CN110218734B - 一种基于t7表达系统的表达组件 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于基因工程技术领域的一种具有稳定性、可调节性和通用性的反馈回路控制的基于T7表达系统的表达组件，该表达组件包含T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、T7 RNAP转录调控元件和T7 RNAP翻译调控元件，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。本发明通过优化反义RNA基因和lac启动子基因实现了该表达组件的稳定传代；通过对T7 RNAP上游的核糖体结合位点RBS序列改变，构建了一系列不同强度的基于T7表达系统的表达组件；所构建的表达组件能够在多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中有效表达，且均能大量表达外源蛋白。

Description

一种基于T7表达系统的表达组件

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有稳定性、可调节性和通用性的基于T7表达系统的表达组件及其转化体，适用于在DE3溶源化菌株以外的宿主中表达外源基因。

背景技术

T7表达系统由T7噬菌体基因组上的启动子，以及能特异性识别该启动子的T7RNA聚合酶(简称T7RNAP)构成。该系统可以高特异性，高效率地转录T7启动子后面的DNA序列，同时被一种T7噬菌体基因组上的终止子T7Φ特异性终止，因而被广泛地应用于原核生物中外源基因的表达。

其中T7RNA聚合酶是在T7噬菌体(EnterobacteriaphageT7)中被发现，T7噬菌体是一种能侵染大肠杆菌(Escherichia coli,简称E.coli)的烈性噬菌体，其遗传物质为双链的线性DNA，长度约为39.94kbp。T7噬菌体基因组上的基因1(Gene1)长2652bp，由大肠杆菌启动子启动转录，并能被翻译得到一个含有883个氨基酸残基、分子量约为98kDa的蛋白质，即T7RNA聚合酶。该RNA聚合酶不能识别大肠杆菌中原有的启动子，只能识别T7噬菌体基因组上特异性的启动子，即T7启动子，并依据DNA模板合成RNA。

在T7表达系统被发现后，其高效性和特异性引起了人们的兴趣。而现有的T7表达系统依赖DE3溶源菌等特殊菌株或病毒载体，使用起来很不方便。

于是有研究者开始着手克隆、表达编码T7RNA聚合酶的基因，但这项工作遇到了很大的障碍。1980年代的研究者缺乏像今天一样成熟的PCR技术，只能选择从T7噬菌体的基因组上用限制性内切酶切下Gene1。在T7噬菌体的基因组上，Gene1后面紧接着两个T7启动子，而在这些启动子前没有可用的限制性位点将它们与Gene1分开。这种带有Gene1和T7启动子的限制性片段无法被成功地连接到质粒载体上并转化宿主。当时的研究者分析，造成这种情况的原因，是Gene1编码的T7RNA聚合酶与T7启动子之间产生正反馈作用，造成质粒DNA过量转录，进而耗尽细胞内的资源，使宿主细胞无法继续生长。注意到这种限制性片段上，Gene1的方向与T7启动子相同。当Gene1被转录并翻译得到T7RNA聚合酶后，聚合酶识别T7启动子并开始转录。由于该系统的转录效率很高，转录可能产生绕整个质粒、包含Gene1的mRNA，这些mRNA翻译将得到更多的T7RNA聚合酶。这样，便形成了T7RNA聚合酶与mRNA产生的正反馈循环，宿主细胞则因为资源在这个过程中被耗尽而无法生长。为了得到Gene1的完整序列而不引入后面的T7启动子，研究者在T7噬菌体的基因组上进行了一系列的突变，设法删去了含有T7启动子部分，并引入了新的限制性位点。这种方法最终使人们得到了包含Gene1完整序列的质粒，并成功表达出了有活性的重组T7RNA聚合酶。

此后，研究者尝试向带有Gene1的质粒上插入一段由T7启动子控制的基因。尽管质粒上Gene1受到乳糖操纵子lacO基因的控制，这一尝试仍以失败告终。可能的原因是，即使在非诱导条件下，lacO基因并不能完全被LacI蛋白阻遏，因而下游的Gene1有少量的表达。这种本底表达产生的少量T7RNA聚合酶依然导致了T7启动子下游序列的过量转录。

因此可以看出T7表达系统有一定的致死性，如果想简单地将T7表达系统整合到一个质粒上，是比较困难的，而在本发明的申请人的在先专利CN103276005B中，构建的表达载体成功地将完整的Gene1与T7启动子置于同一质粒载体上，并通过使用反义RNA技术能实现表达目的基因的功能。该质粒载体的使用不依赖于特殊菌株，只需要该菌株能从lac启动子开始转录，因此能方便地应用于在不同的菌种、菌株中表达目的基因。

发明内容

尽管如此，目前已有的成熟的商业化表达系统只适合具体的宿主，在不同宿主细胞间的通用性不强，其表达能力的可调节范围较窄，表达量不易调节，在遗传背景不清楚的野生菌中寻找强启动子难度较大，大量表达外源蛋白十分困难。而理想的通用表达系统要求通用性，可调节性以及强大的蛋白表达能力，其中，可调节性是指通过功能片段的替换获得一系列强弱不同的转录元件，通用性是指具有独立于宿主之外转录的特性。

鉴于此，本发明的目的就在于提供这样一种稳定性、可调节性和通用性优异的改进的反馈回路控制的基于T7表达系统的表达组件及其转化体。本发明的思路是：本发明通过整合并改进T7RNAP转录调控元件和T7RNAP翻译调控元件来改善该表达组件的稳定传代；具体来说，通过进一步优化T7RNAP翻译调控元件中的反义RNA基因，以及作为T7RNAP转录调控元件的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子，并且通过对T7RNAP上游的核糖体结合位点RBS序列改变来进一步优化T7RNAP翻译调控元件，构建了一系列不同强度的基于T7表达系统的表达组件。

本发明的目的在于提供一种稳定性、可调节性和通用性优异的基于T7表达系统的表达组件。

本发明的目的又在于提供一种基于T7表达系统的表达组件，其中待表达的目的基因被插入到上述的表达组件中。

本发明的目的还在于提供一种转化体，其包含上述表达组件。

一种基于T7表达系统的表达组件，所述表达组件包含T7RNA聚合酶基因、T7启动子、T7RNAP转录调控元件和T7RNAP翻译调控元件；所述表达组件不依赖DE3溶源化菌表达T7启动子控制的待表达的目的基因。

所述T7RNAP转录调控元件优选为表达强度可调的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子。

具体来说，该表达强度可调的启动子可以是表达强度可调的lac启动子基因。

该表达强度可调的启动子可以是带有lacO调控序列的表达强度可调的lac启动子基因。

所述lac启动子基因的核苷酸序列优选为如序列表中SEQ ID No.1所示。

所述T7RNAP翻译调控元件优选为包含T7RNAP翻译调控元件1和T7RNAP翻译调控元件2，其中，所述T7RNAP翻译调控元件1为调控T7RNA聚合酶表达的反义RNA基因，所述T7RNAP翻译调控元件2为核糖体结合位点RBS序列。

所述反义RNA基因优选为能够和Hfq蛋白结合的反义RNA基因。

所述反义RNA基因优选为抑制或者减弱T7RNA聚合酶的表达的反义RNA基因。

T7RNAP翻译调控元件1的核苷酸序列优选为如序列表中SEQ ID No.3所示，T7RNAP翻译调控元件2的核苷酸序列优选为如序列表中SEQ ID No.2以及SEQ ID No.6-15中的任一项所示。

一种基于T7表达系统的表达组件，其中待表达的目的基因连接至上述表达组件中的T7启动子的下游。

在本发明中，对于上述表达组件中的各个组成部分的顺序没有限定，通常来说，只要T7启动子位于“表达强度可调的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子”的下游，待表达的目的基因位于T7启动子的下游即可。

只要T7RNA聚合酶基因和待表达的目的基因分别位于T7启动子的下游即可。

将所述表达组件组入重组质粒或者基因组中使用。

一种转化体，包含上述任一项所述表达组件。

在本发明中，上述转化体可以为任何通常使用的基因工程菌细菌，例如大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、中华根瘤菌、塔特姆菌、谷氨酸棒杆菌、巨大芽胞杆菌、木糖醋杆菌以及铅紫青链霉菌、短杆菌、放线菌、小球菌、节杆菌、丙酮丁醇梭菌、红球菌等等。

具体来说，所述转化体优选为大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、中华根瘤菌、塔特姆菌、谷氨酸棒杆菌、巨大芽胞杆菌、木糖醋杆菌以及铅紫青链霉菌。

本发明通过优化的反义RNA限制了T7RNAP的表达量，其抑制效果优异，并且本发明对抗性基因启动子进行了改造，同时还对RBS的影响进行了研究和改造从而从多个角度和维度来调节对待表达基因的表达。

本发明得到的表达组件的稳定性提高，能够应用的宿主菌更多；可调节性更好。

总体来说，本发明的有益效果主要体现在：1、本发明通过优化反义RNA基因和用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子基因实现了该表达组件的稳定传代；2、通过对T7RNAP上游的RBS序列改变，构建了一系列不同强度的基于T7表达系统的表达组件；3、所构建的表达组件能够在多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中有效表达，且均能大量表达外源蛋白。

附图说明

图1为表示所测定的不同宿主细胞中T7RNAP的含量的图。

图2为传代实验的流程示意图。

图3为表示不同宿主传代过程中细胞荧光强度的变化的图。

图4为表示不同宿主传代过程中荧光细胞占比的变化的图。

图5为不同强度正交转录元件的荧光测定的结果的图。

图6为表示pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒的结构的示意图。

具体实施方式

以下将对本发明做以详细说明。

本发明的表达组件包含T7RNA聚合酶基因、T7启动子、T7RNAP转录调控元件和T7RNAP翻译调控元件；其中表达组件不依赖DE3溶源化菌表达T7启动子控制的待表达的目的基因。

如上所述，在本发明的表达组件中包含的T7RNA聚合酶基因是一种RNA聚合酶，分子量约99kDa。专门催化5'→3'方向的RNA形成过程。T7RNA聚合酶具有高度启动子专一性，只转录T7噬菌体中位于T7启动子下游的的DNA或DNA复制品。本发明的表达组件中包含的T7RNA聚合酶可以是任何来源的T7RNA聚合酶，没有任何限定。

就本发明的表达组件中包含T7启动子而言，通常来说，T7噬菌体基因组上共有17个T7启动子。这些T7启动子在基因组上均朝向同一方向，但结构与功能并不完全相同，按功能可划分为3类：I类启动子位于基因组DNA两端，与复制原点相关；II类启动子位于基因组DNA靠前位置，可以转录II类基因(与DNA代谢相关的基因)和III类基因(与T7噬菌体的组装及成熟相关的基因，如噬菌体颗粒蛋白基因)；III类启动子位于基因组DNA靠后位置，仅能够转录III类基因。通常所应用的T7启动子序列是“TAATACGACTCACTATA”或者“TAATACGACTCACTATAGG”，其后第一个碱基为G，转录即从该碱基开始。同样的，T7启动子能且仅能被T7RNA聚合酶识别从而启动其下游基因转录，而不能被其他种类的RNA聚合酶识别。本发明的表达组件对于T7启动子没有任何具体的限定，本领域技术人员可以根据实际情况选择适当的T7启动子和与其一起使用的T7RNA聚合酶。

在本发明中，T7RNAP转录调控元件为表达强度可调的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子。在本领域中可以使用的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子通常包括lac启动子、tac启动子、trp启动子、Sp6启动子、P_BAD启动子、P_R启动子、P_L启动子、P_xyl启动子、P_grac启动子、抗性基因启动子等等。

在一个具体的实施方式中，用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子为表达强度可调的lac启动子基因。

在本发明中，其中表达强度可调是指表达强度可以上调，也可以下调，换言之，可以增强或减弱表达组件中使用的T7RNA聚合酶的表达强度。例如，在本发明中，这个增强或减弱的程度可以与未进行改造的用于启动T7RNA聚合酶基因的启动子(即表达强度没有调节的启动子)相比，T7RNA聚合酶的表达强度为原来的表达强度的1％～200％左右的范围，即缩小到原来的百分之一，或者增加到原来的2倍，优选为原来的2～150％左右。通过增强或减弱表达组件中使用的T7RNA聚合酶的表达强度可以提高该组件的表达性能和在传代过程中的稳定性。

在一个具体的实施方式中，本发明中涉及的Lac启动子是来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。本发明选用lac启动子来表达的T7RNA聚合酶是由于：一方面，本发明并不要求T7RNA聚合酶的表达量较高，甚至还希望其较低以避免致死效应，lac启动子作为一种效率不高的启动子，能够满足这一要求；另一方面，lac启动子是一种宿主适用范围较广的启动子，这一点与本发明试图构建宿主范围广的单质粒T7系统的构想也是相吻合的。从另一个角度来说，即使在某一种宿主中lac启动子不再能够发挥蛋白表达作用，由于对启动子强度没有要求，因而也并不难找到其他适用的启动子来替代lac启动子在该宿主中发挥T7RNA聚合酶表达功能，也就是说，本发明研究的单质粒T7表达系统的设计具有一定的通用性。

在一个具体的实施方式中，在本发明中使用的表达强度可调的lac启动子基因是指除去了CAP结合位点的lac启动子。

在本发明中，CAP结合位点是指在1ac操纵元的启动子P_1ac上游端有一段与P_lac部分重叠的序列，能与CAP特异结合，称为CAP结合位点。

在一个具体的实施方式中，在本发明中使用的表达强度可调的lac启动子基因是指除去了CAP结合位点的lac启动子，并且不具有阻遏蛋白lacI基因。

在一个具体的实施方式中，在本发明中使用的表达强度可调的lac启动子基因是指除去了CAP结合位点的lac启动子，并且具有阻遏蛋白lacI基因。

在一个具体的实施方式中，表达强度可调的lac启动子基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

在一个具体的实施方式中，在本发明中涉及的Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46bp DNA片段(包括Pribnow盒)和Lac操纵基因构成，Tac是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。在有lacI基因时，Tac启动子受IPTG的诱导。

在一个具体的实施方式中，在本发明中涉及的trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及Sp6启动子，其是Sp6噬菌体来源的启动子，需要SP6RNA聚合酶。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及P_BAD启动子，其是阿拉伯糖代谢操纵子的启动子，需要阿拉伯糖诱导。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及P_R启动子，其是Lambda噬菌体来源的启动子，受温度调节，通常和温度敏感的cI857抑制子搭配使用。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及P_L启动子，其是Lambda噬菌体来源的启动子，受温度调节，通常和温度敏感的cI857抑制子搭配使用。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及P_xyl启动子，P_xyl由xylR编码的阻遏蛋白严格控制表达，通过添加0.1％-2％的木糖，能够诱导该启动子的表达，木糖启动子系统对代谢中的大部分代谢产物不敏感，不过却受到葡萄糖的抑制。

在一个具体的实施方式中，本发明涉及P_grac启动子，其包含groE启动子、lacO操纵子和gsiB SD序列，当存在lacI基因的时候受ITGP诱导。

在本发明中使用的T7RNAP翻译调控元件包含T7RNAP翻译调控元件1和T7RNAP翻译调控元件2，其中，T7RNAP翻译调控元件1为调控T7RNA聚合酶表达的反义RNA基因，T7RNAP翻译调控元件2为核糖体结合位点RBS序列。其中，反义RNA基因抑制或者减弱T7RNA聚合酶的表达。

关于调控T7RNA聚合酶表达的反义RNA基因，其中，反义RNA(antisense RNA，简称asRNA)指的是能够与目标基因的DNA或mRNA互补(或部分互补)的单链RNA。反义RNA调控是通过反义RNA分子与靶序列碱基互补配对结合实现的，具有基因元件简单、特异性强、效率高等特点。反义RNA的存在能特异性地抑制靶基因的表达，甚至影响DNA的复制。这种调控机制天然存在于原核生物中，并被用于基因表达的人工调控。

反义RNA通过与目标RNA分子的特异性结合，从而对细胞内的诸多过程起到调控作用，主要表现在以下三个方面：1.基因翻译调控：反义RNA通过与靶mRNA分子结合形成杂交双链RNA，干扰了核糖体对mRNA的结合及翻译过程，目标基因的表达即受到抑制。人们发现与靶mRNA的核糖体结合位点(Ribosome binding site，简称RBS)以及起始密码子附近区域结合的反义RNA分子通常能起到充分的抑制效果。另一种反义RNA调控基因翻译的机制是通过与mRNA的特定序列(通常在非编码区)结合，形成的杂交双链RNA能够被RNA水解酶RNaseIII识别并降解，从而起到抑制目标基因表达的作用。对基因翻译的调控是反义RNA调控的主要作用方式，也是人们主要加以利用的反义RNA调控机制。2.基因转录调控：如果目标mRNA序列中具有一段A/T碱基丰富的区域，当反义RNA与这一区域序列结合后，则会形成类似于转录终止信号的发卡结构，从而终止mRNA转录。3.基因复制调控：某些DNA复制过程受到特定反义RNA分子的调控。

在本发明的一个具体的实施方式中，表达组件中反义RNA基因是能够和Hfq蛋白结合的反义RNA基因，通过在反义RNA基因中增加了一段Hfq序列，这段序列能够跟Hfq蛋白结合，从而促进反义RNA与靶RNA的结合，从而增强反义RNA的抑制效果。

Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白，被认为是细菌基因转录后调控的关键因子，广泛参与细菌多种生命活动的调控。Hfq可以通过形成同源六聚体结合富含A、U的单链RNA参与RNA间互作。同时Hfq蛋白还可与体内的多种RNA调节蛋白如polyA聚合酶I(PAP I)、多聚核苷酸磷酸化酶(PNP)、RNA酶E(RNase E)等并调节它们的活性。

RBS序列，即核糖体结合位点序列，是指起始密码子AUG上游的一段富含嘌呤的非翻译区，也称作SD(Shine-Dalg-arno)序列。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离，SD与AUG之间相距一般以4-10个核苷酸为佳，9个核苷酸最佳。

在具体的实施方式中，发明人设计了一系列不同的RBS序列，本发明采用了SEQ IDNo.2以及SEQ ID No.6-15中的任一项所示的RBS序列(参见下文中表4所给出的序列)，从而实现对于待表达目的基因的表达量的调控。

在本发明中，通过设计了一系列不同的RBS序列，可以将待表达目的基因的表达量调控到与目前利用DE3溶源化细菌和商业质粒表达相同蛋白的情况相比时，所表达的蛋白量的0.1％～300％左右的范围，即缩小到原来的千分之一，或者增加到原来的3倍，优选为原来的0.3～200％左右。在下文的实施例中，将使用商业化的pET30a质粒，利用大肠杆菌BL21或大肠杆菌JM109作为DE3溶源化细菌作为表达宿主，表达的待表达的目的基因的表达量作为上述比较的基准，即将利用该商业体系进行表达时的表达量视为100％。

在一个具体的实施方式中，T7RNAP翻译调控元件1的核苷酸序列如序列表中SEQID No.3所示，T7RNAP翻译调控元件2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2以及SEQ IDNo.6-15中的任一项所示。

在本发明中，虽然采用了GFP作为待表达的目标基因的例子，但是本领域技术人员可以理解，可以使用任何其希望进行表达的目标基因。例如该目标基因表达的可以是1～10000个氨基酸的蛋白质，优选可以是1～5000个氨基酸的蛋白质。

在本发明中，由于T7启动子是用来启动T7RNA聚合酶基因的；因此T7RNA聚合酶基因要位于T7启动子的下游。

在本发明中，所述表达组件还可以包含终止子。终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在构成基因群最后一个基因的后面有一个终止子。对于本发明中的终止子没有任何限定，只要是能用来终止待表达基因转录即可。通常终止子位于待表达基因的下游。

上述表达组件的构建方法，为基因重组的方法，可以进一步描述如下：

提取大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基因组，根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因组(Genome)数据库中T7RNA聚合酶的基因(Gene 1)序列设计引物，用PCR技术得到Gene1基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。然后插入到pUC质粒载体上lac启动子的下游，得到的质粒以pUCA-T-G1表示。将该质粒转入大肠杆菌中，并用IPTG诱导，并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测并确定Gene1成功表达。

此后，为了表达反义RNA，在pUCA-T-G1质粒上被插入一段启动子和终止子的序列，且启动子和终止子之间预留一个限制性位点，这一结构称为“表达单元”。编码反义RNA的序列(A4A27：AACACGATTAACATCGCTAAGAAC)分别以盒式突变的方式插入这个限制性位点中，构建出质粒pUCA-G1-A4A27，针对Gene1的抑制基因(反义序列)以Reps表示，带有Reps的质粒统称为pUCA-G1-Reps。带有这种质粒的大肠杆菌被IPTG诱导，并通过SDS-PAGE定性/半定量地检测Gene1表达被抑制的程度。

在Gene1的表达被有效抑制后，pUCA-G1-Reps质粒上的Gene1(包括上游的启动子)及Reps被切下，并插入到带有T7启动子(T7promoter)的pET质粒，最终得到目标质粒pET-G1-Reps。该质粒的表达效果通过在T7启动子下游插入一段增强型绿色荧光蛋白(EGFP，本发明中称GFP)基因或海因酶基因并诱导表达加以验证(以上操作的具体内容请参照在先专利CN103276005B)。为了参考起见，将专利CN103276005B的公开内容全部援引至本说明书。

本发明中，在上述基础上，进一步构建了包含T7RNA聚合酶基因(Gene1)、T7启动子、T7RNAP转录调控元件(lac启动子基因)和T7RNAP翻译调控元件(反义RNA基因(Reps)以及T7RNAP上游的RBS(核糖体结合位点，Ribosome binding site)序列)的pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒(如图6所示)。利用T7RNAP转录调控元件和T7RNAP翻译调控元件实现了如下效果。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例一 pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒的构建

1、作为T7RNAP翻译调控元件1的反义RNA序列的更换：

通过assembly PCR的技术合成带有Hfq结构的反义RNA序列，所需引物序列如表1所示。合成后的反义RNA序列两端分别带有Nde I和Pvu I酶切位点，将合成得到的反义RNA片段和pET-G1-A4A27-GFP载体(其构建过程请参见本发明人的在先专利CN103276005B的相应实验步骤)经过酶切、连接后得到表达组件pET-G1-A4A27-Hfq-GFP。实验所需限制性内切酶和连接酶均购自Takara。

表1合成反义RNA序列所用Oilgo DNA序列

2、作为T7RNAP转录调控元件的lac启动子基因的改造：

分别扩增pET-G1-A4A27-Hfq-GFP质粒上lac启动子上游CAP((代谢产物激活蛋白，Catabolite activator protein)结合位点)两侧的序列，再通过overlap PCR扩增得到不带有CAP位点的lac启动子启动的T7RNAP片段，片段两端分别带有BamH I和Apa I位点，所需引物序列如表2所示。将扩增得到的片段和pET-G1-A4A27-Hfq-GFP载体经过酶切、连接后得到表达组件pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP。实验所需限制性内切酶和连接酶均购自Takara。

表2lac启动子基因改造所用的Oilgo DNA序列

实施例二 基因工程菌株的构建

将pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒上的T7RNAP基因、T7RNAP转录调控元件和翻译调控元件作为整体转移到相应的宿主质粒上(所用质粒如表3所示)，构建方法采用Gibson快速构建，所用Gibson试剂购自NEB公司。构建完成后的表达组件按照相应的方法转化至对应的宿主细胞中。表3所示的载体由实验室从购买的载体构建得到。

表3各宿主所对应的质粒

实施例三 所构建的质粒在菌体中的稳定性验证

1、细胞中T7RNAP含量的测定：

通过ELISA法测定上述构建得到的基因工程菌株的细胞中的T7RNAP含量，离心收集诱导后的细胞，重悬至PBS中，超声破碎，高速离心后去上清液，测定总蛋白浓度。按每孔5ug总蛋白为准包被96孔酶标板，4℃静置过夜。手工洗涤酶标板3次，去除包被液，每孔加入200μl封闭液(5％脱脂牛奶)，室温放置1h。手工洗涤酶标板3次，去除封闭液，在每孔中加入100ul稀释后的一抗(T7RNAP单抗购自Novagen)，37℃恒温培养箱孵育1h。手工洗涤酶标板3次，去除一抗，将羊抗小鼠二抗(购自中杉金桥)按照相应的比例稀释，每孔加入稀释的二抗100μl，在37℃恒温培养箱内孵育1h。手工洗涤酶标板3次，去除酶标二抗，在配制好的ABTS底物溶液中加入过氧化氢至终浓度为0.2％，每孔加100μl配制好的显色液。室温放置10-20min后测定波长为405nm处的吸光度。图1所示为所测定的不同宿主细胞中T7RNAP的含量。由图1可知上述构建得到的基因工程菌株的细胞中的T7RNAP含量低。

2、细胞传代稳定性的测定：

将构建得到的重组菌株进行传代实验测定其在长期传代过程中的稳定性，具体实验流程如图2所示。从划线培养的平板上挑取一个克隆接种到5ml的LB培养基中，作为种瓶，37℃培养12h，从该种瓶中各取5ul转接到2瓶5ml培养基中，一瓶直接继续置于37℃振荡培养12h；另一瓶中加入终浓度0.2mM的IPTG，置于30℃诱导24h；每一次转接均按照如上操作进行。将每一次转接诱导后的细胞分别测定细胞的相对荧光强度(酶标仪(制造商：TECAN，型号：Infinite M200PRO)测定)和荧光细胞占比(Bio-Rad S3e流式细胞仪(制造商：Bio-Rad，型号：S3e)测定后统计得到)。所测结果如图3、4所示。

由图3、4可知，包含用本发明的pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒所构建的相应质粒的各种基因工程菌株的传代稳定性优异。

实施例四 通过改变作为T7RNAP翻译调控元件2的RBS序列来调节质粒的表达强度的验证

通过RBS Calculator V2.0设计不同翻译起始速率的RBS序列，具体序列如表4所示。将所设计的RBS序列的经过PCR后通过Kpn I/Apa I双酶切构建至载体中，得到一系列不同强度的正交转录元件。将这些正交转录元件分别转化至E.coli JM109和BL21菌株中，测定其相对荧光强度，结果如图5所示。由图5可知，所设计的系列RBS在较大的范围内具有一定的调节能力，说明本发明的pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP-GFP质粒具有可调节性。

表4设计的不同翻译起始速率的RBS序列

实施例五 表达组件在多种菌体中的通用性验证

将装有培养基的摇瓶中加入相应的抗生素，然后接种实施例二中所构建的重组菌株。在摇瓶中加入终浓度0.2mM的IPTG进行诱导。将摇瓶放置于最适培养温度的摇床中诱导培养24h。从摇瓶中取样离心，洗涤菌体，通过多功能酶标仪测定细胞的荧光强度。由下表5可知，由带有表达组件的重组质粒所编码的GFP能够在多种宿主菌体中表达，可见本发明的在包括下述所示的大肠杆菌、恶臭假单胞菌、中华根瘤菌、塔特姆菌等的革兰氏阴性菌和包括谷氨酸棒杆菌等的革兰氏阳性菌中都能够有效表达蛋白质，具有一定的通用性。

表5不同宿主菌中的荧光检测

实施例六 表达组件在大肠杆菌中表达不同工业酶的通用性验证

将不同的工业酶基因构建至pET-G1-A4A27-Hfq-△CAP质粒中得到带有不同工业酶基因的重组质粒，将重组质粒转化至E.coli BL21宿主中。将得到的重组菌株接种至5mlLB培养基中，37℃培养12h。将过夜培养后的种子液转接至50ml LB培养基中，加入终浓度0.2mM的IPTG，置于30℃诱导16h，收集诱导后的菌体检测其表达水平。

由下表6可知，通过在本发明表达组件中插入不同工业酶的基因，都能够较高活性地表达这些工业酶。

表6不同工业酶在大肠杆菌宿主中的表达水平

如上所述，本发明的表达组件通过反义RNA来限制T7RNAP的表达量，并且通过对组件中的反义RNA结构进行了优化，使得其抑制效果非常优异；在本发明的组件中加入了T7RNAP转录调控元件，并对该T7RNAP转录调控元件进行调节；同时本发明的组件对于T7RNAP翻译调控元件，尤其是T7RNAP翻译调控元件2进行改造从而实现对组件的表达强度进行调节。

根据实施例的图3和图4的结果可以看出，本发明涉及的表达组件的稳定性良好，在传代高达20次，高达25次以上时均可以保持良好的稳定性，该稳定性可以达到目前常用的商业化表达系统的水平，相比个别的商业化表达系统，其稳定性甚至更优。此外，根据实施例的结果可以显示本发明涉及的表达组件可以适用于广谱的宿主，尤其是可以在大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、中华根瘤菌、塔特姆菌、谷氨酸棒杆菌等中使用。

实施例中的图5显示了本发明的表达组件具有良好的可调节性，可以实现不同表达量的表达，从而为通过基因工程手段来实现外源基因的表达提供了非常优异的表达平台。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种基于T7表达系统的表达组件

<130> PA00036

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc 60

tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caccccaggc 120

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 180

cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca tgcctgcagg tcgactctag 240

aggatcccca tgatt 255

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggatttac taactggaag aggcactaa 29

<210> 3

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaatgcta 60

gctataaacg cagaaaggcc cacccgaagg tgagccagtg tgactctagt agagagcgtt 120

caccgacaaa aacagataaa acgaaaggcc cagtctttcg actgagcctt tcgttttatt 180

tgatgcctgg ctcgagctcg agaaaaaaag cccggacgac tgttcgggct tgtcttttta 240

tatgttggaa aatcagtggc aatgcaatgg cccaacagaa aaacacgatt aacatcgcta 300

agaactccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 360

gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 390

<210> 4

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctacaag cagacgcaat caatgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ctgtgagcgt gacggtggta gctgcggttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

<210> 5

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 60

gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 120

gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 180

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 240

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 300

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 360

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 420

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 480

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag 540

ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc 600

gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc 660

gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat 720

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caggtttcat taaaaacgcg catcaaaaac ctaa 34

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtatttctt tttaaacatc tccctcccat catta 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcataatcta agatagagct acccgataga ctata 35

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cggctaatac ggcctcaaga acccgagcct atta 34

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcatattaaa cctttaccca acgttaggta aata 34

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaaacaata cataacatcc agacggccac aca 33

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcataaacgg cccaaattag gacccaagaa c 31

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacgtataac gacccacata attaaggctt aactt 35

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accaaaacct actctaaccc taaggcagcc cagt 34

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caccccccct ctcccactat taaggacatc aaca 34

Claims (8)

1.一种基于T7表达系统的表达组件，所述表达组件包含T7 RNA聚合酶基因、T7启动子、T7 RNAP转录调控元件和T7 RNAP翻译调控元件；所述表达组件不依赖DE3溶源化菌表达T7启动子控制的待表达的目的基因,

其特征在于，所述T7 RNAP翻译调控元件包含：

T7 RNAP翻译调控元件1和T7 RNAP翻译调控元件2，

其中，所述T7 RNAP翻译调控元件1为调控T7RNA聚合酶表达的反义RNA基因，

所述T7 RNAP翻译调控元件2为核糖体结合位点RBS序列，

其特征在于，所述反义RNA基因抑制或者减弱T7RNA聚合酶的表达，

其特征在于，所述反义RNA基因是能够和Hfq蛋白结合的反义RNA基因,

其特征在于，T7 RNAP翻译调控元件1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，T7RNAP翻译调控元件2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2以及SEQ ID No.6-15中的任一项所示。

2.根据权利要求1所述的基于T7表达系统的表达组件，其特征在于，所述T7 RNAP转录调控元件为表达强度可调的用于启动T7 RNA聚合酶基因的启动子。

3.根据权利要求2所述的基于T7表达系统的表达组件，其特征在于，所述表达强度可调的用于启动T7 RNA聚合酶基因的启动子是表达强度可调的lac启动子基因，并且是带有lacO调控序列的lac启动子基因。

4.根据权利要求3所述的基于T7表达系统的表达组件，其特征在于，所述lac启动子基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

5.一种基于T7表达系统的表达组件，其中待表达的目的基因连接至权利要求1-4任一项所述的表达组件中的T7启动子的下游。

6.根据权利要求1或5所述的基于T7表达系统的表达组件，其特征在于，将所述表达组件组入重组质粒或者基因组中使用。

7.一种转化体，包含权利要求1-6任一项所述表达组件。

8.根据权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述转化体为大肠杆菌、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、中华根瘤菌、塔特姆菌、谷氨酸棒杆菌、巨大芽胞杆菌、木糖醋杆菌以及铅紫青链霉菌。

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