CN111406104A - 减少为了生产氨基酸或氨基酸衍生产物的亚胺/烯胺的积累 - Google Patents

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Abstract

提供了微生物，该微生物被遗传修饰以过表达亚胺/烯胺脱氨酶以增强该微生物的赖氨酸和赖氨酸衍生物的生产。还提供了产生这种微生物的方法，以及使用该经遗传修饰的微生物生产赖氨酸和赖氨酸衍生物的方法。

Description

减少为了生产氨基酸或氨基酸衍生产物的亚胺/烯胺的积累
背景技术
氨基酸(诸如赖氨酸)和氨基酸衍生产物(诸如尸胺)的过度生产通常需要对宿主细胞的代谢进行重塑以增加含碳和含氮化合物向所需产物的通量。然而，改变代谢途径的通量可导致通常不积累在细胞内的中间体的积累。这样的代谢中间体可以是酶反应的最终产物或从酶的催化位点泄漏的酶反应的中间体。积累的代谢中间体对细胞也可能是有毒的，或诱导将中间体转化成对细胞有毒的化合物的其他途径的活性(Danchin,MicrobialBiotechnology 10:57-72,2017)。
亚胺/烯胺中间体经常在导致反应性氨基酸衍生物(例如氨基丙烯酸酯或亚氨基丙酸)的形成的转氨、外消旋或脱氨反应期间形成。亚胺/烯胺形成有时涉及辅因子磷酸吡哆醛(PLP)。已知反应性亚胺/烯胺引起细胞损伤并且在氨基酸(诸如赖氨酸)和氨基酸衍生产物(诸如尸胺)的过度生产期间可能积累在细胞内。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)中赖氨酸或尸胺的过度生产可涉及以导致产生亚胺/烯胺化合物的方式对宿主代谢重塑。
赖氨酸或尸胺的过度生产涉及编码以下一种或多种蛋白质的基因的过表达：二氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS,EC 4.2.1.52)、二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH,EC 1.4.1.16)和二氨基庚二酸脱羧酶(DAPDC,EC 4.1.1.20)(Anastassiadis,Recent Patents onBiotechnology 1:11-24,2007)。DHDPS催化丙酮酸和天冬氨酸半醛的缩合以形成4-羟基-2,3,4,5-四氢-L,L-吡啶二羧酸，其涉及亚胺中间体的形成(Dobson et al.,ProteinScience 17:2080-2090,2008)。DAPDH催化L-2-氨基-6-酮基庚二酸的还原胺化，产生被NADPH还原的亚胺中间体以产生内消旋DAP(Scapin et al.,Biochemistry 37:3278-3285,1998)。DAPDC是PLP依赖性酶，其催化内消旋DAP脱羧为赖氨酸。某些DAPDC在PLP存在下形成醛亚胺(Hu et al.,J.Biol.Chem.283:21284-21293,2008)。
赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸共享相同的上游代谢途径，因为所有三个氨基酸均衍生自天冬氨酸。天冬氨酸转化为赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸的前体是由三种不同的天冬氨酸激酶催化的，一个激酶对应于一个氨基酸(LysC、MetL、ThrA)。然而，增加天冬氨酸生物合成的通量以增加赖氨酸或尸胺产生也将增加苏氨酸产生，因为它们共享共同的前体。苏氨酸在细胞中的积累可触发苏氨酸脱水酶(EC4.3.1.19)的活性，苏氨酸脱水酶是参与苏氨酸分解代谢为异亮氨酸的第一个酶。苏氨酸脱水酶是催化苏氨酸脱水为氨基巴豆酸酯(烯胺中间体)的PLP依赖性酶。氨基巴豆酸酯可以互变异构化为亚氨基丁酸酯(亚胺中间体)。因此，苏氨酸在细胞中的积累可增加这些有毒的烯胺/亚胺中间体在细胞内的积累。
在某些情况下，减少或消除通过苏氨酸生物合成途径的通量以增加朝向赖氨酸和尸胺生物合成的含碳化合物和含氮化合物的通量。然而，需要将苏氨酸加入培养基中以确保苏氨酸的胞内浓度足以用于细胞生长。外部苏氨酸的添加可导致添加足够的苏氨酸，氨基酸在细胞内积累，在这种情况下，氨基巴豆酸酯和亚氨基丁酸酯的累积可如上所述产生。
赖氨酸转化为尸胺涉及PLP依赖性酶赖氨酸脱羧酶。因此，尸胺的过度生产涉及增加PLP的胞内浓度，这可以通过将PLP加入到培养基中或者过表达参与PLP合成的基因(例如pdxST)来实现。如上所述，导致亚胺/烯胺积累的一些反应是PLP催化的反应。因此，PLP胞内浓度的增加使亚胺/烯胺在细胞内形成和积累的可能性增加。
发现肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)产生具有亚胺/烯胺脱氨酶活性的蛋白RidA(YjgF)，从而允许其催化氨的释放和从亚胺/烯胺化合物生产更稳定且毒性较低的中间体(Lambrecht et al.,J.Biol.Chem.287:3454-3461,2012)。RidA通过催化氨从中间体烯胺/亚胺化合物中去除氨以形成无毒的2-酮丁酸来保护肠道沙门氏菌免受由PLP依赖性苏氨酸脱水酶(IlvA)的活性形成的有害亚胺/烯胺分子的影响。RidA的活性还显示保护细胞免受2-氨基丙烯酸酯(在丝氨酸分解代谢期间形成的烯胺)的影响(Lambrecht etal.,mBio 4:1-8,2013)。亚胺/烯胺的积累还使细胞中的PLP催化的酶失活，因此去除亚胺/烯胺是重要的。
发明内容
本文提供了宿主细胞，该宿主细胞被遗传修饰以提高亚胺和烯胺化合物的去除并因此相对于不具有用以增加亚胺和/或烯胺去除的所述遗传修饰的相同菌株的宿主细胞，增加亚胺/烯胺为其中间体的氨基酸或氨基酸衍生物的产生。本文还提供了产生此类宿主细胞的方法；和使用所述宿主细胞来产生增加产率的氨基酸或氨基酸衍生物诸如赖氨酸或尸胺的方法。
因此，在一个方面，本文提供了一种工程化宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物(例如赖氨酸或尸胺)产生的方法，该方法包括将包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸的多核苷酸(例如异源多核苷酸)引入宿主细胞中，其中所述宿主细胞具有至少一种另外的遗传修饰，与野生型宿主细胞相比，该另外的遗传修饰增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生；在表达所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的条件下培养所述宿主细胞，并选择相对于未修饰成表达编码所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的所述多核苷酸的相同菌株的相对应宿主细胞，产生增加量的氨基酸或氨基酸衍生物(例如赖氨酸或尸胺)的宿主细胞。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQID NO:10具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含在引入到细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含可操作地连接到启动子的所述多核苷酸。在其它实施方案中，引入宿主细胞的所述多核苷酸被整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞被另外修饰以过表达外源赖氨酸脱羧酶；和/或一种或多种外源赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞另外过表达外源LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞被另外修饰以过表达外源CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞是埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；哈夫尼菌属(Hafnia)，例如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；或棒状杆菌属(Corynebacterium)，例如谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在另一方面，本文提供了根据前述段落的方法产生的经遗传修饰的宿主细胞。
在另一方面，本文提供了包含多核苷酸(例如异源多核苷酸)的经遗传修饰的宿主细胞，该多核苷酸包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸，该经修饰的宿主细胞与未修饰成表达编码所述亚胺/烯胺多肽的所述多核苷酸的相对应宿主细胞相比，增加氨基酸(例如赖氨酸)或氨基酸衍生物(例如尸胺)的量；并且与野生型宿主细胞相比，具有增加所述氨基酸或氨基酸衍生物的产生的至少一种另外的遗传修饰。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ IDNO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12具有至少70％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95％的同一性。在一些实施方案中，所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含在引入到细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含可操作地连接到启动子的所述多核苷酸。在其它实施方案中，引入宿主细胞的所述多核苷酸被整合到宿主染色体中。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞另外过表达赖氨酸脱羧酶；和/或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞是埃希氏菌属，例如大肠杆菌；哈夫尼菌属，例如蜂房哈夫尼菌；或棒状杆菌属，例如谷氨酸棒状杆菌。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞另外过表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。在一些实施方案中，所述经遗传修饰的宿主细胞另外过表达CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。
在另一方面，本文提供了产生氨基酸或氨基酸衍生物(例如赖氨酸或尸胺)的方法，该方法包括在表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的条件下培养如前述两段中所述的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离所述氨基酸或氨基酸衍生物，例如赖氨酸或尸胺。
附图说明
图1提供了RidA同源性蛋白序列(由PDB登录号标识)的示例性比对。
图2提供了大肠杆菌RidA和旁系同源物蛋白序列的示例性比对。在对应于RidA的E120、C107、V18、K73和E122的位置下面划线。YjgH的位置D76和K123(分别对应于RidA的位置K73和E122)处的氨基酸在YjgH和YoaB序列中是保守的，并且以粗的放大字体示出。
具体实施方式
术语
如在本公开的上下文中使用的，“亚胺/烯胺脱氨酶多肽”是指降低宿主细胞中亚胺/烯胺水平的酶。这种多肽催化氨从亚胺/烯胺中释放。与未被遗传修饰成过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的野生型相对应宿主细胞相比，当由被遗传修饰成过表达所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞产生时，根据本公开降低亚胺/烯胺水平的多肽通常将水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。
术语“亚胺/烯胺脱氨酶多肽”涵盖本文所述的具体多肽的生物学活性变体、等位基因、突变体和种间同源物。编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸是指基因、mRNA前体、mRNA等，包括编码本文所述的特定氨基酸序列的变体、等位基因、突变体和种间同源物的核酸。
亚胺/烯胺脱氨酶多肽的术语“表达增加”和“过表达”在本文中可互换使用，指在经遗传修饰的细胞(例如其中已经引入编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的表达构建体的细胞)中的亚胺/烯胺脱氨酶多肽的量与不具有所述遗传修饰的相对应细胞(即没有所述修饰的相同菌株的细胞)中亚胺/烯胺脱氨酶多肽的量相比是增加的。与所述相对应未修饰细胞相比，用于本申请目的的增加的表达水平是至少5％、或至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。所述未修饰的细胞不需要表达所述亚胺/烯胺脱氨酶。因此，术语“过表达”还包括其中亚胺/烯胺脱氨酶多肽在不天然表达所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞中表达的实施方案。亚胺/烯胺脱氨酶多肽的表达增加可通过任何测定来评估，包括但不限于测量从所述亚胺/烯胺脱氨酶基因转录的RNA水平、亚胺/烯胺脱氨酶多肽的水平和/或亚胺/烯胺脱氨酶多肽活性的水平。
在生产氨基酸(例如赖氨酸)或氨基酸衍生物(如赖氨酸衍生物，诸如尸胺)的上下文中，如本文所用，术语“提高”是指与对照相对应细胞(诸如野生型菌株的细胞，或者不具有增加氨基酸或氨基酸衍生物产生的所述遗传修饰的相同菌株的细胞)相比，经遗传修饰的宿主细胞的氨基酸(例如赖氨酸)或衍生物的产生增加。与对照细胞相比，所述氨基酸或其衍生物的产生提高了至少5％，通常至少0％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
当在对给定氨基酸或多核苷酸序列进行编号的上下文中使用时，术语“参考...编号”或“对应于”或“参考...确定”是指在将所述给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列比较时指定参考序列的残基的编号。例如，当在SEQ ID NO:10和同源物或变体以最大比对的比较中将残基与氨基酸比对时，YoaB多肽变体或同源物中的残基“对应于”SEQ ID NO:10中位置处的氨基酸。类似地，当在SEQ ID NO:12和同源物或变体以最大比对的比较中将残基与氨基酸比对时，YjgH多肽变体中的残基“对应于”SEQ ID NO:12中位置处的氨基酸。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指从5'端读取到3'端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。在本发明中使用的核酸通常含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，可以使用可具有替代主链的核酸类似物，该替代主链包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺连接(参见Eckstein,Oligonucleotidesand Analogues:A Practical Approach,Oxford University Press)；阳性主链；非离子主链和非核糖主链。核酸或多核苷酸还可以包括允许聚合酶正确通读的经修饰的核苷酸。“多核苷酸序列”或“核酸序列”包括作为单独的单链或以双链的核酸的有义链和反义链两者。如本领域技术人员将理解的，单链的描述还限定互补链的序列；因此，本文所述的序列还提供该序列的互补序列。除非另外指明，否则特定的核酸序列也隐含地包涵其变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的所述序列。核酸可以是DNA，基因组DNA和cDNA，RNA或杂合体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。除非另外指明，否则核酸序列以5’至3’方向呈现。
在两条核酸或多肽的上下文中使用的术语“基本上相同”是指与参考序列具有至少40％、45％或50％序列同一性的序列。同一性百分比可以是50％至100％的任何整数。一些实施方案包括：如下所述，使用本文所述程序，优选使用标准参数的BLAST，与参考序列相比，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如果两个核酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基的序列如下所述进行最大对应性比对时分别是相同的，则这两个序列被认为是“相同的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指当在比较窗口上进行最大对应性比较和比对时，如使用以下序列比较算法中的一个或通过手动比对和目视检查来测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。当参考蛋白质或肽使用序列同一性百分比时，应认识到，不相同的残基位置通常由于保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代并因此不改变分子的功能性质。如果序列因保守取代而不同，可以上调序列同一性百分比以根据取代的保守性质进行校正。用于这种调整的手段是本领域人员已知的。通常，这包括对保守取代作为部分而非完全错配进行评分，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸记为1分且非保守取代记为0分，那么保守取代的分值介于0到1之间。
对于序列比较，通常将一个序列作为与将其与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。也可以使用默认程序参数，或可以设定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可用于确定亚胺/烯胺脱氨酶多肽是否与SEQ ID NO:10或12或另一多肽参考序列具有序列同一性的算法是BLAST算法，其描述在Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410，该文献并入本文参考。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(在万维网ncbi.nlm.nih.gov/)。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认值：字长(W)为3，预期值(E)为10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。可以使用的其他程序包括Needleman-Wunsch程序(J.MoI.Biol.48:443-453(1970))，其使用BLOSUM62，缺口起始罚分为7以及缺口延伸罚分为1；和gapped BLAST 2.0(参见Altschul,et al.1997,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)二者。
如本文所用，“比较窗口”包括提及任何一个数目的连续位置的区段，该数目选自20-600组成的组，通常约50-约200，更通常约100-约150，其中在两个序列进行最佳比对后，可将一个序列与相同数目连续位置的参考序列进行比较。用来比较的序列比对方法是本领域公知的。可以例如通过Smith&Waterman,Adv Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索法，通过这些算法的计算机化实现(GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或通过手工比对和目测检查来进行序列最佳比对用于比较。
与参考序列基本相同的核酸或蛋白质序列包括“经保守修饰的变体”。对于特定的核酸序列，经保守修饰的变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在由密码子确定丙氨酸的每一位点，该密码子可以变化成任何所述的相应密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，它们是一类经保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列还描述所述核酸的任何可能的沉默变异。技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)都可被修饰以生成功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都包含在每个所述序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到当改变导致一个氨基酸被一个化学相似的氨基酸取代时，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中(改变单个氨基酸或者所编码序列中的小部分氨基酸)的各个取代是“经保守修饰的变异”。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。以这种方式定义的氨基酸基团的例子可以包括：“带电/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷氨酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)和His(组氨酸或H)；“芳族或环状组”，包括Pro(脯氨酸或P)、Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)和Trp(色氨酸或W)；和“脂族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)和Cys(半胱氨酸或C)。在每组内，还可以鉴别出亚组。例如，带电/极性氨基酸组可被细分成多个亚组，包括：“带正电亚组”，包括Lys、Arg和His；“带负电亚组”，包括Glu和Asp；以及“极性亚组”，包括Asn和Gln。在另一例子中，芳族或环状组可被细分成多个亚组，包括：“氮环亚组”，包括Pro、His和Trp；和“苯基亚组”，包括Phe和Tyr。在又一例子中，脂族组可以被细分为多个亚组，包括：“大脂族非极性亚组”，包括Val、Leu和Ile；“脂族轻微极性亚组”，包括Met、Ser、Thr和Cys；和“小残基亚组”，包括Gly和Ala。保守突变的例子包括以上亚组内氨基酸的氨基酸取代，诸如但不限于：Lys取代为Arg或反之，使得可维持正电荷；Glu取代为Asp或反之，使得可维持负电荷；Ser取代为Thr或反之，使得可以维持自由-OH；以及Gln取代为Asn或反之，使得可维持自由-NH2。以下六个组各自含有进一步提供用于彼此的示例性保守取代的氨基酸。1)Ala、Ser、Thr；2)Asp、Glu；3)Asn、Gln；4)Arg、Lys；5)Ile，Leu，Met，Val；和6)Phe、Try和Trp(参见例如Creighton，Proteins(1984))。
本文所用的术语“启动子”是指能够驱动细胞中的DNA序列转录的多核苷酸序列。因此，本发明的多核苷酸构建体中使用的启动子包括参与控制或调节基因转录的时间和/或速度的顺式和反式-作用转录控制元件和调节序列。例如，启动子可以是顺式作用转录控制元件，包括增强子、阻遏物结合序列等。这些顺式作用序列通常与蛋白或其它生物分子相互作用以进行(打开/关闭、调节、调整等)基因转录。最经常地，核心启动子序列位于翻译起始位点的1-2kb内，更经常地，在翻译起始位点的1kbp内并且经常在500bp或200bp内或更少。按照惯例，启动子序列通常作为其控制的基因的编码链上的序列提供。在本申请上下文中，启动子通常由其天然调控表达的基因的名称被提及。在本发明的表达构建体中使用的启动子以基因的名称被提及。按名称提及“启动子”包括野生型天然启动子以及保持诱导表达的能力的启动子的变体。通过名称提及启动子不限于特定物种，而且还涵盖来自其它物种中相应基因的启动子。
本发明上下文中的“组成型启动子”是指在细胞的大部分条件下(例如在缺少诱导分子时)能够引发转录的启动子。“诱导型启动子”在诱导物分子存在时引发转录。
如本文所用，如果其源自外来物种，或者如果来自相同物种，则其从其原始形式被修饰，则多核苷酸与生物体或第二多核苷酸序列是“异源”的。例如，当编码多肽序列的多核苷酸被称为可操作地连接至异源启动子时，这意味着编码所述多肽的多核苷酸编码序列源自一个物种，而启动子序列源自另一种不同物种；或者，如果两者均源自相同物种，则编码序列并非天然地与所述启动子相关联(例如为遗传工程化的编码序列，例如来自相同物种的不同基因，或来自不同物种的等位基因)。类似地，如果天然野生型宿主细胞不产生多肽，则所述多肽对宿主细胞是异源的。
本文使用的术语“外源”通常是指通过分子生物学技术引入宿主细胞以产生重组细胞的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的例子包括载体、质粒和/或编码所需蛋白质的人造核酸构建体。宿主细胞中表达的“外源”多肽可以天然地发生在野生型宿主细胞中或者可以与宿主细胞是异源的。该术语还包含已经被工程化以表达外源多核苷酸或多肽序列的原始宿主细胞的子代，即表达“外源”多核苷酸的宿主细胞可以是原始遗传修饰的宿主细胞或包含所述遗传修饰的子代细胞。
术语“内源”是指可以在给定野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸序列或多肽。在这方面，还应当注意，即使生物体可以包含给定多核苷酸序列或基因的内源拷贝，但是引入编码该序列的表达构建体或载体以诸如过表达所编码的蛋白或以其它方式调节所编码蛋白的表达，代表该基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝。本文所述的任何途径、基因或酶可以利用或依赖于可以作为一种或多种“外源”多核苷酸序列提供的“内源”序列，或两者。
如本文所用的“重组核酸”或“重组多核苷酸”是指其中以下至少一个为真的核酸的聚合物：(a)核酸序列对于给定宿主细胞是外来的(即未天然发现于给定宿主细胞中)；(b)序列可以天然发现于给定宿主细胞中，但是非自然的(例如大于预期的)量；或(c)核酸序列包含两个或更多个未发现在天然中彼此存在相同关系的子序列。例如，关于情况(c)，重组核酸序列将具有来自无关基因两个或更多个的序列被排列产生新的功能核酸。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)片段之间的功能关系。通常，它是指转录调控序列与被转录的序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列刺激或调节适当宿主细胞或其它表达系统中的DNA或RNA序列的转录，则启动子或增强子序列可操作地连接到所述DNA或RNA序列。通常，可操作地连接到被转录序列的启动子转录调节序列与所述被转录序列物理上邻接，即它们是顺式作用。然而，某些转录调节序列(诸如增强子)不需要与它们所增强转录的编码序列物理上邻接或在位置上密切靠近.
术语“表达盒”或“DNA构建体”或“表达构建体”是指当引入宿主细胞时分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译的核酸构建体。在表达转基因的情况下，本领域技术人员将认识到，插入的多核苷酸序列不需要与其所衍生自的基因的序列相同，但是可以与其所衍生自的基因的序列仅基本上相同。如本文所解释的，这些基本上相同的变体是通过参考特定核酸序列特异性涵盖的。表达盒的一个例子是多核苷酸构建体，其包含可操作地连接到启动子(例如其天然启动子)的编码用于本发明的多肽的多核苷酸序列，其中表达盒被引入异源微生物。在一些实施方案中，表达盒包含编码本发明多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸靶向微生物基因组中的位置，使得所述多核苷酸序列的表达由存在于所述微生物中的启动子驱动。
在本发明上下文中使用的术语“宿主细胞”是指微生物并且包括个体细胞或细胞培养物，该个体细胞或细胞培养物可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，且该子代因自然的、随机的或有意的突变和/或变化而不必与原亲代细胞完全相同(在形态学上或总DNA互补性上)。宿主细胞包括已经引入了本发明的重组载体或多核苷酸的细胞，包括通过转化、转染等。
术语“分离的”是指基本上或实质上不含通常在其天然状态时与其一起出现的组分。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”可指已经与在其天然存在的状态或基因组状态下位于其侧翼的序列分离的多核苷酸，例如，已经诸如通过克隆进载体中而从通常与DNA片段相邻的序列中取出的DNA片段。如果例如将多核苷酸克隆到不是天然环境一部分的载体中，或者如果将其以不同于其天然存在的状态的方式被人工引入到细胞的基因组中，则认为多核苷酸是分离的。或者，如本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指不含细胞其它组分的多肽分子，即其不与体内物质相关联。
本发明的各方面
本公开部分基于以下发现：微生物(诸如革兰氏阴性细菌)中的一种或多种亚胺/烯胺脱氨酶多肽的表达增加提高了氨基酸(例如赖氨酸)的产生和/或赖氨酸的氨基酸衍生物(诸如尸胺)的产生。
RidA是YjgF/YER057c/UK114家族的成员，该家族在所有生命域中是保守的(pfam:PF01042)。该家族的成员是约15kDa的小蛋白，并形成同型三聚体—三聚体桶状四级结构。该家族成员具有不同表型并且不具有明确限定的生物学作用，如具有限定的底物和产物的大部分其他很好限定的蛋白质家族(例如p450单氧化酶、DNA聚合酶或赖氨酸脱羧酶)。最近，公布了来自拟南芥(Arapidopsis thaliana)的RidA的晶体结构(PBD ID:5HP7)(Lu etal.,Scientific Reports 6:30494,2016)。该家族的其他成员的晶体结构也已被公开(PBDID：1QD9枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YabJ，头寇岱硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)YjgF成员的1X25，大肠杆菌RidA的1QU9，大肠杆菌TdcF的2UYN，人p14.5的1ONI)。RidA同源物蛋白的序列(由PDB登录号标识)在图1中示出。该家族的成员具有参与三聚体形成和底物结合的几个重要的残基。这些位置中的五个在5HP7氨基酸序列中由下划线指示。
大肠杆菌还表达编码RidA的基因。大肠杆菌RidA已经显示在硫胺素合成中是重要的(Bazurto et al.,mBio 7:1-9,2016)，并且还可在氧化应激期间起到伴侣蛋白质的作用(Muller et al.,Nature Communications 5:1-14,2014)。用以增加朝向赖氨酸产生的代谢通量的酶的过表达预期在细胞上产生代谢负担和应激；因此，预期RidA的过表达将有助于除去由于代谢应激而形成的有毒中间体并增加赖氨酸产生。令人惊奇的是，在此发现大肠杆菌RidA的过表达不增加赖氨酸的产生。
然而，大肠杆菌还含有RidA的四个旁系同源物，其为YjgH、TdcF、RutC和YoaB。令人惊讶的是，观察到某些旁系同源物的过表达确实导致赖氨酸和尸胺产生的变化。例如，编码YjgH和YoaB的基因的过表达增加了赖氨酸和尸胺产生。
已经解析大肠杆菌YjgH的晶体结构(PDB ID:1PF5)。使用UCSF Chimera中的Needleman-Wunsch算法和BLOSUM 62矩阵对1PF5和1Q9的晶体结构分析显示，这两个结构可以以极其高的相似性彼此顶部叠加。
在图2中示出了大肠杆菌RidA和其旁系同源物YjgH、YoaB、RutC和TdcF的氨基酸序列比对。对于配体结合和三聚体形成是重要的RidA位置处的氨基酸包括位置E120、C107、V18、K73和E122。涉及配体结合的RidA中的E120在所有旁系同源物中是保守的。然而，对配体结合也重要的RidA中的E107在所有旁系同源物中不是保守的。此外，对三聚体形成是重要的三个残基V18、K73和E122也不是保守的。在这五个氨基酸中，四个在所有旁系同源物中不是保守的，其中对三聚体形成是重要的两个，在YjgH的位置D76和K123(对应于RidA的K73和E122)处的氨基酸，显示在YjgH和YoaB之间是保守的。这两个位置在图2中以粗体突出显示。
根据本发明被工程化以过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽(诸如Yjgh或YoaB)的宿主细胞还过表达参与合成氨基酸或氨基酸衍生物的至少一种酶(诸如赖氨酸脱羧酶多肽)；和/或参与氨基酸生物合成的另外的多肽。赖氨酸脱羧酶和赖氨酸生物合成多肽和核酸序列在本领域中是可获得的。
本发明采用各种常规重组核酸技术。通常，下文描述的重组DNA技术中的术语和实验室步骤是本领域中常规使用的。提供用于进行重组DNA操纵的指导的许多手册是可用的，例如Sambrook&Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(3rd Ed,2001)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,et al.,John Wiley and Sons,NewYork,2009-2014)。
编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的多核苷酸
各种多核苷酸已经显示出编码催化氨释放并降低亚胺和烯胺水平的多肽(例如来自大肠杆菌的yoaB或yjgH)。
适用于本发明的亚胺/烯胺脱氨酶核酸和多肽序列包括编码如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示的亚胺/烯胺脱氨酶多肽或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有基本上同一性的生物学活性变体的亚胺/烯胺脱氨酶核酸序列。在一些实施方案中，这种基本上相同的变体与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或备选的亚胺/烯胺脱氨酶多肽例如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的同源物具有至少70％、或至少75％、80％、85％或90％的同一性。在一些实施方案中，基本上相同的变体(如参照大肠杆菌YjgH蛋白序列SEQ ID NO:12确定的)包括在位置121处的酸性氨基酸残基、在位置76处的酸性残基和在位置123处的碱性氨基酸残基。在一些实施方案中，基本上相同的变体(如参照大肠杆菌YjgH蛋白序列SEQ ID NO:12确定的)包括在位置76处的D、在位置121处的E和在位置123处的K。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％或至少95％的同一性。如本文所用，术语“变体”涵盖相对于亚胺/烯胺脱氨酶多肽参考序列(诸如SEQ ID NO:10或12)具有一个或多个取代、缺失或插入的生物学活性多肽。因此，术语“变体”包括生物学活性片段以及取代变体。
在一些实施方案中，根据本发明对宿主进行遗传修饰以表达YoaB多肽。示例性序列被提供为SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰以表达与SEQ ID NO:10具有至少90％的同一性、或至少95％的同一性的YoaB多肽并且与未被工程化以过表达所述YoaB多肽的相对应菌株相比，增加赖氨酸和/或尸胺产生至少20％或更多。在一些实施方案中，所述YoaB多肽与SEQ ID NO:10具有至少70％的同一性或至少75％的同一性。在一些实施方案中，所述YoaB多肽与SEQ ID NO:10具有至少80％的同一性或至少85％的同一性。
在一些实施方案中，根据本发明对宿主进行遗传修饰以表达YjgH多肽。示例性序列被提供为SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰以表达与SEQ ID NO:12具有至少90％的同一性、或至少95％的同一性的YjgH多肽并且与未被工程化以过表达所述YjgH多肽的相对应菌株相比，增加赖氨酸和/或尸胺产生至少20％或更多。在一些实施方案中，所述YjgH多肽与SEQ ID NO:12具有至少70％的同一性或至少75％的同一性。在一些实施方案中，所述YjgH多肽与SEQ ID NO:12具有至少80％的同一性或至少85％的同一性。
可以使用任意数量的测定来评价亚胺/烯胺脱氨酶多肽活性，包括评价氨基酸或氨基酸衍生化合物产生的测定。在一些实施方案中，测量了赖氨酸的产生或尸胺产生。在实施例部分中提供了示例性测定。在一些实施方案中，在被修饰以共同表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和CadA以及待测试的YoaB或YjgH的变体或者其它待测试的亚胺/烯胺脱氨酶多肽的大肠杆菌中测量尸胺产生。下面是用于评估赖氨酸和/或尸胺生产的示例性测定。大肠杆菌被修饰以表达LysC、DapA、LysA、Asd、DapB、AspC和CadA和待测试的变体。基因可以单独引入大肠杆菌中或者引入一个或多个操纵子中。例如，LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC可以由存在于一个质粒中的合成操纵子编码，而CadA和候选变体可以由单独的质粒编码。每个质粒具有独特的抗生素抗性可选择标记。选择并培养抗生素抗性菌落。例如，在37℃在3mL含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸和用于选择的合适抗生素的培养基中培养培养物过夜。第二天，将各培养物接种于具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、抗生素的50mL新鲜培养基中并在37℃培养72小时，就在这时确定赖氨酸浓度。可以使用NMR定量赖氨酸或尸胺。可以通过将所产生的赖氨酸或尸胺的摩尔量除以加入的葡萄糖的摩尔量来计算产率。用于本发明的亚胺/烯胺脱氨酶多肽增加了赖氨酸或尸胺的产率。或者，针对另一赖氨酸衍生物的产生增加对菌落进行评估。
在一些实施方案中，与包含相同遗传修饰而不是过表达YoaB或YjgH多肽的修饰的相同菌株的相对应宿主细胞相比，YoaB或YjgH多肽当在宿主细胞中表达时增加赖氨酸或尸胺产生至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多。在一些实施方案中，与包含用以过表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶，二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶的修饰但不过表达YoaB或YjgH多肽的相同菌株的相对应宿主细胞相比，YoaB或YjgH多肽当在被修饰过表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶，二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶的宿主细胞中表达时使赖氨酸或尸胺产生增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多。
亚胺/烯胺脱氨酶多核苷酸序列的分离或产生可以通过多种技术完成。这种技术将在亚胺/烯胺脱氨酶基因的上下文中讨论。然而，本领域技术人员理解，可以使用相同技术来分离和表达其他所需基因。在一些实施方案中，基于本文公开的序列的寡核苷酸探针可用于从所需细菌物种中鉴别cDNA或基因组DNA文库中的所需多核苷酸。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同植物物种中的同源基因。
或者，可使用常规扩增技术从核酸样品扩增感兴趣的核酸。例如，PCR可用于直接自mRNA、自cDNA、自基因组文库或cDNA文库扩增基因序列。PCR和其它体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，以使核酸用作用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其它目的的探针。
可以从本文提供的序列的比较中生成用于鉴定细菌中亚胺/烯胺脱氨酶多核苷酸的合适引物和探针。对于PCR的总体概述，参见PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.and White,T.,eds.)Academic Press,San Diego(1990)。在实施例部分中的引物表中示出了示例性引物序列。
编码用于本公开中的亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸序列包括通过诸如使用示例性核酸序列(例如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11)的杂交和/或序列分析的技术来鉴定和表征的基因和基因产物。在一些实施方案中，通过引入与包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的多核苷酸具有至少60％的同一性、或至少70％、75％、80％、85％或90％的同一性或100％的同一性的核酸序列来遗传修饰宿主细胞。
编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸序列可以另外被密码子优化以在所需宿主细胞中表达，该亚胺/烯胺脱氨酶多肽赋予宿主细胞增加的氨基酸(例如赖氨酸)或氨基酸衍生产物(例如尸胺)的产生。可以采用的方法和数据库在本领域中是已知的。例如，可以关于单个基因中的密码子使用、共同功能或来源的一组基因、高度表达的基因、整个生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率、相关生物体的聚集蛋白编码区中的密码子频率或其组合来确定优选的密码子。参见例如Henaut and Danchin in"Escherichia coli andSalmonella,"Neidhardt,et al.Eds.,ASM Pres,Washington D.C.(1996),pp.2047-2066；Nucleic Acids Res.20:2111-2118；Nakamura et al.,2000,Nucl.Acids Res.28:292)。
重组载体的制备
可以使用本领域公知方法制备用于表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的重组载体。例如，编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽(下文进一步详细描述)的DNA序列可以与转录和其它调节序列组合，该转录和其它调节序列将指导在预期细胞(例如细菌细胞，诸如大肠杆菌)中所述基因序列的转录。在一些实施方案中，包含表达盒(包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的基因)的表达载体进一步包含可操作地连接至亚胺/烯胺脱氨酶基因的启动子。在其它实施方案中，指导亚胺/烯胺脱氨酶基因转录的启动子和/或其他调节元件对宿主细胞是内源的，并且包含亚胺/烯胺脱氨酶基因的表达盒通过例如同源重组被引入，使得外源基因可操作地连接到内源启动子并被内源启动子表达驱动。
如上所述，编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的基因的表达可以受包括启动子(其可以是组成型或诱导型的)的许多调节序列；和任选地，阻遏序列(如果需要)控制。合适启动子(尤其是细菌宿主细胞中的)的例子是获自大肠杆菌lac操纵子的启动子和源自参与其它糖(例如半乳糖和麦芽糖)代谢的基因的其它启动子。另外的例子包括启动子诸如trp启动子、bla启动子噬菌体λPL和T5。此外，可以使用合成启动子，诸如tac启动子(美国专利号4,551,433)。启动子的其它例子包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因。合适的启动子也描述在Ausubel和Sambrook&Russell中，同上。另外的启动子包括通过Jensen&Hammer,Appl.Environ.Microbiol.64:82,1998；Shimada,etal.,J.Bacteriol.186:7112,2004；以及Miksch et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:312,2005描述的启动子。
在一些实施方案中，影响天然亚胺/烯胺脱氨酶多肽表达的启动子可被修饰以增加表达。例如，内源YoaB或YjgH启动子可以被与天然启动子相比提供表达增加的启动子置换。
表达载体还可包含影响编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的基因表达的另外的序列。这样的序列包括增强子序列、核糖体结合位点或其它序列(诸如转录终止序列)等。
表达编码本发明的亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸的载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体(其复制独立于染色体复制)，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自复制的任何手段。或者，载体可以是当引入到宿主时被整合到基因组中并与其已经整合入的染色体一起复制的载体。因此，表达载体可另外含有允许载体整合到宿主基因组中的元件。
本发明的表达载体优选含有允许容易地选择转化的宿主的一个或多个可选择标记。例如，表达载体可包含赋予重组宿主生物体(例如细菌细胞，诸如大肠杆菌)抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。
尽管可以将任何合适的表达载体用于掺入所需序列，但是容易获得的细菌表达载体包括但不限于：诸如pSClOl、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pET、pEX、pMRlOO、pCR4、pBAD24、p15a、pACYC、pUC(例如pUC18或pUC19)的质粒，或衍生自这些质粒的质粒；和噬菌体，诸如Ml3噬菌体和λ噬菌体。然而，本领域普通技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定的表达载体是否适合于任何给定宿主细胞。例如，可以将表达载体引入宿主细胞中，然后针对包含在载体中的序列的活力和表达来检测该宿主细胞。
本发明的表达载体可使用任何数量的公知方法引入宿主细胞中，包括基于氯化钙的方法、电穿孔或本领域已知的任何其它方法。
宿主细胞
本发明提供被工程化为过表达外源亚胺/烯胺脱氨酶多肽的经遗传修饰的宿主细胞。这种宿主细胞可包含编码异源亚胺/烯胺脱氨酶肽包括任何非天然存在的亚胺/烯胺脱氨酶多肽变体的核酸；或可以被遗传修饰以相对于野生型宿主细胞过表达天然亚胺/烯胺脱氨酶多肽。
本发明的经遗传修饰的宿主菌株通常包含至少一种另外的遗传修饰以相对于不具有所述一种另外的遗传修饰的对照菌株(例如野生型菌株或没有所述一个另外的遗传修饰的相同菌株的细胞)提高氨基酸或氨基酸衍生物的产生。用以提高氨基酸或氨基酸衍生物的产生的另外的遗传修饰可以是任何遗传修饰。在一些实施方案中，所述遗传修饰是引入表达参与氨基酸或氨基酸衍生物合成的酶的多核苷酸。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含多个修饰以相对于野生型宿主细胞增加氨基酸或氨基酸衍生物的产生。
在一些方面，用以过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞遗传修饰结合修饰所述宿主细胞过表达赖氨酸脱羧酶多肽和/或一或多种赖氨酸生物合成多肽一起进行。
赖氨酸脱羧酶是指将L-赖氨酸转化为尸胺的酶。该酶被分类为E.C.4.1.1.18。赖氨酸脱羧酶多肽是充分表征的酶，其结构是本领域公知的(参见例如Kanjee,et al.,EMBOJ.30:931-944,2011；和a review by Lemmonier&Lane,Microbiology 144；751-760,1998；以及其中描述的参考文献)。赖氨酸脱羧酶的EC编号为4.1.1.18。示例性赖氨酸脱羧酶序列是来自以下菌的CadA同源物：克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)，WP 012968785.1；产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，YP 004592843.1；肠道沙门氏菌，WP 020936842.1；沙雷氏菌属(Serratia sp.)，WP 033635725.1；和解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)，YP 007874766.1；以及以下菌的LdcC同源物：志贺氏菌属(Shigellasp.)，WP 001020968.1；柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)，WP 016151770.1；和肠道沙门氏菌，WP 001021062.1。如本文所用，赖氨酸脱羧酶包括具有赖氨酸脱羧酶酶活性的天然赖氨酸脱羧酶的变体。PCT/CN2014/080873和PCT/CN2015/072978中描述了另外的赖氨酸脱羧酶。
在一些实施方案中，宿主细胞可被遗传修饰以表达一种或多种影响赖氨酸生物合成的多肽。赖氨酸生物合成多肽的例子包括大肠杆菌基因SucA、Ppc、AspC、LysC、Asd、DapA、DapB、DapD、ArgD、DapE、DapF、LysA、Ddh、PntAB、CyoABE、GadAB、YbjE、GdhA、GltA、SucC、GadC、AcnB、PflB、ThrA、AceA、AceB、GltB、AceE、SdhA、MurE、SpeE、SpeG、PuuA、PuuP和YgjG，或来自其他生物体的相应基因。此类基因在本领域中是已知的(参见例如Shah et al.,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.Recent Patents on Biotechnol.1:11-24,2007)。与尸胺产生有关的基因的综述还参见Kind,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011。以下提供了编码赖氨酸生物合成多肽的示例性基因。
Figure BDA0002512703870000121
Figure BDA0002512703870000131
在一些实施方案中，宿主细胞被遗传修饰以表达赖氨酸脱羧酶、天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶和天冬氨酸转氨酶。还可以将另外的修饰掺入宿主细胞中。
在一些实施方案中，宿主细胞可以被遗传修饰以减弱或减少影响赖氨酸生物合成的一种或多种多肽的表达。此类多肽的例子包括大肠杆菌基因Pck、Pgi、DeaD、CitE、MenE、PoxB、AceA、AceB、AceE、RpoC和ThrA，或来自其它生物体的相应基因。此类基因是本领域已知的(参见例如Shah et al.,J.Med.Sci.2:152-157,2002；Anastassiadia,S.RecentPatents on Biotechnol.1:11-24,2007)。被减弱以增加尸胺产生的基因的综述还参见Kind,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.91:1287-1296,2011。以下提供了编码其减弱增加赖氨酸生物合成的多肽的示例性基因。
Figure BDA0002512703870000132
Figure BDA0002512703870000141
编码赖氨酸脱羧酶或赖氨酸生物合成多肽的核酸可以与亚胺/烯胺脱氨酶多核苷酸一起引入宿主细胞中，例如编码在单个表达载体上，或同时以多个表达载体引入。或者，在宿主细胞被遗传修饰以过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽之前或之后，宿主细胞可以被遗传修饰以过表达赖氨酸脱羧酶或一种或多种赖氨酸生物合成多肽。
在备选实施方案中，过表达天然存在的亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞可以通过其它技术获得，例如通过诱变细胞(例如大肠杆菌细胞)，并筛选细胞以鉴别那些与诱变之前的细胞相比亚胺/烯胺脱氨酶多肽例如YoaB或YjhG处于较高水平的。
包含本文所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞是细菌宿主细胞。在典型的实施方案中，细菌宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，细菌为肠细菌。在本发明的一些实施方案中，所述细菌是棒状杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、阪崎肠杆菌(Cronobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、哈夫尼菌属、耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersinia)、摩根氏菌属(Morganella)、爱德华菌属(Edwardsiella)或克雷伯氏菌属(Klebsiella)分类学类别的物种。在一些实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属的成员。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒状杆菌宿主细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌宿主细胞，诸如芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；或另一芽孢杆菌，诸如嗜碱芽孢杆菌(B.alcalophilus)、嗜胺芽孢杆菌(B.aminovorans)、解淀粉芽孢杆菌、热溶芽孢杆菌(B.caldolyticus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌、热葡糖昔酶芽胞杆菌(B.thermoglucosidasius)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)或韦氏芽孢杆菌(B.vulgatis)。
可以针对赖氨酸或赖氨酸衍生物(诸如尸胺)的产生增加来筛选根据本发明修饰的宿主细胞，如本文所述。
生产赖氨酸或赖氨酸衍生物的方法。
可以使用被遗传修饰以过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞来生产赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在一些实施方案中，所述宿主细胞产生尸胺。为生产赖氨酸或赖氨酸衍生物，如本文所述的被遗传修饰以过表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的宿主细胞可在适于允许表达多肽并且表达编码用于生产赖氨酸或赖氨酸衍生物的酶的基因的条件下进行培养。根据本发明修饰的宿主细胞相对于在天然水平表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的未修饰的相对应宿主细胞提供了更高的赖氨酸或赖氨酸衍生物产率。
可以使用公知技术培养宿主细胞(参见例如在实施例部分中提供的示例性条件)。
然后可以使用已知技术分离和纯化赖氨酸或赖氨酸衍生物。然后，根据本发明生产的赖氨酸或赖氨酸衍生物(例如尸胺)可以用于任何已知过程，例如生产聚酰胺。
在一些实施方案中，可以使用化学催化剂或通过使用酶和化学催化剂将赖氨酸转化为己内酰胺。
将通过具体实施例更详细地描述本发明。提供以下实施例用于示例性目的，而非旨在以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改各种非关键参数以产生实质上相同的结果。
实施例
提供以下实施例来说明，而不是限制所要求保护的发明。
实施例1：编码CadA的质粒载体的构建。
使用PCR引物cadA-F和cadA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增包含野生型大肠杆菌cadA(SEQ ID NO:1)的质粒载体(其编码赖氨酸脱羧酶CadA(SEQ ID NO:2))，使用限制性酶SacI和BamHI消化，并接入pSTV28中以产生质粒pCIB39。使用PCR引物cadA-F2和cadA-R2来优化cadA基因上游的5’序列以产生pCIB40。使用SacI-F和SacI-R引物将SacI限制位点加回到pCIB40以产生pCIB41。
实施例2：表达编码亚胺/烯胺脱氨酶的基因的质粒载体的构建。
使用PCR引物ridA-F和ridA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增编码亚胺/烯胺脱氨酶RidA(SEQ ID NO:4)的大肠杆菌基因ridA(SEQ ID NO:3)，用限制性酶SacI和BamHI消化，并接入也用SacI和BamHI消化的pCIB41质粒载体中以产生pCIB144。类似地，使用引物rutC-F和rutC-R将编码RutC(SEQ ID NO:6)的rutC(SEQ ID NO:5)克隆到pCIB41中以产生质粒pCIB174；并且使用引物tdcF-F和tdcF-R将编码TdcF(SEQ ID NO:8)的tdcF(SEQID NO:7)克隆到pCIB41中以产生质粒pCIB175。使用引物yoaB-F和yoaB-R将编码YoaB(SEQID NO:10)的YoaB(SEQ ID NO:9)克隆到pCIB41中以产生质粒pCIB177；并且使用引物yjgH-F和yjgH-R将编码YjgH(SEQ ID NO:12)的yjgH(SEQ ID NO:11)克隆到pCIB41中以产生质粒pCIB194。
实施例3：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的三种蛋白质(LysC、DapA、LysA)的合成操纵子I的质粒载体的构建。
来自大肠杆菌的基因lysC、dapA和lysA编码参与大肠杆菌赖氨酸生物合成途径的蛋白质：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)、二氢吡啶二羧酸合酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)和二氨基庚二酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)。将这三个基因克隆入质粒载体中并在大肠杆菌中过表达三种蛋白质LysC(SEQ ID NO:13)、DapA(SEQ ID NO:14)和LysA(SEQID NO:15)。使用引物lysC-F和lysC-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因lysC，扩增的片段用SacI和BamHI消化，并且接入pUC18中以产生pCIB7。使用引物dapA-F和dapA-R从大肠杆菌MG1655K12基因组DNA扩增基因dapA，扩增的片段用BamHI和XbaI消化，并且接入pCIB7中以产生pCIB8。使用引物lysA-F和lysA-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因lysA，扩增的片段用XbaI和SalI消化，并且接入pCIB8中以产生pCIB9。使用引物lysC-F和lysA-R从pCIB9扩增三基因操纵子。使用SacI和SalI消化扩增产物，并且将消化的片段接入pCIB10以产生pCIB32。
为构建pCIB10，使用PCR引物psyn-1和psyn-2合成启动子序列(SEQ ID NO:22)。引物psyn-1含有启动子序列和与pUC18同源的序列，引物psyn-2含有与pUC18同源的序列。这两个PCR引物用于扩增pUC18的一部分，该部分包括插入合成启动子序列下游的来自质粒的多克隆位点。限制性酶EcoRI和SacI用于消化包含合成启动子的扩增的DNA，其进一步接入pUC18中以构建pCIB10。
实施例4：共表达各种天冬氨酸激酶的质粒载体的构建。表达各种天冬氨酸激酶以增加赖氨酸产生。
选择使大肠杆菌LysC具有对赖氨酸增加的反馈抗性的两对突变。使用引物318-F、318-R、323-F、323-R构建编码第一突变体的基因LysC-1(M318I,G323D)(SEQ.ID NO:16)。将编码LysC-1(M318I,G323D)的基因克隆到pCIB32中并替换野生型大肠杆菌天冬氨酸激酶LysC以产生质粒pCIB43。来自能够产生聚赖氨酸的链霉菌属菌株的天冬氨酸激酶先前被建议，但未证明与大肠杆菌天冬氨酸激酶相比，对赖氨酸具有更强的反馈抗性。因此，来自变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的天冬氨酸激酶基因被密码子优化、合成并克隆以代替pCIB32中的野生型lysC，以便使用引物SlysC-F和SlysC-R产生质粒pCIB55。将表达的所得天冬氨酸激酶蛋白命名为S-LysC(SEQ ID NO:17)。
实施例5：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的三种蛋白质(Asd、DapB、DapD、AspC)的合成操纵子II的质粒载体的构建。
接着，提高参与大肠杆菌赖氨酸生物合成途径的四个另外的基因asd、dapB、dapD和aspC的表达。这些基因编码以下酶：天冬氨酸半醛脱氢酶(Asd(SEQ ID NO:18)，由asd编码)、二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO:19)，由dapB编码)、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶(DapD(SEQ ID NO:20)，由dapD编码)和天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ ID NO:21)，由aspC编码)。使用引物asd-F和asd-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因asd，扩增的片段用SacI和BamHI消化并接入pUC18以产生pCIB12。使用引物dapB-F和dapB-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因dapB，扩增的片段用BamHI和XbaI消化并接入pCIB12以产生pCIB13。使用引物dapD-F和dapD-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因dapD，扩增的片段用XbaI和SalI消化并接入pCIB13以产生pCIB14。类似地，使用引物aspC-F和aspC-R从大肠杆菌MG1655 K12基因组DNA扩增基因aspC，扩增的片段用XbaI和SalI消化并接入pCIB13以产生pCIB31。
实施例6：共表达含有来自赖氨酸生物合成途径的蛋白质的合成操纵子I和II的质粒载体的构建。
使用引物lysC-rbs2-F和lysC-rbs2-R进一步调节合成操纵子I以修饰pCIB43并产生质粒pCIB378。使用引物asd-rbs2-F和asd-rbs2-R进一步调节合成操纵子II以修饰pCIB31并产生质粒pCIB380。使用引物SacI-F2、SacI-R2、ApaI-F和ApaI-R进一步修饰pCIB380以便将ApaI和SacI的限制性酶位点添加至pCIB380以产生质粒pCIB393。将由基因lysC、dapA、lysA、asd、dapB和aspC组成的两个合成操纵子，合成操纵子I和合成操纵子II组合为单个载体。使用引物LAL2-SacI-F和LAL2-ApaI-R扩增由基因lysC、dapA和lysA组成的来自pCIB378的操纵子，使用限制性酶SacI和ApaI消化，并接入pCIB393以产生质粒pCIB394。
实施例7：来自过表达合成操纵子I和II以及亚胺/烯胺脱氨酶的大肠杆菌的赖氨酸的产生。
用质粒的以下组合之一转化大肠杆菌MG1655 K12：pCIB394和pSTV28、pCIB394和pCIB144、pCIB394和pCIB174、pCIB394和pCIB175、pCIB394和pCIB177，或者pCIB394和pCIB194。在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/ml)以及氯霉素(20μg/ml)的3mL培养基中过夜培养来自每个转化的三个单菌落。第二天，将各培养物接种到具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃培养72小时，此时确定每种培养物中赖氨酸的浓度(表1)。
表1.含有合成操纵子I和II和亚胺/烯胺脱氨酶的大肠杆菌菌株的赖氨酸生产
Figure BDA0002512703870000171
如表1所示，不同亚胺/烯胺脱氨酶的过度生产不同地影响赖氨酸生产。RidA的过度生产没有导致任何可观察到的赖氨酸生产变化。类似地，两个RidA旁系同源物RutC和TdcF的过度生产也不会导致赖氨酸生产的任何变化。令人惊讶的是，对于过度生产YoaB的系统，两种RidA旁系同源物的过度生产使赖氨酸生产从6g/L增加至7.3g/L，对于过度生产YjgH的系统，使赖氨酸生产增加至7.1g/L。
实施例8：编码赖氨酸脱羧酶和亚胺/烯胺脱氨酶的质粒载体的构建。
使用引物对rmvBamHI-F和rmvBamHI-R以及rmvSphI-F和rmvSphI-R修饰pCIB177上的YoaB基因以去除BamHI和SphI限制位点。使用引物yoaB-F2和yoaB-R2扩增经修饰的yoaB基因，扩增的片段使用限制性酶BamHI和SphI消化并接入pCIB41以形成质粒pCIB201。类似地，使用引物对rmvBamHI-F2和rmvBamHI-R2、rmvSphI-F2和rmvSphI-R2以及rmvSphI-F3和rmvSphI-R3修饰pCIB194以去除BamHI和SphI限制位点。使用引物yjgH-F2和yjgH-R2扩增经修饰的yjgH基因，扩增的片段使用限制性酶BamHI和SphI消化并接入pCIB41以形成质粒pCIB208。
实施例9：共同过表达编码亚胺/烯胺脱氨酶蛋白和赖氨酸合成操纵子I和II的的基因的大肠杆菌的赖氨酸生产。
用质粒的以下组合之一转化大肠杆菌MG1655 K12：pCIB394和pSTV28、pCIB394和pCIB41、pCIB394和pCIB201，或pCIB394和pCIB208。在37℃在含有4％葡萄糖、0.1％KH2PO4、0.1％MgSO4、1.6％(NH4)2SO4、0.001％FeSO4、0.001％MnSO4、0.2％酵母提取物、0.05％L-甲硫氨酸、0.01％L-苏氨酸、0.005％L-异亮氨酸、氨苄青霉素(100μg/ml)以及氯霉素(20μg/ml)的3mL培养基中过夜培养来自每个转化的三个单菌落。第二天，将各培养物接种到具有30g/L葡萄糖、0.7％Ca(HCO3)2、氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的100mL新鲜培养基中。将培养物在37℃培养72小时，此时确定每种培养物中赖氨酸和尸胺的浓度(表2)。
表2.包含赖氨酸合成操纵子I和II并过度产生赖氨酸脱羧酶和亚胺/烯胺脱氨酶的大肠杆菌菌株的赖氨酸和尸胺产生。
Figure BDA0002512703870000181
如表2所示，CadA的过度生产导致尸胺的产生。此外，对于YoaB，亚胺/烯胺脱氨酶的过度产生进一步使尸胺产生从3.0g/L增加至3.9g/L，并且对于YjgH，使尸胺产生增加至4.1g/L。
虽然为了清楚理解的目的，已经通过示例和实施例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修改。本文引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请均以引用方式并入本文以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。在本申请和本文提供的参考文献之间存在冲突的情况下，应以本申请为准。
实施例中使用的质粒表
过表达的蛋白质 质粒
无 pSTV28
CadA pCIB41
RidA pCIB144
RutC pCIB174
TdcF pCIB175
YoaB pCIB177
YjgH pCIB194
LysC,DapA,LysA,Asd,DapB,AspC pCIB394
CadA,YoaB pCIB201
CadA,YjgH pCIB208
实施例中使用的引物序列表
Figure BDA0002512703870000182
Figure BDA0002512703870000191
示例性序列
SEQ ID NO:1大肠杆菌cadA核酸序列
ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGTGAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGACGACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGATAAATATAATCTCGAGCTGTGCGAAGAAATTAGCAAAATGAACGAGAACCTGCCGTTGTACGCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATTAGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACCACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTTCGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAAAGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATTTCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCAGAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACTTCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATTGACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATCTATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTCCAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACATGCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAAACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCACCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTACGAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTTAAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCTCCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCAGGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAACGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGATACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGATAACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAAGACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAACATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGTATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTCGACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTCTATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCACAATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCGTATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATGGTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATGCCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGTGAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCTGATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA
SEQ ID NO:2CadA多肽序列
MNVIAILNHMGVYFKEEPIRELHRALERLNFQIVYPNDRDDLLKLIENNARLCGVIFDWDKYNLELCEEISKMNENLPLYAFANTYSTLDVSLNDLRLQISFFEYALGAAEDIANKIKQTTDEYINTILPPLTKALFKYVREGKYTFCTPGHMGGTAFQKSPVGSLFYDFFGPNTMKSDISISVSELGSLLDHSGPHKEAEQYIARVFNADRSYMVTNGTSTANKIVGMYSAPAGSTILIDRNCHKSLTHLMMMSDVTPIYFRPTRNAYGILGGIPQSEFQHATIAKRVKETPNATWPVHAVITNSTYDGLLYNTDFIKKTLDVKSIHFDSAWVPYTNFSPIYEGKCGMSGGRVEGKVIYETQSTHKLLAAFSQASMIHVKGDVNEETFNEAYMMHTTTSPHYGIVASTETAAAMMKGNAGKRLINGSIERAIKFRKEIKRLRTESDGWFFDVWQPDHIDTTECWPLRSDSTWHGFKNIDNEHMYLDPIKVTLLTPGMEKDGTMSDFGIPASIVAKYLDEHGIVVEKTGPYNLLFLFSIGIDKTKALSLLRALTDFKRAFDLNLRVKNMLPSLYREDPEFYENMRIQELAQNIHKLIVHHNLPDLMYRAFEVLPTMVMTPYAAFQKELHGMTEEVYLDEMVGRINANMILPYPPGVPLVMPGEMITEESRPVLEFLQMLCEIGAHYPGFETDIHGAYRQADGRYTVKVLKEESKK
SEQ ID NO:3大肠杆菌ridA核酸序列
ATGAGCAAAACTATCGCGACGGAAAATGCACCGGCAGCTATCGGTCCTTACGTACAGGGCGTTGATCTGGGCAATATGATCATCACCTCCGGTCAGATCCCGGTAAATCCGAAAACGGGCGAAGTACCGGCAGACGTCGCTGCACAGGCACGTCAGTCGCTGGATAACGTAAAAGCGATCGTCGAAGCCGCTGGCCTGAAAGTGGGCGACATCGTTAAAACTACCGTGTTTGTAAAAGATCTGAACGACTTCGCAACCGTAAACGCCACTTACGAAGCCTTCTTCACCGAACACAACGCCACCTTCCCGGCACGTTCTTGCGTTGAAGTTGCCCGTCTGCCGAAAGACGTGAAGATTGAGATCGAAGCGATCGCTGTTCGTCGCTAA
SEQ ID NO:4RidA多肽序列
MSKTIATENAPAAIGPYVQGVDLGNMIITSGQIPVNPKTGEVPADVAAQARQSLDNVKAIVEAAGLKVGDIVKTTVFVKDLNDFATVNATYEAFFTEHNATFPARSCVEVARLPKDVKIEIEAIAVRR
SEQ ID NO:5大肠杆菌rutC核酸序列
ATGCCAAAATCCGTAATTATTCCCGCTGGCAGCAGCGCACCGCTGGCCCCCTTCGTTCCCGGCACGCTGGCTGATGGCGTGGTGTATGTCTCCGGTACGCTGGCTTTTGATCAACATAATAACGTGCTGTTTGCCGATGACCCAAAGGCGCAAACCCGCCACGTTCTGGAAACTATCCGCAAGGTGATCGAGACGGCGGGTGGCACGATGGCGGATGTGACCTTCAACAGCATCTTTATTACCGACTGGAAAAATTACGCCGCGATTAACGAAATCTACGCCGAGTTTTTTCCGGGTGATAAACCGGCGCGATTCTGCATTCAGTGCGGACTGGTAAAACCTGACGCGCTGGTGGAAATCGCCACAATTGCGCATATCGCCAAGTGA
SEQ ID NO:6RutC多肽序列
MPKSVIIPAGSSAPLAPFVPGTLADGVVYVSGTLAFDQHNNVLFADDPKAQTRHVLETIRKVIETAGGTMADVTFNSIFITDWKNYAAINEIYAEFFPGDKPARFCIQCGLVKPDALVEIATIAHIAK
SEQ ID NO:7大肠杆菌tdcF核酸序列
ATGAAAAAGATTATCGAAACGCAACGTGCCCCAGGCGCAATCGGCCCTTATGTTCAGGGCGTTGATTTAGGCAGCATGGTCTTCACCTCCGGGCAAATACCGGTTTGCCCACAGACCGGTGAGATCCCGGCTGATGTGCAAGATCAGGCGCGTTTAAGCCTCGAAAACGTCAAAGCGATCGTGGTTGCTGCCGGGCTGAGCGTGGGCGATATCATCAAGATGACCGTGTTTATCACCGATCTGAATGATTTTGCCACCATCAACGAAGTCTATAAGCAGTTCTTCGATGAGCATCAGGCGACCTATCCGACCCGGAGCTGTGTGCAGGTCGCGCGTTTGCCGAAAGATGTGAAGCTGGAAATTGAAGCCATCGCAGTACGTAGTGCGTAA
SEQ ID NO:8TdcF多肽序列
MKKIIETQRAPGAIGPYVQGVDLGSMVFTSGQIPVCPQTGEIPADVQDQARLSLENVKAIVVAAGLSVGDIIKMTVFITDLNDFATINEVYKQFFDEHQATYPTRSCVQVARLPKDVKLEIEAIAVRSA
SEQ ID NO:9大肠杆菌yoaB核酸序列
ATGACTATCGTTCGTATCGATGCTGAAGCCCGCTGGTCTGATGTAGTAATCCACAACAACACGCTCTACTACACTGGTGTACCGGAAAACCTCGACGCCGATGCCTTTGAGCAAACCGCCAACACGCTGGCACAGATTGACGCCGTGCTGGAAAAACAGGGCAGCAATAAATCGAGCATTCTGGATGCCACCATTTTCCTGGCCGATAAAAACGACTTCGCGGCGATGAATAAAGCGTGGGATGCTTGGGTTGTCGCGGGTCATGCGCCGGTGCGCTGCACGGTACAAGCGGGTTTGATGAACCCGAAGTATAAAGTTGAAATTAAGATTGTGGCTGCGGTGTAA
SEQ ID NO:10YoaB多肽序列
MTIVRIDAEARWSDVVIHNNTLYYTGVPENLDADAFEQTANTLAQIDAVLEKQGSNKSSILDATIFLADKNDFAAMNKAWDAWVVAGHAPVRCTVQAGLMNPKYKVEIKIVAAV
SEQ ID NO:11大肠杆菌yjgH核酸序列
ATGGTAGAAAGAACCGCTGTTTTCCCTGCTGGCCGACATTCACTATATGCTGAGCATCGTTATTCTGCGGCTATTCGTTCCGGCGATTTGCTGTTTGTTTCCGGGCAAGTAGGAAGTCGAGAGGACGGAACACCAGAACCCGATTTTCAGCAACAAGTCAGACTGGCATTTGATAATTTGCATGCGACCCTGGCAGCTGCGGGATGCACTTTTGACGATATCATTGATGTTACGAGCTTCCATACCGATCCAGAAAACCAATTTGAAGACATCATGACGGTGAAAAATGAAATATTTAGCGCCCCACCTTATCCAAACTGGACGGCGGTGGGTGTTACATGGCTGGCAGGCTTTGATTTTGAAATTAAAGTGATAGCGCGCATCCCTGAGCAGTAA
SEQ ID NO:12YjgH多肽序列
MVERTAVFPAGRHSLYAEHRYSAAIRSGDLLFVSGQVGSREDGTPEPDFQQQVRLAFDNLHATLAAAGCTFDDIIDVTSFHTDPENQFEDIMTVKNEIFSAPPYPNWTAVGVTWLAGFDFEIKVIARIPEQ
SEQ ID NO:13LysC多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNMLHSRGFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:14DapA多肽序列
MFTGSIVAIVTPMDEKGNVCRASLKKLIDYHVASGTSAIVSVGTTGESATLNHDEHADVVMMTLDLADGRIPVIAGTGANATAEAISLTQRFNDSGIVGCLTVTPYYNRPSQEGLYQHFKAIAEHTDLPQILYNVPSRTGCDLLPETVGRLAKVKNIIGIKEATGNLTRVNQIKELVSDDFVLLSGDDASALDFMQLGGHGVISVTANVAARDMAQMCKLAAEGHFAEARVINQRLMPLHNKLFVEPNPIPVKWACKELGLVATDTLRLPMTPITDSGRETVRAALKHAGLL
SEQ ID NO:15LysA多肽序列
MPHSLFSTDTDLTAENLLRLPAEFGCPVWVYDAQIIRRQIAALKQFDVVRFAQKACSNIHILRLMREQGVKVDSVSLGEIERALAAGYNPQTHPDDIVFTADVIDQATLERVSELQIPVNAGSVDMLDQLGQVSPGHRVWLRVNPGFGHGHSQKTNTGGENSKHGIWYTDLPAALDVIQRHHLQLVGIHMHIGSGVDYAHLEQVCGAMVRQVIEFGQDLQAISAGGGLSVPYQQGEEAVDTEHYYGLWNAAREQIARHLGHPVKLEIEPGRFLVAQSGVLITQVRSVKQMGSRHFVLVDAGFNDLMRPAMYGSYHHISALAADGRSLEHAPTVETVVAGPLCESGDVFTQQEGGNVETRALPEVKAGDYLVLHDTGAYGASMSSNYNSRPLLPEVLFDNGQARLIRRRQTIEELLALELL
SEQ ID NO:16LysC-1M318I,G323D多肽序列
MSEIVVSKFGGTSVADFDAMNRSADIVLSDANVRLVVLSASAGITNLLVALAEGLEPGERFEKLDAIRNIQFAILERLRYPNVIREEIERLLENITVLAEAAALATSPALTDELVSHGELMSTLLFVEILRERDVQAQWFDVRKVMRTNDRFGRAEPDIAALAELAALQLLPRLNEGLVITQGFIGSENKGRTTTLGRGGSDYTAALLAEALHASRVDIWTDVPGIYTTDPRVVSAAKRIDEIAFAEAAEMATFGAKVLHPATLLPAVRSDIPVFVGSSKDPRAGGTLVCNKTENPPLFRALALRRNQTLLTLHSLNILHSRDFLAEVFGILARHNISVDLITTSEVSVALTLDTTGSTSTGDTLLTQSLLMELSALCRVEVEEGLALVALIGNDLSKACGVGKEVFGVLEPFNIRMICYGASSHNLCFLVPGEDAEQVVQKLHSNLFE
SEQ ID NO:17S-LysC多肽序列
MGLVVQKYGGSSVADAEGIKRVAKRIVEAKKNGNQVVAVVSAMGDTTDELIDLAEQVSPIPAGRELDMLLTAGERISMALLAMAIKNLGHEAQSFTGSQAGVITDSVHNKARIIDVTPGRIRTSVDEGNVAIVAGFQGVSQDSKDITTLGRGGSDTTAVALAAALDADVCEIYTDVDGVFTADPRVVPKAKKIDWISFEDMLELAASGSKVLLHRCVEYARRYNIPIHVRSSFSGLQGTWVSSEPIKQGEKHVEQALISGVAHDTSEAKVTVVGVPDKPGEAAAIFRAIADAQVNIDMVVQNVSAASTGLTDISFTLPKSEGRKAIDALEKNRPGIGFDSLRYDDQIGKISLVGAGMKSNPGVTADFFTALSDAGVNIELISTSEIRISVVTRKDDVNEAVRAVHTAFGLDSDSDEAVVYGGTGR
SEQ ID NO:18Asd多肽序列
MKNVGFIGWRGMVGSVLMQRMVEERDFDAIRPVFFSTSQLGQAAPSFGGTTGTLQDAFDLEALKALDIIVTCQGGDYTNEIYPKLRESGWQGYWIDAASSLRMKDDAIIILDPVNQDVITDGLNNGIRTFVGGNCTVSLMLMSLGGLFANDLVDWVSVATYQAASGGGARHMRELLTQMGHLYGHVADELATPSSAILDIERKVTTLTRSGELPVDNFGVPLAGSLIPWIDKQLDNGQSREEWKGQAETNKILNTSSVIPVDGLCVRVGALRCHSQAFTIKLKKDVSIPTVEELLAAHNPWAKVVPNDREITMRELTPAAVTGTLTTPVGRLRKLNMGPEFLSAFTVGDQ
SEQ ID NO:19DapB多肽序列
MHDANIRVAIAGAGGRMGRQLIQAALALEGVQLGAALEREGSSLLGSDAGELAGAGKTGVTVQSSLDAVKDDFDVFIDFTRPEGTLNHLAFCRQHGKGMVIGTTGFDEAGKQAIRDAAADIAIVFAANFSVGVNVMLKLLEKAAKVMGDYTDIEIIEAHHRHKVDAPSGTALAMGEAIAHALDKDLKDCAVYSREGHTGERVPGTIGFATVRAGDIVGEHTAMFADIGERLEITHKASSRMTFANGAVRSALWLSGKESGLFDMRDVLDLNNL
SEQ ID NO:20DapD多肽序列
MQQLQNIIETAFERRAEITPANADTVTREAVNQVIALLDSGALRVAEKIDGQWVTHQWLKKAVLLSFRINDNQVIEGAESRYFDKVPMKFADYDEARFQKEGFRVVPPAAVRQGAFIARNTVLMPSYVNIGAYVDEGTMVDTWATVGSCAQIGKNVHLSGGVGIGGVLEPLQANPTIIEDNCFIGARSEVVEGVIVEEGSVISMGVYIGQSTRIYDRETGEIHYGRVPAGSVVVSGNLPSKDGKYSLYCAVIVKKVDAKTRGKVGINELLRTID
SEQ ID NO:21AspC多肽序列
MFENITAAPADPILGLADLFRADERPGKINLGIGVYKDETGKTPVLTSVKKAEQYLLENETTKNYLGIDGIPEFGRCTQELLFGKGSALINDKRARTAQTPGGTGALRVAADFLAKNTSVKRVWVSNPSWPNHKSVFNSAGLEVREYAYYDAENHTLDFDALINSLNEAQAGDVVLFHGCCHNPTGIDPTLEQWQTLAQLSVEKGWLPLFDFAYQGFARGLEEDAEGLRAFAAMHKELIVASSYSKNFGLYNERVGACTLVAADSETVDRAFSQMKAAIRANYSNPPAHGASVVATILSNDALRAIWEQELTDMRQRIQRMRQLFVNTLQEKGANRDFSFIIKQNGMFSFSGLTKEQVLRLREEFGVYAVASGRVNVAGMTPDNMAPLCEAIVAVL
SEQ ID NO:22合成启动子核酸序列
AGTTTATTCTTGACATGTAGTGAGGGGGCTGGTATAAT
序列表
<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司
CIBT美国公司
<120> 减少为了生产氨基酸或氨基酸衍生产物的亚胺/烯胺的积累
<130> IBPA17004
<160> 89
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2148
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 2
<211> 715
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 3
<211> 387
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgagcaaaa ctatcgcgac ggaaaatgca ccggcagcta tcggtcctta cgtacagggc 60
gttgatctgg gcaatatgat catcacctcc ggtcagatcc cggtaaatcc gaaaacgggc 120
gaagtaccgg cagacgtcgc tgcacaggca cgtcagtcgc tggataacgt aaaagcgatc 180
gtcgaagccg ctggcctgaa agtgggcgac atcgttaaaa ctaccgtgtt tgtaaaagat 240
ctgaacgact tcgcaaccgt aaacgccact tacgaagcct tcttcaccga acacaacgcc 300
accttcccgg cacgttcttg cgttgaagtt gcccgtctgc cgaaagacgt gaagattgag 360
atcgaagcga tcgctgttcg tcgctaa 387
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala
35 40 45
Gln Ala Arg Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr
85 90 95
Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg
115 120 125
<210> 5
<211> 387
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgccaaaat ccgtaattat tcccgctggc agcagcgcac cgctggcccc cttcgttccc 60
ggcacgctgg ctgatggcgt ggtgtatgtc tccggtacgc tggcttttga tcaacataat 120
aacgtgctgt ttgccgatga cccaaaggcg caaacccgcc acgttctgga aactatccgc 180
aaggtgatcg agacggcggg tggcacgatg gcggatgtga ccttcaacag catctttatt 240
accgactgga aaaattacgc cgcgattaac gaaatctacg ccgagttttt tccgggtgat 300
aaaccggcgc gattctgcat tcagtgcgga ctggtaaaac ctgacgcgct ggtggaaatc 360
gccacaattg cgcatatcgc caagtga 387
<210> 6
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
Met Pro Lys Ser Val Ile Ile Pro Ala Gly Ser Ser Ala Pro Leu Ala
1 5 10 15
Pro Phe Val Pro Gly Thr Leu Ala Asp Gly Val Val Tyr Val Ser Gly
20 25 30
Thr Leu Ala Phe Asp Gln His Asn Asn Val Leu Phe Ala Asp Asp Pro
35 40 45
Lys Ala Gln Thr Arg His Val Leu Glu Thr Ile Arg Lys Val Ile Glu
50 55 60
Thr Ala Gly Gly Thr Met Ala Asp Val Thr Phe Asn Ser Ile Phe Ile
65 70 75 80
Thr Asp Trp Lys Asn Tyr Ala Ala Ile Asn Glu Ile Tyr Ala Glu Phe
85 90 95
Phe Pro Gly Asp Lys Pro Ala Arg Phe Cys Ile Gln Cys Gly Leu Val
100 105 110
Lys Pro Asp Ala Leu Val Glu Ile Ala Thr Ile Ala His Ile Ala Lys
115 120 125
<210> 7
<211> 390
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
atgaaaaaga ttatcgaaac gcaacgtgcc ccaggcgcaa tcggccctta tgttcagggc 60
gttgatttag gcagcatggt cttcacctcc gggcaaatac cggtttgccc acagaccggt 120
gagatcccgg ctgatgtgca agatcaggcg cgtttaagcc tcgaaaacgt caaagcgatc 180
gtggttgctg ccgggctgag cgtgggcgat atcatcaaga tgaccgtgtt tatcaccgat 240
ctgaatgatt ttgccaccat caacgaagtc tataagcagt tcttcgatga gcatcaggcg 300
acctatccga cccggagctg tgtgcaggtc gcgcgtttgc cgaaagatgt gaagctggaa 360
attgaagcca tcgcagtacg tagtgcgtaa 390
<210> 8
<211> 129
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Met Lys Lys Ile Ile Glu Thr Gln Arg Ala Pro Gly Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Phe Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Cys Pro Gln Thr Gly Glu Ile Pro Ala Asp Val Gln Asp
35 40 45
Gln Ala Arg Leu Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Val Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Ser Val Gly Asp Ile Ile Lys Met Thr Val Phe Ile Thr Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Ile Asn Glu Val Tyr Lys Gln Phe Phe Asp
85 90 95
Glu His Gln Ala Thr Tyr Pro Thr Arg Ser Cys Val Gln Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Ser
115 120 125
Ala
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 9
atgactatcg ttcgtatcga tgctgaagcc cgctggtctg atgtagtaat ccacaacaac 60
acgctctact acactggtgt accggaaaac ctcgacgccg atgcctttga gcaaaccgcc 120
aacacgctgg cacagattga cgccgtgctg gaaaaacagg gcagcaataa atcgagcatt 180
ctggatgcca ccattttcct ggccgataaa aacgacttcg cggcgatgaa taaagcgtgg 240
gatgcttggg ttgtcgcggg tcatgcgccg gtgcgctgca cggtacaagc gggtttgatg 300
aacccgaagt ataaagttga aattaagatt gtggctgcgg tgtaa 345
<210> 10
<211> 114
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
Met Thr Ile Val Arg Ile Asp Ala Glu Ala Arg Trp Ser Asp Val Val
1 5 10 15
Ile His Asn Asn Thr Leu Tyr Tyr Thr Gly Val Pro Glu Asn Leu Asp
20 25 30
Ala Asp Ala Phe Glu Gln Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gln Ile Asp Ala
35 40 45
Val Leu Glu Lys Gln Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ile Leu Asp Ala Thr
50 55 60
Ile Phe Leu Ala Asp Lys Asn Asp Phe Ala Ala Met Asn Lys Ala Trp
65 70 75 80
Asp Ala Trp Val Val Ala Gly His Ala Pro Val Arg Cys Thr Val Gln
85 90 95
Ala Gly Leu Met Asn Pro Lys Tyr Lys Val Glu Ile Lys Ile Val Ala
100 105 110
Ala Val
<210> 11
<211> 396
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 11
atggtagaaa gaaccgctgt tttccctgct ggccgacatt cactatatgc tgagcatcgt 60
tattctgcgg ctattcgttc cggcgatttg ctgtttgttt ccgggcaagt aggaagtcga 120
gaggacggaa caccagaacc cgattttcag caacaagtca gactggcatt tgataatttg 180
catgcgaccc tggcagctgc gggatgcact tttgacgata tcattgatgt tacgagcttc 240
cataccgatc cagaaaacca atttgaagac atcatgacgg tgaaaaatga aatatttagc 300
gccccacctt atccaaactg gacggcggtg ggtgttacat ggctggcagg ctttgatttt 360
gaaattaaag tgatagcgcg catccctgag cagtaa 396
<210> 12
<211> 131
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 12
Met Val Glu Arg Thr Ala Val Phe Pro Ala Gly Arg His Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Ala Glu His Arg Tyr Ser Ala Ala Ile Arg Ser Gly Asp Leu Leu Phe
20 25 30
Val Ser Gly Gln Val Gly Ser Arg Glu Asp Gly Thr Pro Glu Pro Asp
35 40 45
Phe Gln Gln Gln Val Arg Leu Ala Phe Asp Asn Leu His Ala Thr Leu
50 55 60
Ala Ala Ala Gly Cys Thr Phe Asp Asp Ile Ile Asp Val Thr Ser Phe
65 70 75 80
His Thr Asp Pro Glu Asn Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Val Lys Asn
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Glu Ile Phe Ser Ala Pro Pro Tyr Pro Asn Trp Thr Ala Val Gly Val
100 105 110
Thr Trp Leu Ala Gly Phe Asp Phe Glu Ile Lys Val Ile Ala Arg Ile
115 120 125
Pro Glu Gln
130
<210> 13
<211> 449
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp
1 5 10 15
Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn
20 25 30
Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
35 40 45
Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
50 55 60
Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu
115 120 125
Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
165 170 175
Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
180 185 190
Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
195 200 205
Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys
385 390 395 400
Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
405 410 415
Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro
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Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 14
<211> 292
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys
1 5 10 15
Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val
20 25 30
Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser
35 40 45
Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile
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165 170 175
Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu
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195 200 205
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210 215 220
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Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys
245 250 255
Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr
260 265 270
Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His
275 280 285
Ala Gly Leu Leu
290
<210> 15
<211> 420
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 15
Met Pro His Ser Leu Phe Ser Thr Asp Thr Asp Leu Thr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Leu Leu Arg Leu Pro Ala Glu Phe Gly Cys Pro Val Trp Val Tyr Asp
20 25 30
Ala Gln Ile Ile Arg Arg Gln Ile Ala Ala Leu Lys Gln Phe Asp Val
35 40 45
Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu
50 55 60
Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile
65 70 75 80
Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp
85 90 95
Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val
100 105 110
Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp
115 120 125
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130 135 140
Pro Gly Phe Gly His Gly His Ser Gln Lys Thr Asn Thr Gly Gly Glu
145 150 155 160
Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp
165 170 175
Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile
180 185 190
Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met
195 200 205
Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp
225 230 235 240
Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala
245 250 255
Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe
260 265 270
Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys
275 280 285
Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp
290 295 300
Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu
305 310 315 320
Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val
325 330 335
Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu
340 345 350
Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp
355 360 365
Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser
370 375 380
Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly
385 390 395 400
Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala
405 410 415
Leu Glu Leu Leu
420
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<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LysC-1 M318I, G323D polypeptide sequence
<400> 16
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Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu
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Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu
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Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp
100 105 110
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Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys
130 135 140
Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala
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Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu
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Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg
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Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu
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210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile
225 230 235 240
Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala
245 250 255
Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile
260 265 270
Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu
275 280 285
Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Ile Leu His
305 310 315 320
Ser Arg Asp Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn
325 330 335
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340 345 350
Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln
355 360 365
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Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg
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Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe
435 440 445
Glu
<210> 17
<211> 425
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S-LysC polypeptide sequence
<400> 17
Met Gly Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Val Ala Asp Ala
1 5 10 15
Glu Gly Ile Lys Arg Val Ala Lys Arg Ile Val Glu Ala Lys Lys Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Val Val Ala Val Val Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Ile Asp Leu Ala Glu Gln Val Ser Pro Ile Pro Ala Gly Arg
50 55 60
Glu Leu Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Met Ala Leu
65 70 75 80
Leu Ala Met Ala Ile Lys Asn Leu Gly His Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Ile Thr Asp Ser Val His Asn Lys Ala Arg
100 105 110
Ile Ile Asp Val Thr Pro Gly Arg Ile Arg Thr Ser Val Asp Glu Gly
115 120 125
Asn Val Ala Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Ser Gln Asp Ser Lys
130 135 140
Asp Ile Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asp Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Thr Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Phe Thr Ala Asp Pro Arg Val Val Pro Lys Ala Lys Lys
180 185 190
Ile Asp Trp Ile Ser Phe Glu Asp Met Leu Glu Leu Ala Ala Ser Gly
195 200 205
Ser Lys Val Leu Leu His Arg Cys Val Glu Tyr Ala Arg Arg Tyr Asn
210 215 220
Ile Pro Ile His Val Arg Ser Ser Phe Ser Gly Leu Gln Gly Thr Trp
225 230 235 240
Val Ser Ser Glu Pro Ile Lys Gln Gly Glu Lys His Val Glu Gln Ala
245 250 255
Leu Ile Ser Gly Val Ala His Asp Thr Ser Glu Ala Lys Val Thr Val
260 265 270
Val Gly Val Pro Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Arg Ala
275 280 285
Ile Ala Asp Ala Gln Val Asn Ile Asp Met Val Val Gln Asn Val Ser
290 295 300
Ala Ala Ser Thr Gly Leu Thr Asp Ile Ser Phe Thr Leu Pro Lys Ser
305 310 315 320
Glu Gly Arg Lys Ala Ile Asp Ala Leu Glu Lys Asn Arg Pro Gly Ile
325 330 335
Gly Phe Asp Ser Leu Arg Tyr Asp Asp Gln Ile Gly Lys Ile Ser Leu
340 345 350
Val Gly Ala Gly Met Lys Ser Asn Pro Gly Val Thr Ala Asp Phe Phe
355 360 365
Thr Ala Leu Ser Asp Ala Gly Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser
370 375 380
Glu Ile Arg Ile Ser Val Val Thr Arg Lys Asp Asp Val Asn Glu Ala
385 390 395 400
Val Arg Ala Val His Thr Ala Phe Gly Leu Asp Ser Asp Ser Asp Glu
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Ala Val Val Tyr Gly Gly Thr Gly Arg
420 425
<210> 18
<211> 350
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 18
Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val
1 5 10 15
Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro
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Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly
35 40 45
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130 135 140
Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr
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Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr
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Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly
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Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg
225 230 235 240
Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser
245 250 255
Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg
260 265 270
Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile
275 280 285
Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val
290 295 300
Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala
305 310 315 320
Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn
325 330 335
Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln
340 345 350
<210> 19
<211> 273
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 19
Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg
1 5 10 15
Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln
20 25 30
Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp
35 40 45
Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser
50 55 60
Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr
65 70 75 80
Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly
85 90 95
Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln
100 105 110
Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn
115 120 125
Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala
130 135 140
Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His
145 150 155 160
Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu
165 170 175
Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr
180 185 190
Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe
195 200 205
Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe
210 215 220
Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg
225 230 235 240
Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly
245 250 255
Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn
260 265 270
Leu
<210> 20
<211> 274
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 20
Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala
1 5 10 15
Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val
115 120 125
Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala
130 135 140
Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly
145 150 155 160
Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr
165 170 175
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180 185 190
Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile
195 200 205
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210 215 220
Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser
225 230 235 240
Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val
245 250 255
Asp Ala Lys Thr Arg Gly Lys Val Gly Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr
260 265 270
Ile Asp
<210> 21
<211> 396
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 21
Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly
20 25 30
Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser
35 40 45
Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn
50 55 60
Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu
65 70 75 80
Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg
85 90 95
Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp
100 105 110
Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro
115 120 125
Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val
130 135 140
Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
165 170 175
Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu
180 185 190
Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro
195 200 205
Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp
210 215 220
Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val
225 230 235 240
Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala
275 280 285
His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg
290 295 300
Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 315 320
Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg
325 330 335
Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly
340 345 350
Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr
355 360 365
Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn
370 375 380
Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu
385 390 395
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic promoter nucleic acid sequence
<400> 22
agtttattct tgacatgtag tgagggggct ggtataat 38
<210> 23
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-F
<400> 23
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa cgttattgca atattgaatc 50
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-R
<400> 24
ggcggatccc cacttccctt gtacgagcta attatttttt gctttcttct ttc 53
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-F2
<400> 25
atttcacaca ggaaacagct atgaacgtta ttgcaatatt gaatcac 47
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer cadA-R2
<400> 26
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-F
<400> 27
ggcgagctcc tcctgtgtga aattgttatc cgctc 35
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-R
<400> 28
ggcgagctca tgaacgttat tgcaatattg aatc 34
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ridA-F
<400> 29
ggcgagctca tgagcaaaac tatcgcgacg 30
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ridA-R
<400> 30
ggcggatcct tagcgacgaa cagcgatcg 29
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rutC-F
<400> 31
ggcgagctca tgccaaaatc cgtaattatt cc 32
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rutC-R
<400> 32
ggcggatcct cacttggcga tatgcgcaa 29
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer tdcF-F
<400> 33
ggcgagctca tgaaaaagat tatcgaaacg caac 34
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer tdcF-R
<400> 34
ggcggatcct tacgcactac gtactgcga 29
<210> 35
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yoaB-F
<400> 35
ggcgagctca tgactatcgt tcgtatcgat gctg 34
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yoaB-R
<400> 36
ggcggatcct tacaccgcag ccacaatct 29
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yjgH-F
<400> 37
ggcgagctca tggtagaaag aaccgctgtt ttc 33
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yjgH-R
<400> 38
ggcggatcct attgcttact gctcagggat g 31
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-F
<400> 39
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-R
<400> 40
ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapA-F
<400> 41
ggcggatcca cacaggaaac agaccatgtt cacgggaagt attgtc 46
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapA-R
<400> 42
ggctctagat tacagcaaac cggcatgc 28
<210> 43
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysA-F
<400> 43
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgcc acattcactg ttcagc 46
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysA-R
<400> 44
ggcgtcgact taaagcaatt ccagcgccag 30
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 318-F
<400> 45
cagcctgaat atactgcatt ctc 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 318-R
<400> 46
gagaatgcag tatattcagg ctg 23
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 323-F
<400> 47
gcattctcgc gatttcctcg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 323-R
<400> 48
cgaggaaatc gcgagaatgc 20
<210> 49
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SlysC-F
<400> 49
ggcgagctca cacaggaaac agaccatggg cttagttgtg cagaaa 46
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SlysC-R
<400> 50
ggcggatcct taacgacctg tgccgccata 30
<210> 51
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-F
<400> 51
ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-R
<400> 52
ggcggatcct tacgccagtt gacgaagc 28
<210> 53
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapB-F
<400> 53
ggcacacagg aaacagacca tgcatgatgc aaacatccg 39
<210> 54
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapB-R
<400> 54
ggctctagat tacaaattat tgagatcaag tacatctc 38
<210> 55
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapD-F
<400> 55
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgca gcagttacag aacat 45
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer dapD-R
<400> 56
ggcgcatgct tagtcgatgg tacgcagca 29
<210> 57
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer aspC-F
<400> 57
ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46
<210> 58
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer aspC-R
<400> 58
ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47
<210> 59
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-rbs2-F
<400> 59
atttcacaca ggaaacagct atgtctgaaa ttgttgtctc ca 42
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer lysC-rbs2-R
<400> 60
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 61
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-rbs2-F
<400> 61
atttcacaca ggaaacagct atgaaaaatg ttggttttat cggctg 46
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer asd-rbs2-R
<400> 62
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-F2
<400> 63
ggcgagctct cccctgattc tgtggataa 29
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer SacI-R2
<400> 64
ggcgagctca gcaaaaggcc aggaaccgt 29
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ApaI-F
<400> 65
ggcgggcccg tattaccgcc tttgagtgag 30
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer ApaI-R
<400> 66
ggcgggccca cagaatcagg ggagagctc 29
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer LAL2-SacI-F
<400> 67
ggcgagctcg ttggccgatt cattaatgc 29
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer LAL2-ApaI-R
<400> 68
ggcgggccct taaagcaatt ccagcgccag 30
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvBamHI-F
<400> 69
tgcggtgtaa ggttcctcta gag 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvBamHI-R
<400> 70
ctctagagga accttacacc gca 23
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvSphI-F
<400> 71
gacctgcagg cttgcaagct tg 22
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvSphI-R
<400> 72
caagcttgca agcctgcagg tc 22
<210> 73
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yoaB-F2
<400> 73
ggcggatccc acacaggagg agctcatgac tatcgttcgt atcgatg 47
<210> 74
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yoaB-R2
<400> 74
ggcgcatgct cattcgccat tcaggctgc 29
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvSphI-F2
<400> 75
catttgataa tttacatgcg accctg 26
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer rmvSphI-R2
<400> 76
cagggtcgca tgtaaattat caaatg 26
<210> 77
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yjgH-F2
<400> 77
ggcggatccc acacaggagg agctcatggt agaaagaacc gctgtt 46
<210> 78
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer yjgH-R2
<400> 78
ggcgcatgct attgcttact gctcaggga 29
<210> 79
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer psyn-1
<400> 79
ggcgaattca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatgag ctcggtaccc 60
ggggat 66
<210> 80
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer psyn-2
<400> 80
ggcagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtg 34
<210> 81
<211> 131
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 81
Met Val Glu Arg Thr Ala Val Phe Pro Ala Gly Arg His Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Ala Glu His Arg Tyr Ser Ala Ala Ile Arg Ser Gly Asp Leu Leu Phe
20 25 30
Val Ser Gly Gln Val Gly Ser Arg Glu Asp Gly Thr Pro Glu Pro Asp
35 40 45
Phe Gln Gln Gln Val Arg Leu Ala Phe Asp Asn Leu His Ala Thr Leu
50 55 60
Ala Ala Ala Gly Cys Thr Phe Asp Asp Ile Ile Asp Val Thr Ser Phe
65 70 75 80
His Thr Asp Pro Glu Asn Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Val Lys Asn
85 90 95
Glu Ile Phe Ser Ala Pro Pro Tyr Pro Asn Trp Thr Ala Val Gly Val
100 105 110
Thr Trp Leu Ala Gly Phe Asp Phe Glu Ile Lys Val Ile Ala Arg Ile
115 120 125
Pro Glu Gln
130
<210> 82
<211> 124
<212> PRT
<213> Arapidopsis thaliana
<400> 82
Gly Pro His Met Ser Thr Glu Lys Ala Pro Ala Ala Leu Gly Pro Tyr
1 5 10 15
Ser Gln Ala Ile Lys Ala Asn Asn Leu Val Phe Leu Ser Gly Val Leu
20 25 30
Gly Leu Ile Pro Glu Thr Gly Lys Phe Val Ser Glu Ser Val Glu Asp
35 40 45
Gln Thr Glu Gln Val Leu Lys Asn Met Gly Glu Ile Leu Lys Ala Ser
50 55 60
Gly Ala Asp Tyr Ser Ser Val Val Lys Thr Thr Ile Met Leu Ala Asp
65 70 75 80
Leu Ala Asp Phe Lys Thr Val Asn Glu Ile Tyr Ala Lys Tyr Phe Pro
85 90 95
Ala Pro Ser Pro Ala Arg Ser Thr Tyr Gln Val Ala Ala Leu Pro Leu
100 105 110
Asn Ala Lys Ile Glu Ile Glu Cys Ile Ala Thr Leu
115 120
<210> 83
<211> 129
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 83
Met Lys Lys Ile Ile Glu Thr Gln Arg Ala Pro Gly Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Phe Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Cys Pro Gln Thr Gly Glu Ile Pro Ala Asp Val Gln Asp
35 40 45
Gln Ala Arg Leu Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Val Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Ser Val Gly Asp Ile Ile Lys Met Thr Val Phe Ile Thr Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Ile Asn Glu Val Tyr Lys Gln Phe Phe Asp
85 90 95
Glu His Gln Ala Thr Tyr Pro Thr Arg Ser Cys Val Gln Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Ser
115 120 125
Ala
<210> 84
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 84
Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala
35 40 45
Gln Ala Arg Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr
85 90 95
Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg
115 120 125
<210> 85
<211> 131
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 85
Met Val Glu Arg Thr Ala Val Phe Pro Ala Gly Arg His Ser Leu Tyr
1 5 10 15
Ala Glu His Arg Tyr Ser Ala Ala Ile Arg Ser Gly Asp Leu Leu Phe
20 25 30
Val Ser Gly Gln Val Gly Ser Arg Glu Asp Gly Thr Pro Glu Pro Asp
35 40 45
Phe Gln Gln Gln Val Arg Leu Ala Phe Asp Asn Leu His Ala Thr Leu
50 55 60
Ala Ala Ala Gly Cys Thr Phe Asp Asp Ile Ile Asp Val Thr Ser Phe
65 70 75 80
His Thr Asp Pro Glu Asn Gln Phe Glu Asp Ile Met Thr Val Lys Asn
85 90 95
Glu Ile Phe Ser Ala Pro Pro Tyr Pro Asn Trp Thr Ala Val Gly Val
100 105 110
Thr Trp Leu Ala Gly Phe Asp Phe Glu Ile Lys Val Ile Ala Arg Ile
115 120 125
Pro Glu Gln
130
<210> 86
<211> 114
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 86
Met Thr Ile Val Arg Ile Asp Ala Glu Ala Arg Trp Ser Asp Val Val
1 5 10 15
Ile His Asn Asn Thr Leu Tyr Tyr Thr Gly Val Pro Glu Asn Leu Asp
20 25 30
Ala Asp Ala Phe Glu Gln Thr Ala Asn Thr Leu Ala Gln Ile Asp Ala
35 40 45
Val Leu Glu Lys Gln Gly Ser Asn Lys Ser Ser Ile Leu Asp Ala Thr
50 55 60
Ile Phe Leu Ala Asp Lys Asn Asp Phe Ala Ala Met Asn Lys Ala Trp
65 70 75 80
Asp Ala Trp Val Val Ala Gly His Ala Pro Val Arg Cys Thr Val Gln
85 90 95
Ala Gly Leu Met Asn Pro Lys Tyr Lys Val Glu Ile Lys Ile Val Ala
100 105 110
Ala Val
<210> 87
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 87
Met Pro Lys Ser Val Ile Ile Pro Ala Gly Ser Ser Ala Pro Leu Ala
1 5 10 15
Pro Phe Val Pro Gly Thr Leu Ala Asp Gly Val Val Tyr Val Ser Gly
20 25 30
Thr Leu Ala Phe Asp Gln His Asn Asn Val Leu Phe Ala Asp Asp Pro
35 40 45
Lys Ala Gln Thr Arg His Val Leu Glu Thr Ile Arg Lys Val Ile Glu
50 55 60
Thr Ala Gly Gly Thr Met Ala Asp Val Thr Phe Asn Ser Ile Phe Ile
65 70 75 80
Thr Asp Trp Lys Asn Tyr Ala Ala Ile Asn Glu Ile Tyr Ala Glu Phe
85 90 95
Phe Pro Gly Asp Lys Pro Ala Arg Phe Cys Ile Gln Cys Gly Leu Val
100 105 110
Lys Pro Asp Ala Leu Val Glu Ile Ala Thr Ile Ala His Ile Ala Lys
115 120 125
<210> 88
<211> 129
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 88
Met Lys Lys Ile Ile Glu Thr Gln Arg Ala Pro Gly Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Ser Met Val Phe Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Cys Pro Gln Thr Gly Glu Ile Pro Ala Asp Val Gln Asp
35 40 45
Gln Ala Arg Leu Ser Leu Glu Asn Val Lys Ala Ile Val Val Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Ser Val Gly Asp Ile Ile Lys Met Thr Val Phe Ile Thr Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Ile Asn Glu Val Tyr Lys Gln Phe Phe Asp
85 90 95
Glu His Gln Ala Thr Tyr Pro Thr Arg Ser Cys Val Gln Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Ser
115 120 125
Ala
<210> 89
<211> 128
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 89
Met Ser Lys Thr Ile Ala Thr Glu Asn Ala Pro Ala Ala Ile Gly Pro
1 5 10 15
Tyr Val Gln Gly Val Asp Leu Gly Asn Met Ile Ile Thr Ser Gly Gln
20 25 30
Ile Pro Val Asn Pro Lys Thr Gly Glu Val Pro Ala Asp Val Ala Ala
35 40 45
Gln Ala Arg Gln Ser Leu Asp Asn Val Lys Ala Ile Val Glu Ala Ala
50 55 60
Gly Leu Lys Val Gly Asp Ile Val Lys Thr Thr Val Phe Val Lys Asp
65 70 75 80
Leu Asn Asp Phe Ala Thr Val Asn Ala Thr Tyr Glu Ala Phe Phe Thr
85 90 95
Glu His Asn Ala Thr Phe Pro Ala Arg Ser Cys Val Glu Val Ala Arg
100 105 110
Leu Pro Lys Asp Val Lys Ile Glu Ile Glu Ala Ile Ala Val Arg Arg
115 120 125

Claims (44)

1.一种包含外源多核苷酸的经遗传修饰的宿主细胞，所述外源多核苷酸包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸，相对于未修饰成表达所述外源多核苷酸的相对应的宿主细胞，所述经遗传修饰的宿主细胞增加了氨基酸或氨基酸衍生物的量；并且与野生型宿主细胞相比，所述经遗传修饰的宿主细胞具有增加所述氨基酸或所述氨基酸衍生物生产的至少一种另外的遗传修饰。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述氨基酸是赖氨酸并且所述氨基酸衍生物是尸胺。
3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。
4.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。
5.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。
6.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。
7.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
8.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽对所述宿主细胞是异源的。
9.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含对所述宿主细胞是天然的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸包含在引入到所述细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含可操作地连接到启动子的所述外源多核苷酸。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源多核苷酸被整合到宿主染色体中。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达外源赖氨酸脱羧酶多肽。
13.根据权利要求12所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源赖氨酸脱羧酶多肽是CadA多肽。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达一种或多种外源赖氨酸生物合成多肽。
15.根据权利要求14所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述外源赖氨酸生物合成多肽是天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。
16.根据权利要求15所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞过表达外源CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞属于埃希氏菌属(Escherichia)、哈夫尼菌属(Hafnia)或棒状杆菌属(Corynebacterium)。
19.根据权利要求18所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)。
20.根据权利要求19所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
21.一种工程化宿主细胞以增加氨基酸或氨基酸衍生物生产的方法，所述方法包括将包含编码亚胺/烯胺脱氨酶多肽的核酸的多核苷酸引入所述宿主细胞中，其中所述宿主细胞具有至少一种另外的遗传修饰，与野生型宿主细胞相比，所述另外的遗传修饰增加所述氨基酸或所述氨基酸衍生物的生产；
在表达所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的条件下培养所述宿主细胞，以及
选择相对于未修饰成引入编码所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽的所述多核苷酸的相对应的宿主细胞，生产的氨基酸或氨基酸衍生物的量增加的宿主细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述氨基酸是赖氨酸并且所述氨基酸衍生物是尸胺。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YoaB多肽。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。
25.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽是YjgH多肽。
26.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少80％的同一性，或至少90％的同一性。
27.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽对所述宿主细胞是异源的。
29.根据权利要求21-27中任一项所述的方法，其中所述亚胺/烯胺脱氨酶多肽包含对所述宿主细胞是天然的氨基酸序列。
30.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含在引入到所述细胞中的表达载体中，其中所述表达载体包含操作地连接到启动子的所述多核苷酸。
31.根据权利要求21-29中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸被整合到所述宿主染色体中。
32.根据权利要求21-31中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞被遗传修饰以过表达外源赖氨酸脱羧酶多肽。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述赖氨酸脱羧酶多肽是CadA多肽。
34.根据权利要求21-33中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞被遗传修饰以过表达一种或多种外源赖氨酸生物合成多肽。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述赖氨酸生物合成多肽是天冬氨酸激酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氨基庚二酸脱羧酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶甲酸还原酶或天冬氨酸转氨酶。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述赖氨酸生物合成多肽是LysC、DapA、LysA、Asd、DapB或AspC多肽。
37.根据权利要求21-31中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞被遗传修饰以过表达外源CadA、LysC、DapA、LysA、Asd、DapB和AspC多肽。
38.根据权利要求21-37中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞属于埃希氏菌属、哈夫尼菌属或棒状杆菌属。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌或谷氨酸棒状杆菌。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
41.通过权利要求21-40中任一项所述的方法产生的宿主细胞。
42.一种以增加的量生产氨基酸或氨基酸衍生物的方法，所述方法包括在表达亚胺/烯胺脱氨酶多肽的条件下培养权利要求1-20和41中任一项所述的宿主细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，进一步包括分离所述氨基酸或氨基酸衍生物。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述氨基酸是赖氨酸并且所述氨基酸衍生物是尸胺。
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