CN117947001A - 一种耐热木聚糖酶突变体及其应用 - Google Patents
一种耐热木聚糖酶突变体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株木聚糖酶突变体及其应用。所述的木聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，通过基因工程的手段将含有突变基因的载体导入宿主中获得基因工程菌，通过发酵性能验证，其木聚糖酶酶活可达100000U/mL以上。所述木聚糖酶突变体最适pH为3.5，较突变前降低0.5，最适温度为45℃，在pH3.5、温度70℃的条件下处理24h，该酶相对活性仍剩余80％左右，与突变前相比耐热性得到提高，更有利于在纤维素生物转化行业和饲用酶制剂中进行应用。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耐热木聚糖酶突变体及其应用。
背景技术：
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一类包括多种内切酶和外切酶的复合酶系，能将木聚糖降解成低聚木糖或木寡糖，属于水解酶类。木聚糖酶在自然界中广泛分布，这对于降解自然界中的半纤维素起显著作用。已报道的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、曲霉、青霉、木霉等。另外，木聚糖酶在一些如蜗牛、海洋藻类、陆地植物组织、各种无脊椎动物和反刍动物瘤胃中也都存在。在发酵工业中霉菌和酵母菌应用广泛，工业发酵生产木聚糖酶的产生菌主要有：曲霉菌、青霉菌、芽孢杆菌属、链霉菌、酵母菌、木霉菌等。
木聚糖酶作为一种高效、绿色、安全的植物细胞壁水解酶类被广泛应用于实际生产中。微生物木聚糖酶来源广泛，品种多样，在一定程度上满足了工业生产的需求，在食品、饲料、制浆造纸、医药、化工、纺织、能源、环保等行业具有重要的应用价值。
木聚糖酶作为一种重要的饲用酶制剂，在家畜养殖中，向饲料中添加木聚糖酶后，能有效降解大分子物质，提高动物消化酶活性，促进营养物质的消化吸收。此外，木聚糖被降解后，由于低聚木糖能使双歧杆菌增殖，可有效的调节动物肠道微生态环境，从而提高动物的抗病及生产性能。为了适应不同饲料加工工艺及应用的需要，常需筛选耐高温的菌种，或采用基因工程及蛋白质工程手段改造木聚糖酶的属性，以满足各种因素对木聚糖酶的要求。
我国拥有着丰富的廉价木质纤维原料，每年产生的大部分农业木质纤维原料如玉米芯、麦麸、米糠、稻杆、玉米秆和甘蔗渣等正以一定数量递增，某些还会造成污染，危害生态环境。木聚糖酶作为一种纤维素转化用酶可以将这些丰富的半纤维素资源转化为有用产品，实现秸秆的大规模饲料化、能源化利用。因此进一步加强木聚糖酶作为一种纤维素生物转化用酶的研究和开发工作，对于解决我国资源短缺、非常规资源浪费的问题，具有极大的社会及经济效益。
野生菌株在发酵生产木聚糖酶的过程中存在很多缺点，如产量偏低、原料成本较高，难以大量发酵生产，且活力较低，另外天然木聚糖酶本身的一些酶学特性不能完全满足日益严苛的生产环境，在应用过程中受到一些限制。因此可以通过研究木聚糖酶在工程菌中的异源表达来实现木聚糖酶在实际应用中的限制问题。
本申请选择一株产木聚糖酶的木霉为实验材料，诱变并从中筛选克隆得到其中一个木聚糖酶基因，获得一种耐热的木聚糖酶突变体，并且通过构建毕赤酵母的表达载体，最终得到在毕赤酵母中表达较高木聚糖酶活力的工程菌，满足了纤维素生物转化工业生产和饲用酶制剂应用的需求，降低了生产成本，为进一步研究和开发工作奠定基础。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种酶活、耐热性提高的木聚糖酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。旨在解决木聚糖酶在工业生产中酶活力较低、纤维素生物转化、饲用酶制剂应用不理想的问题。
本发明具体通过以下技术方案实现：
首先由申请人实验室保藏的木霉(Trichoderma sp.)M014经过ARTP诱变的方法筛选获得一株诱变株，将木聚糖酶突变体编码基因从诱变菌株中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母GS115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株，并以此生产酶活、耐热性提高的木聚糖酶突变体。
本发明提供的技术方案之一：是一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体是在SEQ ID No.2所示的M014野生型木聚糖酶的基础上，发生以下突变中的至少一种获得的：将其中第61位丝氨酸突变为苏氨酸、第64位谷氨酰胺突变为组氨酸、第82位天冬氨酸突变为组氨酸、第238位赖氨酸突变为精氨酸、或第240位异亮氨酸突变为天冬酰胺；
优选地，所述木聚糖酶突变体为同时发生上述五个位点突变的突变体Ser61Thr/Gln64His/Asp82His/Lys238Arg/Ile240Asn，氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；
本发明还提供上述木聚糖酶突变体的编码基因；
进一步地，所述木聚糖酶突变体Ser61Thr/Gln64His/Asp82His/Lys238Arg/Ile240Asn的编码基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
所述木聚糖酶突变体Ser61Thr/Gln64His/Asp82His/Lys238Arg/Ile240Asn的酶学性质如下：
(1)最适pH：pH 3.0-4.5酶活稳定，最适作用pH 3.5；
(2)最适温度：40℃-65℃酶活稳定，最适作用温度为45℃；
(3)耐热性：该酶在pH 3.5、温度70℃的条件下，24h后酶活力仍存留80％以上。
本发明提供的技术方案之二：是包含上述木聚糖酶突变体编码基因的重组载体或重组菌株，将上述木聚糖酶突变体编码基因重新构建重组载体，并在毕赤酵母中高效表达，得到产高活力木聚糖酶的重组菌株，通过发酵、提取等技术获得高活力木聚糖酶；
进一步地，用于表达所述的木聚糖酶突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115；
进一步地，用于表达所述的木聚糖酶突变体的表达载体为pPIC9K质粒；
优选地，所述重组菌株是将SEQ ID No.3所示的木聚糖酶突变体编码基因连接表达载体pPIC9K，并在毕赤酵母GS115中表达所得。
本发明提供的技术方案之三：是技术方案二所述重组载体或重组菌株的应用，特别是在发酵生产SEQ ID No.4所示的木聚糖酶突变体中的应用。
本发明提供的技术方案之四：是SEQ ID No.4所示木聚糖酶突变体的应用，特别是在降解木聚糖中的应用；
进一步地，是在纤维素生物转化产业中的应用，如通过降解木质纤维原料中的木聚糖，使原料饲料化、能量化；
进一步地，是在饲用酶制剂中的应用，如在饲料中添加该木聚糖酶后，能有效降解大分子物质，提高动物消化酶活性，促进营养物质的消化吸收。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母或单字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.木聚糖酶突变体的标识
采用“原始氨基酸+位置+替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Ser61Thr表示位置61的氨基酸由野生型的Ser替换成Thr，位置的编号对应于SEQ ID No.2中野生型木聚糖酶的氨基酸序列编号。在本发明中，MT-1表示野生型木聚糖酶，AMT-2表示木聚糖酶突变体Ser61Thr/Gln64His/Asp82His/Lys238Arg/Ile240Asn，信息如下表：
有益效果：
本发明公布了一种全新的木聚糖酶突变体，该突变体具有酶活高，耐热性高的特点，该突变体发酵液酶活可达100000U/mL以上。
本发明获得的木聚糖酶突变体的最适反应pH在3.5，与野生型M014的木聚糖酶相比，最适反应pH降低了0.5，说明耐酸性提高。
本发明获得的木聚糖酶在pH 3.5、70℃的条件下，24h后酶活力仍存留80％以上，与野生型M014的木聚糖酶相比，耐热性显著提高。
附图说明：
图1最适pH曲线；
图2最适温度曲线；
图3耐热性曲线。
具体实施方式：
通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。
本发明提供一种酶活、耐热性提高的木聚糖酶突变体，该突变体筛选自一株由申请人实验室保藏的木霉菌株(Trichoderma sp.)M014经过ARTP诱变后获得的诱变株，通过基因测序得到突变的位点为将第61位丝氨酸突变为苏氨酸、第64位谷氨酰胺突变为组氨酸、第82位天冬氨酸突变为组氨酸、第238位赖氨酸突变为精氨酸、第240位异亮氨酸突变为天冬酰胺。本发明首先获得木聚糖酶突变体的编码基因，将该突变体编码基因与pPIC9K载体相连接构建重组质粒，转入相应宿主菌GS115中进行异源表达，发酵获得该突变体相应的木聚糖酶。该木聚糖酶具有较高的酶活力，适合工业化生产和纤维素生物转化行业及饲用酶制剂。
本发明涉及的部分材料和方法如下：
1、实验材料和试剂：
实验菌株和载体：野生型菌株为申请人实验室保存的木霉菌株M014；表达宿主菌及载体：GS115和pPIC9K均购于Novagen公司；宿主菌：DH5α。
主要试剂：DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、RNA提取试剂盒、pNPG、DNAmarker、琼脂糖、氨苄青霉素、桦木木聚糖、IPTG、X-gal：均购自上海生工；各种限制性内切酶：购自NEB公司。
实验仪器：凝胶成像仪(Bio-Rad)、蛋白电泳仪(Bio-Rad)、核酸电泳仪(Bio-Rad)、PCR扩增仪(Bio-Rad)、高速离心机(Eppendorf)。
2、本发明采用的木聚糖酶活力测定方法：
(1)酶活力的定义：
一定条件下(如未特别说明，所述条件为：37℃、pH为5.5)，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
(2)标准曲线的绘制：
称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70mL，再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH，用0.1mol/L乙酸溶液或0.1mol/L乙酸钠溶液调节至pH5.5，备用。
称取无水木糖1.0000g，加上述乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至100mL。
吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0mL，加入DNS试剂5mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别用上述乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100mL，制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL的木糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.00mL乙酸-乙酸钠缓冲液和5.0mL DNS试剂。电磁震荡3s～5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新制成的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
(3)酶活力测定方法：
吸取10.0mL木聚糖溶液(5mg/mL)，于37℃平衡20min。
吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，于37℃平衡10min。
吸取2.00mL经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s～5s。然后加入2.0mL木聚糖溶液，37糖保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁震荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL木聚糖溶液(已经过37℃平衡)，电磁振荡3s～5s，37℃精确保温30min。加入5mL DNS试剂，电磁震荡3s～5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁震荡3s～5s，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
(4)木聚糖酶酶活力计算公式：
式中：
X------样品的木聚糖酶活力，U/mL；
AE------酶反应液的吸光度；
AB------酶空白样的吸光度；
K-------标准曲线的斜率；
Co------标准曲线的截距；
M-------木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)＝150.2g/mol；
t-------酶反应时间，min；
n------试样的稀释倍数；
1000----转化因子，1mmol＝1000μmol。
本发明中，野生型木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
MKFSALLFTASLVAAMPASVYPTKVPVDDDSDDDCAETDARKEKDGLLFNAQYQPKAAYTSLAQAAGLKYFGSAVDNGYLSDAPYSKLADDVEEFGQLVPQGKFNFGGADQVVNFAAQNGFQGHLIVGETPSRSELAATFKRFTDLNVEVAITELDIRHELKVRGHALVWHSQLPQWVHNFQGHLIVGETPSRSELAATFFRAARAADPNAKLYINDYSIDDPNAAKLKAGMVANVKKWIYPTKVPVDDDSDDDCAETDANGVQAALQQMASTGVKEVAITELDIRSAPAADYATVTKACEPRQAQDSINKLIKNKGKTYSLRKDSPFTQVLGEEFVGIAFRAARAADPNAKLYINDYSIDDPNAAKLKAGMVANVKKWIYGTITDPNLLQSQQNNAIIKADFGQVTPENSMKWDATEPQQGGNPFQQGGAQPQQEQAAGESCQSN*。
本发明中，木聚糖酶突变体Ser61Thr/Gln64His/Asp82His/Lys238Arg/Ile240Asn的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示：
MKFSALLFTASLVAAMPASVYPTKVPVDDDSDDDCAETDARKEKDGLLFNAQYQPKAAYTTLAHAAGLKYFGSAVDNGYLSHAPYSKLADDVEEFGQLVPQGKFNFGGADQVVNFAAQNGFQGHLIVGETPSRSELAATFKRFTDLNVEVAITELDIRHELKVRGHALVWHSQLPQWVHNFQGHLIVGETPSRSELAATFFRAARAADPNAKLYINDYSIDDPNAAKLKAGMVANVKRWNYPTKVPVDDDSDDDCAETDANGVQAALQQMASTGVKEVAITELDIRSAPAADYATVTKACEPRQAQDSINKLIKNKGKTYSLRKDSPFTQVLGEEFVGIAFRAARAADPNAKLYINDYSIDDPNAAKLKAGMVANVKKWIYGTITDPNLLQSQQNNAIIKADFGQVTPENSMKWDATEPQQGGNPFQQGGAQPQQEQAAGESCQSN*。
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1木聚糖酶突变体AMT-2编码基因的获得
1.出发菌株：申请人实验室保藏的一株产木聚糖酶的木霉菌株M014。
2.培养基：
(1)种子培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨0.4％，磷酸二氢钾0.12％，硫酸镁0.5％，pH4.5，121℃灭菌20min；
(2)YPD固体养基：酵母膏1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、琼脂粉1.5％、pH 4.5、121℃灭菌20min；
(3)初筛培养基：YPD固体培养基添加1％桦木木聚糖，115℃灭菌20min；
(4)摇瓶复筛培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1.5％、玉米浆1％、硫酸铵1％、pH4.5、121℃灭菌20min。
3.ARTP诱变：
(1)取发菌株M014的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的三角瓶中振荡，使菌体分散，在摇床上振荡打散50min，然后用4层擦镜纸过滤，并进行梯度稀释，于血球计数板计数并调整孢子浓度为107-108个/mL左右，以此作为诱变出发菌悬液。
(2)开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。灭菌结束，取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为30s、60s、90s、120s、150s。
(3)每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布于初筛培养基平板上后置于30℃培养箱中培养5天，培养好后从平板上随机挑取长势良好的菌株，进行初筛。
4.突变株筛选
(1)初筛：将初筛培养基平板用1％刚果红进行染色20min，再用1mol/LNaCl脱色20min，根据透明斑的大小进行筛选，选择透明圈最大的7个菌株接种至YPD固体培养基平板上继续培育直至获得其纯培养物，7个菌株分别依次命名MA-01、MA-02、MA-03、MA-04、MA-05、MA-06、MA-07。
(2)复筛：然后对上述这7菌株进行3批次的发酵摇瓶复筛，经过摇瓶发酵试验，根据3批次的平均木聚糖酶活力，筛选得1株产木聚糖酶较高的菌株MA-03，复筛结果如下表：
5.木聚糖酶高产菌株MA-03的遗传稳定性实验
将木聚糖酶高产诱变菌株MA-03于筛选分离平板上划线分离培养，挑取生长情况较好的单菌落于斜面培养基，并于30℃培养5d，然后分别经种瓶增殖培养，摇瓶发酵培养，培养结束测定木聚糖酶酶活力。将该菌株连续传代培养，传代10次的摇瓶结果如下表所示：
将该突变菌株连续传代培养10代，实验结果表明，该突变菌株的遗传稳定性良好。
以诱变筛选获得的MA-03作为出发菌株，根据野生型木聚糖酶MT-1编码基因的核苷酸序列设计PCR引物(Forward/Rerverse)，5'端加入酶切位点Xho I，3'端加入酶切位点Not I，通过PCR得到突变体AMT-2的编码基因，经过测序得到其核苷酸序列为SEQ ID No.3，对应的氨基酸序列为SEQ ID No.4。
引物序列：
Forward：5’-GACCTCGAGTTAGTTGCTCTGGCA-3’(下划线为限制性内切酶Xho I识别位点)；
Rerverse：5’-CAGGCGGCCGCATGAAGTTCTCTGCC-3’(下划线为限制性内切酶Not I识别位点)。
在本发明中，通过野生型和突变体的核苷酸序列的比较，得到突变位点信息如下表：
实施例2重组载体pPIC9K-AMT-2的构建
分别对突变体AMT-2编码基因(SEQ ID No.3)和质粒pPIC9K进行Xho I和Not I酶切，回收产物，将回收后的AMT-2编码基因和pPIC9K按比例混合，用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布在LB(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养，经菌落PCR得到目的序列，测序比对均显示为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即所得重组载体含有正确的突变基因，将所得重组载体命名为pPIC9K-AMT-2。
实施例3重组质粒转化毕赤酵母
1.毕赤酵母GS115感受态细胞的制备
(1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5mL的YPD培养基，30℃，220r/min振荡过夜；
(2)取0.5mL的过夜培养的菌液，接种于50mL新鲜配制的YPD培养基，30℃，220r/min振荡培养，使OD600值达到1.3-1.5；
(3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；
(4)弃去上清液，加入50mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
(5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；
(6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；
(7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀；
(8)分装100μL/管至无菌EP罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。
2.线性化质粒的转化
将实施例2得到的阳性克隆子进行抽提得到重组质粒pPIC9K-AMT-2，用Sal I进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)GS115感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。
(1)将100μL感受态细胞移出至一新的无菌EP管中，加入10μL线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
(2)转化杯置于冰浴中5-10min，保持低温；
(3)电穿孔转化电击条件：1500V，200Ω，25μF，放电时间5ms左右，一次电击；
(4)电击后，马上在电击转化杯中加入1mL 4℃预冷的1mol/L的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
(5)在超净工作台上无菌操作涂布MD培养基(1.34％ YNB；4×10-5％生物素；2％葡萄糖平板)，150μL/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；
(6)在MD平板上筛选得到三株重组菌，经菌落PCR得到目的序列，测序比对均显示为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即所得重组菌株含有正确的突变基因，三株重组菌株分别命名为MD-01，MD-02、MD-03。
实施例4含有重组质粒pPIC9K-AMT-2的酵母菌的诱导表达
BMGY培养基配方：1.4％酵母浸出物，2.0％蛋白胨，0.1mol/L pH 5.5磷酸盐缓冲液，1.5％ YNB，3.5×10-5％生物素，1.5％甘油，其余为水。
BMMY培养基配方：1.4％酵母浸出物，2.0％蛋白胨，0.1mol/L pH 5.5磷酸盐缓冲液，1.5％ YNB，3.5×10-5％生物素，1.2％甲醇，其余为水。
将MD-01，MD-02、MD-03，以及采用实施例3同样方法以野生型木聚糖酶编码基因(SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)构建的重组菌株MD分别接种于装有30mL BMGY培养基的三角瓶中，30℃，200r/min培养至OD600为10左右，离心收集菌体，用35mL的BMMY诱导培养基重悬菌体，并在30℃，200r/min条件下继续培养60h，发酵液离心后测定上清中的木聚糖酶酶活，结果如下表。
| 菌株 | 木聚糖酶酶活(U/mL) |
| MD | 2782 |
| MD-01 | 6512 |
| MD-02 | 6425 |
| MD-03 | 6620 |
实施例5MD-03发酵性能验证
以实施例3获得的MD-03为生产菌株进行发酵罐培养生产木聚糖酶。
种子罐培养基配方：4.5％甘油，2.1％磷酸二氢铵，1.5％磷酸二氢钾，0.7％硫酸镁，1.0％硫酸钾，0.08％硫酸钙，0.5％氢氧化钾，其余为水，pH 5.5；
发酵罐培养基配方：4.5％甘油，2.1％磷酸二氢铵，1.5％磷酸二氢钾，0.7％硫酸镁，1.0％硫酸钾，0.08％硫酸钙，0.5％氢氧化钾，其余为水，pH 5.5；
碳源：55％甘油；
甲醇：纯甲醇；
种子罐培养：培养温度30℃，初始转速200r/min，初始风量2.0m3/h，通风搅拌培养，pH 5.0，溶氧保持30-40％，当溶氧低于30％时通过增加转速和风量进行控制，湿重增长至85g/L时移种；
发酵罐培养：培养温度30℃，初始转速200r/min，初始风量2.0m3/h，通风搅拌培养，接种量10％，pH 5.0，第0-15h周期，按流速600g/h流加碳源55％甘油，溶氧保持30-40％，当低于30％时通过增加转速和风量进行控制，培养菌体至湿重220g/L；第16h周期后，停补碳源，溶氧反弹至80％以上，保持0.5h；之后按照初始190g/h的速度流加甲醇，流加甲醇的过程通过调整补料速率控制溶氧保持30-40％，培养至总发酵周期为170h发酵结束。
采用以上发酵方法进行50L发酵罐放大验证实验，发酵周期170h，其3批次的发酵产酶情况如下表，平均产酶水平为105392U/mL，说明菌株MD-03不仅高产木聚糖酶而且其发酵性能以及其所产的木聚糖酶的酶活均具有一定的稳定性。
3批次基因工程菌的发酵产酶情况
| 批次 | 发酵周期(h) | 发酵活力(U/mL) |
| 1 | 170 | 105420 |
| 2 | 170 | 104556 |
| 3 | 170 | 106200 |
实施例6木聚糖酶的酶学性质
(1)最适作用pH
以实施例4所得重组菌MD-03发酵液上清液为突变后木聚糖酶样品，以MD发酵液上清液为野生型对照样品，采用本发明的木聚糖酶活力测定方法，在37℃的条件下，测定不同pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0条件下的相对酶活力，以两种酶各自测得的木聚糖酶最高酶活为基准100％。由图1可知，本发明木聚糖酶突变体在pH范围3.0-4.5酶活稳定，最适作用pH 3.5，其最适pH较对照降低0.5。上述结果表明，与突变前相比，本发明突变后的木聚糖酶在更高的酸性条件下的酶活力更高，其作用pH范围更为宽泛，更适合纤维素生物转化行业和饲用酶制剂。
(2)最适作用温度
以实施例4所得重组菌MD-03发酵液上清液为突变后木聚糖酶样品，以MD发酵液上清液为野生型对照样品，采用本发明的木聚糖酶活力测定方法，在pH3.5的条件下，测定不同温度30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃条件下的酶活力，以两种酶各自测得的木聚糖酶最高酶活为基准100％，计算相对酶活力，结果如图2所示，本发明木聚糖酶突变体在40-65℃酶活稳定，最适作用温度为45℃，相较于野生型木聚糖酶，最适反应温度没有变化，但是最适温度范围有提高。
(3)耐热性
以实施例4所得重组菌MD-03发酵液上清液为突变后木聚糖酶样品，以MD发酵液上清液为野生型对照样品，以各自不作处理的木聚糖酶酶活为100％基准，两个样品分别在pH3.5的条件下进行70℃保温处理，每隔2h，在温度37℃、缓冲液pH 5.5的条件下测定酶活力，计算剩余酶活，从图3中可以看出，在24h后，本发明木聚糖酶突变体相对活性仍存留80％以上，与野生型木聚糖酶相比，突变体木聚糖酶的耐热性有很大提高，说明本发明木聚糖酶突变体具有良好的耐热性。上述结果表明，与突变前相比，耐热性的提高使突变后的木聚糖酶更适合在纤维素生物转化行业和饲用酶制剂中应用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (10)
1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述木聚糖酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，表达载体为pPIC9K质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞毕赤酵母GS115。
7.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是将SEQ IDNo.3所示的木聚糖酶突变体编码基因连接表达载体pPIC9K，并在毕赤酵母GS115中表达所得。
8.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述木聚糖酶突变体中的应用。
9.权利要求1所述木聚糖酶突变体的应用。
10.如权利要求9所述木聚糖酶突变体的应用，其特征在于，所述木聚糖酶突变体在分解木聚糖中的应用，或在纤维素生物转化、饲用酶制剂制备中的应用。
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