期中期时，将碳和/或氮溶液补加给生产阶段发酵罐。在本发明的另一个实施方案中，补料溶液包含约50％甘油(v/v)和约25％谷氨酸一钠(w/v)。在另一个实施方案中，补料溶液包含约60％甘油(v/v)。
本发明涉及选择用于生产质粒DNA的大肠杆菌(包括但不限于DH5细胞)的高产克隆亚型的方法。在本发明的一个实施方案中，通过包含下述步骤的方法，选择所述大肠杆菌菌株高产克隆亚型：(a)纯化携带DNA质粒的大肠杆菌菌株菌落，当铺平板在作为指示剂的血琼脂上时，所述菌落在表型上是灰色的，其中灰色菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(b)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与在类似发酵条件下测试的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的另一个实施方案中，通过包含下述步骤的方法，选择大肠杆菌细胞的高产克隆亚型：(a)培养铺平板在化学成分确定的琼脂培养基上的携带DNA质粒的大肠杆菌菌株，直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体；(b)纯化所述来自步骤(a)的奶油色菌落，其中奶油色菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(c)测试所述步骤(b)的潜在高产克隆亚型的生产力，其中与在类似发酵条件下测试的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。
附图简述
图1显示了通过血琼脂表型筛选测定鉴定的存在于DNA疫苗候选物流感M1的培养物中的灰色菌落百分比。在4次富集的过程中，当铺平板在血琼脂上时，生成的灰色菌落的百分比从44％升高到89％，证实了从灰色表型菌落纯化的克隆分离物超过从白色菌落纯化的那些克隆分离物的选择生长优势。
图2显示了使用HIV-Gag DNA质粒进行动态富集研究的结果。使用各种白色∶灰色表型菌落比来接种化学成分确定的培养基。该图显示了在5个富集步骤的过程中，通过血琼脂表型筛选测定鉴定的存在于培养物中的灰色菌落百分比。在第三次富集后，在所有测试瓶中得到的细胞群体由超过95％的灰色表型菌落组成。
图3总结了为一般的接种发酵罐收集的关键数据，包括气流速度(小图A)、搅拌速度(小图A)和溶解氧百分比(小图B)。从用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的接种发酵罐，产生该数据。
图4总结了为一般的接种发酵罐收集的更关键的数据，如由用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的接种发酵罐所证实的。数据包括摄氧速度(小图A)、碳放出速度(evolution rate)(A)和光密度(小图B)。
图5总结了一般的接种发酵罐的pH数据，如由用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的接种发酵罐所证实的。
图6总结了为一般的生产发酵罐收集的关键数据，包括气流速度(小图A)、搅拌速度(小图A)和功率(小图B)。从用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的生产发酵罐，产生该数据。
图7总结了为一般的生产发酵罐收集的更关键的数据，如由用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的生产发酵罐所证实的。数据包括压力(小图A)和溶解氧百分比(小图B)。
图8总结了为一般的生产发酵罐收集的关键的光密度(小图A)、二氧化碳放出速度(小图B)和摄氧速度(小图B)数据，如由用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的生产发酵罐所证实的。
图9总结了为一般的生产发酵罐收集的关键的pH(小图A)和呼吸商(小图B)数据，如由用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法1的V1Jns-gag质粒的细胞的生产发酵罐所证实的。
图10显示了二氧化碳放出速度(“CER”)(小图A)、生长(OD600)(小图A)和质粒生产情况(小图B)，其来自用于培养含有根据实施例9的质粒生产方法2的V1Jns-gag质粒的细胞的生产发酵罐。
图11显示了从培养含有根据实施例9的质粒生产方法3的V1Jns-gag质粒的细胞得到的结果。小图A显示了二氧化碳放出速度、摄氧速度(“OUR”)和在线光密度(“OD”)测量值。在生产发酵罐中培养细胞，并以2.66-3.66g/L/h的速度，补加50％甘油(v/v)和25％MSG(w/v)。小图B显示了体积(g质粒/L)和个别产量(μg质粒/mg干细胞重)，以及在发酵过程中的硫胺素、铵和甘油浓度。
图12显示了从培养含有根据实施例9的质粒生产方法3的V1Jns-gag质粒的细胞得到的结果，其中以2.0-12g/L/h的速度，给生产发酵罐补加60％(v/v)甘油。小图A对比了由每个发酵方案产生的个别产量(μg质粒/mg干细胞重)，而小图B对比了体积产量(g质粒/L)。
发明详述
本发明描述了发酵方法，其组合了从预选择高产细菌克隆得到的益处，和与在限制的营养物补料方案下、在化学成分确定的培养基中培养细菌有关的益处。公开了选择用于生产质粒DNA的、包括但不限于大规模生产质粒DNA的大肠杆菌高产克隆的新方法。本文公开的方法包含，选择与非选择的、转化的细胞相比，每个细胞能产生大量质粒DNA的大肠杆菌细胞高产克隆亚型；然后在限制的营养物补料的发酵方案下，在化学成分确定的培养基中培养所述细菌克隆。所述发酵方案能确保高细胞密度的扩大的质粒生产力。得到的方法是高产的，从而产生1-1.5g质粒/L量级的最高记录高体积生产力，可升级的和可再现的。在发酵过程中实现高比生产力(即，每个细胞的拷贝数)和质粒高产量是有助于所述质粒DNA的有效的下游纯化的重要因素。
本发明涉及生产质粒DNA的方法，其包含选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株高产克隆亚型的第一个步骤，其中与相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，所述高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。使用大肠杆菌的DH5菌株，在本文说明书和实施例中，例证了该选择方法；但是，该例证无意将本发明的范围限制为仅仅使用大肠杆菌DH5细胞进行本文所述的发酵方法。本领域的技术人员能知道，大肠杆菌的替代菌株可以用于本发明的DNA生产方法。
本发明部分地基于下述观察，即用许多质粒DNA疫苗候选物转化的大肠杆菌DH5细胞能表现出培养不均匀性，从而当铺平板在鉴别和/或化学成分确定的琼脂培养基上时，会表现出2种具有不同形态学的菌落表型。菌落分离和随后的每种表型的测试，会导致发现能增加发酵过程中的质粒扩增的特定表型的克隆分离物，从而产生大量的临床级质粒DNA。因而，本发明描述了新的发酵方法，其包含选择用于生产质粒DNA的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的高产克隆分离物的第一个步骤。
使用限制的营养物补料方案，在化学成分确定的培养基中，对通过本发明所述的方法选择的高产克隆分离物进行发酵方法，包括但不限于商业化的大规模发酵方法。大肠杆菌是不挑剔的微生物，其可以在丰富的复合有机培养基和基于盐的化学成分确定的补充了有机碳源的培养基中生长。培养基组成可以直接决定生物量生产和影响微生物的调节系统，从而分别影响质粒体积产量(即，g质粒/升培养基)和个别产量(即，每个细胞的质粒拷贝数)。用于实验室级DNA疫苗生产的细菌发酵方法通常采用在复杂且丰富的培养基中的分批方法，其中使用大摇瓶或小实验室发酵罐。复合培养基的优点是，组分原材料便宜，容易得到，且能为微生物形成完全或几乎完全的营养源。分批发酵也允许细菌宿主细胞快速生长。但是，复合发酵培养基具有几个重要的缺点，尤其是对于大规模商业化操作。最重要的是，复合原材料具有化学成分不确定的、量可变的组成。当使用复合培养基进行细菌发酵时，需要高氧供应，以及大规模发酵过程中的高搅拌速度、通气速度和压力。经常形成泡沫，这主要是由于较差的氧传递，从而导致低质粒生产力和不一致的结果。因而，这些发酵方案会产生较低的细胞量(1-7g干细胞重/升)和不大的质粒产量，这仅仅适用于使用有限数目的小动物的研究(见，例如，Diogo，M.等，2000，Biotechnol.Bioeng.68：576-583；Diogo，M.等，2001，J.Gene Med.3：577-584；Drew，D.等，2000，Vaccine 18：2522-2532；Wang，Z.等，2001，Process Biochem.36：1085-1093；和Reinikainen，P.等，1989，Biotechnol.Bioeng.33：386-393)。
通过使用连续补料方案，在化学成分确定的培养基中培养预选的、高产细菌克隆，本发明解决了上述问题。在过去，一般认为在工业规模使用化学成分确定的培养基得到的产物产量基本上低于使用含有复合原材料的培养基得到的产量。因而，化学成分确定的培养基已经经典地用于质粒DNA生产，以用于单纯的研究目的或相对小规模的发酵方法。本发明描述了使用能产生最高记录量的产物的化学成分确定的培养基，甚至用工业规模的生产方法，产生质粒DNA的发酵方法。该方法允许易处理的操作条件(例如，搅拌速度和通气速度)，因为通过关键营养物的受控制的补料，可以实现减少的培养生长速度。尽管细胞生长速度在营养物补料阶段过程中显著减少，但细胞内的质粒复制继续。因而，本发明描述了确定的培养基发酵方案，其能维持高比生产力。通过控制微生物的比生长速度，细胞将它的内部细胞机理从生物量生产转换到质粒或蛋白生产，从而产生放大的比生产力(即，每个细胞的质粒拷贝数)(见Chen，W.等，1997，J.Ind.Microbiol.Biot.18：43-48；Riesenberg，D.等，1991，J.Biotechnol.20：17-28)。化学成分确定的培养基制剂也允许广泛的分析研究，例如代谢和质量控制研究，且有助于通过支持安全性和再现性权利要求达到关于调节环境的更好的位置，这是在设计生产用于遗传疫苗接种和基因治疗目的的质粒DNA的方法时的重要因素。
本发明涉及生产质粒DNA、包括但不限于大规模生产质粒DNA的方法，其能产生最高记录高产量的产物。该方法包含选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的高产克隆亚型，其中与类似地测试的、相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。然后，通过补料分批发酵，在化学成分确定的培养基中，培养如本文所述选择的高产克隆亚型。本发明还涉及如上所述的发酵方法，其中所述鉴定含有DNA质粒的大肠杆菌菌株高产克隆亚型的选择方法包含，第一个选择步骤，其中分离大肠杆菌的潜在高产克隆亚型；随后是第二个选择步骤，其中在小规模发酵系统中评价以前分离的所述潜在高产克隆亚型，以确定哪个克隆亚型是高产的。在鉴定本文所述的大肠杆菌高产克隆亚型的两步选择方法中，第一个选择步骤包含大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的潜在高产克隆亚型的鉴定和后续纯化。在该第一个选择步骤中，将包含用目标DNA质粒转化的细菌细胞的大肠杆菌克隆亚型库减少至仅仅包含具有能表现出产生比在类似发酵条件下生长的其它转化大肠杆菌细胞更高的每个细胞的质粒拷贝数的能力的可能性的那些克隆变体。因而，本发明大肠杆菌的潜在高产克隆亚型具有表现出高于标准比生产力(即，每个细胞的质粒拷贝数)的潜力。
在本发明的一个实施方案中，选择用目标DNA质粒转化的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的潜在高产克隆亚型的方法包含，首先观察所述大肠杆菌菌株在琼脂培养基上产生的菌落的表型不均匀性；然后纯化代表着由转化的细菌细胞产生的菌落群体的一小部分的那些菌落。当转化的细菌细胞的菌落群体存在表型不均匀性，包括但不限于形态、生理和/或生化特征的不均匀性时，本领域的技术人员可以容易地进行鉴定。所述表型不均匀性可能是由于许多不同的因素，包括但不限于例如，在转化过程中可能产生的原始细菌菌株的克隆变体的存在。如果表型不均匀性是由于原始细菌菌株的亚型的存在，那么本领域的技术人员能明白所述表型变体的潜力，其代表着具有改变的生长特征，包括但不限于增加的质粒扩增的特征的原始细菌菌株克隆。
已经在科学文献中描述了细菌克隆亚型。作为有差别的基因表达的直接结果，发生白色假丝酵母(Candida albicans)中的表型转换(Soll，D.等，1995，Can.J.Bot.73：1049-1057)。2个不透明-特异性的基因PEP1和OP4和一个白色-特异性的基因WH11负责病原性假丝酵母中的白色向不透明表型的转换。尽管这与假丝酵母的毒力有关，但在选择具有优越的比生产力的细菌克隆时，可能存在类似的现象。还已经为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的病原性菌株鉴定了菌落变体。在该情况下，表型多样性与脂多糖和5类外膜蛋白的菌株内的不均匀性有关(Poolman，J.T.等，1985，J.Med.Microbiol.19：203-209)。Mason，C.A.等(1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32：54-60)还已经描述了质粒存在对大肠杆菌DH5的生长和酶活性的作用，从而证实了质粒拷贝数对参与碳代谢的宿主细胞酶的表达具有直接作用。因而，具有不同的生长特征的大肠杆菌克隆亚型的产生，可以归因于许多不同的事件，包括但不限于DNA转化过程或通过在选择性富集培养基中培养细菌施加的应激诱导的突变。
一旦如本文所述鉴定和纯化了含有目标DNA质粒的大肠杆菌的潜在高产克隆分离物，则选择方法的第二步是评价每种潜在高产克隆亚型，以确定哪个克隆亚型实际上是高产的。在本发明的一个实施方案中，使用小规模发酵系统测试在选择方法的步骤1中分离的所述潜在高产克隆亚型的生产力，最后鉴定从所述选择方法的轮次1中分离的克隆分离物，与用相同DNA质粒转化并在类似发酵条件下生长的非选择的大肠杆菌细胞相比，其能产生更高的每个细胞的质粒拷贝数。如果通过该选择方法鉴定的高产克隆亚型是要用于生产商业量的质粒DNA的大规模发酵方案中的，那么所述小规模发酵系统能模仿随后的大规模发酵方法的发酵条件。通过计算所述细菌菌株的克隆分离物群体的平均生产力，可以容易地确定携带DNA质粒的非选择的大肠杆菌细胞(即，不是在本文所述的选择方法的第一轮中选择的大肠杆菌的克隆分离物)的比生产力，所述细胞包括但不限于DH5细胞。
本领域的技术人员能认识到，可以以许多不同的方式鉴定本发明的细菌克隆变体，包括但不限于观察铺平板在鉴别琼脂上的细菌菌落群体的表型(例如，形态)不均匀性。在本发明的一个实施方案中，当铺平板到血琼脂上时，转化的大肠杆菌DH5细胞的潜在高产克隆分离物能形成表型上灰色的菌落。所述灰色菌落似乎是不规则形状的、平坦的和半透明的。相反地，当铺平板到血琼脂上时，转化的大肠杆菌DH5细胞群体的主要成分形成的菌落是白色、圆形的，和带有光滑质地地隆起。当对流感DNA疫苗候选物的药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice)(“GMP”)发酵的最终发酵液样品进行常规培养物纯度检验时，初步鉴定了所述能在血琼脂上形成灰色菌落的大肠杆菌DH5的潜在高产克隆分离物。灰色和白色菌落的不均匀群体在血琼脂平板上是可视的。已经确定，灰色菌落在发酵液样品中会变成优势表型。纯化了灰色和白色菌落-生成性细胞的克隆分离物，并表征生长动力学和质粒生产力。当与能产生白色菌落的克隆分离物相对比时，鉴定了能产生灰色表型菌落的克隆分离物和增加的比生产力之间的关联。
当在血琼脂上显现时，可以区别开代表着所述细胞的潜在高产克隆分离物的本发明转化的大肠杆菌DH5细胞的灰色表型菌落和相同菌株的非选择的、白色DH5菌落。血琼脂是用于培养挑剔的和不挑剔的微生物的通用的、非选择性的、不确定的培养基。血琼脂平板一般含有5％羊血(按体积计)和Columbia琼脂或胰胨豆胨琼脂基质。本领域的技术人员能容易地明白，应当在有利于细菌菌落形成的条件下，温育用于区分2种菌落表型的琼脂平板。所述生长条件可以在例如温育温度以及温育时间的长度方面有变化。可以根据以经验为主地确定的条件，调节温育时间和温度，以促进替代菌落表型之间的最大可视区别。在本发明的一个实施方案中，当铺平板在5％Columbia羊血琼脂上时，将大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌DH5)的潜在高产克隆分离物鉴定为灰色菌落。优选的使血琼脂上的灰色和白色DH5菌落之间的表型差异最大化的温育条件是，在约30℃的温育温度，温育约48小时的时间段；但是，本领域的技术人员能明白，这些数字不是严格的规则。
为了评价本发明的潜在高产克隆分离物的生长特征，首先必须从非选择的、转化的细胞(即，能在血琼脂产生白色菌落的那些)纯化所述细菌克隆。克隆分离物代表着目标原始细菌细胞的亚型的纯培养物。因而，纯培养物是源自单个细胞的细胞群体。当在琼脂表面铺平板或划线细胞混合物、以使单个的细菌细胞产生完全分离的菌落时，所述菌落代表着纯培养物。通常，通过挑取单个菌落并将所述菌落重新涂布/重新划线到另一个琼脂平板上，可以分离并随后繁殖所述纯培养物。因而，本领域的技术人员能明白，如果琼脂平板上的多个细菌菌落彼此接触，那么使用涂布平板或划线平板方法的重复纯化技术，最终会导致纯培养物的纯化。
在本发明的一个实施方案中，可以在血琼脂上鉴定大肠杆菌DH5的潜在高产克隆分离物，因为与非选择的、转化的DH5细胞形成的白色菌落相比，所述克隆亚型能形成灰色菌落。但是，当铺平板在化学成分确定的琼脂培养基上时，代表着潜在高产克隆分离物的所述灰色菌落可以与非选择的、转化的DH5细胞的菌落区分开。从所述血琼脂平板，可以直接纯化能在血琼脂上形成灰色菌落的本发明的潜在高产克隆亚型。备选地，可能需要避免在本发明的最终质粒DNA生产方法中使用的高产克隆分离物和任意血液产品之间的所有接触。为了纯化能在血琼脂上形成表型独特的菌落的大肠杆菌菌株的潜在高产克隆亚型，例如，如本文所述的灰色菌落，其中要在最终的发酵方法中使用的最终克隆亚型没有接触任何血液产品，可以使用双份铺平板技术。双铺平板技术要求，除了任何后续的纯化中间体外，将最初的转化的大肠杆菌细胞一式两份地铺平板在血琼脂和第二种类型的琼脂培养基上，包括但不限于化学成分确定的琼脂培养基。一旦在所述血琼脂平板可以看见表型上不同菌落的不均匀群体，例如，灰色和白色DH5菌落的混合物，则挑取来自对应的第二个琼脂平板的单个菌落，并重新涂布/重新划线到2种类型的琼脂培养基上。继续该选择和纯化方法，直到血琼脂平板含有表型上不同的和独特的菌落(例如，灰色菌落)的均一群体，其中来自对应的第二种琼脂培养基的单个菌落代表着从未接触血液产品的潜在高产克隆分离物。在本发明的一个实施方案中，上述的第二种琼脂培养基是DME-P5化学成分确定的琼脂培养基，如下面的实施例1所述。一旦纯化了本发明的克隆分离物，则可以周期性地在血琼脂上重新评价所述细胞，从而测试培养物的纯度。
本文所述的质粒DNA生产方法的第一步包含选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的高产克隆亚型，其中所述选择方法的第一步是鉴定和纯化当铺平板到血琼脂上时，能形成表型上灰色的菌落的所述菌株的潜在高产克隆亚型。本发明还涉及选择用于生产质粒DNA的大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌的DH5菌株)的高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：(a)纯化携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的菌落，其在血琼脂上是表型灰色的，其中灰色菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(b)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与在类似发酵条件下测试的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的一个实施方案中，在约30℃，温育所述方法的血琼脂平板约48小时。
本发明的另一个实施方案包含选择用于生产质粒DNA的大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌的DH5菌株)的高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：(a)将携带DNA质粒的大肠杆菌菌株铺平板到血琼脂和化学成分确定的琼脂培养基上，并温育所述平板，直到形成细菌菌落；(b)从化学成分确定的琼脂培养基平板挑取单个的菌落，其对应的血琼脂平板含有具有灰色表型的菌落的群体；(c)在血琼脂和化学成分确定的琼脂培养基平板上，纯化来自步骤(b)的单个菌落，直到血琼脂平板含有表型上灰色的菌落的均一群体；(d)从化学成分确定的琼脂培养基平板上，挑取在步骤(c)中纯化的单个菌落，所述菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(e)确定所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与在类似发酵条件下的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌细胞相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的一个实施方案中，上述的化学成分确定的琼脂培养基是DME-P5化学成分确定的琼脂培养基，如下面的实施例1所述。
本领域的技术人员能认识到，可以得到许多不同的选择策略，来分离本发明的潜在高产细菌克隆。一种这样的策略如上所述，在观察到转化的大肠杆菌DH5细胞可以在血琼脂上产生表型上灰色和白色菌落的不均匀群体后开发。在最优化许多DNA疫苗候选物的发酵方案时，也观察到从最初转化的、回收的DH5细胞群体形成的菌落，在约37℃延长温育时间段至约5天后，能在如下面的实施例1所述的化学成分确定的琼脂培养基DME-P5上表现出2种不同的表型。检测到了奶油色菌落和含有褐色中心的奶油色菌落。以后确定，当铺平板到血琼脂上时，从奶油色菌落产生的克隆分离物具有产生如下所述的灰色表型菌落的潜力。因而，所述奶油色菌落代表着用DNA质粒转化的大肠杆菌DH5细胞的亚群，其具有被鉴定为根据本发明的高产克隆亚型的潜力。已经观察到，能在DME-P5选择性琼脂培养基上表现出奶油色菌落表型的克隆分离物，当铺平板到血琼脂上时，可以产生白色和灰色表型菌落的混合群体。但是，能产生带有褐色中心的奶油色菌落的转化的DH5克隆分离物都没有表现出产生高质粒DNA效价或在血琼脂上产生灰色表型菌落的能力。
本发明涉及如本文所述的发酵方法，其包含第一个步骤，其中在化学成分确定的培养基上，选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌的DH5菌株)的高产克隆亚型，所述选择方法包含第一个选择步骤，其中分离大肠杆菌的潜在高产克隆亚型。如上所述，该第一个选择步骤能将包含用DNA质粒转化的特定菌株的细菌细胞的目标大肠杆菌克隆亚型库减少至具有能表现出产生比在类似发酵条件下生长的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌细胞更高的每个细胞的质粒拷贝数的能力的可能性的那些克隆。本发明的一个实施方案代表着选择所述用目标DNA质粒转化的大肠杆菌菌株(包括但不限于DH5菌株)的潜在高产克隆亚型的方法，其包含首先观察当铺平板到鉴别和/或化学成分确定的琼脂培养基上时，所述细菌细胞产生的菌落的表型不均匀性；然后纯化代表着由所述转化的细胞产生的菌落群体的一小部分的那些菌落。在本发明的另一个实施方案中，所述潜在高产克隆亚型在化学成分确定的琼脂培养基上是表型上奶油色的，其已经被温育，直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落的群体。在本发明的该方面的另一个实施方案中，在约37℃，在所述化学成分确定的琼脂培养基上温育约5天后，形成所述奶油色菌落。
本发明还涉及选择用于质粒DNA生产的大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌的DH5菌株)的高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：(a)温育铺平板到化学成分确定的琼脂培养基上的携带DNA质粒的大肠杆菌菌株，直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体；(b)纯化所述来自步骤(a)的奶油色菌落，其中奶油色菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(c)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与在类似发酵条件下测试的相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌细胞相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的另一个实施方案中，将在该选择方法中使用的化学成分确定的琼脂培养基，包括但不限于下文所述的DME-P5选择性琼脂培养基，在约37℃温育约5天。
本发明的另一个实施方案包含选择用于质粒DNA生产的大肠杆菌菌株(包括但不限于大肠杆菌的DH5菌株)的高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：(a)温育铺平板到化学成分确定的琼脂培养基上的携带DNA质粒的大肠杆菌菌株，直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体；(b)挑取来自步骤(a)的奶油色菌落；(c)将在步骤(b)中挑取的所述奶油色菌落的细胞铺平板到血琼脂和化学成分确定的琼脂培养基上；(d)从化学成分确定的琼脂培养基平板上，挑取单个菌落，其对应的血琼脂平板含有具有灰色表型的菌落群体；(e)在血琼脂和化学成分确定的琼脂培养基上，纯化来自步骤(d)的单个菌落，直到血琼脂平板含有表型上灰色的菌落的均一群体；(f)从化学成分确定的琼脂培养基，挑取在步骤(e)中纯化的单个菌落，所述菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，(g)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与相同菌株的类似地测试的、非选择的、转化的大肠杆菌细胞相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。在本发明的一个实施方案中，将上面步骤(a)所述的化学成分确定的琼脂培养基，包括但不限于下文所述的DME-P5琼脂培养基，在约37℃温育约5天；但是，本领域的技术人员能明白，这些温育参数仅仅是指导方针，和如何改变这些指导方针，以达到类似的结果。
当初步观察转化的大肠杆菌细胞的不均匀群体的存在时，例如，通过可视地鉴定所述能显示替代形态表型的转化细胞在琼脂培养基上产生的细菌菌落，重要的是估计表观的细菌变体是否确实是所述转化的大肠杆菌细胞的亚型，而不仅仅是污染物。可能的污染物可以源自外来细菌或非细菌来源。另外，当选择用于生产质粒DNA的转化细菌菌株的高产克隆时，必须证实所述质粒确实包含在所述细菌细胞中。本领域的技术人员能认识到，存在许多鉴定外来细菌或非细菌污染物的方法，包括但不限于将克隆分离物铺平板到鉴别琼脂上，并进行脂肪酸甲酯(“FAME”)分析。还存在许多检测细菌细胞内的质粒DNA的技术，包括但不限于进行细菌细胞裂解物的琼脂糖凝胶电泳，或将所述细菌铺平板到含有抗生素的琼脂培养基上，其对应着质粒内的抗生素抗性基因。例如，在本发明中，将纯化的、DH5克隆分离物(即，在血琼脂上形成灰色或白色菌落的那些)铺平板到下述类型的琼脂培养基上：DME-P5，见下文，其含有新霉素，因为所述克隆中的质粒含有新霉素抗性标记；缺乏新霉素的DME-P5；和LESEndo和Levine EMB，用于区分和鉴定革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriaceae)生长的大肠杆菌选择性琼脂培养基。在测试的大约50个克隆分离物中，都含有能赋予抗性的质粒。测试的克隆分离物也表现出大肠杆菌、尤其是DH5菌株的一般生长模式，表明通过FAME分析得到的优良的大肠杆菌特征匹配(profile match)。
选择本发明的携带DNA质粒的大肠杆菌潜在高产克隆亚型后，本发明包括评价所述克隆亚型，以确定从第一个选择步骤鉴定出的哪个克隆具有大于用相同质粒转化并在类似发酵条件下生长的相同菌株的非选择的大肠杆菌细胞的比生产力。在本发明的一个实施方案中，使用小规模发酵系统，评价潜在高产克隆分离物。小规模发酵系统的大小取决于要用于本文所述的选择的高产克隆亚型的最终发酵方法的大小。例如，如果通过本发明的方法选择的大肠杆菌高产克隆亚型要用于大规模生产质粒DNA的发酵方法中，那么在其中评价潜在高产克隆亚型的小规模发酵系统包含一个系统，其在约250mL至约2L大小的瓶中培养所述细菌分离物。另外，使用能模仿最终的商业化大规模发酵方法的发酵方案，评价所述潜在高产克隆分离物。小规模发酵系统能允许快速筛选潜在高产克隆，且能产生与用于生产质粒DNA的最终发酵方法相一致的生产力数据。同样地，如果选择的大肠杆菌高产克隆亚型要用于更小规模DNA生产方法，则用于评价在选择方法的步骤1中分离的潜在高产克隆亚型的生产力的本发明的小规模发酵方案包含一个系统，其在比最终的发酵方法中使用的发酵容器更小的发酵容器中培养克隆亚型。另外，小规模发酵系统能模仿用于生产质粒DNA的最终发酵方案的发酵条件。
在本发明的一个实施方案中，使用带有补料的摇瓶(“SFF”)发酵系统，其中每个瓶配有连续补料，评价本文所述的潜在高产克隆分离物。SFF系统代表着小规模发酵系统，其中在不超过约1000mL的带挡板的摇瓶和优选250mL的带挡板的摇瓶中，培养所述克隆分离物。在如本文所述的SFF系统中评价后鉴定的本发明的高产克隆变体，可以用于在大规模商业化发酵方法中生产质粒DNA。在本发明的一个实施方案中，给用于评价大肠杆菌(包括但不限于本文所述的DH5细胞)的潜在高产克隆分离物的SFF系统摇瓶，连续补加稀释的甘油/谷氨酸一钠(“MSG”)混合物，优选包含约4.6％甘油(v/v)和约2.9％MSG(w/v)的补料溶液。补料优选地在细菌的指数生长期(即，对数生长期中期)期间开始，并模仿在最终的大规模发酵方法中使用的补料分批法。另外，使用缓慢的补料策略，优选地，其中以大约6.4μl/小时/mL培养液送递所述补料溶液，从而迫使细胞以缓慢的线性方式生长。另外，这能模仿大规模发酵方法。用于评价通过本文所述的方法选择的克隆分离物的优选的SFF系统不需要pH控制，因为其不适用于摇瓶系统。优选地，可以适当地同步化本文所述的SFF系统，以筛选尽可能多的潜在高产克隆分离物。另外，因为摇瓶中固有的氧限制，所以优选地在没有补料的能支持相对低的生物量的培养基中，培养以该方式测试的克隆分离物。因此，当开始补料时，生物量可以显著升高，而培养没有变成氧限制的。在本发明的一个实施方案中，在与DME-P5培养基有关的化学成分确定的培养基DME-B 12培养基(具体组成见下文实施例3)中，培养本文所述的潜在高产克隆分离物。
在本发明的一个实施方案中，在评价本发明的潜在高产克隆亚型的特征和确定在选择方法的轮次1中鉴定和纯化的哪个克隆亚型能表现出高比生产力后，如下文所述，然后在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵培养高产克隆亚型。可以在工业规模培养所述高产克隆亚型，从而增加大规模生产质粒DNA的产量。如本文使用的，认为工业或大规模微生物细胞发酵具有比标准的实验室生物反应器更大的总发酵体积，所述生物反应器通常能容纳大约200L、500L或1000L的发酵体积。工业或大规模微生物细胞生物反应器可以容纳大于约1000L的总发酵体积，且可以包括大至10,000-100,000L的发酵容器。
已经采用2种不同发酵技术(分批和补料分批)来在大肠杆菌中超量生产质粒(见，例如，Riesenberg，D.，1991，Curr.Opin.Biotechnol.2：380-384；Yee，L和H.Blanch，1992，Biotechnol.10：1550-1556；和Lee，S.Y.，1996，TIBTECH 14：98-105)。一般，分批发酵是细胞培养方法，其中细胞生长和质粒生产所需的所有营养物都在接种时非常过量地存在于发酵容器中，不需要向容器中添加。在分批发酵中，通过操纵环境参数(例如，温度、pH、氧供应)和碳源来控制生长速度。在达到高生物量培养方面，分批发酵受到严重限制，从而有助于产生低的质粒体积产量。在补料分批法中，在发酵方法的开始阶段，将包含一种或多种发酵培养基的结构和/或催化成分的化合物的一部分添加到发酵罐中，或者不添加。一旦细胞已经达到需要的密度，则然后分别将包含一种或多种结构和/或催化成分的化合物的全部或剩余部分补加给发酵罐。在补料分批发酵中，通过在延长的时间段，向培养物添加这些营养物，来控制细胞生长速度。选择的用于补料的化合物可以一起或彼此分开地补加。在重复的补料分批和连续发酵方法中，在该发酵阶段，额外补加完全的开始培养基。在重复的补料分批法中，以规则的时间间隔，取出包含生物量的发酵液的一部分，而在连续补料分批发酵方法中，连续取出发酵液的一部分。因此，用与取出的发酵液量相对应的一部分新鲜培养基，补充发酵方法。
当使用补料分批发酵系统时，通过将营养物可利用性控制到能与发酵容器的氧传递能力相容的水平，能避免由于氧限制的环境的生成造成的有毒副产物的积累。使用恒定的补料速度或按照复杂的补料算法，通过特定的补料方案建立恒定环境，实现需要的生长速度。通过维持下调的生长速度，可以积极地影响质粒拷贝数，称作质粒扩增(见Reinikainen，P.等，1989，Biotechnol.Bioeng.33：386-393；Namdev，P.K.，1993，Biotechnol.Bioeng.41：660-670；Schmidt，T.等，2001，P/ace setter 5：4-6；和Chen，W.C.，1997，J.Indust Microbiol.Biotechnol.18：43-48)。认为该更高的质粒含量是由于比其它生化途径更高的质粒稳定性和有利的质粒合成。因而，在生产质粒DNA方法中，经常采用二阶段策略：(1)生物量积累阶段，其中细胞指数地生长；和(2)通过补料分批方法达到的缓慢的生长阶段，其中发生质粒扩增。重要的是，每种重组的构建体也存在它自身的限制。
发酵容器含有浸没在液体营养培养基中的培养细胞。一般，在放入发酵容器之前或之后，灭菌培养基。在一些情况下，不能一起灭菌培养基的某些组分，因为在热灭菌过程中，培养基的某些组分之间可能形成化学中间体，从而改变培养基的组成和某些营养物在所述培养基中的浓度。在这些情况下，可以将培养基制成2种或更多种分开的培养基，其中在灭菌过程中，将已知不相容的组分彼此分开。然后，可以在灭菌后，组合这些分开的培养基，以生成完全的、无菌的培养基。另外，有些物质，尤其是某些蛋白，不适合热灭菌，因为它们可能被热变性。这可以通过在将它们加入培养基之前，将这些物质过滤灭菌来避免。
发酵容器通常配备有给溶液中的细胞充氧的装置。给罐充氧的一般装置包括搅拌装置，其经常是发酵容器自身的一部分，或入口，空气或氧在其中泵入容器中。除了给培养的细胞通气的装置之外，包含在发酵容器上并在本发明中使用的其它有用的组分包括，但不限于，进行pH、溶解氧和温度测量的探头，压力传感器，以及一个或多个用于添加营养物和/或其它溶液的孔。
本发明涉及用于生产质粒DNA的发酵方法，其包含下述步骤：首先选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株高产克隆亚型，如上文所述，然后通过补料分批发酵，培养所述高产克隆亚型。在本发明的一个实施方案中，使用大规模发酵方法，培养所述高产克隆亚型。使用化学成分确定的培养基，执行本发明的选择方法和最终的发酵方案。本文所述的化学成分确定的培养基已经设计用于支持质粒DNA的超量生产。如本文使用的，术语“化学成分确定的”培养基应当理解为，基本上由化学成分确定的组分组成的培养基。基本上由化学成分确定的组分组成的发酵培养基包括不含有复杂的碳和/或氮源的培养基。因此，化学成分确定的培养基基本上不含有不确定的氮(例如，动物或植物蛋白，或蛋白水解产物组合物)或碳源(例如，糖蜜或玉米浆)。相反地，氮源是非常确定的无机或有机化合物，且碳源是非常确定的糖。另外，化学成分确定的培养基含有矿物组分，例如盐，例如，碱金属和碱土金属的硫酸盐、磷酸盐和氯化物和微量营养物。
本发明的一个实施方案涉及一系列化学成分确定的培养基配方，其包含一碱价磷酸钾(KH2PO4)、磷酸钾(K2HPO4)和硫酸铵((NH4)2SO4)的盐组分。在另一个实施方案中，所述公开的化学成分确定的培养基的盐组分任选包括氯化钠(NaCl)。本发明的一个具体实施方案涉及化学成分确定的培养基，其包含约7.0g/L KH2PO4、约7.0g/LK2HPO4和约6.0g/L(NH4)2SO4，且任选地包含约0.5g/L NaCl。
在本发明的另一个实施方案中，除了包括但不限于甘油的碳源和/或包括但不限于谷氨酸一钠(“MSG”)和L-谷氨酸的氮源之外，所述用于本文公开的质粒DNA生产方法的选择和/或发酵步骤的化学成分确定的培养基包含如上所述的盐组分。MSG是L-谷氨酸的钠盐。本发明的一个具体实施方案涉及化学成分确定的培养基，其除了用作碳源的优选约10.0-15.0g/L，且更优选15.0g/L的浓度的甘油之外，包含如本文所述的盐组分。本发明的另一个具体实施方案涉及化学成分确定的培养基，其除了约5.0g/L浓度的MSG或L-谷氨酸氮源外，包含如本文所述的盐组分和碳源。在本发明的另一个具体实施方案中，所述化学成分确定的培养基任选地包含一种或多种下述组分：ucon、盐酸硫胺素、MgSO4·7H2O、硫酸新霉素和痕量元素，在所述培养基上选择本发明的高产克隆分离物，并随后用于培养所述细菌克隆。
用于选择和/或培养本文所述的高产大肠杆菌细胞的本发明的化学成分确定的培养基包括但不限于，选自DME-P5、DME-B 12、培养基C、培养基D、培养基E、培养基F和培养基G的培养基(见下文特定培养基组成和制备的实施例部分)。应当明白，这些培养基仅仅是实例。本领域的技术人员能提供替代性的化学成分确定的培养基，其允许选择和/或培养如本文公开的新方法中所述的携带DNA质粒的高产大肠杆菌细胞，包括但不限于DH5细胞。同样，本发明不限于使用本文所述和示例的特定培养基组成，但是意在包括其它的、非示例的化学成分确定的培养基组成，其适用于选择和/或培养携带DNA质粒的大肠杆菌的高产克隆分离物。在本发明的一个实施方案中，将所述用于培养根据本文所述的方法鉴定的大肠杆菌高产克隆亚型的化学成分确定的培养基配制成支持所述细菌的大规模发酵。
通过本发明所述的方法培养的DNA质粒载体可以是任意的染色体外DNA分子，其含有能编码目标生物化合物的基因，即转基因。质粒含有它在微生物细胞(例如，大肠杆菌)中维持和繁殖以及转基因在动物宿主中随后表达所需的元件。对于细菌繁殖，除了复制所需的任何质粒编码的功能，例如用于选择成功的转化体的选择标记外，需要复制起点。对于基因表达，质粒应当设计成能使转基因在进入动物宿主后的瞬时生产最大化。有助于基因表达的质粒组分可以包括，但不限于，真核启动子、转录终止和多腺苷酸化信号和增强子元件。为动物细胞中的重组基因表达选择的启动子可以是同源的或异源的，且可以是组成型或诱导型的，包括但不限于来自人巨细胞病毒/立即-早期(CMVIE)、猿猴病毒/早期(SV40)、人延伸因子-1α(EF-1α)和人遍在蛋白C(UbC)的启动子。本领域的普通技术人员还能认识到如何将这些不同的组分以特定方式置于载体上，从而赋予它们功能。使用本领域的普通技术人员众所周知的技术，可以重组地工程改造质粒DNA，见Sambrook，Fritsch，Maniatis，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress.1989；和Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.& Wiley，1987；二者都在本文中引作参考。低拷贝数载体不适用于多核苷酸疫苗接种或基因治疗的质粒DNA生产，因为产物产量会不利地较低。使用许多众所周知的方法，例如氯化钙转染、电穿孔、显微注射等，可以将质粒载体转染或转化进宿主细胞。
根据本发明，可以在工业规模培养根据本文公开的方法鉴定的大肠杆菌菌株高产克隆亚型，以用于生产大量的质粒DNA。在这种情况下，通常通过直接接种接种发酵罐，优选小瓶(即，约250mL至约2升)，其含有具有转化的细胞的起始批培养基，启动所述大规模发酵方案，经常称作发酵方法的“接种”阶段。如果培养如本文所述鉴定的大肠杆菌高产克隆亚型的最终发酵步骤包含更小规模的发酵方案，那么所述“接种”阶段可以由直接接种起始批培养基的小容器(例如，15mL无菌管)组成。起始批培养基一般含有细胞的生长和增殖必需的所有营养物。本发明的起始批培养基优选地是化学成分确定的培养基，包括但不限于培养基D、培养基E、培养基F和培养基G(它们都如下文所述)。接种物可以由工作种子或大种子原种的解冻等分试样组成(见实施例6)。使接种阶段的细胞生长至需要的密度，然后将“接种”发酵罐的内容物在无菌条件下转移到生产发酵罐，从而启动发酵方法的“生产”阶段。对于大规模发酵方案，生产发酵的大小决定了所述发酵方案的“工业规模”或“大规模”名称。在本发明的一个实施方案中，接种和生产发酵阶段之间的转换的时间选择是基于达到对数生长期中期的转化的、细菌细胞的，如例如通过二氧化碳放出速度(“CER”)的在线测量所测得的。在发酵的生产阶段中使用的本发明的培养基是化学成分确定的培养基，包括但不限于培养基D、培养基E、培养基F和培养基G。接种发酵罐和生产发酵罐的发酵条件可以在温度、气流速度、搅拌速度、容器压力和pH方面有变化。在本发明的一个实施方案中，携带目标DNA质粒的大肠杆菌在大约37℃生长。将接种和生产发酵罐的气流速度优选地设定在约0.25至1.00vvm(空气体积/培养液体积/分钟)的范围内。接种和生产发酵罐的搅拌速度优选地设定在约200-800rpm的范围内；但是，搅拌速度取决于发酵罐的大小，更大的容器需要更低的搅拌速度。接种和生产发酵罐的压力维持在约5-约20PSI的范围内。当发酵过程中需求增加时，可以通过增加搅拌速度来维持溶解氧水平。大于或等于约30％的溶解氧水平，以及中性pH是优选的。通过添加25％(v/v)磷酸或30％(v/v)氢氧化钠，可以维持中性pH。可以在线测量发酵液的溶解氧水平、CER、摄氧速度(“OUR”)、pH和细胞密度。在一个替代方法中，可以从冷冻接种物来源直接接种生产阶段，而跳过接种发酵步骤。
本发明的发酵方法的生产阶段包含补料分批系统。本发明的一个优选的实施方案包含增加质粒DNA生产的产量的方法，包括但不限于质粒DNA的大规模生产，其包含通过补料分批发酵方案培养携带目标DNA质粒的大肠杆菌DH5细胞，其中在发酵方法的生产阶段采用该补料分批方案。在本发明的一个实施方案中，在生产阶段，将碳和/或氮源补加进发酵容器。碳源可以包括，但不限于，甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、山梨糖醇或其它单糖。氮源可以包括，但不限于，酪蛋白的蛋白水解产物、乳清蛋白、清蛋白、大豆蛋白；肉类蛋白；和MSG或单独的氨基酸的混合物。在本发明的一个实施方案中，碳源是甘油，且氮源是MSG。在本发明的另一个实施方案中，使用包含约50％甘油(v/v)和约25％MSG(w/v)的补料溶液。在本发明的另一个实施方案中，使用包含约60％甘油(v/v)的补料溶液。在本发明中，一旦生产阶段培养达到对数生长，则启动碳和/或氮补料方案(基于CER的时间选择)，并继续约24-30小时。该补料方案的目的是减小生长速度，这有助于质粒扩增。与分批法相反，在补料分批法中，可以耐受显著更高量的碳和氮供给。具体地，在补料分批法中使用的碳和/或氮源的量可以比分批法中使用的最高量高至少约2倍。这又会导致补料分批发酵方法比分批发酵方法明显更大量的生物量生产。
在本发明中，在发酵过程中，一般改变向本发明的生产阶段发酵罐中送递补料溶液的速度、时间选择和体积。例如，在本发明的一个实施方案中，在更低的调定点启动补料速度，并且，一旦呼吸活性(通过CER测量)已经达到峰值就经一定的时间段手工增加至最高值，为大约2.66至3.66g/L/h。优选地，补料过程会导致细胞以线性速度生长，这与补料前发生的指数生长速度相反。在发酵方法的补料阶段过程中达到的减少的生长允许发酵过程中更大的质粒扩增，从而导致更大的比生产力和最终更大的DNA质粒产量。备选地，以约2.0-12g/L/h的恒定速度，更优选地，以不超过约8.0g/L/h的恒定速度，且最优选地，以大约8.0g/L/h的恒定速度，给本发明的生产发酵罐补料。
完成大肠杆菌宿主细胞的培养后，可以从细菌细胞得到质粒DNA。首先从发酵培养基收获含有目标质粒的大肠杆菌细胞，以提供细胞糊或浆。从液体培养基收获细胞的任何常规方式都是合适的，包括但不限于离心或微量过滤。随后的纯化一般包含许多步骤，包含各种技术例如过滤、沉淀、氯化铯/溴化乙锭密度梯度；和各种形式的色谱，包括离子/阴离子交换、凝胶渗透和反相色谱。一般，在一系列步骤中采用这些技术中的几种，以成功地增加质粒DNA的纯度。
在本文中提及的所有出版物都引作参考，其目的为描述和公开可以关于本发明使用的方法和材料。本文中的任何内容都不应当理解为承认，本发明不能借助于优先权发明而早于这些公开内容。
已经参考附图描述了本发明的优选的实施方案，应当理解，本发明不限于这些准确的实施方案，且本领域的技术人员可以在其中实现各种变化和改进，而不脱离所附权利要求书定义的本发明的范围或精神。
提供了下面的实施例来解释本发明，但不是对它进行限制。
实施例1
大肠杆菌DH5的2种不同表型的鉴定和评价
化学试剂-所有化学试剂都是试剂级的，且购自Sigma ChemicalCo.(St.Louis，MO)或Fisher Scientific Products(Springfield，NJ)。API20E测试条购自bioMerieux(加拿大)。
培养基-DME-P5化学成分确定的培养基含有下述成分：7.0g/LKH2PO4、7.0g/L K2HPO4、6.0g/L(NH4)2SO4、5.0g/L L-谷氨酸、10g/L甘油、0.5g/L NaCl，并用氢氧化钠将pH调至7.2。在液体循环的高压灭菌器中，将培养基灭菌30分钟。当冷却时，加入痕量元素混合物的1∶1000稀释液，其由下述溶解在10％HCl中的痕量元素组成，并过滤灭菌：27g/L氯化铁(FeCl3·6H2O)、2.0g/L氯化锌(ZnCl2·4H2O)、2.0g/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、2.0g/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、1.0g/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、1.27g/L氯化铜(CuCl2·2H2O)和0.5g/L硼酸(H3BO3)。将该DME-P5/痕量元素混合物保藏在4℃。当使用培养基时，加入下述Th/Mg/Neo溶液的1∶120稀释液：24g/L盐酸硫胺素、240g/L MgSO4·7H2O和9.6g/L硫酸新霉素。将15g/L Difco细菌用琼脂加入上述培养基，从制成琼脂平板。Columbia 5％羊血琼脂(SBA)平板、胰胨豆胨琼脂平板(TSA)和Levine EMB和LES Endo琼脂平板购自Fisher Scientific。
培养物纯度测定-将发酵罐培养液样品在TSA和血琼脂平板上划线，并在25℃和35℃温育。48小时和7天后，检查平板的培养物纯度。
结果-在生产临床材料的过程中，初步观察大肠杆菌DH5细胞的2种不同表型，以支持2种潜在流感DNA疫苗(流感NP和M1)的安全性评价研究。当测试常规培养物纯度时，用于GMP发酵的最终发酵罐培养液样品能在血琼脂上表现出2种不同的菌落形态学。优势表型是灰色的，且表现为不规则形状的、扁平的和半透明的菌落。少数表型是白色的，且表现为平滑的、隆起和圆形的菌落。少数的白色菌落在形态学上与最初使用的大肠杆菌DH5克隆宿主菌株相同。后来确定，2种细胞表型存在于用于发酵的前主(Pre-Master)、主(Master)和工作细胞库中(表1)。
表1.流感NP和M1构建体的细胞库和发酵液中的白色和灰色表型菌落群体。
  铺来板的样品   ％白色表型   ％灰色表型
  细胞库的M1源材料M1前主种子M1主种子M1工作种子M1F38904 GMP发酵细胞库的NP源材料NP前主种子NP主种子NP工作种子NPF38951 GMP发酵   未测试100％1％2.5％1.5％100％100％86％1％1％   未测试0％99％97.5％98.5％0％0％14％99％99％
在用于维持培养物的化学成分确定的琼脂(DME-P5)上没有检测到2种表型的存在，因为当在37℃、在该琼脂上温育48小时时，2个菌落类型的表现相同。因此，通过一式两份地在血琼脂和DME-P5琼脂平板上划线，得到了每种表型的分离的菌落。当对应的血琼脂平板含有灰色菌落的均一群体时，从化学成分确定的琼脂(DME-P5)平板上，分离了纯的灰色菌落。
为了进一步检查灰色和白色克隆分离物，将分离的菌落在含有新霉素的DME-P5琼脂平板(这些培养物中的质粒载体含有新霉素抗性标记)、缺乏新霉素的DME-P5琼脂平板和大肠杆菌鉴别琼脂(LESEndo和Levine EMB琼脂)上划线。含有质粒的细胞可以在有或没有新霉素的DME-P5平板上生长。LES Endo和Levine EMB琼脂是用于区分和鉴定革兰氏阴性肠杆菌科和大肠杆菌的选择性琼脂。在上述琼脂上，评价了从GMP发酵和工作细胞库分离的大约50个菌落。所有克隆分离物都能在补加了新霉素的DME-P5平板上生长，表明它们含有能赋予抗性的质粒。通过流感NP和M1构建体的琼脂糖凝胶电泳，证实了质粒在2种表型中的存在。这些克隆分离物在鉴别琼脂平板上的生长对大肠杆菌是一般的。API20E分析得到的优秀的大肠杆菌特征匹配进一步证实，灰色和白色克隆确实是大肠杆菌。为检测2种类型的菌落的相关性而在代表性的菌落上进行的FAME(脂肪酸甲酯)分析表明，克隆分离物彼此相同，且与DH5克隆宿主菌株相同，而无论它们在血琼脂上的表型。上述结果有力地证实，灰色和白色菌落不是不同的生物，而是大肠杆菌DH5的表型变体。
开发了筛选测定，以使用肉眼检查区分2种菌落形态学。系列地稀释流感M1白色和灰色克隆分离物的混合物，将其铺平板到5％Columbia羊血琼脂平板上，并在30℃、37℃或42℃温育特定的时间段。表型分化的最佳条件是，在30℃温育48小时时间段。该血琼脂表型筛选测定用于所有将来的铺平板实验，并用作筛选处于开发中的以后的构建体的高生产者的重要工具。
实施例2
大肠杆菌DH5灰色表型富集研究
流感M1灰色表型富集研究-使含有流感M1 DNA质粒载体的白色和灰色表型菌落的分开的培养物在DME-P5化学成分确定的培养基上生长至指数期。然后，以相等的比例混合培养物，并用于接种新瓶的DME-P5培养基。每个富集瓶的起始OD600是0.001。使混合的培养物生长17代，然后接种进第二个富集瓶。这能确保，细胞在每个转移步骤处于指数生长中。该过程重复共4次富集。将来自每个富集步骤的细胞等分试样冷冻在40％甘油(v/v)中，并通过实施例1所述的血琼脂表型筛选测定进行分析，以确定富集后灰色表型菌落的百分比。
HIV-Gag灰色表型富集研究-使用携带HIV-Gag基因的构建体，建立了动态富集实验。以下述比率，混合HIV-Gag白色菌落和HIV-Gag灰色菌落的纯培养物：100％灰色、5％灰色、20％灰色、50％灰色、70％灰色和0％灰色。使每个瓶都在DME-P5化学成分确定的培养基中生长17代，并与流感M1灰色表型富集研究所述类似地转移5次。每次富集后，取出细胞的等分试样，并冷冻在40％甘油(v/v)中。在实验结束时，系列地稀释这些样品，并通过实施例1所述的血琼脂表型筛选测定进行分析，以计算富集后灰色表型菌落的群体。
结果-进行2个单独的实验，以研究在DME-P5化学成分确定的培养基中生长的过程中，富集灰色表型大肠杆菌DH5菌落的观察结果。使用流感M1和HIV-Gag构建体两者来确定富集现象是否是构建体特异性的。
流感M1灰色表型富集研究证实，在测试的生长条件下，灰色表型菌落具有超过白色菌落的选择生长优势。在DME-P5培养基的4次富集过程中，流感M1灰色菌落的百分比从44％增加至89％(图1)。
为了进一步检查该现象，使用HIV-Gag构建体，进行动态富集实验。使用不同比率的白色∶灰色HIV-Gag表型菌落来接种DME-P5培养基。每个实验瓶共进行5次富集。3次富集(51代)后，在所有实验瓶中，得到的细胞群体由超过95％的灰色表型菌落组成(图2)。此外，最初具有100％灰色菌落的瓶没有表现出任何向白色表型的回复；而从100％白色菌落开始的瓶确实在第5次富集后表现出2-10％灰色表型菌落增加。
基于这些发现，在从4个单独的大肠杆菌构建体(流感M1和NP、单纯疱疹病毒gD和HIV-Gag)得到的白色和灰色分离的培养物上，进行了动态生长研究。使每个构建体的灰色和白色表型菌落的纯培养物在DME-P5培养基中单独地生长，且在指数生长过程中，得到了每个培养的生长曲线，以确定它们的比生长速度(表2)。在所有情况下，灰色表型表现出了轻微超过白色表型的生长速度优势(Δμ＝0.01-0.06)，这支持了在不均匀灰色/白色群体中较早发现灰色表型菌落的富集。
表2.从DNA疫苗培养物分离的灰色和白色表型菌落的比生长速度(μ)
  M1白色   M1灰色   NP白色   NP灰色   gD白色   gD灰色   HIV白色   HIV灰色
  μ   0.44   0.47   0.45   0.46   0.39   0.44   0.40   0.46
  Δμ(灰色-白色)        0.03        0.01        0.05        0.06
实施例3
质粒DNA浓度与大肠杆菌DH5的灰色表型菌落的关联
转化-使用2种方法来转化大肠杆菌DH5细胞，以得到要筛选质粒生产力的克隆分离物。对于第一种方法，将100ng(2μL)质粒DNA加入100μL大肠杆菌DH5感受态细胞。使用标准的分子生物学实践，制备了感受态细胞。将该混合物在冰上保藏30分钟，然后在42℃热处理90秒。将这些管在冰上冷却，然后将800μL DME-P5培养基加入每个管。然后，在37℃温育这些管90分钟，以恢复抗生素抗性。然后，将回收的培养物铺平板到DME-P5琼脂平板上，并温育36小时，以得到转化体。第二种转化方法使用电转化和Bio-Rad脉冲发生器(Hercules，CA)系统。对于该方法，将80μL感受态细胞与0.5-4.0μg质粒DNA相混合。将该混合物转移到冷电穿孔杯中，并在1.8kV的环境中脉冲一次。向该杯中加入1.0mL DME-P5培养基。将该悬浮液转移到无菌的15mL离心管，并在37℃温育3小时，以恢复抗生素抗性。恢复阶段后，将悬浮液铺平板或稀释到DME-P5培养基中，并在37℃温育，以得到转化体。
23升发酵-用0.1％(v/v)解冻的种子悬浮液接种含有15L DME-P5化学成分确定的培养基的23L生物反应器。在150rpm搅拌(最小调定点)和0.3巴背压，并以7.5L/m的速度喷射空气，来运行生物反应器。通过计算机控制的搅拌的直线上升(ramping)，将溶解氧张力维持在30％。将pH控制在7.2。当OD600是8-10时，气流和背压分别增加至12L/m和1巴，并以3.2mL/L/分钟的速度，补加由50％甘油(v/v)：25％L-谷氨酸(w/v)组成的溶液。发酵进行50小时。使用细胞裂解和HPLC阴离子交换方法，确定比生产力。
DME-B12培养基-DME-B 12培养基是基于DME-P5培养基的。DME-B 12培养基由下述成分组成：7.0g/L KH2PO4、14.0g/LK2HPO4、3.0g/L(NH4)2SO4、0.5g/L NaCl和2ml/L甘油。用50％NaOH将pH调节至7.2，然后在液体循环的高压灭菌器中灭菌30分钟。当冷却时，加入痕量元素混合物的1∶1000稀释液，其由溶解在10％HCl中的下述痕量元素组成，并过滤灭菌：27g/L氯化铁(FeCl3·6H2O)、2.0g/L氯化锌(ZnCl2·4H2O)、2.0g/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、2.0g/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、1.0g/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、1.27g/L氯化铜(CuCl2·2H2O)和0.5g/L硼酸(H3BO3)。将该DME-B 12/痕量元素混合物保藏在4℃。当使用培养基时，加入下述Th/Mg/Neo溶液的1∶120稀释液：24g/L盐酸硫胺素、240g/L MgSO4·7H2O和9.6g/L硫酸新霉素。
摇瓶发酵(SFF)-该方法是上述的23-L发酵方法的缩小版，且其使用250mL测试瓶装置。将瓶设计成，在它们的帽上有用于补料送递的孔。使测试培养物在DME-B 12培养基中生长至指数期(OD600＝1.5-2.5)。一旦培养达到该阶段，则以6.4μL/h/mL培养液的速度，补加由4.6％甘油(v/v)和2.9％L-谷氨酸(w/v)组成的溶液。使用Watson Marlow 205U泵(Wilmington，MA)来送递补料溶液。在220rpm恒定搅拌下，在37℃温育瓶40小时。使用细胞裂解和HPLC阴离子交换方法测定比生产力。
细胞裂解方法-测量了23L发酵或SFF OD600样品，并制备OD10沉淀(10/OD培养物＝在14,000rpm、5分钟离心的μl样品)。去除上清液，使用标准的分子生物学试剂，如下所述裂解沉淀。将沉淀首先重新悬浮在0.5mL STET缓冲液(8％蔗糖、5％Triton X-100、50mMEDTA、50mM Trizma碱)中，然后加入0.5mL溶菌酶溶液(4mg/mL)。涡旋管，以重新悬浮细胞。然后，在37℃温育管45分钟，并置于沸水浴中1分钟。沸腾后，在14,000rpm离心管15分钟。然后，将上清液倒入标记的HPLC小瓶中，其中加入了10μL核糖核酸酶。然后，通过阴离子交换色谱分析上清液，以定量超螺旋的质粒DNA的量。
阴离子交换HPLC-使用Waters HPLC系统(Milford，MA)，其包含3个泵、紫外检测器、自动注射器和PC计算机系统，从裂解的发酵样品分离了超螺旋的和松弛的质粒DNA。使用GEN-PAK FAX阴离子交换柱(4.6×100mm)(Waters Corporation)。使用溶于25mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8中的1M NaCl梯度(缓冲液B)，进行分离。缓冲液A等于没有NaCl的缓冲液B。使用0.04M磷酸溶液(缓冲液C)来洗涤注射之间的柱。使用0.75mL/分钟的恒定流速。从35/65(v/v)A∶B的初始梯度、3分钟增加到25/75(v/v)A∶B、超过30分钟。然后，用缓冲液C洗涤柱6分钟，随后用缓冲液B洗涤10分钟。将系统重新平衡回70/30(v/v)A∶B 13分钟，然后进行下一次注射。在260nm的检测表明，10分钟后洗脱了超螺旋的质粒DNA，且9.5分钟后洗脱了松弛的、开环的质粒DNA。将超螺旋的质粒DNA的比生产力报道为μg质粒DNA/mL OD2沉淀或μg质粒DNA/mg DCW(干细胞重)。
结果-总结在表1和图1中的从流感NP和M1细胞库培养物和GMP发酵样品的铺平板实验得到的数据表明了高质粒生产力和本文鉴定的灰色表型菌落之间的关联。流感M1和NP的GMP发酵分别产生了36μg/mg DCW和31μg/mg DCW的超螺旋质粒DNA效价。在所有情况下，培养液由99％灰色表型菌落组成。从流感M1和NP白色和灰色分离物的细胞裂解物测定了质粒拷贝数，从而证实了从灰色表型菌落分离的微生物细胞含有比从白色表型菌落分离的细胞更高的质粒拷贝数。
从用流感构建体进行的工作看显而易见的，当选择转化后的灰色表型菌落时，可以生产高水平的质粒DNA。几个其它的构建体显示了灰色表型菌落和高质粒产量之间的类似关联(表3)。对于一个构建体，具体地是HSV-gD，生产力从＜1μg/mL增加至20μg/mL OD2沉淀的超螺旋的质粒DNA。这可以通过从由仅仅14％灰色表型组成的混合培养物分离灰色表型菌落来实现。在摇瓶发酵系统或23-L生物反应器中，测试了来自该混合物的3种单独的灰色克隆分离物。每种生成≥15μg/mL OD2沉淀的超螺旋的DNA。
表3.白色和灰色克隆分离物的生产力数据
  在23L或SFF规模发酵的分离物  生成的超螺旋的质粒DNA(μg/mL/OD2沉淀)
  HSV-gDm.7混合培养物(86％白色/14％灰色)HSV-gDm.7-灰色分离物N-11AHSV-gDm.7-灰色分离物N-19AHSV-gDm.7-灰色分离物N5-1A流感M1白色分离物流感M1灰色分离物流感NP白色分离物流感NP灰色分离物HSV-ΔgB白色分离物HSV-ΔgB灰色分离物HIV-Gag白色分离物HIV-Gag灰色分离物  ＜1152320＜123719＜120＜322
实施例4
富集大肠杆菌DH5的灰色表型菌落的选择策略
开发了2个策略，来选择和富集转化后的大肠杆菌DH5的灰色表型菌落。第一个策略依赖于下述事实，即灰色表型菌落能表现出比白色表型菌落更高的比生长速度。因而，经过连续富集，灰色菌落能竞争过白色表型。对于该方案，在DME-P5化学成分确定的培养基中富集转化的和回收的细胞，随后铺平板到血琼脂和DME-P5琼脂平板上。基于在它们对应的血琼脂平板上检测到的灰色表型菌落的百分比，从DME-P5平板挑取单个菌落。该策略用于鉴定能编码病毒蛋白的3种质粒HSV-gB、HIV-Gag和HIV-env的高质粒DNA克隆分离物。在这些富集过程中，灰色表型细胞的百分比总是稳定在富集瓶的总细胞群体的5-15％之间。
在开发用于分离高产的灰色克隆分离物的第二个策略时，当铺平板到DME-P5化学成分确定的琼脂平板上并在37℃温育5天时，观察到最初的转化的、回收的细胞群体表现出2种不同表型。检测到奶油色菌落和具有褐色靶心的奶油色菌落。奶油色菌落能产生需要的高产灰色表型菌落，而带有褐色中心的奶油色菌落不能。这也被HSV-gD证实。HSV-gD、N-11A、N-19A和N5-1A的灰色克隆分离物(表3)，都在DME-P5化学成分确定的琼脂上生成了奶油色菌落，并在血琼脂上生成了灰色菌落。这些克隆分离物也表现出高效价的超螺旋的质粒DNA。在DME-P5化学成分确定的琼脂上形成带有褐色中心的奶油色菌落的分离物都不能生成高质粒DNA效价或产生灰色表型。但是，挑取并在液体DME-P5培养基中扩张的能在DME-P5琼脂上表现出奶油色形态的单个菌落，产生了由白色和灰色表型组成的混合群体。因此，转化后在DME-P5化学成分确定的琼脂平板上得到的奶油色菌落倾向于生产灰色表型。这表明，在转化后选择富集阶段，灰色表型从单个菌落发展而来。尽管并非每个奶油色分离物都能产生灰色表型，但它们是灰色表型已经从其发展的唯一菌落类型。因此，重要的是，通过一式两份地在血琼脂和DME-P5化学成分确定的琼脂平板上铺平板，来选择灰色表型菌落，以确保选择高产克隆分离物。
实施例5
主细胞库生产的改进方案
使用上述的改进的选择和富集技术，得到了高产分离物，其用作生产3种DNA疫苗构建体(HSV-ΔgB、HSV-gD和HIV-Gag)的前主、主和工作种子原种培养物的种子培养物。当对比为这些构建体生产的前主、主和工作细胞库培养物的血琼脂铺平板结果和以前得到的流感M1和NP构建体的结果(表1)时，消除了原来存在于主细胞库培养物中的表型多样性，并得到了高质粒生产性菌株(表4)。这对于从这些构建体生产的临床材料是极其关键的，因为不均匀的大肠杆菌群体可能对发酵方法的一致性和产量具有影响。HIV-Gag构建体的工作细胞库培养物以后用于GMP发酵，以生产用于临床研究的细胞糊。在该发酵方法中，没有检测到培养不均匀性。在富集研究过程中，灰色表型也没有表现出向白色表型的任何回复(图2)，从而表明该表型的稳定性。
表4.HSV-ΔgB、HSV-gD和HIV-Gag构建体的细胞库铺平板结果的总结
铺平板的样品   ％灰色表型   比生产力(μg质粒DNA/mLOD2沉淀)
HSV-ΔgB前主种子HSV-ΔgB主种子HSV-ΔgB工作种子HSV-gD前主种子HSV-gD主种子HSV-gD工作种子HIV-Gag前主种子HIV-Gag主种子HIV-Gag工作种子   ＞99％＞99％＞99％＞99％＞99％＞99％＞99％＞99％＞99％   未测试2217未测试1922未测试2023
实施例6
通过培养大肠杆菌DH5制备用于生产质粒DNA的种子原种
使用装在来源小瓶中的根据上述方法选择的且携带V1Jns HIVFlgag质粒的大肠杆菌DH5高质粒生产性菌株的冷冻细胞的等分试样，接种3个含有200mL培养基A的2-L带挡板的摇瓶(每个瓶接受200μL)(表5)。在摇动(在50mm摇动直径的定轨摇床上，以180-rpm)下，在37±0.5℃温育所述瓶。2个瓶用于监控目的，且第3个瓶用于制备冷冻细胞悬浮液。当监控瓶的培养物的光密度(OD600)达到5-9范围的值时，再检查来源瓶的光密度，以确保它也已经达到类似值。然后，在湿冰上冷却来源瓶。将等体积的冷却的溶于水中的40％甘油溶液(v/v)加入瓶的内容物中。将混合的悬浮液分配到(约1mL)冷冻小瓶中，后者立即在干冰上瞬间冻结，并在-65℃保藏。该第一步种子原种标记为“前主”。解冻来自前主小瓶的冷冻悬浮液，并根据上述方案，用于制备主种子原种。解冻来自主小瓶的冷冻悬浮液，并根据相同的方案，用于制备工作种子原种。
表5.确定的培养基A。
  组分   浓度
  KH2PO4 *K2HPO4 *(NH4)2SO4 *谷氨酸一钠*甘油*盐酸硫胺素1MgSO4·7H2O1硫酸新霉素1痕量元素2   7.0g/L7.0g/L6.0g/L5.0g/L10.0g/L0.20g/L2.0g/L0.08g/L1.0mL/L
*这些组分形成基础培养基。它们溶解在水中，且用50％NaOH
将pH调节至7.2。通过0.22μm膜，过滤灭菌基础培养基。
1：在使用当天，通过将硫胺素-HCl(24g/L)、MgSO4·7H2O(240g/L)和硫酸新霉素(9.6g/L)溶解在去离子水中，并过滤灭菌(0.22μm膜)，制备原液。将一定量的8.3mL/L该原液加入每升培养基中，以产生需要的终浓度。
2：将痕量元素溶于1.2N HCl中，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。通过0.22μm膜，过滤灭菌溶液。
实施例7
通过培养大肠杆菌DH5制备用于生产质粒DNA的大种子原种
通过用30mL培养基A(表5)填充2个250-mL带挡板的锥形瓶，制备了根据本文所述方法选择且携带V1Jns HIV Flgag质粒接种物的大肠杆菌DH5高质粒生产性菌株的冷冻细胞的实验室供给。通过将来自4-mL小瓶的30μL解冻的GMP HIV-FL-gag主种子移液到每个瓶中，接种每个瓶。在具有50mm摇动直径的定轨摇床(AdolfKühner AG；Birsfelden，瑞士)上，以220-rpm摇动，在37±0.5℃温育所述瓶。一个瓶用于监控，而第二个用作生物反应器的接种物来源。当监控瓶中的培养物在600nm的光密度(OD600)达到5-9范围的值(接种后大约26小时)时，测量来源瓶的OD600，以确保它已经达到类似值。
原位灭菌含有15L培养基B(表6)的30-L生物反应器(B.Braun Biotech，Inc.；Allentown，PA)，其与使用Gas Works软件(Thermo ONIX Corp.)的SCADA控制系统连接。用装配了18-号针的20-mL注射器，通过生物反应器孔中的无菌隔片，注射接种物，给制备的生物反应器接种15mL(0.1％v/v)如上所述制备的新摇瓶培养物。培养条件是：温度，37℃；背压，4.5PSI；气流，7.5slpm。同时在线测量并记录溶解氧水平(DO)、碳放出速度(CER)、摄氧速度(OUR)(Prima V质谱仪600型，Thermo ONIX Corp.，Houston，TX)、细胞密度(OD探头，Monitek，Bedford，MA)和pH。通过搅拌速度的自动反馈级联控制(250-750rpm)，将DO维持在调定点(大于或等于30％空气饱和)。通过自动添加无菌的30％NaOH溶液，将培养物pH维持在7.1±0.1。一旦达到对数期生长的中期，这通过CER的在线测量值等于35mmol/L/小时来指示，就将5-L体积培养物无菌地转移进含有5L 50％甘油溶液的无菌10-L塑料酸坛(carboy)中。将酸坛置于在生物安全柜中的磁搅拌板上，并连续混合内容物，以通过填充程序，提供细胞的均匀悬浮液。通过蠕动泵和灭菌的硅管，给500-mL瓶子(Nalgene)填充300mL工作种子。通过用干冰覆盖，初步冷却填充的瓶子，然后转移到-65℃冷冻机中保藏。
表6.确定的培养基B。
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1谷氨酸一钠1甘油1Ucon2盐酸硫胺素2MgSO4·7H2O2硫酸新霉素3痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L5.0g/L10.0g/L0.3mL/L0.20g/L2.0g/L0.08g/L1.0mL/L
1：将成分加入15L水中，并在123℃的地方蒸汽灭菌发酵罐25分钟。
2：制备了浓溶液(硫胺素：24g/L；MgSO4·7H2O：240g/L；硫酸新霉素9.6g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
3：将痕量元素溶于1.2N HCl，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。
在灭菌后加入痕量元素溶液。
接种之前，将培养基的pH调节至7.1。
实施例8
质粒定量的分析方法
细胞裂解-通过计算在1mL终体积中达到OD为10所需的培养体积，随后在14,000rpm离心Eppendorf Centrifuge 5415C(Westbury，NY)中的培养物5分钟，制备了用于裂解的来自每个样品的细胞。抛弃上清液，并将沉淀保藏在-70℃冷冻机中，直到裂解时。解冻后，将每种沉淀重新悬浮到500μL STET缓冲液(每升蒸馏水)：Tris-EDTA缓冲液(Sigma)，50mL；0.5M EDTA pH 8(Sigma)，190mL；蔗糖，80g；Triton X-100(Sigma)，20g；然后是500μL溶菌酶溶液(每升STET缓冲液：溶菌酶(Sigma)，0.4g)。在Eppendorf ThermomixerR(Westbury，NY)中，以500rpm连续摇动，将管在37℃温育45分钟。温育后，将管插入浮动支架(floating rack)，并置于沸水中1分钟。通过在14,000rpm，在Eppendorf Centrifuge 5415C中离心15分钟，分离细胞碎片。与10μL RNAce-It！核糖核酸酶混合物(Stratagene，La Jolla，CA)一起，将每个管的上清液转移进1.8mLHPLC小瓶。给每个小瓶加帽，并轻轻摇动，以混合内容物。
HPLC测定-使用装配了Waters Gen-Pak FAX柱(4.6×100mm)(Milford，MA)的HPLC系统(Gilson，Middleton，WI)，定量质粒DNA。用以0.75mL/分钟的速度送递的由缓冲液A和缓冲液B组成的流动相的基于梯度的洗脱，实现超螺旋的质粒DNA的分离。在测定的前2分钟期间，缓冲液A[每973mL HPLC-级H2O：1M Tris-HClpH 8.0，25mL；0.5M EDTA pH 8.0，2mL]的浓度从70％降至35％，而缓冲液B[每773mL HPLC-级H2O：1M Tris-HCl pH 8.0，25mL；0.5M EDTA pH 8.0，2mL；5M NaCl，200mL]的浓度从30％增加到65％。在该点，注射样品，并在35％缓冲液A和65％缓冲液B继续流动相7分钟，同时洗脱样品组分。流动相转换成100％缓冲液C[每升HPLC-级H2O：85％ H3PO4 HPLC-级，4.61mL]12分钟以进行清洗，在该点，流动相恢复至70％缓冲液A和30％缓冲液B。在25℃，进行260nm的检测。在这些条件下，大约5分钟后洗脱超螺旋的DNA。针对使用纯的质粒DNA产生的标准曲线，计算超螺旋的质粒DNA浓度。通过超螺旋的DNA峰的自动积分，计算个别和体积质粒产量，包括制备OD10沉淀和干细胞重测量(DCW)所需的细胞培养物的体积。
实施例9
质粒生产方法
质粒生产方法1-制备了20-L接种发酵罐，其含有大约12.7kg无菌的化学成分确定的培养基C(表7)。在环境温度解冻如实施例6所述制备的携带V1Jns HIV Flgag质粒的大肠杆菌DH5菌株的2个冷冻工作种子小瓶，且将6mL细胞悬浮液加入200mL盐水磷酸盐缓冲液(每升水；NaCl：7.0g，KH2PO4：0.2g，K2H2PO4：0.674g)。将整个体积泵入20-L接种发酵罐。最初的发酵条件如下：温度，37℃；气流，2L/分钟；搅拌，100rpm；和压力，0.5巴。pH初始值是7.0-7.1。在接种物生产过程中，不使用pH控制。当起始溶解氧水平从100％降低至50％时，在接种后约8-12小时，手动地将气流调定点增加至6L/分钟。随着需求的增加，通过将搅拌速度自动直线上升在100-800rpm的范围内，在发酵周期的剩余部分，将溶解氧水平维持在大于或等于30％的调定点。全部在线测量发酵液的溶解氧水平、CER、摄氧速度(OUR)、pH和细胞密度(使用Monitek OD探头和变送器)。在接种后约17-20小时，细胞达到对数期的中期，如在线测量CER和培养物密度所指示的，后两者分别达到约35-50mMoles/L/h和0.80-1.0吸光度单位(等于在600nm时的离线OD值8-10)。在那时使用转移瓶，将600mL种子培养物从接种发酵罐无菌地转移到1000-L生产发酵罐。
图3-5总结了为用于生产含有V1Jns gag质粒的细胞的一般接种发酵罐收集的关键数据。图3，小图A和B，清楚地表明，在所有时间都维持需氧培养，如通过控制气流和搅拌速度造成的溶解氧值大于30％饱和所证实的。代谢活性测量值CER和OUR(图4，小图A)和在线光密度监控(图4，小图B)的动力学清楚地表明，当细胞被转移到生产发酵罐时，其不受限制地活跃生长。最后，图5所示的数据表明，在活跃生长过程中，pH值下降，达到约6.70-6.65的最终值。
用大约600L无菌的、化学成分确定的培养基D(表8)，对1000-L生产发酵罐进行分批。起始发酵条件如下：温度，37℃；气流，200L/分钟；搅拌，100rpm；和压力，7.5PSI。将溶解氧水平维持在大于或等于30％空气饱和环境压力的调定点。通过在发酵周期中自动添加25％(v/v)磷酸或30％(v/v)氢氧化钠，将培养物的pH维持在7.0-7.2范围内。全部在线测量发酵液的溶解氧水平、CER、OUR、细胞密度(使用在线Monitek探头)和pH。在接种后约15小时，当在线测量CER读数约35-40mMoles/L/h和培养物密度读数约0.70-0.80吸光度单位(相当于在600nm时的离线OD值8-10)时，开始补加含有50％甘油和25％谷氨酸一钠的溶液。为了适应高溶解氧需要，且也为了维持DO＞30％，将容器压力和气流分别手动地增加至15PSI和600L/分钟(在补料开始时)，同时通过计算机反馈回路，自动直线上升搅拌。在35小时期间，泵入共计大约75L补料溶液(速度为大约2.66-3.66g/L/h)。在更低的调定值开始补料，且一旦呼吸活性(通过CER测量)已经达到峰值，则在2小时时间段期间手动增加到它的高值。
图6-9总结了为这些发酵收集的关键数据。在补料过程中，细胞以线性速度生长，其中CER和OUR分别维持在35-60mM/L/h和40-60mM/L/h之间的近似恒定值(图8，小图A和B)。培养约50小时后，最终的培养物密度是约1.5吸光度在线单位，这对应着约65单位的离线密度(在600nm时的OD)。图6(小图A和B)表明，由于增加背压、搅拌速度(rpm)和气流的组合，溶解氧(％)维持在或大于30％调定点。在峰需求(过程中约20小时)过程中，氧需求在约80mM/L/h达到峰值。通过在线光密度和质谱分析法读数，不断地监控细胞的生长和代谢。图8(小图A)表明，指数生长期发生在接种后最高达约20小时(对应着峰OUR和CER(小图B))，然后在该过程的补料阶段，达到更低的生长，这时呼吸活性和生长速度都直接依赖于营养物补料速度。最终的个别和体积质粒DNA生产力分别是24.45μg质粒/mg干细胞重和0.538g/L。
表7.确定的培养基C
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1NaCl2谷氨酸一钠2甘油3Ucon4盐酸硫胺素4MgSO4·7H2O4硫酸新霉素5痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L0.5g/L5.0g/L10.0g/L0.3mL/L0.20g/L2.0g/L0.08g/L1.0mL/L
对接种发酵罐分批，并用8kg纯化水灭菌。
1：制备10X浓盐溶液，并用50％NaOH将pH调节至7.2。将浓基础盐溶液过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
2：制备浓溶液(MSG：250g/L；甘油：500g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
3：将Ucon制备成溶于水中的稀溶液(1.5％)，热灭菌，并无菌转移到接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
4：制备浓溶液(硫胺素：24g/L；MgSO4·7H2O：240g/L；硫酸新霉素9.6g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
5：将痕量元素溶于1.2N HCl，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。制备稀溶液(12mL溶于200mL水中)，并过滤灭菌进接种发酵罐。
表8.确定的培养基D。
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1NaCl2谷氨酸一钠2甘油3Ucon4盐酸硫胺素4MgSO4·7H2O4硫酸新霉素5痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L0.5g/L5.0g/L10.0g/L0.3mL/L0.20g/L2.0g/L0.08g/L1.0mL/L
对生产发酵罐分批，并用525kg纯化水灭菌。
1：制备10X浓盐溶液，并用50％NaOH将pH调节至7.2。将浓基础盐溶液过滤灭菌进无菌酸坛。然后通过无菌的过滤装置，将无菌的10X溶液泵入发酵罐。使用60L总体积的10X溶液，产生需要的终浓度。
2：制备浓溶液(MSG：250g/L；甘油：500g/L)，并过滤灭菌进酸坛。在分批(12L)时，将浓溶液泵入发酵罐，以产生需要的终浓度。含有相同配方溶液的酸坛用于补料目的。
3：将Ucon制备成溶于水中的稀溶液(60％)，热灭菌，并无菌转移到接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
4：制备浓溶液(硫胺素：24g/L；MgSO4·7H2O：240g/L；硫酸新霉素9.6g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
5：将痕量元素溶于1.2N HCl，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。
将溶液(600mL)过滤灭菌进生产发酵罐。添加后，通过无菌过滤装置添加纯化水，使发酵罐的重量达到最多600kg。
通过添加无菌的NaOH(30％，溶于水中)或磷酸(25％，溶于水中)，控制发酵的pH。两种溶液都经过高压灭菌器灭菌。
质粒生产方法2-用15L培养基E(表9)，对30-L接种发酵罐进行分批。用300mL如实施例7所述制备的携带V1Jns HIV Flgag质粒的大肠杆菌DH5菌株的冷冻接种物，接种种子反应器。解冻程序由从冷冻机取出冷冻的Nalgene瓶，并将它置于静止的37℃水浴中组成，其中定期强烈手动摇动。发生完全解冻需要大约20分钟。随后，从水浴中取出瓶子，并将解冻的接种物无菌地转移到接种装置。操作条件如下：温度，37℃；气流，7.5L/分钟；搅拌，250rpm；和压力4.5PSI。pH的起始值是7.0-7.1范围。在接种物生产过程中，没有pH控制。随着需求的增加，通过将搅拌速度自动直线上升在250-750rpm的范围内，在发酵周期的剩余部分，将溶解氧水平维持在大于或等于30％的调定点。
在约7小时中，细胞达到35mM/L/h的碳放出速度(CER)。在此时，将75mL体积的接种物发酵罐转移到30-L生产发酵罐，后者含有15L培养基F(表10)。操作条件如下：温度，37℃；气流，7.5L/分钟；搅拌，250rpm；和压力，4.5PSI。通过自动级联控制搅拌速度在250-700rpm之间，并通过使气流和背压调定点分别从7.5增加到12L/分钟和从4.5增加到15PSI，将溶解氧水平维持在大于或等于30％空气饱和环境压力的调定点。在MSG-甘油补料时，进行这些增加。通过在发酵周期期间自动添加15％(v/v)磷酸或30％(v/v)氢氧化钠，将培养物的pH维持在7.0-7.2的范围内。全部在线测量发酵液的溶解氧水平、CER、OUR和pH。
在接种后约9.8小时，当在线测量CER读数约35mMoles/L/h时，以3.2g/L/h的恒定速度，自动开始补加含有50％甘油和25％谷氨酸一钠的溶液。为了适应伴随更高的细胞浓度的高溶解氧需要，且也为了维持DO＞30％，将容器压力和气流分别手动地增加至15PSI和12L/分钟(在补料开始时)。使用对搅拌器的计算机控制回路(从250rpm至750rpm)，另外控制DO大于30％。在45小时期间，泵入共计大约2.1L补料溶液。
达到19.9g/L干细胞重的最大生物量，且个别和体积质粒DNA生产力分别是29.6μg质粒/mg干细胞重和0.588g/L。图10(小图A和B)代表着CER、生长(OD600)和质粒生产特征。
表9.确定的培养基E
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1甘油1Ucon2盐酸硫胺素2MgSO4·7H2O2硫酸新霉素3痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L15.0g/L0.3mL/L0.20g/L2.0g/L0.08g/L1.0mL/L
1：将这些成分加入15L水，并在123℃，将发酵罐蒸汽灭菌25分钟。
2：制备浓溶液(硫胺素：24g/L；MgSO4·7H2O：240g/L；硫酸新霉素：9.6g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
3：将痕量元素溶于1.2N HCl中，作为原液。组分：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2·(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。
灭菌后，将溶液加入发酵罐。
接种之前，将培养基的pH调节至7.1。
表10.确定的培养基F
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1甘油1Ucon2盐酸硫胺素2MgSO4·7H2O3痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L15.0g/L0.3mL/L0.60g/L2.0g/L1.0mL/L
1：将这些成分加入15L水，并在123℃，将发酵罐蒸汽灭菌25分钟。
2：制备浓溶液(硫胺素：72g/L；MgSO4·7H2O：240g/L)，并过滤灭菌进发酵罐，以产生需要的终浓度。
3：将痕量元素溶于1.2N HCl中，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。
灭菌后，将溶液加入发酵罐。
接种之前，将培养基的pH调节至7.1。
补料溶液制备：制备浓溶液(MSG：250g/L；甘油：500g/L)，并在121℃高压灭菌30分钟。
质粒生产方法3-在含有15L培养基G(表11)的30L发酵罐中，培养携带V1Jns HIV Flgag质粒的大肠杆菌DH5菌株。用如实施例7所述制备并如本实施例方法2所述解冻的300mL体积的冷冻培养物，接种每个生产发酵罐(30-L)。发酵罐的操作条件类似于本实施例方法2所述的条件，例外是将最大搅拌调定点增加到800rpm。补料分批法包括，当碳放出速度(CER)达到35mmol/L/小时时，以恒定补料速度启动60％甘油补料溶液。在启动补料溶液后不同的时间点，收集样品，以监控质粒生产。在接种后48小时，终止该过程。
在2.0-12g/L/h的补料速度，表征了共18个生产批次。通过表征2个独立批次的最小值，测量每个补料速度对质粒产量的作用。在整个发酵过程中收集样品，并对每个测定2次质粒产量，以检查结果的标准差。在线分析包括，每个批次的OUR/CER监控和在线OD表征。图11(小图A)显示了为在8.0g/L/h的补料速度培养的一个批次得到的结果。代谢分析揭示，尽管硫胺素浓度随时间推移而降低，其在发酵结束时并未完全耗尽(图11，小图B)。在该方法的补料部分，甘油维持在不可检测的水平，且可能是限制性营养物。在整个培养过程中，铵浓度维持在2.5和1.5g/L之间(图11，小图B)。质粒含量的分析表明，在大于8.0g/L/h的恒定补料速度，比质粒产量没有相当大的增加(图12，小图A和B)。在8.0-12.0g/L/h的补料速度，达到大约30-32μg质粒/mg DCW个别产量的最大质粒效价。依赖于补料方案，能达到0.2g/L至1.3g/L的体积产量。
表11.确定的培养基G
  组分   浓度
  1KH2PO4 1K2HPO4 1(NH4)2SO4 1甘油1Ucon2盐酸硫胺素2MgSO4·7H2O3痕量元素   7.0g/L7.0g/L6.0g/L15.0g/L1.0mL/L0.60g/L2.0g/L1.0mL/L
1：将这些成分加入15L水，并在123℃，将发酵罐蒸汽灭菌25分钟。
2：制备浓溶液(硫胺素：72g/L；MgSO4·7H2O：240g/L)，并过滤灭菌进接种发酵罐，以产生需要的终浓度。
3：将痕量元素溶于1.2N HCl中，作为原液。组成：FeCl3·6H2O(27g/L)、ZnCl2(2g/L)、CoCl2·6H2O(2g/L)、Na2MoO4·2H2O(2g/L)、CaCl2·2H2O(1g/L)、CuCl2·2H2O(1.27g/L)和H3BO3(0.5g/L)。灭菌后，将溶液加入发酵罐。补料溶液制备：制备甘油浓溶液(600g/L)，并在121℃高压灭菌60分钟。接种之前，将培养基的pH调节至7.1。用50％氢氧化铵溶液，控制pH。

Claims (34)

1.生产质粒DNA的方法，其包含：
(a)选择携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的高产克隆亚型，其中与相同菌株的非选择的、转化的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数；和，
(b)在化学成分确定的培养基中，通过补料分批发酵，培养所述高产克隆亚型。
2.权利要求1的方法，其中所述步骤(a)中的选择包含：
(a)第一个选择步骤，其中分离携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的潜在高产克隆亚型；和，
(b)第二个选择步骤，其中测试所述在步骤(a)中分离的潜在高产克隆亚型，以确定哪个所述克隆亚型是高产的。
3.权利要求2的方法，其中所述大肠杆菌菌株是DH5。
4.权利要求2的方法，其中所述步骤(a)的潜在高产克隆亚型的菌落在血琼脂上是表型灰色的。
5.权利要求4的方法，其中在约30℃温育所述血琼脂约48小时。
6.权利要求2的方法，其中温育所述大肠杆菌直到已经形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体后，所述步骤(a)的潜在高产克隆亚型菌落在化学成分确定的琼脂培养基上在表型上是奶油色的。
7.权利要求6的方法，其中所述化学成分确定的琼脂培养基是DME-P5琼脂培养基。
8.权利要求7的方法，其中在约37℃温育所述化学成分确定的琼脂培养基约5天。
9.权利要求1的方法，其中所述步骤(b)中的化学成分确定的培养基包含选自下述的培养基：培养基C、培养基D、培养基E、培养基F和培养基G。
10.权利要求1的方法，其中在化学成分确定的培养基中，在步骤(b)中以工业规模培养所述大肠杆菌菌株的高产克隆亚型。
11.权利要求2的方法，其中在步骤(b)中，在小规模发酵系统中测试所述潜在高产克隆亚型，以确定哪个克隆亚型是高产的。
12.权利要求11的方法，其中所述用于测试潜在高产克隆亚型的生产力的步骤(b)的小规模发酵系统是使用化学成分确定的培养基的摇瓶发酵系统。
13.权利要求12的方法，其中所述化学成分确定的培养基包含DME-B 12培养基。
14.权利要求12的方法，其中当所述克隆亚型是在对数生长期中期时，将溶液连续补加给含有所述潜在高产克隆亚型的摇瓶。
15.权利要求14的方法，其中所述补料溶液包含约4.6％甘油(v/v)和约2.9％谷氨酸一钠(w/v)。
16.权利要求10的方法，其中所述化学成分确定的培养基包含选自下述的培养基：培养基C、培养基D、培养基E、培养基F和培养基G。
17.权利要求10的方法，其中所述培养步骤包含至少一个生产阶段发酵期。
18.权利要求17的方法，其中当所述克隆亚型是在对数生长期中期时，将溶液连续补加给含有高产克隆亚型的生产阶段发酵罐。
19.权利要求18的方法，其中所述补料溶液包含约50％甘油(v/v)和约25％谷氨酸一钠(w/v)。
20.权利要求18的方法，其中所述补料溶液包含约60％甘油(v/v)。
21.选择用于质粒DNA生产的大肠杆菌菌株高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：
(a)纯化携带DNA质粒的大肠杆菌菌株的菌落，其在血琼脂上在表型上是灰色的，其中灰色菌落代表着潜在高产克隆亚型；和，
(b)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与类似测试的相同菌株的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。
22.权利要求21的方法，其中所述大肠杆菌菌株是DH5。
23.权利要求21的方法，其中在约30℃温育所述步骤(a)中的血琼脂约48小时。
24.权利要求21的方法，其中在摇瓶发酵系统中、在化学成分确定的培养基中培养所述克隆亚型后，测定所述步骤(b)的潜在高产克隆亚型的生产力。
25.权利要求24的方法，其中所述化学成分确定的培养基包含DME-B 12培养基。
26.权利要求24的方法，其中当潜在高产克隆亚型是在对数生长期中期时，将溶液连续补加给摇瓶。
27.权利要求26的方法，其中所述补料溶液包含约4.6％甘油(v/v)和约2.9％谷氨酸一钠(w/v)。
28.选择用于质粒DNA生产的大肠杆菌菌株的高产克隆亚型的方法，其包含下述步骤：
(a)在化学成分确定的琼脂培养基上，温育携带DNA质粒的大肠杆菌菌株，直到形成奶油色菌落和带有褐色靶心的奶油色菌落群体；
(b)纯化所述来自步骤(a)的奶油色菌落，其中奶油色菌落代表着潜在高产克隆亚型；
(c)测试所述潜在高产克隆亚型的生产力，其中与类似测试的相同菌株的大肠杆菌克隆亚型相比，高产克隆亚型能表现出更高的每个细胞的质粒拷贝数。
29.权利要求28的方法，其中所述大肠杆菌菌株是DH5。
30.权利要求28的方法，其中在约37℃温育步骤(a)所述的化学成分确定的培养基琼脂约5天。
31.权利要求28的方法，其中在摇瓶发酵系统中、在化学成分确定的培养基中培养所述克隆亚型后，测定所述步骤(c)的潜在高产克隆亚型的生产力。
32.权利要求31的方法，其中所述化学成分确定的培养基包含DME-B 12培养基。
33.权利要求31的方法，其中当潜在高产克隆亚型是在对数生长期中期时，将溶液连续补加给摇瓶。
34.权利要求33的方法，其中所述补料溶液包含约4.6％甘油(v/v)和约2.9％谷氨酸一钠(w/v)。
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