CN115960934A - 大肠杆菌表达外源基因优化方法及其序列 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了大肠杆菌表达外源基因优化方法及其序列，本发明通过使用易错PCR方法扩增含绿色荧光蛋白GFP的序列，建立一个序列突变PCR文库，再将此文库使用无缝连接的方式连接在pET22b表达载体上，使用荧光定量的方式检测蛋白的表达量，筛选出表达量最高的质粒，进行核苷酸测序。本发明使用pET22b载体，优化了其SD序列和起始密码子之间的核苷酸序列，选出了较优序列，可以大幅提升蛋白的表达量。
Description
技术领域
本发明属于DNA技术领域，尤其涉及一种大肠杆菌表达外源基因优化方法及其序列。
背景技术
大肠杆菌表达蛋白系统是发展最早、目前最为成熟的表达系统。因其具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点，因此是基础研究和商业生产重组蛋白的强大工具[1-3]，在商业化蛋白生产过程中通常需要蛋白产量最大化，因为可以降低生产成本并促进下游纯化步骤。但令人沮丧的是，目前许多编码序列即使经过密码子优化并从具有强大遗传元件的载体上表达，表达效果也很不理想。
pET表达系统是目前最常用的重组蛋白表达系统[4]，载体和编码序列之间交界处的核苷酸序列(位于SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间)，是翻译起始区域的组成部分[5-8]，有研究表明此区域的核苷酸序列可能会导致蛋白表达效果差，有进一步改进的空间。
具体包括：
1)针对不同的目标蛋白去筛选不同的克隆载体，表达菌株以及表达和纯化条件，可变因素过多，实验周期很长；
2)制备方法较复杂，不利于大批量制备，并且制备期间会引入较多的其他因素，可能对效果评估有不利影响；
3)提高蛋白表达量效果较弱。
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发明内容
本发明在于提供一种大肠杆菌表达外源基因优化方法及其序列。使用pET22b载体，优化了其SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间的核苷酸序列，选出了一条最优序列，可以大幅提升蛋白的表达量。
本发明第一个目的在于提供一种大肠杆菌表达外源基因优化方法，包括以下步骤:
(1)利用简并引物对原质粒进行PCR扩增，构建特定起始密码子上游定量个核苷酸质粒中的所有组合，对线性DNA序列进行环化后获得一个包含所有组合的质粒文库；
(2)将获得的质粒文库通过化学转化进BL21(DE3)菌株，涂固体平板，过夜生长之后挑取单菌落进行LB液发酵，培养至少12h；
(3)将细菌培养物转入TB液体培养基内，37℃培养；
(4)当OD600达到2-4时，加入终浓度为0.3mM的异丙基β-d-1-巯基半乳糖苷，28℃下继续发酵至少20h；
(5)稀释样品至OD600＝0.2-0.8；读取光密度和GFP荧光；
(6)挑选出荧光强度符合预期的菌株，进行DNA序列测序，获得突变序列。
特别的，步骤(1)中，特定起始密码子为AUG起始密码子；所述定量个核苷酸质粒为9个核苷酸的质粒。
本发明第二个目的在于提供一种大肠杆菌表达外源基因优化序列，如核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.41所示。
本发明第三个目的是提供前述序列在大肠杆菌表达蛋白中的应用。
本发明筛选出来的核苷酸序列适用于所有大肠杆菌外源基因蛋白的表达，在使用常规的蛋白表达条件下，蛋白表达量高达500mg/ml。通过发酵和纯化条件优化后蛋白表达量可达700mg/ml，可以用于商业化和药用蛋白生产，大大降低了生产成本。
此外，使用简单的蛋白标签His就可以实现蛋白纯化，缩短了纯化时间。
附图说明
图1使用构建好的质粒文库表达荧光蛋白GFP结果。
图2选择前3个序列进行不同的合成蛋白(带荧光标签GFP)表达结果。
图3本发明的技术路线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明中，GFP是指绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)。pET是指pET载体；T7是指T7 promoter：来源于T7噬菌体。IPTG是指异丙基β-d-1-巯基半乳糖苷。OD是指吸光度，OD600是指某种溶液在600nm波长处的吸光值。
本发明中，使用基于T7的pET系列的蛋白质生产载体。它们允许在含有编码T7 RNA聚合酶的溶原DE3噬菌体片段的大肠杆菌菌株中表达编码序列(coding sequence,CDS)。
这类菌株的例子包括BL21(DE3)和已被选择或设计用于高水平生产的衍生物。此前，我们将多个生物合成蛋白CDSs克隆到pET22a载体中。CDSs基因被融合到一个编码-TEV-GFP-6×His标签的区域，这样整个细胞的荧光测量就可以用来估计表达水平。
本发明所用的兼并引物为北京擎科生物科技有限公司生产的BY-1引物。
实施例一
包括以下步骤：
(1)利用简并引物对原质粒进行PCR扩增，构建了AUG起始密码子上游9个核苷酸在质粒中的所有组合，对线性DNA序列进行环化后获得一个包含所有组合的质粒文库，命名为pET22a-BY。
(2)针对获得的质粒文库pET22a-BY，通过化学转化进BL21(DE3)菌株，涂固体平板，过夜生长之后挑取单菌落至96孔板进行发酵，37℃，LB液每孔200μL，培养12h。
(3)将8μL的细菌培养物转入96孔板，每孔800μL TB液体培养基，37℃培养。
(4)当OD600达到2-4时，加入终浓度为0.3mM的IPTG，28℃下继续发酵20h。
(5)发酵完成后，将将样品稀释到适当的浓度(OD600＝0.2-0.8)。
(6)采用常规的ELISA平板阅读器测量600nm处的光密度(OD600)和GFP荧光。含200μL培养液的样品转入96孔透明微孔板用于OD600测定，96孔黑色微孔板用于GFP荧光测定。荧光强度的激发波长为485nm，发射波长为520nm。
所有测量均在摇匀20s后进行，重复3次。
(7)统计分析之后，挑选出荧光强度比较高的的菌株，进行DNA序列测序，获得突变序列。
本发明根据荧光强度排序，筛选出的高表达序列如下表1-1、表1-2所示。
表1-1
表1-2
结果如图1、图2所示；图1为对应表1-1强度比较高的48个序列，SEQ ID NO.1对应表1中序列号1的荧光强度，荧光蛋白GFP最高表达量约为65000，为SEQ ID NO.1的结果。
图2是选择表1-1中的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3选择四种不同的合成蛋白的结果，其中最高的表达量为700mg/ml。
Claims (4)
1.一种大肠杆菌表达外源基因优化方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)利用简并引物对原质粒进行PCR扩增，构建特定起始密码子上游定量个核苷酸质粒中的所有组合，对线性DNA序列进行环化后获得一个包含所有组合的质粒文库；
(2)将获得的质粒文库通过化学转化进BL21(DE3)菌株，涂固体平板，过夜生长之后挑取单菌落进行LB液发酵，培养至少12h；
(3)将细菌培养物转入TB液体培养基内，37℃培养；
(4)当OD600达到2-4时，加入终浓度为0.3mM的异丙基β-d-1-巯基半乳糖苷，28℃下继续发酵至少20h；
(5)稀释样品至OD600＝0.2-0.8；读取光密度和GFP荧光；
(6)挑选出荧光强度符合预期的菌株，进行DNA序列测序，获得突变序列。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌表达外源基因优化方法，其特征在于，步骤(1)中，特定起始密码子为AUG起始密码子；所述定量个核苷酸质粒为9个核苷酸的质粒。
3.一种大肠杆菌表达外源基因优化序列，其特征在于，如核苷酸序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.96所示。
4.权利要求3所述的序列在大肠杆菌表达蛋白中的应用。
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