CN113564190B - 高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法，包括如下步骤：(1)制备prs+purF核酸片段：获得EC‑RF 01菌株：(2)将步骤(1)得到的prs+purF核酸片段通过λ‑Red基因重组的方法整合到大肠杆菌EC‑Rib 02基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC‑RF 01。本发明的高产核黄素大肠杆菌工程菌株的核黄素产量高，生产周期短，节省能源，底物的利用率较高。

Description

高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用和发酵工程领域，具体地涉及一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法。
背景技术
核黄素，俗称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，分子量为376，是人和动物所必须的一种营养物质。在细胞内部，核黄素通常磷酸化为黄素单核苷酸(以下简称FMN)，FMN进一步腺苷酰化为黄素腺嘌呤二核苷酸(以下简称FAD)。FMN和FAD是核黄素的活性形式，以黄素辅酶的形式参数胞内的多种氧化还原反应，起到传递电子的作用，对于维持人和动物的正常代谢和生理功能具有重要的作用。
核黄素广泛应用于食品、医药和饲料领域，起到营养强化和一些疾病的辅助治疗的作用。核黄素能促进蛋白质、脂肪、碳水化合物的正常代谢，具有维护皮肤和粘膜的生理功能。如果机体的核黄素摄取不足，可能导致核黄素缺乏，临床表现为舌炎、唇炎、口角炎和皮肤干燥等。
目前，工业上核黄素的生产主要是微生物发酵法。常用的生产菌株有真菌类的棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)和细菌类的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。利用真菌进行核黄素生产往往需要复杂的培养条件，并且需要较长的发酵周期。目前，用于核黄素生产的枯草芽孢杆菌多为通过诱变筛选得到的，由于随机诱变导致的突变位点不确定性较大，因此这些菌株往往具有较复杂的遗传背景，通过理性方法改进这些菌株具有较大困难。此外，由于突变的随机性，往往会有一些与核黄素高产表型无关的突变点的积累，从而导致工程菌在菌体生长速率、环境耐受性(鲁棒性)、底物利用效率和遗传稳定性等方面存在缺陷。
大肠杆菌作为一种重要的模式菌株，对其生理生化特性及遗传背景已经有了比较深入的了解。经检索，目前未见有使用代谢工程同时改造大肠杆菌prs、purF、gmk、ndk、sthA、pntAB和ndh基因，来提高核黄素产量的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第二个目的是提供第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第三个目的是提供第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第四个目的是提供第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第五个目的是提供第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株。
本发明的第六个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第七个目的是提供第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第八个目的是提供第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第九个目的是提供第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第十个目的是提供第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法。
本发明的第十一个目的是提供一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株发酵生产核黄素的用途。
本发明的第十二个目的是提供第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株发酵生产核黄素的用途。
本发明的第十三个目的是提供第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株发酵生产核黄素的用途。
本发明的第十四个目的是提供第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株发酵生产核黄素的用途。
本发明的第十五个目的是提供第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株发酵生产核黄素的用途。
本发明的技术方案概述如下：
第一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备prs+purF核酸片段：
分别以ZL-1F和ZL-1R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-2F和ZL-2R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-3F和ZL-3R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，再通过CPEC质粒构建方法构建成第一种质粒，将所述第一种质粒命名为p20C-prs+purF；
所述ZL-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述ZL-1R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述ZL-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述ZL-2R的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；所述ZL-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ZL-3R的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；
分别以ZL-4F和ZL-4R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-5F和ZL-5R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-6F和ZL-6R为上、下游引物，以所述p20C-prs+purF为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，制备得到prs+purF核酸片段；
所述ZL-4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述ZL-4R的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示；所述ZL-5F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述ZL-5R的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示；所述ZL-6F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；所述ZL-6R的核苷酸序列如SEQID No.12所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述prs+purF片段的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；
(2)获得EC-RF 01菌株：
将步骤(1)得到的prs+purF核酸片段通过λ-Red基因重组的方法整合到大肠杆菌EC-Rib02(来源于已授权的专利，专利号201511014766.6)基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到第一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01。
上述方法构建的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01。
上述一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01发酵生产核黄素的用途。
第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备gmk+ndk核酸片段：
分别以ZL-9F和ZL-9R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-10F和ZL-10R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-11F和ZL-11R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第二种质粒，将所述第二种质粒命名为p20C-gmk+ndk；
所述ZL-9F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述ZL-9R的核苷酸序列如SEQ IDNo.18所示；所述ZL-10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；所述ZL-10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述ZL-11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；所述ZL-11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
分别以ZL-12F和ZL-12R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-13F和ZL-13R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-14F和ZL-14R为上、下游引物，以所述p20C-ndk+gmk为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，制备得到gmk+ndk片段。
所述ZL-12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；所述ZL-12R的核苷酸序列如SEQID No.24所示；所述ZL-13F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；所述ZL-13R的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；所述ZL-14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；所述ZL-14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述gmk+ndk片段的核苷酸序列如SEQ No.51所示；
(2)获得EC-RF 02菌株：
将步骤(1)得到的gmk+ndk片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02。
上述方法构建的第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02。
上述第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02发酵生产核黄素的用途。
第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备sthA核酸片段：
分别以ZL-15F和ZL-15R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-16F和ZL-16R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第三种质粒，将所述第三种质粒命名为p20C-sthA；
所述ZL-15F的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；所述ZL-15R的核苷酸序列如SEQID No.30所示；所述ZL-16F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；所述ZL-16R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；分别以ZL-17F和ZL-17R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-18F和ZL-18R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-19F和ZL-14R为上、下游引物，以所构建的p20C-sthA质粒为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到以sthA片段；
所述ZL-17F的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；所述ZL-17R的核苷酸序列如SEQID No.34所示；所述ZL-18F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；所述ZL-18R的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；所述ZL-19F的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；所述ZL-14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述sthA片段的核苷酸序列如SEQ No.52所示；
(2)获得EC-RF 03菌株：
将步骤(1)得到的sthA片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03。
上述方法构建的第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03。
上述第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03发酵生产核黄素的用途。
第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备ΔpntAB片段：
分别以ZL-20F和ZL-20R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-21F和ZL-21R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-22F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-22R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到以ΔpntAB片段；
所述ZL-20F的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；所述ZL-20R的核苷酸序列如SEQID No.40所示；所述ZL-21F的核苷酸序列如SEQ ID No.41所示；所述ZL-21R的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；所述ZL-22F的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-22R的核苷酸序列如SEQ ID No.44所示；所述ΔpntAB片段的核苷酸序列如SEQ No.53所示；
(2)获得EC-RF 04菌株：
将步骤(1)得到的ΔpntAB片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04。
上述方法构建的第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04。
上述第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04发酵生产核黄素的用途。
第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备Δndh片段：
分别ZL-23F和ZL-23R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-24F和ZL-24R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-25F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-25R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到Δndh片段。
所述ZL-23F的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；所述ZL-23R的核苷酸序列如SEQID No.46所示；所述ZL-24F的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示；所述ZL-24R的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示；所述ZL-25F的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-25R的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示；所述Δndh片段的核苷酸序列如SEQ No.54所示。
(2)获得EC-RF 05菌株：
将步骤(1)得到的Δndh片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04基因组上，通过过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05。
上述方法构建的第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05。
上述第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05发酵生产核黄素的用途。
本发明的优点：
本发明的高产核黄素大肠杆菌工程菌株核黄素产量提高，是目前大肠杆菌生产核黄素的最高产量。
本发明的高产核黄素大肠杆菌菌株的生产周期为60-80h，比现有常用的核黄素工程菌株生产周期短。
本发明的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株核黄素对葡萄糖底物利用率较高。
附图说明
图1为p20C-prs+purF质粒图谱。
图2为prs+purF片段电泳图。
图3为prs+purF片段λ-Red基因重组的方法整合到EC-Rib 02基因组上，电泳检测图。
图4为p20C-gmk+ndk质粒图谱。
图5为gmk+ndk片段电泳图。
图6为gmk+ndk片段λ-Red基因重组的方法整合到EC-RF 01基因组上，电泳检测图。
图7为p20C-sthA质粒图谱。
图8为sthA片段电泳图。
图9为sthA片段通过λ-Red基因重组的方法整合到EC-RF 02基因组上，电泳检测图。
图10为ΔpntAB片段电泳图。
图11为通过λ-Red基因重组的方法敲除EC-RF 03的pntAB基因，电泳检测图。
图12为Δndh片段电泳图。
图13为通过λ-Red基因重组的方法敲除EC-RF 04的ndh基因，电泳检测图。
图14为EC-RF 05菌株核黄素产量随时间变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的野生型菌株大肠杆菌E.coli MG1655，市售。
质粒pTKRed和pTKS/CS来源为Addgene(https://www.addgene.org/)。
质粒p20C来源于如下文章：Liu,S.；Diao,N.；Wang,Z.；Lu,W.；Tang,Y.-J.；Chen,T.,Modular Engineering of the Flavin Pathway in Escherichia coli for ImprovedFlavin Mononucleotide and Flavin Adenine Dinucleotide Production.J.Agric.FoodChem.2019,67(23),6532-6540.
λ-Red基因重组的方法和菌株摇瓶发酵方法来源于如下文章：Lin,Z.；Xu,Z.；Li,Y.；Wang,Z.；Chen,T.；Zhao,X.,Metabolic engineering of Escherichia coli for theproduction of riboflavin.Microbial cell factories 2014,13(1),104.
CPEC质粒构建方法来源于如下文章：Quan,J.and J.Tian(2009)."Circularpolymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways."PLoS One4(7):e6441.
LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂0.8％-2％)余量是水。
LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L)余量是水。
本发明中用到的发酵罐培养所用发酵培养基：以每1L计含有：葡萄糖5-30g，酵母抽提物10-30g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1g，磷酸氢二钠1-10g，磷酸二氢钾1-10g，尿素1-10g，柠檬酸铁胺10-100mg，氯化钙10-100mg，硫酸锌0.01-0.1mg，氯化锰0.01-0.1mg，硼酸0.01-0.1mg，氯化钴0.01-0.1mg，硫酸铜0.01-0.1mg，氯化镍0.01-0.1mg，钼酸钠0.01-0.1mg，余量为水。
本发明中用到的发酵罐培养所用补料培养基：以每1L计含有：葡萄糖500-750g，酵母抽提物10-30g，硫酸铵0.5-5g，硫酸镁0.05-1g，磷酸氢二钠1-10g，磷酸二氢钾1-10g，余量为水。
所用引物从金唯智公司合成(https://www.genewiz.com.cn/)。所用DNA聚合酶等分子生物学试剂购买自诺唯赞(http://www.vazyme.com/)。所用发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司(http://www.blbio.com/)。所用PCR仪购自Bio-Rad(http://www.bio-rad.com/)。电转仪购自Eppendorf公司(https://www.eppendorf.com/CN-zh/)
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。
prs(编码核糖磷酸二磷酸激酶基因)；purF(编码酰胺基磷酸核糖基转移酶基因)；gmk(编码鸟苷酸激酶基因)；ndk(编码核苷二磷酸激酶基因)；sthA(编码NAD(P)转氢酶)基因；pntAB(编码吡啶核苷酸转氢酶基因)；ndh(编码NADH：醌氧化还原酶II基因)，
实施例1
第一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备prs+purF核酸片段：
分别以ZL-1F和ZL-1R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-2F和ZL-2R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-3F和ZL-3R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，再通过CPEC质粒构建方法构建成第一种质粒，将所述第一种质粒命名为p20C-prs+purF；质粒图谱如图1所示。
所述ZL-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述ZL-1R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述ZL-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述ZL-2R的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；所述ZL-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ZL-3R的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示；分别以ZL-4F和ZL-4R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-5F和ZL-5R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-6F和ZL-6R为上、下游引物，以所述p20C-prs+purF为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，制备得到prs+purF核酸片段；其电泳图如图2所示。
所述ZL-4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；所述ZL-4R的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示；所述ZL-5F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述ZL-5R的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示；所述ZL-6F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；所述ZL-6R的核苷酸序列如SEQID No.12所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述prs+purF片段的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；
(2)获得EC-RF 01菌株：
将步骤(1)得到的prs+purF核酸片段通过λ-Red基因重组的方法整合到大肠杆菌EC-Rib02(来源于已授权的专利，专利号201511014766.6)基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，电泳检测结果如图3所示得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01。
实施例2
第二种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备gmk+ndk核酸片段：
分别以ZL-9F和ZL-9R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-10F和ZL-10R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-11F和ZL-11R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第二种质粒，将所述第二种质粒命名为p20C-gmk+ndk；质粒图谱如图4所示；
所述ZL-9F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述ZL-9R的核苷酸序列如SEQ IDNo.18所示；所述ZL-10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；所述ZL-10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述ZL-11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；所述ZL-11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；分别以ZL-12F和ZL-12R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coliMG1655为模板；以ZL-13F和ZL-13R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-14F和ZL-14R为上、下游引物，以所述p20C-ndk+gmk为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，制备得到gmk+ndk片段。电泳检测结果如图5所示。
所述ZL-12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；所述ZL-12R的核苷酸序列如SEQID No.24所示；所述ZL-13F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；所述ZL-13R的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；所述ZL-14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；所述ZL-14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述gmk+ndk片段的核苷酸序列如SEQ No.51所示；
(2)获得EC-RF 02菌株：
将步骤(1)得到的gmk+ndk片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，电泳检测结果如图6所示，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF02。
实施例3
第三种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备sthA核酸片段：
分别以ZL-15F和ZL-15R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-16F和ZL-16R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第三种质粒，将所述第三种质粒命名为p20C-sthA；质粒图谱如图7所示。
所述ZL-15F的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；所述ZL-15R的核苷酸序列如SEQID No.30所示；所述ZL-16F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；所述ZL-16R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；分别以ZL-17F和ZL-17R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-18F和ZL-18R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-19F和ZL-14R为上、下游引物，以所构建的p20C-sthA质粒为模板；以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到以sthA片段；电泳检测结果如图8所示。所述ZL-17F的核苷酸序列如SEQID No.33所示；所述ZL-17R的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；所述ZL-18F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；ZL-18R的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
所述ZL-19F的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；所述ZL-14R的核苷酸序列如SEQID No.28所示；所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；所述sthA片段的核苷酸序列如SEQ No.52所示；
(2)获得EC-RF 03菌株：将步骤(1)得到的sthA片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，电泳检测结果如图9所示，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03。
实施例4
第四种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备ΔpntAB片段：
分别以ZL-20F和ZL-20R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-21F和ZL-21R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-22F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-22R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到以ΔpntAB片段；电泳检测结果如图10所示。所述ZL-20F的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；所述ZL-20R的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示；所述ZL-21F的核苷酸序列如SEQ ID No.41所示；所述ZL-21R的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；所述ZL-22F的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-22R的核苷酸序列如SEQ ID No.44所示；所述ΔpntAB片段的核苷酸序列如SEQ No.53所示；
(2)获得EC-RF 04菌株：
将步骤(1)得到的ΔpntAB片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，从而实现pntAB基因的敲除，电泳检测结果如图11所示，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04。
实施例5
第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)制备Δndh片段：
分别ZL-23F和ZL-23R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-24F和ZL-24R为上、下游引物，以大肠杆菌E.coli MG1655为模板；以ZL-25F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；以ZL-8F和ZL-25R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到Δndh片段。电泳检测结果如图12所示。
所述ZL-23F的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；所述ZL-23R的核苷酸序列如SEQID No.46所示；所述ZL-24F的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示；所述ZL-24R的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示；所述ZL-25F的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示；所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述ZL-25R的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示；所述Δndh片段的核苷酸序列如SEQ No.54所示。
(2)获得EC-RF 05菌株：
将步骤(1)得到的Δndh片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，从而实现ndh基因的敲除，电泳检测结果如图13所示，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05。
实施例6
高产核黄素大肠杆菌工程菌株的摇瓶发酵方法，包括如下步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01、EC-RF 02、EC-RF 03、EC-RF04、EC-RF 05和出发菌株EC-Rib 02分别在LB固体培养基中划线，37℃培养12h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的各活化菌接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h，得到种子液。
(3)发酵：将步骤(2)所得各种子液按照体积比为1％的接种量接种到发酵培养基中，37℃，220rpm培养至葡萄糖耗尽，然后检测核黄素产量；
通过摇瓶发酵验证：
EC-RF 01菌株的核黄素产量，比出发菌株EC-Rib 02提高了10％。EC-RF 02菌株的核黄素产量，比出发菌株EC-Rib 02提高了18％。EC-RF 03菌株的核黄素产量，比出发菌株EC-Rib02提高了55％。EC-RF 04菌株的核黄素产量，比出发菌株EC-Rib 02提高了84％。EC-RF 05菌株的核黄素产量，比出发菌株EC-Rib 02提高了108％。
实施例11
第五种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05的发酵罐发酵方法，包括如下步骤：
(1)活化菌株：将高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05和出发菌株EC-Rib 02分别在LB固体培养基中划线，37℃培养20h，使菌株复壮；
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养15h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)所获得的种子液按照体积比为10％的比例接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，加入氯霉素，使浓度为40ug/L，在37℃，pH＝7.0，搅拌转速和溶氧关联条件下发酵，其中溶氧设定为20％～80％，转速设定为350-800rpm；当培养基中葡萄糖浓度降到1g/L以下时，采用连续补料的方式补充补料培养基；补料速度为0.3ml/min，当发酵液中的核黄素浓度不再增加时，停止发酵。经过70h发酵，核黄素产量达到22g/L，比出发菌株EC-Rib 02的发酵罐的核黄素产量提高了120％，发酵结果见图14。
序列表
<110> 天津大学
<120> 高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建方法
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 43
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgacaggagg tggcattgac aattaatcat ccggc 35
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggataacagg gtaatggaag cggaatatat ccctag 36
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gccccccgcg actagtcgct acactaagag aggtcttttt atgccacatt cctacgatt 59
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gatgccttgg cttcagttaa aacaggcggt ttaaacc 37
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cgcctgtttt aactgaagcc aaggcatcaa at 32
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tagcgactag tcgcgggggg cccgctcaca attccacaca 40
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gctgcggaat tactggtgta 20
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgattaatt gtcaacaaca atatctggag atcttcactg 40
<210> 35
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccgccgccct agacctaggg atatattccg cttcctggag caagttacag cgtaa 55
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcgttgctgg aagatggc 18
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ctccagatat tgttgttgac aattaatcat ccggc 35
<210> 38
<211> 5028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gccagacaag cagaatcaag ttctaccgtg ccgacgttca ataaccagcg gctgggatgt 60
gaaaggctgg cgttggtgat atgcgcaagc tgacaatctc ccaccagata acggagatcg 120
ggaatgatta aacctttacg cgtaatgcgt gggctttcat ctaatgcaat acgtgtcccg 180
agcggtagcc agatgcccgc cagcgtggga acccacagcc cgagcgtcat cagcagcgtc 240
aacggcacaa gaataatcag taataacagc gcgagaacgg ctttatattt acccagcatg 300
ggtagttaat atcctgattt agcgaaaaat taagcattca atacgggtat tgtggcatgt 360
ttaaccgttc agttgaaggt tgcgcctaca ctaagcatag ttgttgatga atttttcaat 420
atcgccatag ctttcaatta aatttgaaat tttgtaaaat atttttagta gcttaaatgt 480
gattcaacat cactggagaa ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg 540
tgagcggtga actctctcta acaaggagcc taactgtgcc tgatatgaag ctttttgctg 600
gtaacgccac cccggaacta gcacaacgta ttgccaaccg cctgtacact tcactcggcg 660
acgccgctgt aggtcgcttt agcgatggcg aagtcagcgt acaaattaat gaaaatgtac 720
gcggtggtga tattttcatc atccagtcca cttgtgcccc tactaacgac aacctgatgg 780
aattagtcgt tatggttgat gccctgcgtc gtgcttccgc aggtcgtatc accgctgtta 840
tcccctactt tggctatgcg cgccaggacc gtcgcgtccg ttccgctcgt gtaccaatca 900
ctgcgaaagt ggttgcagac ttcctctcca gcgtcggtgt tgaccgtgtg ctgacagtgg 960
atctgcacgc tgaacagatt cagggtttct tcgacgttcc ggttgataac gtatttggta 1020
gcccgatcct gctggaagac atgctgcagc tgaatctgga taacccaatt gtggtttctc 1080
cggacatcgg cggcgttgtg cgtgcccgcg ctatcgctaa gctgctgaac gataccgata 1140
tggcaatcat cgacaaacgt cgtccgcgtg cgaacgtttc acaggtgatg catatcatcg 1200
gtgacgttgc aggtcgtgac tgcgtactgg tcgatgatat gatcgacact ggcggtacgc 1260
tgtgtaaagc tgctgaagct ctgaaagaac gtggtgctaa acgtgtattt gcgtacgcga 1320
ctcacccgat cttctctggc aacgcggcga acaacctgcg taactctgta attgatgaag 1380
tcgttgtctg cgataccatt ccgctgagcg atgaaatcaa atcactgccg aacgtgcgta 1440
ctctgaccct gtcaggtatg ctggccgaag cgattcgtcg tatcagcaac gaagaatcga 1500
tctctgccat gttcgaacac taatcgaacc cgggaaccta gggactagaa actatgtgcg 1560
gtattgtcgg tatcgccggt gttatgccgg ttaaccagtc gatttatgat gccttaacgg 1620
tgcttcagca tcgcggtcag gatgccgccg gcatcatcac catagatgcc aataactgct 1680
tccgtttgcg taaagcgaac gggctggtga gcgatgtatt tgaagctcgc catatgcagc 1740
gtttgcaggg caatatgggc attggtcatg tgcgttaccc cacggctggc agctccagcg 1800
cctctgaagc gcagccgttt tacgttaact ccccgtatgg cattacgctt gcccacaacg 1860
gcaatctgac caacgctcac gagttgcgta aaaaactgtt tgaagaaaaa cgccgccaca 1920
tcaacaccac ttccgactcg gaaattctgc ttaatatctt cgccagcgag ctggacaact 1980
tccgccacta cccgctggaa gccgacaata ttttcgctgc cattgctgcc acaaaccgct 2040
taatccgcgg cgcgtatgcc tgtgtggcga tgattatcgg ccacggtatg gttgctttcc 2100
gcgatccaaa cgggattcgt ccgctggtac tgggaaaacg tgatattgac gagaaccgta 2160
cagaatatat ggtcgcttcc gaaagcgtag cgctcgatac gctgggcttt gatttcctgc 2220
gtgacgtcgc gccgggcgaa gcgatttaca tcactgaaga agggcagttg tttacccgtc 2280
aatgtgctga caatccggtc agcaatccgt gcctgtttga gtatgtatac tttgcccgcc 2340
cggactcgtt tatcgacaaa atttccgttt acagcgcgcg tgtgaatatg ggcacgaaac 2400
tgggcgagaa aattgcccgc gaatgggaag atctggatat cgacgtggtg atcccgatcc 2460
cagaaacctc gtgtgatatc gcgctggaaa ttgctcgtat tctgggcaaa ccgtaccgcc 2520
agggcttcgt taaaaaccgc tatgttggcc gcacctttat catgccgggc cagcagctgc 2580
gtcgtaagtc cgtgcgccgt aaactgaatg ccaaccgcgc cgagttccgc gataaaaacg 2640
tcctgctggt cgacgactcc atcgtccgtg gcaccacttc tgagcagatt atcgagatgg 2700
cacgcgaagc cggagcgaag aaagtgtacc tcgcttctgc ggcaccggaa attcgcttcc 2760
cgaacgttta tggtattgat atgccgagcg ccacggaact gatcgctcac ggtcgcgaag 2820
ttgatgaaat tcgccagatc atcggtgctg acgggttgat tttccaggat ctgaacgatc 2880
tgatcgacgc cgttcgcgct gaaaatccgg atatccagca gtttgaatgc tcggtgttca 2940
acggcgtcta cgtcaccaaa gatgttgatc agggctacct cgatttcctc gatacgttac 3000
gtaatgatga cgccaaagca gtgcaacgtc agaacgaagt ggaaaatctc gaaatgcata 3060
acgaaggatg aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt 3120
tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta 3180
gggatatatt ccgcttccat taccctgtta tccctactaa gcacttgtct cctgtttact 3240
cccctgagct tgaggggtca acatgaaggt cattgatagc aggataataa tacagtaaaa 3300
cgctaaacca ataatccaaa tccagccatc ccaaattggt agtgaatgat tataaataac 3360
agtaaacagt aatgggccaa taacaccggt tgcattggta aggctcacca ataatccctg 3420
taaagcacct tgctcatgac tctttgtttg gatagacatc actccctgta atgcaggtaa 3480
agcgatccca ccaccagcca ataaaattaa aacagggaaa tctaaccaac cttcagatat 3540
aaacgctaaa aaggcaaatg cactactatc tgcaataaat tcgagcagta ctgccgtttt 3600
ttcgccccat ttagtggcta ttcttcctgc cacaaaggct tggaatactg agtgtaaaag 3660
accaagaccc gctaatgaaa agccaaccat catgctattc catccaaaac gattttcggt 3720
aaatagcacc cacaccgttg cgggaatttg gcctatcaat tgcgctgaaa aataaataat 3780
caacaaaatg ggcatcgttt taaataaagt gatgtacacc gaatttgatt gcgtctcaac 3840
ccctacttcg gtatctgtat tatcacgtgt atttttggtt tcacggaacc aaaacataac 3900
cacaaggaaa gtgacaatat ttagcaacgc agcgataaaa aagggactat gcggtgaaat 3960
ctctcctgca aaaccaccaa taataggccc cgctattaaa ccaagcccaa aacttgcccc 4020
taaccaaccg aaccacttca cgcgttgaga agctgaggtg gtatcggcaa tgaccgatgc 4080
cgcgacagcc ccagtagctc ctgtgatccc tgaaagcaaa cggcctaaat acagcatcca 4140
aagcgcactt gaaaaagcca gcaataagta atccagcgat gcgcctatta atgacaacaa 4200
cagcactggg cgccgaccaa atcggtcaga catttttcca agccaaggag caaagataac 4260
ctgcattaac gcataaagtg caagcaatac gccaaagtgg ttagcgatat cttccgaagc 4320
aataaattca cgtaataacg ttggcaagac tggcatgata aggccaatcc ccatggcatc 4380
gagtaacgta attaccaatg cgatctttgt cgaactattc atattcacca ccctgaattg 4440
actctcttcc gggcgctatc atgccatacg cgaaaggtgg tgtcaacgta aatattaccc 4500
tgttatccct accgccgccc tagacctagg gatatattcc gcttcccgaa cgaactggtt 4560
taatcttgcc gctcccctgc attccagggg agctgattca gataatcccc aatgaccttt 4620
catcctctat tcttaaaata gtcctgagtc agaaactgta attgagaacc acaatgaaga 4680
aagtagccgc gtttgttgcg ctaagcctgc tgatggcggg atgtgtaagt aatgacaaaa 4740
ttgctgttac gccagaacag ctacagcatc atcgctttgt gctggaaagc gtaaacggta 4800
agcccgtgac cagcgataaa aatccgccag aaatcagctt tggtgaaaaa atgatgattt 4860
ccggcagcat gtgtaaccgc tttagcggtg aaggcaaact gtctaatggt gaactgacag 4920
ccaaagggct ggcaatgacc cgtatgatgt gcgctaaccc gcagcttaat gaactcgata 4980
acaccattag cgaaatgctg aaagaaggtg cacaagtgga tctgaccg 5028
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aataatcctt cgccttgc 18
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acagggtaat gatattccct tccatcggtt t 31
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aaccatcatc aataaaaccg atggaaggga atatcaaagc tctgtaaccc tgac 54
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgtgcgattg acagtgtt 18
<210> 43
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agggaatatc attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgtt 48
<210> 44
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cggttttatt gatgatggtt tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 58
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
agcggacatc tgaagagt 18
<210> 46
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ggtaatgagg cgtttatgcc acatccgcca gtgtacgtcg acgtagtcaa cgtgaccc 58
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gttatcccta taatcgacgt acactggc 28
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
caacagtggc gacatctt 18
<210> 49
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggcataaacg cctcattacc ctgttatccc tactaagcac ttgtctcctg tt 52
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgtcgatta tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 48
<210> 51
<211> 3625
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tggtctttag tgtgcggttg aggccgaaaa cagccagaat gccagtgcgg tcatggcaaa 60
agaccccaga aggttgacga aaacgttcag taatgcccag ccaaagcggc cctcttgtaa 120
caaaaacacc acttctgccg aaaatgttga gaaggttgtt agaccgccac aaaatccggt 180
ggtgattaat actttccaca ctggatcaat gttcgtcatc ctgctgaacc atgcgaatcc 240
tattcctatg atgaatgccc caatcaggtt tgctgtcagc gtccccaacg gaatcgcctg 300
atgcagtggg ttaaatcgca tacttaacag ccatctcgcc acgcttcccg taccaccgcc 360
aataaaaact gctaaaagaa gttgtaacac tgcaaaatcc tgctatttga tttgtatgag 420
tgataagtgt aacgccgaat aatcgtcgtt ggcgaatttt acgactctga caggaggtgg 480
cattgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga actagtacta 540
cgcggagaaa aggacatggc tcaaggcacg ctttatattg tttctgcccc cagtggcgcg 600
ggtaaatcca gcctgattca ggctttatta aaaacccaac cgttgtatga cacccaggtt 660
tctgtttcac acaccacacg ccaaccgcgt cctggtgaag tccacggtga acattatttc 720
tttgttaatc atgatgaatt taaagaaatg attagcagag atgcgttcct cgaacacgca 780
gaagtttttg gtaattacta tggcacttcg cgtgaggcca ttgagcaagt actggcgacc 840
ggtgtcgatg tttttctcga tatcgactgg cagggcgcgc agcaaattcg ccagaagatg 900
ccgcacgcgc ggagtatctt tattttaccg ccgtccaaaa ttgaactgga ccgccgtcta 960
cgcggtcgcg gtcaggacag cgaagaggtc attgcaaagc gtatggcgca agctgttgca 1020
gaaatgagcc attacgccga atatgattat ctgattgtga atgatgactt cgataccgcg 1080
ttgaccgatt tgaagaccat tattcgcgcc gaacgtctgc gcatgagccg ccaaaagcag 1140
cgtcatgacg ctttaatcag caaattgttg gcagactgag cccatttcaa taaggaggta 1200
ataatggcta ttgaacgtac tttttccatc atcaaaccga acgcggtagc aaaaaacgtc 1260
attggtaata tctttgcgcg ctttgaagct gcagggttca aaattgttgg caccaaaatg 1320
ctgcacctga ccgttgaaca ggcacgtggc ttttatgctg aacacgatgg aaaaccgttc 1380
tttgatggtc tggttgaatt catgacctct ggcccgatcg tggtttccgt gctggaaggt 1440
gaaaacgccg ttcagcgtca ccgcgatctg ctgggcgcga ccaatccggc aaacgcactg 1500
gctggtactc tgcgcgctga ttacgctgac agcctgaccg aaaacggtac ccacggttct 1560
gattccgtcg aatctgccgc tcgcgaaatc gcttatttct ttggcgaagg cgaagtgtgc 1620
ccgcgcaccc gttaataatt ctgaagccaa ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 1680
aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 1740
atccgccgcc ctagacctag ggatatattc cgcttccatt accctgttat ccctactaag 1800
cacttgtctc ctgtttactc ccctgagctt gaggggtcaa catgaaggtc attgatagca 1860
ggataataat acagtaaaac gctaaaccaa taatccaaat ccagccatcc caaattggta 1920
gtgaatgatt ataaataaca gtaaacagta atgggccaat aacaccggtt gcattggtaa 1980
ggctcaccaa taatccctgt aaagcacctt gctcatgact ctttgtttgg atagacatca 2040
ctccctgtaa tgcaggtaaa gcgatcccac caccagccaa taaaattaaa acagggaaat 2100
ctaaccaacc ttcagatata aacgctaaaa aggcaaatgc actactatct gcaataaatt 2160
cgagcagtac tgccgttttt tcgccccatt tagtggctat tcttcctgcc acaaaggctt 2220
ggaatactga gtgtaaaaga ccaagacccg ctaatgaaaa gccaaccatc atgctattcc 2280
atccaaaacg attttcggta aatagcaccc acaccgttgc gggaatttgg cctatcaatt 2340
gcgctgaaaa ataaataatc aacaaaatgg gcatcgtttt aaataaagtg atgtacaccg 2400
aatttgattg cgtctcaacc cctacttcgg tatctgtatt atcacgtgta tttttggttt 2460
cacggaacca aaacataacc acaaggaaag tgacaatatt tagcaacgca gcgataaaaa 2520
agggactatg cggtgaaatc tctcctgcaa aaccaccaat aataggcccc gctattaaac 2580
caagcccaaa acttgcccct aaccaaccga accacttcac gcgttgagaa gctgaggtgg 2640
tatcggcaat gaccgatgcc gcgacagccc cagtagctcc tgtgatccct gaaagcaaac 2700
ggcctaaata cagcatccaa agcgcacttg aaaaagccag caataagtaa tccagcgatg 2760
cgcctattaa tgacaacaac agcactgggc gccgaccaaa tcggtcagac atttttccaa 2820
gccaaggagc aaagataacc tgcattaacg cataaagtgc aagcaatacg ccaaagtggt 2880
tagcgatatc ttccgaagca ataaattcac gtaataacgt tggcaagact ggcatgataa 2940
ggccaatccc catggcatcg agtaacgtaa ttaccaatgc gatctttgtc gaactattca 3000
tattcaccac cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccatacgc gaaaggtggt 3060
gtcaacgtaa atattaccct gttatcccta ccgccgccct agacctaggg atatattccg 3120
cttccgccgc cgcaattatt atgatgtttt tttactcggc gcttgattca ccttgttaca 3180
gattgctatt gtgtgcgcgc gtcgaatgac cgttaatatt ctctggtttt taaggcgcgt 3240
tctgttgccg gttatatgtc aagaaggtat ctatgggtga gattagtatt accaaactgc 3300
tggtagttgc ggcgctggtc gttctgctgt ttgggactaa gaagttacgt acgctgggcg 3360
gagaccttgg agcggccatt aaagggttca agaaggcgat gaatgatgac gatgctgcgg 3420
cgaaaaaagg cgcagacgtt gatcttcagg ctgaaaagct ctctcataaa gagtgacgtg 3480
gcgagcagga cgctccctca atatcttgtt cgatacaaaa aacccgcttc aaaaagcggg 3540
ttttttatca gacagatgta agtaattatt acaggattac ttaacttcca tccctttcgc 3600
ctgcaaatcg gcgtggtaag aagag 3625
<210> 52
<211> 3971
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gctgcggaat tactggtgta attttgcgtg acagccagcg cctctggccc ctatagtgaa 60
gtagatgttc aactaccaaa cagggccagt ttatgcttca aagtaatgag tacttttccg 120
gcaaagtgaa atcaatcggc ttttccagca gcagcactgg tcgcgccagc gtgggtgtta 180
tggttgaagg cgaatacacc ttcagcaccg ctgagccgga agagatgacg gtaatcagtg 240
gcgcgctgaa tgtgttactg cctgacgcga ccgactggca ggtgtatgaa gccggttcgg 300
tgtttaatgt tcccggtcac agtgagtttc atctgcaagt tgccgaaccc acctcttatc 360
tgtgccgcta tctgtaattc ctcgccttcc ccttgaacgg gagggcattt ttctgaaata 420
tcctttcttt agcccataat aatatttcct ttgctgcgat tttttcaatt tccgatatat 480
tcataattta tcaaggttga tataaatatc agtgaagatc tccagatatt gttgttgaca 540
attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg ggccccccgc gactagtcgc 600
tacactaaga gaggtctttt tatgccacat tcctacgatt acgatgccat agtaataggt 660
tccggccccg gcggcgaagg cgctgcaatg ggcctggtta agcaaggtgc gcgcgtcgca 720
gttatcgagc gttatcaaaa tgttggcggc ggttgcaccc actggggcac catcccgtcg 780
aaagctctcc gtcacgccgt cagccgcatt atagaattca atcaaaaccc actttacagc 840
gaccattccc gactgctccg ctcttctttt gccgatatcc ttaaccatgc cgataacgtg 900
attaatcaac aaacgcgcat gcgtcaggga ttttacgaac gtaatcactg tgaaatattg 960
cagggaaacg ctcgctttgt tgacgagcat acgttggcgc tggattgccc ggacggcagc 1020
gttgaaacac taaccgctga aaaatttgtt attgcctgcg gctctcgtcc atatcatcca 1080
acagatgttg atttcaccca tccacgcatt tacgacagcg actcaattct cagcatgcac 1140
cacgaaccgc gccatgtact tatctatggt gctggagtga tcggctgtga atatgcgtcg 1200
atcttccgcg gtatggatgt aaaagtggat ctgatcaaca cccgcgatcg cctgctggca 1260
tttctcgatc aagagatgtc agattctctc tcctatcact tctggaacag tggcgtagtg 1320
attcgtcaca acgaagagta cgagaagatc gaaggctgtg acgatggtgt gatcatgcat 1380
ctgaagtcgg gtaaaaaact gaaagctgac tgcctgctct atgccaacgg tcgcaccggt 1440
aataccgatt cgctggcgtt acagaacatt gggctagaaa ctgacagccg cggacagctg 1500
aaggtcaaca gcatgtatca gaccgcacag ccacacgttt acgcggtggg cgacgtgatt 1560
ggttatccga gcctggcgtc ggcggcctat gaccaggggc gcattgccgc gcaggcgctg 1620
gtaaaaggcg aagccaccgc acatctgatt gaagatatcc ctaccggtat ttacaccatc 1680
ccggaaatca gctctgtggg caaaaccgaa cagcagctga ccgcaatgaa agtgccatat 1740
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ggcacgctga aaattttgtt ccatcgggaa acaaaagaga ttctgggtat tcactgcttt 1860
ggcgagcgcg ctgccgaaat tattcatatc ggtcaggcga ttatggaaca gaaaggtggc 1920
ggcaacacta ttgagtactt cgtcaacacc acctttaact acccgacgat ggcggaagcc 1980
tatcgggtag ctgcgttaaa cggtttaaac cgcctgtttt aactgaagcc aaggcatcaa 2040
ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 2100
aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ccctagacct agggatatat tccgcttcca 2160
ttaccctgtt atccctacta agcacttgtc tcctgtttac tcccctgagc ttgaggggtc 2220
aacatgaagg tcattgatag caggataata atacagtaaa acgctaaacc aataatccaa 2280
atccagccat cccaaattgg tagtgaatga ttataaataa cagtaaacag taatgggcca 2340
ataacaccgg ttgcattggt aaggctcacc aataatccct gtaaagcacc ttgctcatga 2400
ctctttgttt ggatagacat cactccctgt aatgcaggta aagcgatccc accaccagcc 2460
aataaaatta aaacagggaa atctaaccaa ccttcagata taaacgctaa aaaggcaaat 2520
gcactactat ctgcaataaa ttcgagcagt actgccgttt tttcgcccca tttagtggct 2580
attcttcctg ccacaaaggc ttggaatact gagtgtaaaa gaccaagacc cgctaatgaa 2640
aagccaacca tcatgctatt ccatccaaaa cgattttcgg taaatagcac ccacaccgtt 2700
gcgggaattt ggcctatcaa ttgcgctgaa aaataaataa tcaacaaaat gggcatcgtt 2760
ttaaataaag tgatgtacac cgaatttgat tgcgtctcaa cccctacttc ggtatctgta 2820
ttatcacgtg tatttttggt ttcacggaac caaaacataa ccacaaggaa agtgacaata 2880
tttagcaacg cagcgataaa aaagggacta tgcggtgaaa tctctcctgc aaaaccacca 2940
ataataggcc ccgctattaa accaagccca aaacttgccc ctaaccaacc gaaccacttc 3000
acgcgttgag aagctgaggt ggtatcggca atgaccgatg ccgcgacagc cccagtagct 3060
cctgtgatcc ctgaaagcaa acggcctaaa tacagcatcc aaagcgcact tgaaaaagcc 3120
agcaataagt aatccagcga tgcgcctatt aatgacaaca acagcactgg gcgccgacca 3180
aatcggtcag acatttttcc aagccaagga gcaaagataa cctgcattaa cgcataaagt 3240
gcaagcaata cgccaaagtg gttagcgata tcttccgaag caataaattc acgtaataac 3300
gttggcaaga ctggcatgat aaggccaatc cccatggcat cgagtaacgt aattaccaat 3360
gcgatctttg tcgaactatt catattcacc accctgaatt gactctcttc cgggcgctat 3420
catgccatac gcgaaaggtg gtgtcaacgt aaatattacc ctgttatccc taccgccgcc 3480
ctagacctag ggatatattc cgcttcctgg agcaagttac agcgtaaaac gcataatatt 3540
gctgcgctaa aaattattgc tcgccgtagc gaataattat atgcctggtg tggcttcgta 3600
cgccggataa gacgcggcag gcgtcgcatc cggcattaaa ggaaaatcag caattaacgt 3660
tgtgcttcgc cacctaatcc ttcaatcagg ttttgaatta acgctgccag ttcaccagtc 3720
atcaggatga aatcggcatc aaaacgctgg gcgaaatctt cacggtcgat atcttcgttt 3780
tgatcgcgca gctcgtcgca gaacttcaga cgcttgagcg aaccatcgtc gcacatcaca 3840
aactgaatgc gctgctgcca gtcgagcgcc agtttagtca ccacttttcc ggcttcaatg 3900
tgattggtga tctcttcgct ggtcagatct tgtttcttcg cgcggatcac gccgccatct 3960
tccagcaacg a 3971
<210> 53
<211> 2378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aataatcctt cgccttgcgc aaaccaggta ctggtattgt tattaacgag aaacgtggct 60
gattattgca tttaaacggt gtaactgtct gcgtcatttt tcatatcaca ttccttaagc 120
caattttaat cctgctcaaa tgaccgtcta tgcttaaaaa acagccgtat cagcatcatt 180
actactgaag caactgaatt gtataagtta atttaatgtt aagtagtgat tcgtgccggg 240
gcgatgtctc gttttacccg accgtcgaag acaattatca gtctttatcc ggcgttctaa 300
ggtgtttatc ccactatcac ggctgaatcg ttaatatttt gcgagttcac gccgaaatac 360
tgatttttgg cgctagatca caggcataat tttcagtacg ttatagggcg tttgttacta 420
atttatttta acggagtaac atttagctcg tacatgagca gcttgtgtgg ctcctgacac 480
aggcaaacca tcatcaataa aaccgatgga agggaatatc attaccctgt tatccctact 540
aagcacttgt ctcctgttta ctcccctgag cttgaggggt caacatgaag gtcattgata 600
gcaggataat aatacagtaa aacgctaaac caataatcca aatccagcca tcccaaattg 660
gtagtgaatg attataaata acagtaaaca gtaatgggcc aataacaccg gttgcattgg 720
taaggctcac caataatccc tgtaaagcac cttgctcatg actctttgtt tggatagaca 780
tcactccctg taatgcaggt aaagcgatcc caccaccagc caataaaatt aaaacaggga 840
aatctaacca accttcagat ataaacgcta aaaaggcaaa tgcactacta tctgcaataa 900
attcgagcag tactgccgtt ttttcgcccc atttagtggc tattcttcct gccacaaagg 960
cttggaatac tgagtgtaaa agaccaagac ccgctaatga aaagccaacc atcatgctat 1020
tccatccaaa acgattttcg gtaaatagca cccacaccgt tgcgggaatt tggcctatca 1080
attgcgctga aaaataaata atcaacaaaa tgggcatcgt tttaaataaa gtgatgtaca 1140
ccgaatttga ttgcgtctca acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg 1200
tttcacggaa ccaaaacata accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa 1260
aaaagggact atgcggtgaa atctctcctg caaaaccacc aataataggc cccgctatta 1320
aaccaagccc aaaacttgcc cctaaccaac cgaaccactt cacgcgttga gaagctgagg 1380
tggtatcggc aatgaccgat gccgcgacag ccccagtagc tcctgtgatc cctgaaagca 1440
aacggcctaa atacagcatc caaagcgcac ttgaaaaagc cagcaataag taatccagcg 1500
atgcgcctat taatgacaac aacagcactg ggcgccgacc aaatcggtca gacatttttc 1560
caagccaagg agcaaagata acctgcatta acgcataaag tgcaagcaat acgccaaagt 1620
ggttagcgat atcttccgaa gcaataaatt cacgtaataa cgttggcaag actggcatga 1680
taaggccaat ccccatggca tcgagtaacg taattaccaa tgcgatcttt gtcgaactat 1740
tcatattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata cgcgaaaggt 1800
ggtgtcaacg taaatattac cctgttatcc ctaaaccatc atcaataaaa ccgatggaag 1860
ggaatatcaa agctctgtaa ccctgacggc ctctgctgag gccgtcactc tttattgaga 1920
tcgcttaaca gaacggcgat gctttgacct cccgctgttt gttcaagcgc aattttgaca 1980
ataattgtca acggcacgga aagcagcata cccaccggtc ctaacaacca tccccaaaaa 2040
atcaacgaca aaaataccac caatgtggaa agccccagcc cacgccccat gatacgcggc 2100
tccagaatat tgccgaagac cagattaatc agcagatatc ccgccagcac cagcaacgct 2160
tcgtagaagc cattaaacac cagtacctga gcgatagggg ggattgccgc gaggactgaa 2220
ccaatattcg ggatgtaatt aagcgcaaag gccagcaatc cccagacaaa agcgaagcga 2280
acatcgagtg cggcgagcat cgcccaggcg accaggccgg tgatgatgct gatggctgtt 2340
ttcagcacca gataatgaga aacactgtca atcgcacg 2378
<210> 54
<211> 2388
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agcggacatc tgaagagttg catcattatt acgagattgt ctgggacgaa gagcagacgc 60
acaaattcaa gaatatctcc ccgcatttac agcgcattaa agcgttcaaa accctcgggt 120
aaatgccctc gtcgcatcag gtaaccttgc cggtacctga tgcgctccga attctgtggg 180
tcggataagg cgtccacgcc gcatccgaca gtcgagcatc aatgcctgat gcgcttctta 240
tcaggcctac cgaacgccct gcatacaccc ctcactctat atcactctca caaattcgct 300
caaataataa acaataaact ctgttttttg atctcacccg gtaaagtcgc ctatcttttc 360
agcaacaaaa cttgattaac atcaattttg gtatgaccaa tgcaccattc atgttattct 420
caatagcgaa gaacattttc attgctgtaa cctgttgtta attaagagct atgttaataa 480
ccattaatta acaattggtt aataaattta agggggtcac gttgactacg tcgacgtaca 540
ctggcggatg tggcataaac gcctcattac cctgttatcc ctactaagca cttgtctcct 600
gtttactccc ctgagcttga ggggtcaaca tgaaggtcat tgatagcagg ataataatac 660
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aaataacagt aaacagtaat gggccaataa caccggttgc attggtaagg ctcaccaata 780
atccctgtaa agcaccttgc tcatgactct ttgtttggat agacatcact ccctgtaatg 840
caggtaaagc gatcccacca ccagccaata aaattaaaac agggaaatct aaccaacctt 900
cagatataaa cgctaaaaag gcaaatgcac tactatctgc aataaattcg agcagtactg 960
ccgttttttc gccccattta gtggctattc ttcctgccac aaaggcttgg aatactgagt 1020
gtaaaagacc aagacccgct aatgaaaagc caaccatcat gctattccat ccaaaacgat 1080
tttcggtaaa tagcacccac accgttgcgg gaatttggcc tatcaattgc gctgaaaaat 1140
aaataatcaa caaaatgggc atcgttttaa ataaagtgat gtacaccgaa tttgattgcg 1200
tctcaacccc tacttcggta tctgtattat cacgtgtatt tttggtttca cggaaccaaa 1260
acataaccac aaggaaagtg acaatattta gcaacgcagc gataaaaaag ggactatgcg 1320
gtgaaatctc tcctgcaaaa ccaccaataa taggccccgc tattaaacca agcccaaaac 1380
ttgcccctaa ccaaccgaac cacttcacgc gttgagaagc tgaggtggta tcggcaatga 1440
ccgatgccgc gacagcccca gtagctcctg tgatccctga aagcaaacgg cctaaataca 1500
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acaacaacag cactgggcgc cgaccaaatc ggtcagacat ttttccaagc caaggagcaa 1620
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ccgaagcaat aaattcacgt aataacgttg gcaagactgg catgataagg ccaatcccca 1740
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tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccatacgcga aaggtggtgt caacgtaaat 1860
attaccctgt tatccctata atcgacgtac actggcggat gtggcataaa cgcctcatcc 1920
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cgaatcctta agtatttcca gccattcccg cgcttttcat cttctgtctg atagctgctt 2040
ttctccttcg cttgcatgat tggcataact gcaaagaagg aggtgttccc gtgaataaat 2100
caatgttggc gggtatcggg attggtgtcg cagctgcgct gggcgtagcg gcagtggcca 2160
gtctgaacgt gtttgaacgg ggcccgcaat acgctcaggt tgtttctgca accccaatca 2220
aggaaacggt taaaacaccg cgtcaggagt gtcgcaacgt cacagtgacc catcgtcgac 2280
cggtgcagga tgaaaatcgc attaccgggt cggtgctcgg cgctgttgct ggcggcgtga 2340
tagggcatca gtttggtggt ggtcgcggta aagatgtcgc cactgttg 2388

Claims (3)

1.高产核黄素大肠杆菌工程菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
（1）制备prs+purF核酸片段：
分别以ZL-1F和ZL-1R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-2F和ZL-2R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-3F和ZL-3R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；
分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，再通过CPEC质粒构建方法构建成第一种质粒，将所述第一种质粒命名为p20C-prs+purF；
所述ZL-1F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述ZL-1R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述ZL-2F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
所述ZL-2R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述ZL-3F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
所述ZL-3R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
分别以ZL-4F和ZL-4R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-5F和ZL-5R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-6F和ZL-6R为上、下游引物，以所述p20C-prs+purF为模板；
以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；
以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，
通过融合PCR的方法，制备得到prs+purF核酸片段；
所述ZL-4F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
所述ZL-4R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
所述ZL-5F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
所述ZL-5R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
所述ZL-6F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
所述ZL-6R的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
所述ZL-7F的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
所述ZL-7R的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
所述ZL-8F的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
所述ZL-8R的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
所述prs+purF片段的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；
（2）获得EC-RF 01菌株：
将步骤（1）得到的prs+purF核酸片段通过λ-Red基因重组的方法整合到大肠杆菌EC-Rib 02基因组上 ，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01；
（3）制备gmk+ndk核酸片段：
分别以ZL-9F和ZL-9R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-10F和ZL-10R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-11F和ZL-11R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；
分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第二种质粒，将所述第二种质粒命名为p20C-gmk+ndk；
所述ZL-9F的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
所述ZL-9R的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
所述ZL-10F的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；
所述ZL-10R的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
所述ZL-11F的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
所述ZL-11R的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
分别以ZL-12F和ZL-12R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-13F和ZL-13R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-14F和ZL-14R为上、下游引物，以所述p20C-ndk+gmk为模板；
以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；
以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，
通过融合PCR的方法，制备得到gmk+ndk片段；
所述ZL-12F的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；
所述ZL-12R的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
所述ZL-13F的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；
所述ZL-13R的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
所述ZL-14F的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；
所述ZL-14R的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示；
所述gmk+ndk片段的核苷酸序列如SEQ No.51所示；
（4）获得EC-RF 02菌株：
将步骤（3）得到的gmk+ndk片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 01基因组上 ，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02；
（5）制备sthA核酸片段：
分别以ZL-15F和ZL-15R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-16F和ZL-16R为上、下游引物，以p20C质粒为模板；
分别通过PCR的方法扩增出来核酸片段，然后将所得的核酸片段通过CPEC质粒构建方法构建成第三种质粒，将所述第三种质粒命名为p20C-sthA；
所述ZL-15F的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；
所述ZL-15R的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；
所述ZL-16F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；
所述ZL-16R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
分别以ZL-17F和ZL-17R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-18F和ZL-18R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-19F和ZL-14R为上、下游引物，以所构建的p20C-sthA质粒为模板；
以ZL-7F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；
以ZL-8F和ZL-8R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，
通过融合PCR的方法，得到以sthA片段；
所述ZL-17F的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；
所述ZL-17R的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
所述ZL-18F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；
所述ZL-18R的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
所述ZL-19F的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；
所述sthA片段的核苷酸序列如SEQ No.52所示；
（6）获得EC-RF 03菌株：
将步骤（5）得到的sthA片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 02基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03；
（7）制备ΔpntAB片段：
分别以ZL-20F和ZL-20R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-21F和ZL-21R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-22F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；
以ZL-8F和ZL-22R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，
通过融合PCR的方法，得到以ΔpntAB片段；
所述ZL-20F的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；
所述ZL-20R的核苷酸序列如SEQ ID No.40所示；
所述ZL-21F的核苷酸序列如SEQ ID No.41所示；
所述ZL-21R的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；
所述ZL-22F的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示；
所述ZL-22R的核苷酸序列如SEQ ID No.44所示；
所述ΔpntAB片段的核苷酸序列如SEQ No.53 所示；
（8）获得EC-RF 04菌株：
将步骤（7）得到的ΔpntAB片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 03基因组上，通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04；
（9）制备Δndh片段：
分别ZL-23F和ZL-23R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-24F和ZL-24R为上、下游引物，以大肠杆菌E. coli MG1655为模板；
以ZL-25F和ZL-7R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板；
以ZL-8F和ZL-25R为上、下游引物，以pTKS/CS质粒为模板，通过融合PCR的方法，得到Δndh片段；
所述ZL-23F的核苷酸序列如SEQ ID No.45所示；
所述ZL-23R的核苷酸序列如SEQ ID No.46所示；
所述ZL-24F的核苷酸序列如SEQ ID No.47所示；
所述ZL-24R的核苷酸序列如SEQ ID No.48所示；
所述ZL-25F的核苷酸序列如SEQ ID No.49所示；
所述ZL-25R的核苷酸序列如SEQ ID No.50所示；
所述Δndh片段的核苷酸序列如SEQ No.54 所示；
（10）获得EC-RF 05菌株：
将步骤（9）得到的Δndh片段通过λ-Red基因重组的方法整合到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 04基因组上，通过过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，得到高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05。
2.权利要求1的方法构建的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05。
3.权利要求2的一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株EC-RF 05发酵生产核黄素的用途。
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