CN112852654B - 一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株PAS_chr1‑3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用，该基因工程菌由原始毕赤酵母的PAS_chr1‑3_0141基因失活后改造得到。本发明首次敲除PAS_chr1‑3_0141基因，在固定化发酵过程中，可增加毕赤酵母在固定化发酵中的粘附作用，成膜能力提高，提高了发酵效率，提升了毕赤酵母基因工程菌产植酸酶的发酵性能，不仅提高了产物酶酶活，酶活性更强、更稳定，增加固定化发酵的成膜量、缩短发酵的时间，而且改造后的毕赤酵母基因工程菌能进行多批次连续发酵，在发酵上具有明显优势。

Description

一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其 构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程及微生物技术领域，具体涉及一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

磷是动物生长发育所必须的一种元素，所以多数饲料中都会添加植酸磷作为饲料添加剂。但在单胃动物如猪、鸡等体内，由于缺乏可以分解植酸磷的酶，使得大量的植酸磷没有得到有效利用进而以粪便的形式排出。这既没有让动物充分吸收生长需要的磷；又因为粪便中的磷对环境也造成了污染。植酸酶(phytases)是一种可以将植酸(即肌醇六磷酸)及植酸盐水解成肌醇和无机磷酸(或磷酸盐)的酶。因此，在饲料中添加可分解植酸磷的植酸酶是必要的，植酸酶不仅能提高动物对饲料中磷的利用率，同时还降低了植酸磷的抗营养作用，而且还减少了环境中的磷污染。

生物膜又称生物被膜，是一种微生物及其胞外基质形成的致密的、复杂的生物聚集体，由微生物细胞及其分泌的生物大分子如蛋白质、多糖、磷脂、脂肪酸等共同附着于有生命或无生命的介质表面而成。生物膜的存在，不仅作为屏障为细胞的生命活动创造了稳定的内环境，介导了细胞与细胞、细胞与基质之间的连接，而且还承担了物质转运、信息的跨膜传递和能量转换等功能。生物膜还有另一种重要的存在形式——固定化发酵过程中形成的生物膜，固定化细胞成膜后会表现出较高的底物耐/产物受性和更短的发酵时间。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇营养型酵母，因其具有调控严谨、表达强度高、基因的分子水平易操作和能进行蛋白后修饰等优点，许多异源蛋白都选择毕赤酵母作为表达载体。但是，在工业生产中，由于甲醇诱导时间长的问题使得发酵周期延长很多，不利用产物的分离。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述毕赤酵母基因工程菌的构建方法。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述毕赤酵母基因工程菌的应用。

发明思路：PAS_chr1-3_0141基因是毕赤酵母粘附相关基因，抑制固定化发酵过程中成膜，因此本发明选取PAS_chr1-3_0141基因作为改造对象。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株的毕赤酵母基因工程菌，所述毕赤酵母基因工程菌的PAS_chr1-3_0141基因失活。

其中，所述原始毕赤酵母为ACCC 21040，可在中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)购买得到。

其中，所述PAS_chr1-3_0141基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，PAS_chr1-3_0141基因失活后的序列如SEQ ID NO.1所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以原始毕赤酵母的基因组DNA为模板，扩增得到PAS_chr1-3_0141基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒pPIC3.5K为模板，扩增得到遗传霉素抗性标记G418基因；

(2)以步骤(1)所得PAS_chr1-3_0141基因的上游同源臂、下游同源臂和遗传霉素抗性标记G418基因为模板，通过overlap PCR扩增得到基因敲除片段；

(3)将步骤(2)得到的基因敲除片段电转化至原始毕赤酵母感受态中，即得PAS_chr1-3_0141基因失活的酿酒酵母基因工程菌。

步骤(1)中，扩增上游同源臂引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。

步骤(1)中，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

步骤(1)中，扩增下游同源臂引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示。

步骤(1)中，所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

步骤(1)中，扩增遗传霉素抗性标记G418基因引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示。

步骤(1)中，遗传霉素抗性标记G418基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(2)中，扩增基因敲除片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示。

步骤(2)中，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(3)中，用含有1g/L遗传霉素的YPD培养基筛选获得阳性转化子，得到敲除PAS_chr1-3_0141基因的毕赤酵母基因工程菌。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述毕赤酵母基因工程菌在提升成膜量中的应用。

上述毕赤酵母基因工程菌在产植酸酶中的应用也在本发明的保护范围之内。

其中，所述毕赤酵母基因工程菌发酵产植酸酶。

优选地，以所述毕赤酵母基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵产植酸酶。

进一步优选地，以所述毕赤酵母基因工程菌为发酵菌株，通过固定化，批次连续发酵产植酸酶。

其中，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体、人工无机高分子材料、复合材料作为固定化介质，优选为以棉纤维材料为固定化介质。

其中，所述发酵固定化，批次连续发酵具体为：将毕赤酵母基因工程菌种子液接种于固定化培养基中，培养；当酶活下降时，用发酵换液培养基替换发酵液，重复发酵。

其中，培养过程中，优选为每隔24h添加1mL甲醇。

其中，所述固定化培养基的配方为：12.5g/L酵母粉，25g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.3g/L三水合磷酸氢二钾，1.18g/L磷酸二氢钾，10mL/L甲醇，0.4mg/L生物素，100mL/L10％的甘油，溶剂为水。

其中，所述发酵换液培养基的配方为：12.5g/L酵母粉，25g/L蛋白胨，13.4g/LYNB，0.3g/L三水合磷酸氢二钾，1.18g/L磷酸二氢钾，10mL/L甲醇，0.4mg/L生物素，100mL/L10％的甘油，溶剂为水。

其中，所述发酵的温度为28-30℃。

其中，所述发酵是在200-300rpm转速的摇床中培养。

其中，所述发酵的时间为96-120h。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明首次敲除PAS_chr1-3_0141基因，在固定化发酵过程中，可增加毕赤酵母在固定化发酵中的粘附作用，成膜能力提高，提高了发酵效率，提升了毕赤酵母基因工程菌产植酸酶的发酵性能，不仅提高了产物酶酶活，酶活性更强、更稳定，增加固定化发酵的成膜量、缩短发酵的时间，而且改造后的毕赤酵母基因工程菌能进行多批次连续发酵，在发酵上具有明显优势。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1实施例1中PAS_chr1-3_0141基因上游同源臂、下游同源臂的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000的DNA marker；泳道2、3为PAS_chr1-3_0141基因下游同源臂；泳道4、5为PAS_chr1-3_0141基因上游同源臂。

图2实施例1中G418基因扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为DL5000的DNAmarker；泳道2、3为水；泳道4、5、6为G418基因扩增片段；泳道7为DL2000的DNA marker。

图3实施例1中PAS_chr1-3_0141基因缺失转化子的PCR鉴定电泳图；其中，泳道1、2为原始对照组；泳道3、4为阳性转化子；泳道5为DL5000的DNA marker。

图4为实施例2中原始菌(WT)与PAS_chr1-3_0141基因敲除菌(△0141)的OD570数据图。

图5为实施例3中原始菌(WT)与PAS_chr1-3_0141基因敲除菌(△0141)的产酶酶活数据图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在以下所实施的方案当中，本发明所选用的毕赤酵母菌株是ACCC 21040。

实施例1：PAS_chr1-3_0141基因敲除菌的构建

以下实施例中用到的引物如下：

PAS_chr1-3_0141-UP-F：TTATATGGATTCTGATCTGTAATATCC(SEQ ID NO.4)

PAS_chr1-3_0141-UP-R：gtattctgggcctccatgtcCATCTGATAACTATCATGAC(SEQ IDNO.5)

PAS_chr1-3_0141-DOWN-F：gaatgctggtcgctatactgGCAGATCCCGCCAAGAAAGT(SEQID NO.6)

PAS_chr1-3_0141-DOWN-R：GATCTGAAAACCGGATCCACCTAAGATAGAAAGTA(SEQ IDNO.7)

G418-PAS_chr1-3_0141-F：CGTCATGATAGTTATCAGATGgacatggaggcccagaatac(SEQID NO.8)

G418-PAS_chr1-3_0141-R：ACTTTCTTGGCGGGATCTGCcagtatagcgaccagcattc(SEQID NO.9)

一、PAS_chr1-3_0141基因敲除片段的构建

(1)以原始毕赤酵母ACCC 21040的基因组为模板，用普通PCR以PAS_chr1-3_0141-UP-F、PAS_chr1-3_0141-UP-R(序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)为引物扩增得到PAS_chr1-3_0141基因上游同源臂；用普通PCR以PAS_chr1-3_0141-DOWN-F、PAS_chr1-3_0141-DOWN-R(序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示)为引物扩增得到PAS_chr1-3_0141基因下游同源臂。

PCR反应体系见下表1，反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸2min；变性、退火、延伸三个步骤循环30次；68℃再延伸10min。其中，退火的温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb/min)。PCR完成后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图1，切胶回收得到PAS_chr1-3_0141基因的上游、下游同源臂扩增片段，上下游同源臂扩增片段核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。

表1 PCR反应体系

(2)以质粒pPIC3.5K(淼灵)为模板，用普通PCR以G418-PAS_chr1-3_0141-F、G418-PAS_chr1-3_0141-R(序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示)为引物扩增得到G418基因扩增片段。

PCR反应体系见下表2，反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸2min；变性、退火、延伸三个步骤循环30次；68℃再延伸10min。其中，退火的温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb/min)。PCR完成后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图2，切胶回收得到遗传霉素抗性标记G418基因扩增片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表2 PCR反应体系

(3)以步骤(1)所得G418基因的上下游同源臂及步骤(2)所得遗传霉素抗性标记G418基因为模板，以PAS_chr1-3_0141-UP-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)为上引物、PAS_chr1-3_0141-DOWN-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)为下引物，运用overlap PCR技术扩增得到PAS_chr1-3_0141基因敲除片段。

PCR反应体系见下表3，反应条件为：95℃预变性4min；94℃变性10s；60℃退火30s；68℃延伸2min；变性、退火、延伸三个步骤循环30次；68℃再延伸10min。其中，退火的温度取决于引物的Tm值，68℃的延伸时间取决于扩增片段的长度(1kb/min)。PCR完成后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图3，切胶回收得到毕赤酵母PAS_chr1-3_0141基因敲除组件。其中敲除片段的核苷酸序列见SEQ ID NO.1。

表3 PCR反应体系

二、毕赤酵母菌株感受态制备

(1)挑取毕赤酵母菌株ACCC 21040接种于YPD液体培养基，在30℃、200rpm条件下过夜培养，得到活化的种子液；

(2)按照1：10的体积比接种，将种子液转接到100mL的新鲜YPD液体培养基，在30℃、200rpm条件下继续培养至OD600的值在0.8-1.2之间；

(3)将步骤(2)得到的菌液冰浴预冷30min后，用低温高速离心机4℃、6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；

(4)用10mL 4℃的无菌水轻柔重悬菌体后，用低温高速离心机4℃、6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，重复2次；用10mL 4℃的山梨醇水溶液轻柔重悬菌体后，用低温高速离心机4℃、6000rpm离心5min，弃上清，收集菌体，重复3次；

(5)用1mL 1M山梨醇水溶液轻柔重悬菌体后，分装成每管90μL。

三、毕赤酵母菌株感转化及转化子的鉴定

(1)取1管步骤二(5)分装的感受态细胞，加入10μL步骤一(3)得到的基因敲除片段，冰浴30min；

(2)将混合液转移至电转杯中，冰浴5min；

(3)用纸巾擦干电转杯表面水分后，放入电转仪，1.5kv电击4.9ms；

(4)电转后至超净台，加入1mL YPD培养基将电转液洗出，于30℃、200rpm培养2h；

(5)挑取步骤(4)得到的转化子并提取基因组作为模板，使用验证引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示)进行菌落PCR扩增以鉴定PAS_chr1-3_0141基因被敲除的阳性转化子；PAS_chr1-3_0141基因敲除后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(6)挑选阳性转化子ACCC 21040-△0141接入5mL含有1g/L遗传霉素的YPD液体培养基中活化24h，与灭菌的30％甘油1：1混合，-80℃保藏。

实施例2：结晶紫染色实验

(1)将甘油菌WT(原始菌ACCC 21040)和△0141(实施例1构建得到的敲除菌)各取100μL加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养，活化；

(2)按照体积比1：10的比例，将步骤(1)活化的菌液转接至100mL的YPD液体培养基，在30℃、200rpm条件下继续培养至菌液OD600值在0.8-1.2之间；

(3)取2mL菌液在OD600下测吸光度值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为0.01；

(4)取200μL稀释后的菌液加入96孔板中，用液体培养基做对照，37℃培养3天、5天和7天；

(5)将96孔板中菌液倒出，取200μL 0.01M PBS缓冲液清洗2-3次，拍干；

(6)取200μL 1％结晶紫溶液加入96孔板，染色10-20min，再用PBS缓冲液冲洗2-3次，拍干；

(7)取200μL冰醋酸加入96孔板溶解生物膜，轻轻振荡40min，测量OD600生物膜产率，取平均值。实验结果如图4所示，表明敲除PAS_chr1-3_0141基因的毕赤酵母生物膜明显增多。

实施例3：基因工程菌固定化发酵实验

(1)平板活化：将冻存保藏的原始毕赤酵母菌株(WT)和基因工程菌(△0141)接种到平板培养基上，恒温培养箱中30℃静置培养3-4天活化。

(2)种子液生长：取活化好的单菌落转接于装100mL种子培养基的500mL摇瓶中，于28-30℃，250rpm摇床中培养22-24h。

(3)固定化反复批次发酵：将相同体积的固定化培养基补入摇瓶中，于28-30℃，250rpm摇床中培养72-120h，每隔24h添加1mL甲醇，中途测定植酸酶酶活，当酶活达到最高并开始下降时，将瓶中的发酵液全部移出，再补入新的发酵换液培养基进行下一批发酵。基因工程菌(△0141)连续生产12批，产酶酶活水平基本没有下降，而原始毕赤酵母菌株(WT)从第11批次开始产酶酶活水平开始下降。

其中，酶活的定义为在温度37℃、pH5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

其中，种子培养基成分：12.5g/L酵母粉，25g/L蛋白胨，13.4g/L无氨基酸酵母氮源(YNB)，0.3g/L三水合磷酸氢二钾，1.18g/L磷酸二氢钾，5mL/L甲醇，0.4mg/L生物素，溶剂为水。

其中，固定化培养基配方：12.5g/L酵母粉，25g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.3g/L三水合磷酸氢二钾，1.18g/L磷酸二氢钾，10mL/L甲醇，0.4mg/L生物素，100mL/L 10％的甘油，溶剂为水。

其中，发酵换液培养基配方：12.5g/L酵母粉，25g/L蛋白胨，13.4g/L YNB，0.3g/L三水合磷酸氢二钾，1.18g/L磷酸二氢钾，10mL/L甲醇，0.4mg/L生物素，100mL/L 10％的甘油，溶剂为水。

(4)发酵结果见图5，由发酵数据可以看出，基因改造菌株△0141产酶酶活与原始菌株WT相比有明显提高。

本发明提供了一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3157

<212> DNA

<213> 基因敲除片段(Artificial Sequence)

<400> 1

gtattccaac tggagtcgaa agctctacca ttgagccacc gcatcaacta taaacaagaa 60

agcaaaaaag ctgtttaaga tgcaaatttc cgattaaaaa atactattat aatgaaccga 120

tggaaaagaa gatctttcta ttaaattggt gtgggttatt aaaggtaacg caattaagta 180

attgactgtt ttgtaggaac tcatatagct gttgactcgt ttgaggaggc actatgtttg 240

agaaatattg acaatcttat aaacagtaca agctcaggca attatcaccg ttatatataa 300

ttggaacacc ctcaaaacat atgatacgat acagtacatg ctcttttctt tagcaaaagt 360

catttgtgat tgcctttgat ttcagtctcc agctctccac ttcacttcag atttgaataa 420

aagactttaa atacgtaacc aacatggagt aaattgcggc tgtacgagat ttctactcaa 480

tgaggcccct ccgtgcccga gaaacctgtt ctgtggattc ttcaacaatc actaactgca 540

ttcttccctt ataaggccac taagtcctat tcaaaaacca gcaaaatcga ctcacttccc 600

ggtaaagaca gagtccaaca taagcccctt tatcctcata tcccacaata cctgtttatc 660

tacgtagcta cggatgcgct gttcaagact gcatttcctc tgtcaagata tccctactat 720

cgctcatttt cccccctttc agatctgtcg tgtgaagcga tacaaaaact agtaacaaaa 780

tctaaacggg aaatctgtac cagatacaaa tcgccaagta tctttcacca cttaccgtca 840

ttcactaaca tactccattc attcgtttac tcattctttc atattccaag tgctttgact 900

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 960

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 1020

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 1080

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 1140

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 1200

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 1260

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 1320

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 1380

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 1440

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 1500

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 1560

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 1620

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 1680

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 1740

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 1800

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 1860

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 1920

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 1980

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 2040

atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga acttgtcatt 2100

tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 2160

tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 2220

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactgtag actttatcac tgtatacttc 2280

ctacctaatt gactgtttgt atcatcctcc ttctccttct ccttctcctt ctccatcgcc 2340

ctcactatat caattgcaga ttataatttt ttgccatccg ccatcgcgat gtttccactc 2400

actttcatca cctgtcccag aaaaaaccat cttgaacccc caaaacctga cataaaacta 2460

atgcttcccc tatttttgct ggccaccgct aaaggtgaac cgattcaggt ggaattgaag 2520

aataatgtca caataaatgg atatctggtg gattgtgatt catggatgaa tctgactttg 2580

gagaatgtgt tggaggtcga cgctactgga gagcatttca aaaagtttcc ccagttttat 2640

gttcacggcg ttgaaataaa gggcgtaaga atggatgaaa atatcataga tcgtgctagg 2700

caaaaggaac aacgagccag aaactggaat aataataaca acagcaataa taaccagaga 2760

agaaactaca acaatagata tagcgcaaac tcctctggcg gaaacagagg caatcaaaga 2820

cagagataag acgaacgttc tcaggggttg ctactagttt tcaatttata atacattctc 2880

ctttttttca cttttgtctt tctatcttct ctcagttgga gtacacagtt ttagtagaat 2940

ggacaccacc caagatacag tagtgacaag tttgccggat cggttgcctc ctgaattaac 3000

tcacggacaa cggcttcagt acttagtcca tcggcaaaca actttctcaa aactccttca 3060

atcgctattt gggcttctga accatctcgt tgagctttca cagctgcctc tatattctcc 3120

atctcctgaa tacggtgtct tctaatggga gagacgg 3157

<210> 2

<211> 1357

<212> DNA

<213> 遗传霉素抗性标记G418基因(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 360

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 420

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 480

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 540

agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc aagcatttta 600

tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccggcaaa acagcattcc 660

aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg gcagtgttcc 720

tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat cgcgtatttc 780

gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt gattttgatg 840

acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataag cttttgccat 900

tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt atttttgacg 960

aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac cgataccagg 1020

atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag aaacggcttt 1080

ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat ttgatgctcg 1140

atgagttttt ctaatcagta ctgacaataa aaagattctt gttttcaaga acttgtcatt 1200

tgtatagttt ttttatattg tagttgttct attttaatca aatgttagcg tgatttatat 1260

tttttttcgc ctcgacatca tctgcccaga tgcgaagtta agtgcgcaga aagtaatatc 1320

atgcgtcaat cgtatgtgaa tgctggtcgc tatactg 1357

<210> 3

<211> 1983

<212> DNA

<213> PAS_chr1-3_0141

<400> 3

atggtaactg ttaagacatc acttatatgg attctgatct gtaatatcca gttggtcaga 60

tgttttagca taaccagttt gttgaaaggc tctcaggttc accgttacat gcaagggcag 120

cgtgtccatt tactggttaa caaaatagaa tctgatgaga ctcagcttcc ctattcctac 180

tacgacttgc cttttgtttg tcctcccatg gacgatgcca aacctgttac aatgtctcta 240

ggagaggtat ttaatggaga tcgactatgg gattccaatt acggtttgta ttttgggatc 300

gacgagagtt gcaaacgttt atgcgatcga ataacgcaac ccgaagcatt aaggagagcc 360

gaccaactca tcagacaggg ctatgtcgta cagtggacag tcgatagttt acctggagcc 420

acaacattta tcagctcttc ctccaattcc aaatattatg catcaggttt tcctctcggc 480

ttcgtcaagg atggagacac ttatttacac aaccacgtca tgatagttat cagatggcac 540

actgaagctg cagatcccgc caagaaagtt attgtcgggt ttgaggtata tccaagatcc 600

gtgagtgatt atcagtgtcc tggagctagt tcaaactttg acaactataa acttgatatc 660

aactcaaccg aacctgctca gattcctttt acttacgccg tctattggag agaggagaaa 720

gatttatcgt gggaaaacag atggtccatg tactttgtaa gtgaactcaa ccaaggaaac 780

attcattggt tttcattagt caattctttt gttttggtac tgttcttatc tacagtggta 840

ggtgtggttt tatacaaaac gttaacgcga gatatcaacg agttcaagtc ttctcatcga 900

attcatgacg ccgtcacgga ggaactaaag tttcttccca atgtgcaaca tactgatagc 960

gactctgatg gttggaaatc aattaggaat gaagttttcc acgtaccttc tcacccctta 1020

ttactttcta tcttaggtgg atccggtttt cagatccttc tgacagctct ttctgttatc 1080

atattctata caataggagt gcttagaccc cagttcaaag gtgatttctt tactatctct 1140

tttgcaagct ttatattagc tggatttggt tccggctttg caggtgctca attctatttt 1200

cagcttaaaa gtgaccctca catgacagct ggttggagaa aagtttcaat tctgtgcggt 1260

gtgttttgta caagtgttat actatctaca attctgtttt gcaatttttt tgtgtgggcc 1320

aaatcttctt catttgcact cccaatcagg acaattttga tactggttct ctcaatcata 1380

gtcatagaaa tcccgctctc ttacatggga ggttatgtta gtaaaaggct gaaatattcc 1440

tggtctctca agggatccag caagagttct cttctgagaa ccaaatcttc aaatgattta 1500

attatcaaaa caccgatacc caaacagcca ttctataaca aattattcgt ggctgtccca 1560

ctatttggag ctttcccttt cggaataatc tacgtggaac tcttgtttat attccgttca 1620

ttgtggttgg agaaatcaac ctactattac atgtacgggt tcctgtttgt tacagtgggt 1680

ctattatgca tcgtcatcgt cgaaacagcc atcatagcga cattcttgtc cgtaaacaaa 1740

ggaaactata attggcattg gagatcattc attattggtg gatctgtggc attttacctt 1800

acttcataca gcattttcta tctgatcttt tacttgaaag tcgtcgactt tacaagtaca 1860

ttgatctacc tgatctacat ggccctaatt agttgtaccg ttggggtcgc ctgtggatca 1920

gtgggattgt tcagctccat tattttgatg aacacgatct acaatgcaat caaagatgat 1980

taa 1983

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(PAS_chr1-3_0141-UP-F)

<400> 4

ttatatggat tctgatctgt aatatcc 27

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(PAS_chr1-3_0141-UP-R)

<400> 5

gtattctggg cctccatgtc catctgataa ctatcatgac 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(PAS_chr1-3_0141-DOWN-F)

<400> 6

gaatgctggt cgctatactg gcagatcccg ccaagaaagt 40

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(PAS_chr1-3_0141-DOWN-R)

<400> 7

gatctgaaaa ccggatccac ctaagataga aagta 35

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(G418-PAS_chr1-3_0141-F)

<400> 8

gtcatgatag ttatcagatg gacatggagg cccagaatac 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(G418-PAS_chr1-3_0141-R)

<400> 9

actttcttgg cgggatctgc cagtatagcg accagcattc 40

<210> 10

<211> 900

<212> DNA

<213> PAS_chr1-3_0141基因的上游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 10

gtattccaac tggagtcgaa agctctacca ttgagccacc gcatcaacta taaacaagaa 60

agcaaaaaag ctgtttaaga tgcaaatttc cgattaaaaa atactattat aatgaaccga 120

tggaaaagaa gatctttcta ttaaattggt gtgggttatt aaaggtaacg caattaagta 180

attgactgtt ttgtaggaac tcatatagct gttgactcgt ttgaggaggc actatgtttg 240

agaaatattg acaatcttat aaacagtaca agctcaggca attatcaccg ttatatataa 300

ttggaacacc ctcaaaacat atgatacgat acagtacatg ctcttttctt tagcaaaagt 360

catttgtgat tgcctttgat ttcagtctcc agctctccac ttcacttcag atttgaataa 420

aagactttaa atacgtaacc aacatggagt aaattgcggc tgtacgagat ttctactcaa 480

tgaggcccct ccgtgcccga gaaacctgtt ctgtggattc ttcaacaatc actaactgca 540

ttcttccctt ataaggccac taagtcctat tcaaaaacca gcaaaatcga ctcacttccc 600

ggtaaagaca gagtccaaca taagcccctt tatcctcata tcccacaata cctgtttatc 660

tacgtagcta cggatgcgct gttcaagact gcatttcctc tgtcaagata tccctactat 720

cgctcatttt cccccctttc agatctgtcg tgtgaagcga tacaaaaact agtaacaaaa 780

tctaaacggg aaatctgtac cagatacaaa tcgccaagta tctttcacca cttaccgtca 840

ttcactaaca tactccattc attcgtttac tcattctttc atattccaag tgctttgact 900

<210> 11

<211> 900

<212> DNA

<213> PAS_chr1-3_0141基因的下游同源臂(Artificial Sequence)

<400> 11

tagactttat cactgtatac ttcctaccta attgactgtt tgtatcatcc tccttctcct 60

tctccttctc cttctccatc gccctcacta tatcaattgc agattataat tttttgccat 120

ccgccatcgc gatgtttcca ctcactttca tcacctgtcc cagaaaaaac catcttgaac 180

ccccaaaacc tgacataaaa ctaatgcttc ccctattttt gctggccacc gctaaaggtg 240

aaccgattca ggtggaattg aagaataatg tcacaataaa tggatatctg gtggattgtg 300

attcatggat gaatctgact ttggagaatg tgttggaggt cgacgctact ggagagcatt 360

tcaaaaagtt tccccagttt tatgttcacg gcgttgaaat aaagggcgta agaatggatg 420

aaaatatcat agatcgtgct aggcaaaagg aacaacgagc cagaaactgg aataataata 480

acaacagcaa taataaccag agaagaaact acaacaatag atatagcgca aactcctctg 540

gcggaaacag aggcaatcaa agacagagat aagacgaacg ttctcagggg ttgctactag 600

ttttcaattt ataatacatt ctcctttttt tcacttttgt ctttctatct tctctcagtt 660

ggagtacaca gttttagtag aatggacacc acccaagata cagtagtgac aagtttgccg 720

gatcggttgc ctcctgaatt aactcacgga caacggcttc agtacttagt ccatcggcaa 780

acaactttct caaaactcct tcaatcgcta tttgggcttc tgaaccatct cgttgagctt 840

tcacagctgc ctctatattc tccatctcct gaatacggtg tcttctaatg ggagagacgg 900

Claims (8)

1.一株PAS_chr1-3_0141基因敲除的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌由原始毕赤酵母的PAS_chr1-3_0141基因失活后改造得到；

其中，所述原始毕赤酵母为ACCC 21040；

其中，所述PAS_chr1-3_0141基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以原始毕赤酵母的基因组DNA为模板，扩增得到PAS_chr1-3_0141基因的上游同源臂和下游同源臂；以质粒pPIC3.5K为模板，扩增得到遗传霉素抗性标记G418基因；

（2）以步骤（1）所得PAS_chr1-3_0141基因的上游同源臂、下游同源臂和遗传霉素抗性标记G418基因为模板，扩增得到基因敲除片段；

（3）将步骤（2）得到的基因敲除片段转化至原始毕赤酵母感受态中，即得PAS_chr1-3_0141基因失活的酿酒酵母基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述毕赤酵母基因工程菌在提升成膜量中的应用。

5.权利要求1所述毕赤酵母基因工程菌在产植酸酶中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以所述毕赤酵母基因工程菌为发酵菌株，通过固定化发酵产植酸酶。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化发酵以天然有机载体、人工合成高分子载体作为固定化介质。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28-30℃。

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